2558240 - Эффективный транспорт в лейкоциты

Эффективный транспорт в лейкоциты

Иллюстрации

Показать все

Изобретение относится к области биотехнологии. Описано применение специфических молекул-конъюгатов, которые являются транспортерами карго-молекул, для транспортировки представляющей интерес субстанции в лейкоциты. Указанные молекулы-конъюгаты, которые являются транспортерами карго-молекулы, можно применять для лечения, профилактики, ослабления и/или уменьшения интенсивности заболевания и/или нарушения, в котором принимают участие лейкоциты. Описаны также способ получения указанных молекул-конъюгатов, которые являются транспортерами карго-молекул, способ транспортировки представляющей интерес субстанции в лейкоциты и лейкоциты, содержащие указанные молекулы-конъюгаты, которые являются транспортерами карго-молекул. Изобретение может быть использовано в медицине. 5 н. и 21 з.п. ф-лы, 34 ил., 5 табл., 29 пр.

Реферат

Настоящее изобретение относится к применению специфических молекул-конъюгатов, которые являются транспортерами переносимой молекулы (карго-молекулы), предназначенных для переноса представляющей интерес субстанции (карго-молекулы) в лейкоциты. Указанные молекулы-конъюгаты, которые являются транспортерами карго-молекул, можно применять для лечения, профилактики, ослабления и/или уменьшения интенсивности заболевания и/или нарушения, в которых принимают участие лейкоциты. Настоящее изобретение относится также к получению указанных молекул-конъюгатов, которые являются транспортерами карго-молекул, к способу переноса представляющей интерес субстанции (карго-молекула) в лейкоциты и к лейкоцитам, содержащим молекулы-конъюгаты, которые являются транспортерами карго-молекул, или их фрагменты.

Методики, позволяющие обеспечивать эффективный перенос представляющей интерес субстанции, такой как нуклеиновые кислоты, белки или цитотоксические агенты, но также и другие соединения, из внешней среды в ткань или клетки и, прежде всего в ядра клеток, представляют большой интерес в области биотехнологии. Эти методики, можно применять для переноса и транслокации нуклеиновых кислот в клетки in vitro и in vivo и, как следствие, для производства белка или полипептида, для регуляции генной экспрессии, для индукции цитотоксических или апоптозных действий, для анализа внутриклеточных процессов и для анализа воздействий, обусловленных транспортом широкого разнообразия различных карго-молекул в клетку (или ядро клетки), и т.д.

Одним из важных путей применения указанного переноса представляющей интерес карго-молекулы из наружной среды в ткань или клетку, является направленный перенос лекарственного средства. Направленный перенос лекарственного средства относится к специфическому для ткани/клетки переносу фармацевтически активного лекарственного средства. Изобретение должно обеспечивать достижение после (системного) введения в течение определенного промежутка времени высокой концентрации фармацевтически активного лекарственного средства в клетках и тканях, представляющих интерес, сохраняя при этом в остальных клетках и тканях низкую концентрацию фармацевтически активного лекарственного средства. Это повышает эффективность терапии и снижает побочные действия. Указанный направленный перенос лекарственного средства можно обеспечивать, например, с помощью высоко специфических антител.

Другой важной областью применения указанного переноса представляющей интерес карго-молекулы из внешней среды в ткань или клетку, является генная терапия, в которой карго-молекула, как правило, представляет собой нуклеиновую кислоту или ген. Хотя, как известно, в последние десятилетия достигнуты многообещающие результаты в совершенствовании этого метода, применение переноса генов, как правило, ограничено из-за отсутствия у векторов, предназначенных для транспорта генов, способности к эффективному переносу биологически активных карго-молекул в цитоплазму или ядра клеток в организме хозяина, подлежащего лечению, без воздействия на геном хозяина или изменения биологических свойств активной карго-молекулы.

С учетом этого было разработано несколько методик, способствующих более эффективной трансфекции клеток, например, нуклеиновыми кислотами, такими как ДНК или РНК. Трансфекция нуклеиновыми кислотам клеток или тканей пациентов с помощью метода переноса генов представляет собой основной метод молекулярной медицины, и она имеет решающее значение для лечения и предупреждения многочисленных заболеваний.

Репрезентативными примерами методов переноса генов являются общепринятые (физические или физико-химические) методы, такие как копреципитация нуклеиновых кислот с фосфатом кальция или ДЭАЭ-декстраном, метод, который обеспечивает проникновение нуклеиновых кислот в плазматическую мембрану, а затем поступать в клетку и/или ядро. Однако недостатком этого метода является низкая эффективность переноса и высокий процент гибели клеток. Кроме того, указанный метод можно применять только в условиях in vitro или ex vivo, но он не применим в ситуациях in vivo из-за их специфических природных особенностей.

Это же можно отнести к методам, включающим электропорацию in vitro. Электропорация in vitro основана на применении тока высокого напряжения для того, чтобы сделать клеточные мембраны достаточно проницаемыми с целью интродукции в клетку новых нуклеиновых кислот, например, ДНК или РНК. Однако такие методы, как правило, не пригодны для применения in vivo. Кроме того, недостатками этого метода являются также низкая эффективность переноса и высокий процент гибели клеток.

Другие хорошо известные физические или физико-химические методы включают (непосредственную) инъекцию («голых») нуклеиновых кислот или биобаллистический перенос генов. Биобаллистический перенос генов (известный также как бомбардировка биобаллистическими частицами) представляет собой метод, разработанный в Корнельском университете, который позволяет интродуцировать генетический материал в ткани или культуры клеток. Биобаллистический перенос генов, как правило, осуществляют путем нанесения покрытия на поверхность металлических частиц, таких как золотые или серебряные частицы, и бомбардировки этими металлическими частицами, содержащими адсорбированную ДНК, клеток с помощью генной пушки. Аналогично описанным выше методам этот метод можно применять только в условиях in vitro или ex vivo, но, как правило, он не применим в ситуациях in vivo.

Другие методы основаны на транспортных способностях так называемых молекул-транспортеров. В этом контексте предназначенные для применения молекулы-транспортеры, как правило, можно подразделять на вирусные векторы, с одной стороны, т.е. молекулы-транспортеры, которые включают вирусные элементы, и невирусные векторы, с другой стороны.

Наиболее успешные применяемые в настоящее время стратегии генной терапии основаны на вирусных векторах, таких как аденовирусы, аденоассоциированные вирусы, ретровирусы и вирусы герпеса. Эти вирусные векторы, как правило, применяют для конъюгации родственной вирусу субстанции, обладающей высокой аффинностью к ДНК и нуклеиновой кислоте. Из-за их инфекционных свойств вирусы или вирусные векторы обладают очень высоким уровнем трансфекции. Вирусные векторы, как правило, представляют собой вирусы, генетически модифицированные таким образом, чтобы в трансфектированных клетках не образовывались функциональные инфекционные частицы. Однако в свете указанных мер предосторожности, связанных с безопасностью, существует много проблем, ассоциированных с вирусными векторами, которые связаны с иммуногенностью, цитотоксичностью и инсерционным мутагенезом. Например, нельзя исключать риск неконтролируемого увеличения интродуцированных терапевтически активных генов или вирусных генов, например, из-за возможных случаев рекомбинации. Кроме того, включающие вирусы конъюгаты трудно применять, и их использование, как правило, требует длительного периода подготовки перед осуществлением обработки (см., например, US №5521291).

Невирусные векторы являются менее эффективными, чем вирусные векторы, при их применении в генной терапии; однако многие из них созданы в качестве безопасной альтернативы генной терапии. Некоторые из наиболее распространенных невирусных векторов включают транспортные системы на основе полиэтиленимина, дендримеров, хитозана, полилизина и полипептидов, например, многих типов полипептидов, которые, как правило, являются катионными по природе и обладают способностью взаимодействовать с нуклеиновыми кислотами, такими как плазмидная ДНК, посредством электростатических взаимодействий. Кроме того, невирусные векторы позволяют также осуществлять введение лекарственных средств, основой которых не являются нуклеиновые кислоты.

Для обеспечения успешного введения невирусные векторы, в частности транспортные системы на основе полипептидов, должны обладать способностью преодолевать многие барьеры. Такие барьеры включают защиту фрагмента карго-молекулы (карго-фрагмента), например, ДНК или других соединений, в процессе транспорта и предупреждают раннее расщепление или метаболизм карго-фрагмента in vivo. В случае нуклеиновых кислот, таких как молекулы ДНК и РНК, невирусные векторы также могут обладать способностью к специфическому введению этих молекул для эффективной экспрессии генов в клетках-мишенях.

Так, касательно нуклеиновых кислот, таких как молекулы ДНК и РНК, известно 4 барьера, которые должны преодолеть невирусные векторы для обеспечения успешного введения гена (см., например, Martin и др., The AAPS Journal, 9(1), 2007, статья 3). Невирусные векторы должны обладать способностью 1) плотно сжимать и защищать нуклеиновые кислоты, 2) они должны обладать способностью направленно воздействовать на специфические для клеток поверхностные рецепторы, 3) невирусные векторы должны обладать способностью разрушать эндосомальную мембрану и 4) они должны обеспечивать введение карго-молекулы, представляющей собой нуклеиновую кислоту, в ядро и давать возможность транслироваться кодируемой белковой или полипептидной последовательности.

Указанные невирусные векторы, прежде всего невирусные векторы, основой которых являются полипептиды, обладают преимуществом по сравнению с другими стратегиями, основанными на применении невирусных векторов, состоящим в том, что они, как правило, обладают способностью решать все 4 указанные задачи, однако с различной эффективностью в отношении различных барьеров.

Например, катионные полипептиды, богатые основными остатками, такими как лизин и/или аргинин, обладают способностью эффективно конденсировать нуклеиновые кислоты, такие как ДНК, в небольшие компактные частицы, которые могут стабилизоваться в сыворотке. Кроме того, присоединение полипептидного лиганда с полиплексом позволяет обеспечивать направленный перенос к специфическим рецепторам и/или специфическим типам клеток. Как отмечалось выше, полиплексы или катионные полимеры, как правило, формируют комплексы с отрицательно заряженными нуклеиновыми кислотами, что приводит к конденсации нуклеиновых кислот и защите этих нуклеиновых кислот от расщепления. Транспорт в клетки с помощью полиплексов (катионных полимеров), как правило, происходит посредством опосредуемого рецептором эндоцитоза. При этом ДНК сшивают с отличной от нее молекулой, такой как трансферрин, например, через полиплекс поли-L-лизин (PLL), который связывается с поверхностным рецептором и инициирует эндоцитоз. Полиплексы (катионные полимеры) включают, например, поли-L-лизин (PLL), хитозан, полиэтиленимин (PEI), полидиметиламиноэтилметакрилат (PD-MAEMA), полиамидоамин (РАМАМ). Известно, что такие действия характерны также для наноплексов (системы на основе наночастиц) или липоплексов (системы на основе липосом). Наноплексы (системы на основе наночастиц), как правило, предусматривают применение полиакрилатов, полиамидов, полистирола, цианакрилатов, полилактата (PLA), сополимера молочной и гликолевой кислоты (PLGA) и т.д. Липоплексы или липосомные системы, как правило, предусматривают применение катионных липидов, которые обладают способностью имитировать клеточную мембрану. При этом положительно заряженный остаток липида взаимодействует с отрицательно заряженным остатком нуклеиновой кислоты и тем самым может обеспечивать слияние с клеточной мембраной. Липоплексы или липосомные системы включают, например, DOTMA, DOPE, DOSPA, DOTAP, DC-Chol, EDMPC и т.д.

В этом контексте опосредуемый рецептором эндоцитоз также широко используется в экспериментальных системах, предназначенных для направленного введения карго-молекул, таких как нуклеиновые кислоты или терапевтические агенты, в клетки. В процессе опосредуемого рецептором эндоцитоза содержащие карго-молекулу комплексы либо избирательно интернализируются рецепторами, локализованными в клеточной мембране, которые являются специфическими для карго-молекулы, либо специфическими антителами, локализованными в компонентах мембраны. Эндоцитозная активность описана для многих рецепторов, включая IgG-Fc, рецепторы соматостатина, инсулина, IGF-I и -II, трансферрина, EGF, GLP-1, VLDL или интегрина и т.д.

Различные полипептидные или белковые последовательности всесторонне протестированы в отношении их применения в методах переноса генов с помощью опосредуемого рецептором эндоцитоза. Важно отметить, что выделение полипептидных последовательностей, которые контролируют эффективный опосредуемый рецептором эндоцитоз, в значительной степени усовершенствовалось в результате применения методов фагового дисплея. Фаговые дисплейные библиотеки представляют собой чрезвычайно эффективные инструменты, которые являются практически неограниченными источниками молекулярных вариантов, включая модификации встречающихся в естественных условиях лигандов или карго-фрагментов клеточных рецепторов и коротких полипептидов. Подобные библиотеки инъецировали также непосредственно мышам и успешно выделяли полипептидные последовательности, которые обладали 13-кратной селективностью в отношении головного мозга и почки.

Пропротеинконвертазы могут служить примером полипептидных или белковых последовательностей, которые можно применять для транспорта молекул в клетки. Пропротеинконвертазы являются примером рецептора клеточной поверхности, который интернализируется в результате опосредуемого рецептором эндоцитоза. Установлено, что эти белки ответственны за превращение предшественников полипептидных гормонов, нейропептидов и многих других белков в их биологически активные формы. Все сайты расщепления семейства пропротеинконвертаз характеризуются наличием консенсусной последовательности R-X-X-R. Пропротеинконвертазы млекопитающих можно подразделить на 3 группы на основе их распределения в тканях. Фурин, РАСЕ4, РС5/РС6 и LPCIPC7/PC8/SPC7 экспрессируются в широком разнообразии тканей и клеточных линий. В отличие от этого, экспрессия РС2 и РС1/РС3 ограничена нейроэндокринными тканями, такими как панкреатические островки, гипофиз, мозговое вещество надпочечников и многие области головного мозга. Экспрессия РС4 в значительной степени ограничена тестикулярными сперматогенными клетками. Специфические для нейроэндокринной ткани конвертазы, РС2 и РС1/РС3, главным образом локализованы в секреторных гранулах. Опубликованы также данные о том, что РС5/РС6А локализованы в секреторных гранулах. Кроме того, имеются косвенные данные, которые позволяют предположить, что часть молекул пропротеинконвертаз присутствует на клеточной поверхности, и было установлено, что фурин циркулирует между TGN (транс-сеть аппарата Гольджи) и клеточной поверхностью. Взятые в совокупности эти свойства свидетельствуют о том, что пропротеинконвертазы транспортируют внеклеточные лиганды во внутриклеточное пространство.

Представляют интерес также так называемые транслокаторные белки или домены белковой трансдукции (PTD). Полипептидные последовательности, выведенные из транслокаторных белков или доменов белковой трансдукции (PTD), как правило, обладают способностью осуществлять избирательный лизис эндосомальной мембраны в ее кислотном окружении, приводя к высвобождению полиплекса в цитоплазму. Транслокаторные белки рассматриваются в качестве группы полипептидов, обладающих способностью осуществлять транспорт макромолекул между клетками (транслокаторные белки), к ним относятся белок ТАТ вируса ВИЧ-ЦВИЧ), белок гена antennapedia (Drosophila antennapedid), VP22 HSV (вирус герпеса простого), FGF или лактоферрин и т.д. В отличие от этого домены белковой трансдукции (PTD) рассматриваются в качестве группы полипептидов, которые обладают способностью направлять белки и полипептиды, ковалентно связанные с этими последовательностями, в клетку через мембрану (Leifert и Whitton: Translocatory proteins and protein transduction domains: a critical analysis of their biological effects and the underlying mechanisms. Molecular Therapy, т.8, №1, 2003). Общей для транслокаторных белков, а также для PTD является основная область, которая рассматривается как основной элемент, ответственный за транспорт слитых полипептидов, поскольку она обладает способностью связывать полианионы, такие как нуклеиновые кислоты. Не вдаваясь в теорию, можно предположить, что PTD действуют подобно катионным трансфектирующим реагентам, используя зависящий от рецептора ненасыщаемый адсорбтивный эндоцитоз. PTD, как правило, сшивают с белками или полипептидами для того, чтобы оказывать воздействие или повышать CTL-ответ при введении вакцины на основе полипептида (см. Melikov и Chernomordik, Arginine-rich cell penetrating polypeptides: from endosomal uptake to nuclear delivery. Cell. Mol. Life Sci., 2005).

Хотя, в целом, в данной области известно несколько методов, обеспечивающих перенос представляющей интерес субстанции из наружной среды в ткань или клетки, все еще существует выраженная необходимость в методиках, позволяющих осуществлять эффективный перенос в конкретные типы тканей и клеток.

Таким образом, объектом настоящего изобретения являются новые средства для направленного переноса карго-молекулы, например, лекарственных средств и эффекторных молекул, эффективно и с улучшенной специфичностью в конкретные типы тканей и клеток.

Эта задача решается для лейкоцитов (WBC) с помощью средств, являющихся объектом изобретения, которые представлены в прилагаемой формуле изобретения. В частности, при создании настоящего изобретения неожиданно было установлено, что определенные типы полипептидов обеспечивают эффективный перенос представляющей интерес карго-молекулы в лейкоциты.

Понятие «обеспечивающий направленный перенос в WBC полипептид» в контексте настоящего описания относится к полипептиду, который обладает способностью проникать в лейкоциты с повышенной специфичностью (по сравнению, например, с HepG2-клетками (клетки карциномы печени человека) или НСТ-116-клетками (клетки карциномы ободочной кишки человека)) и который получают из белка ТАТ ВИЧ, т.е. он содержит или состоит из аминокислотой последовательности, представляющей собой фрагмент или вариант (или вариант указанного фрагмента белка ТАТ ВИЧ (SEQ ID NO:1; описана в US №№5804604 и 5674980, каждая из указанных ссылок включена в настоящее описание в качестве ссылки). В частности, указанные фрагменты, варианты и варианты указанных фрагментов получают из остатков ТАТ 49-57 (SEQ ID NO:2) или 48-57 (SEQ ID NO:3). Эта аминокислотная последовательность может содержать D-аминокислоты и/или L-аминокислоты.

Понятие «полипептиды» в контексте настоящего изобретения имеет значение, общепринятое в данной области, например, относится к цепи аминокислот. Однако не следует рассматривать, что понятие накладывает ограничение на длину аминокислотной цепи. Также не является обязательным, чтобы цепь была линейной, она может быть и разветвленной.

Предпочтительно обеспечивающий направленный перенос в WBC полипептид содержит менее 150, 100, 90, 80, 70, 60, 50, 40, 30, 20 или 10 аминокислотных остатков, более предпочтительно от 5 до 150 аминокислотных остатков, более предпочтительно от 5 до 100 аминокислотных остатков, еще более предпочтительно от 5 до 75 аминокислотных остатков и наиболее предпочтительно от 9 до 50 аминокислотных остатков, например, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 30, 40 или 50 аминокислотных остатков.

Приведенные в качестве примера последовательности полипептидов, которые обеспечивают направленный перенос в WBC, могут содержать или состоять из последовательностей, представленных в таблице 1.

Таблица 1
Обозначение последовательности/пептида	SEQ ID NO	AK	Последовательность
ТАТ (1-86)	1	86	MEPVDPRLEP WKHPGSQPKT ACTNCYCKKC CFHCQVCFIT KALGISYGRK KRRQRRRPPQ GSQTHQVSLS KQPTSQSRGD PTGPKE
L-TAT (s1a)	2	9	RKKRRQRRR (NH₂-RKKRRQRRR-COOH)
L-TAT (s1b)	3	9	GRKKRRQRRR (NH₂-GRKKRRQRRR-COOH)
D-TAT	4	9	rrrqrrkkr (NH₂-RRRQRRKKR-COOH)
D-TAT	5	10	rrrqrrkkrg (NH₂-RRRQRRKKRG-COOH)
L-дженерик-ТАТ (s)	6		NH₂-X_n ^b-RKKRRQRRR-X_n ^b-COOH
D-дженерик-ТАТ (s)	7		NH₂-X_n ^b-rrrqrrkkr-X_n ^b-СООН
TAT (37-72)	8	36	CFITKALGIS YGRKKRRQRR RPPQGSQTHQ VSLSKQ
TAT (37-58)	9	22	CFITKALGIS YGRKKRRQRR RP
TAT (38-58)GGC	10	24	FITKALGISY GRKKRRQRRR PGGC
TAT CGG (47-58)	11	15	CGGYGRKKRR QRRRP
TAT (47-58) GGC	12	15	YGRKKRRQRR RPGGC
TAT (1-72) MutCys/Ala72	13	56	MEPVDPRLEP WKHPGSQPKT AFITKALGIS YGRKKRRQRR RPPQGSQTHQ VSLSKQ
L-TAT (slc)	14	11	YDRKKRRQRRR
r₃-L-TAT	15	9	rKKRrQRRr
r₃-L-TATi	16	9	rRRQrRKKr
βA-r₃-L-TAT	17	9	βA-rKKRrQRRr
βА-r₃-L-TATi	18	9	βA-rRRQrRKKr
FITC-βA-r₃-L-TAT	19	9	FITC-βA-rKKRrQRRr
FITC-βA-r₃-L-TATi	20	9	FITC-βA-rRRQrRKKr
TAT (s2-1)	21	9	rAKRrQRRr
TAT (s2-2)	22	9	rKARrQRRr
TAT (s2-3)	23	9	rKKArQRRr
TAT (s2-4)	24	9	rKKRrARRr
TAT (s2-5)	25	9	rKKRrOARr
TAT (s2-6)	26	9	rKKRrQRAr
TAT (s2-7)	27	9	rDKRrQRRr

Обозначение последовательности/пептида	SEQ ID NO	AK	Последовательность
TAT (s2-8)	28	9	rKDRrQRRr
TAT (s2-9)	29	9	rKKDrQRRr
TAT (s2-10)	30	9	rKKRrDRRr
TAT (s2-11)	31	9	rKKRrQDRr
TAT (s2-12)	32	9	rKKRrQRDr
TAT (s2-13)	33	9	rEKRrQRRr
TAT (s2-14)	34	9	rKERrQRRr
TAT (s2-15)	35	9	rKKErQRRr
TAT (s2-16)	36	9	rKKRrERRr
TAT (s2-17)	37	9	rKKRrQERr
TAT (s2-18)	38	9	rKKRrQREr
TAT (s2-19)	39	9	rFKRrQRRr
TAT (s2-20)	40	9	rKFRrQRRr
TAT (s2-21)	41	9	rKKFrQRRr
TAT (s2-22)	42	9	rKKRrFRRr
TAT (s2-23)	43	9	rKKRrQFRr
TAT (s2-24)	44	9	rKKRrQRFr
TAT (s2-25)	45	9	rRKRrQRRr
TAT (s2-26)	46	9	rKRRrQRRr
TAT (s2-27)	47	9	rKKKrQRRr
TAT (s2-28)	48	9	rKKRrRRRr
TAT (s2-29)	49	9	rKKRrQKRr
TAT (s2-30)	50	9	rKKRrQRKr
TAT (s2-31)	51	9	rHKRrQRRr
TAT (s2-32)	52	9	rKHRrQRRr
TAT (s2-33)	53	9	rKKHrQRRr
TAT (s2-34)	54	9	rKKRrHRRr
TAT (s2-35)	55	9	rKKRrQHRr
TAT (s2-36)	56	9	rKKRrQRHr
TAT (s2-37)	57	9	rIKRrQRRr
TAT (s2-38)	58	9	rKIRrQRRr
TAT (s2-39)	59	9	rKKIrQRRr
TAT (s2-40)	60	9	rKKRrIRRr
TAT (s2-41)	61	9	rKKRrQIRr
TAT (s2-42)	62	9	rKKRrQRIr
TAT (s2-43)	63	9	rLKRrQRRr
TAT (s2-44)	64	9	rKLRrQRRr
TAT (s2-45)	65	9	rKKLrQRRr
TAT (s2-46)	66	9	rKKRrLRRr
TAT (s2-47)	67	9	rKKRrQLRr
TAT (s2-48)	68	9	rKKRrQRLr
TAT (s2-49)	69	9	rMKRrQRRr
TAT (s2-50)	70	9	rKMRrQRRr
TAT (s2-51)	71	9	rKKMrQRRr
TAT (s2-52)	72	9	rKKRrMRRr
TAT (s2-53)	73	9	rKKRrQMRr
TAT (s2-54)	74	9	rKKRrQRMr
TAT (s2-55)	75	9	rNKRrQRRr
TAT (s2-56)	76	9	rKNRrQRRr
TAT (s2-57)	77	9	rKKNrQRRr
TAT (s2-58)	78	9	rKKRrNRRr
TAT (s2-59)	79	9	rKKRrQNRr
TAT (s2-60)	80	9	rKKRrQRNr
TAT (s2-61)	81	9	rQKRrQRRr

Обозначение последовательности/пептида	SEQ ID NO	AK	Последовательность
TAT (s2-62)	82	9	rKQRrQRRr
TAT (s2-63)	83	9	rKKQrQRRr
TAT (s2-64)	84	9	rKKRrKRRr
TAT (s2-65)	85	9	rKKRrQQRr
TAT (s2-66)	86	9	rKKRrQRQr
TAT (s2-67)	87	9	rSKRrQRRr
TAT (s2-68)	88	9	rKSRrQRRr
TAT (s2-69)	89	9	rKKSrQRRr
TAT (s2-70)	90	9	rKKRrSRRr
TAT (s2-71)	91	9	rKKRrQSRr
TAT (s2-72)	92	9	rKKRrQRSr
TAT (s2-73)	93	9	rTKRrQRRr
TAT (s2-74)	94	9	rKTRrQRRr
TAT (s2-75)	95	9	rKKTrQRRr
TAT (s2-76)	96	9	rKKRrTRRr
TAT (s2-77)	97	9	rKKRrQTRr
TAT (s2-78)	98	9	rKKRrQRTr
TAT (s2-79)	99	9	rVKRrQRRr
TAT (s2-80)	100	9	rKVRrQRRr
TAT (s2-81)	101	9	rKKVrQRRr
TAT (s2-82)	102	9	rKKRrVRRr
TAT (s2-83)	103	9	rKKRrQVRr
TAT (s2-84)	104	9	rKKRrQRVr
TAT (s2-85)	105	9	rWKRrQRRr
TAT (s2-86)	106	9	rKWRrQRRr
TAT (s2-87)	107	9	rKKWrQRRr
TAT (s2-88)	108	9	rKKRrWRRr
TAT (s2-89)	109	9	rKKRrQWRr
TAT (s2-90)	110	9	rKKRrQRWr
TAT (s2-91)	111	9	rYKRrQRRr
TAT (s2-92)	12	9	rKYRrQRRr
TAT (s2-93)	13	9	rKKYrQRRr
TAT (s2-94)	14	9	rKKRrYRRr
TAT (s2-95)	15	9	rKKRrQYRr
TAT (s2-96)	16	9	rKKRrQRYr
r3 (дженерик)	235	9	rXXXrXXXr

В таблице 1 D-энантиомерные аминокислоты обозначены прописными буквами, а L-энантиомерные аминокислоты обозначены заглавными буквами. Все последовательности записаны в направлении от N-конца к С-концу (слева направо). «βА» обозначает бета-аланин. В SEQ ID NO:6 и SEQ ID NO:7 каждый X, как правило, обозначает аминокислотный остаток, предпочтительно выбранный из любого (нативного) аминокислотного остатка. X_n ^a, как правило, обозначает один аминокислотный остаток, предпочтительно выбранный из любого аминокислотного остатка кроме серина или треонина, где n (число повторений X) обозначает 0 или 1. Кроме того, каждый X_n ^b можно выбирать из любого аминокислотного остатка, где n (число повторений X) обозначает 0-5, 5-10, 10-15, 15-20, 20-30 или более при условии, что, если n (число повторений X) обозначает 0 для X_n ^a, X_n ^b предпочтительно не содержит серии или треонин на С-конце для того, чтобы избежать присутствия серина или треонина в этом положении. Предпочтительно X_n ^b обозначает состоящий из смежных полипептидных остатков участок, полученный из SEQ ID NO:1. X_n ^a и X_n ^b могут обозначать либо D-, либо L-аминокислоты.

Обеспечивающий направленный перенос в WBC полипептид, предназначенный для применения в различных вариантах осуществления настоящего изобретения, может представлять собой, например, полипептид, который содержит или состоит из аминокислотной последовательности ТАТ ВИЧ, остатки 49-57 (SEQ ID NO:2), или ее (химического) производного или его варианта, или ее варианта, где вариант SEQ ID NO:2 выбирают из группы, включающей:

I) полипептид, который содержит или состоит по меньшей мере из одной аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO:235, ее (химического) производного или обратной ей последовательности, и

II) полипептид, который содержит или состоит по меньшей мере из одной аминокислотной последовательности, представленной в одной из SEQ ID NO:2-116, ее (химического) производного или обратной ей последовательности.

В наиболее предпочтительном варианте осуществления изобретения вариант фрагмента белка ТАТ ВИЧ представляет собой полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, представленную в одной из SEQ ID NO:1-116, более предпочтительно полипептид, который содержит или состоит из аминокислотной последовательности L-TAT (SEQ ID NO:2), D-TAT (SEQ ID NO:4), r₃-L-TAT (SEQ ID NO:15), r₃-L-TATi (SEQ ID NO:16), TAT (s2-28) (SEQ ID NO:48), TAT (s2-64) (SEQ ID NO:84) или TAT (s2-91) (SEQ ID NO:111).

В конкретном предпочтительном варианте осуществления изобретения обеспечивающий направленный перенос в WBC полипептид содержит или состоит по меньшей мере из одной из последовательности, представленной в виде rXXXrXXXr (SEQ ID NO:235), в которой

r обозначает D-энантиомерный аргинин;

Х обозначает любую из L-аминокислот;

и в которой Х каждый может быть выбран индивидуально и независимо от любых других X, присутствующих в SEQ ID NO:252. Предпочтительно по меньшей мере 4 из 6 обозначенных Х L-аминокислот в SEQ ID NO:235 обозначают K или R. В другом варианте осуществления изобретения обеспечивающий направленный перенос в WBC полипептид, предлагаемый в настоящем изобретении, содержит или состоит из последовательности rX₁X₂X₃rX₄X₅X₆r (SEQ ID NO:235), в которой X₁ обозначает K, X₂ обозначает K, Х₃ обозначает R и Х₄, Х₅ и Х₆ обозначают любую L-аминокислоту, выбранную независимо друг от друга. Аналогично этому, конструкция транспортера, предлагаемая в настоящем изобретении, может содержать или состоять из последовательности rX₁X₂X₃rX₄X₅X₆r (SEQ ID NO:235), в которой Х₄ обозначает Q, Х₅ обозначает R, Х₆ обозначает R и X₁, X₂, и Х₃ обозначают любую L-аминокислоту, выбранную независимо друг от друга. Предлагаемая в изобретении конструкция транспортера может содержать также или состоять из последовательности rX₁X₂X₃rX₄X₅X₆r (SEQ ID NO:235), в которой один, два, три, четыре, пять или шесть аминокислотных остатков Х выбирают из группы, в которой: X₁ обозначает K, X₂ обозначает K, Х₃ обозначает R, Х₄ обозначает Q, X₅ обозначает R, Х₆ обозначает R, а остальные аминокислотные остатки X, которые не выбраны из указанной выше группы, могут представлять собой любую L-аминокислоту, и их выбирают независимо друг от друга. Кроме того, X₁ предпочтительно обозначает Y и/или Х₄ предпочтительно обозначает К или R. Аналогичные положения относятся к обратным последовательностям и/или химическим вариантам указанных выше последовательностей и вариантов SEQ ID NO:235.

Кроме того, обеспечивающие направленный перенос в WBC полипептиды можно выбирать из фрагментов или вариантов указанных выше обеспечивающих направленный перенос в WBC полипептидов, которые представлены в таблице 1, при условии, что они сохраняют функциональную активность/способность проникать в WBC с высокой селективностью. В частности, варианты последовательностей, представленных в таблице 1, не обязательно должны иметь такую же последовательность D- и L-аминокислот, т.е. они могут полностью состоять из D-аминокислот, полностью состоять из L-аминокислот или состоять из произвольной смеси D- и L-аминокислот.

В контексте настоящего изобретения варианты и/или фрагменты полипептида предпочтительно содержат или состоят из полипептидной последовательности, которая по меньшей мере на 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% или 85%, предпочтительно по меньшей мере на 90%, более предпочтительно по меньшей мере на 95% и наиболее предпочтительно по меньшей мере на 99% идентична по всей длине последовательности референс-полипептида. Кроме того, фрагмент указанного полипептида может содержать также эпитопы (которые обозначают также как «антигенные детерминанты») полноразмерной последовательности. Эпитопы в контексте настоящего изобретения, как правило, представляют собой фрагменты, локализованные на наружной поверхности (нативной) белковой или полипептидной последовательности, указанной в настоящем изобретении, предпочтительно состоят из 5-15 аминокислот, более предпочтительно состоят из 5-12 аминокислот, еще более предпочтительно состоят из 6-9 аминокислот, которые могут распознаваться антителами, т.е. находятся в их исходной форме.

Под «фрагментом» в контексте настоящего описания, в частности обеспечивающего направленный перенос в WBC полипептида, представленного в таблице 1, предпочтительно подразумевается его укороченная последовательность, т.е. аминокислотная последовательность, которая на N-конце, С-конце и/или внутри последовательности укорочена по сравнению с аминокислотной последовательностью исходной последовательности.

Кроме того, в контексте настоящего изобретения под «вариантом» полипептида предпочтительно подразумевается последовательность, при этом аминокислотная последовательность варианта отличается от последовательности указанного полипептида (или его фрагмента) одной или несколькими мутацией(ями), такой(ими) как одна или несколько замен (или при необходимости инсерцией и/или делеций) аминокислот. Варианты обладают в основном такой же биологической функцией или специфической активностью, что и полноразмерная исходная последовательность. Касательно вариантов обеспечивающих направленный перенос в WBC полипептидов это означает, что они все еще обладают способностью обеспечивать транспорт в WBC-клетки. Более предпочтительно вариант может включать примерно 1-50, 1-20, еще более предпочтительно 1-10 и наиболее предпочтительно 1-5, 4, 3, 2 или 1 изменение аминокислот в пределах указанных выше значений. Варианты могут содержать консервативные аминокислотные замены. Консервативные аминокислотные замены могут включать замены аминокислотных остатков на другие аминокислотные остатки, которые обладают в достаточной степени сходными физико-химическими свойствами, что должно сохранять биологическую активность молекулы (см., например, Grantham R., Science 185, 1974, сс.862-864). Специалистам в данной области должно быть очевидно, что аминокислоты можно также встраивать и/или изымать путем делеции из указанных выше последовательностей без изменения их функции, в частности, если инсерции и/или делеции затрагивают лишь несколько аминокислот, например, менее 20 и предпочтительно менее 10, и что недопустимо удалять или заменять аминокислоты, которые имеют решающее значение для функциональной активности. Консервативные аминокислотные замены предпочтительно представляют собой замены, в которых аминокислоты, относящиеся к одному и тому же классу аминокислот (основные аминокислоты, кислые аминокислоты, полярные аминокислоты и т.д.), заменяют друг на друга. В этом отношении важными являются алифатические боковые цепи, положительно или отрицательно заряженные боковые цепи, ароматические группы в боковых цепях аминокислот, боковые цепи, которые могут обеспечивать образование водородных связей, например, боковые цепи с гидроксильной функцией. Это означает, что, например, аминокислоту с полярной боковой цепью заменяют на другую аминокислоту с подобной полярной боковой цепью или, например, аминокислоту, отличающуюся гидрофобной боковой цепью, заменяют на другую аминокислоту с подобной гидрофобной боковой цепью (например, серии (треонин) на треонин (серин) или лейцин (изолейцин) на изолейцин (лейцин)). Синонимические аминокислотные остатки, которые представляют собой остатки, отнесенные к одной и той же группе, и которые, как правило, можно заменять друг на друга путем консервативных аминокислотных замен, приведены в таблице 2.

Таблица 2
Предпочтительные группы синонимических аминокислотных остатков
Аминокислота	Синонимический остаток
Ser	Ser, Thr, Gly, Asn
Arg	Arg, Gin, Lys, Glu, His
Leu	Ile, Phe, Tyr, Met, Val, Leu
Pro	Gly, Ala, (Thr), Pro
Thr	Pro, Ser, Ala, Gly, His, Gln, Thr
Ala	Gly, Thr, Pro, Ala
Val	Met, Tyr, Phe, He, Leu, Val
Gly	Ala, (Thr), Pro, Ser, Gly
Ile	Met, Tyr, Phe, Val, Leu, Ile
Phe	Trp, Met, Tyr, He, Val, Leu, Phe
Tyr	Trp, Met, Phe, He, Val, Leu, Tyr
Cys	Ser, Thr, Cys
His	Glu, Lys, Gln, Thr, Arg, His
Gln	Glu, Lys, Asn, His, (Thr), Arg, Gln
Asn	Gln, Asp, Ser, Asn
Lys	Glu, Gln, His, Arg, Lys
Asp	Glu, Asn, Asp
Glu	Asp, Lys, Asn, Gln, His, Arg, Glu
Met	Phe, He, Val, Leu, Met
Trp	Trp

В конкретном варианте осуществления изобретения вариант представляет собой вариант SEQ ID NO:2, выбранный из группы, включающей:

Функциональную способность/активность фрагментов или вариантов можно оценивать с помощью различных анализов, например, по эффективности трансфекции, правильной экспрессии белков, кодируемых карго-молекулами, представляющими собой нуклеиновые кислоты, или с помощью биофизических методов, например, с помощью спектроскопии, компьютер

Эффективный транспорт в лейкоциты

Патент 2558240