Варианты сериновой протеазы с множественными мутациями

Варианты сериновой протеазы с множественными мутациями

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Настоящая заявка представляет собой подачу международной заявки с USSN 11/809104, зарегистрированной 31 мая 2007 года, которая представляет собой продолжение рассматриваемой патентной заявки США с серийным номером 11/583334, зарегистрированной 19 октября 2006 года, которая представляет собой частичное продолжение рассматриваемой патентной заявки США с серийным номером 10/576331, по которой испрашивается приоритет по PCT/US2004/039066, зарегистрированной 19 ноября 2004 года, по которой испрашивается приоритет по предварительной патентной заявке США с серийным номером 60/523609, зарегистрированной 19 ноября 2003 года, рассмотрение которой в настоящее время прекращено.

ОБЛАСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение относится к новым сериновым протеазам видов Micrococcineae с множественными заменами. В частности, настоящее изобретение относится к сериновым протеазам с множественными заменами, к ДНК, кодирующим эти протеазы, к векторам, содержащим ДНК, кодирующие протеазы, клеткам-хозяевам, трансформированным ДНК-содержащим вектором, и продуцируемым клетками-хозяевами ферментам. Настоящее изобретение также относится к чистящим композициям (например, детергентным композициям), композициям животных кормов и композициям для обработки тканей и кожи, содержащим эти варианты сериновых протеаз. В особенно предпочтительных вариантах осуществления настоящее изобретение относится к мутантным протеазам (т.е. вариантам протеаз), полученным из протеаз дикого типа, описываемых в настоящем документе. Эти варианты протеаз также находят применение в многочисленных приложениях.

ПРЕДПОСЫЛКИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Сериновые протеазы представляют собой подгруппу ферментов различных классов с широким диапазоном специфичности и биологических функций (см., например Stroud, Sci. Amer., 131:74-88 [1974]). Несмотря на их функциональное разнообразие, каталитический аппарат сериновых протеаз представлен по меньшей мере двумя генетически различными семействами ферментов: 1) субтилизины; и 2) родственные химотрипсину сериновые протеазы млекопитающих и гомологичные бактериальные сериновые протеазы (например, трипсины). Эти два семейства сериновых протеаз демонстрируют необычно сходные механизмы катализа (см., например Kraut, Ann. Rev. Biochem., 46:331-358 [1977]). Кроме того, хотя первичная структура является непохожей, третичная структура этих двух семейств ферментов совместно дает консервативную каталитическую триаду аминокислот, состоящую из серина, гистидина и аспарагиновой кислоты.

В отличие от этого, субтилизины и родственные химотрипсину сериновые протеазы содержат каталитическую триаду, состоящую из аспарагиновой кислоты, гистидина и серина. У родственных субтилизину протеаз порядок расположения этих аминокислот при чтении от N- к С-концу составляет аспарагиновую кислоту-гистидин-серин. Однако у родственных химотрипсину протеаз порядок расположения составляет гистидин-аспарагиновую кислоту-серин. С субтилизинами проведено большое количество исследований, в основном вследствие их применимости в очистных и кормовых составах. Дополнительные исследования были сфокусированы на вредных условиях окружающей среды (например, воздействие окислителей, хелатирующих средств, экстремальных температур и/или pH), которые могут вредно влиять на функциональность этих ферментов при различных применениях. Тем не менее, в данной области остается необходимость в ферментных системах, которые способны противостоять этим вредным условиям и сохранять активность или обладать улучшенной активностью по сравнению с известными в данной области в настоящее время ферментными системами.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение относится к новым сериновым протеазам видов Micrococcineae с множественными заменами. В частности, настоящее изобретение относится к сериновым протеазам с множественными заменами, ДНК, кодирующим эти протеазы, векторам, содержащим ДНК, кодирующие протеазы, клеткам-хозяевам, трансформированным ДНК-содержащим вектором, и продуцируемым клетками-хозяевами ферментам. Настоящее изобретение также относится к чистящим композициям (например, детергентным композициям), композициям животных кормов и композициям для обработки тканей и кожи, содержащим эти варианты сериновых протеаз. В особенно предпочтительных вариантах осуществления настоящее изобретение относится к мутантным протеазам (т.е. вариантам протеаз), полученным из протеаз дикого типа, описываемых в настоящем документе. Эти варианты протеаз также находят применение в многочисленных приложениях.

Настоящее изобретение относится к выделенным вариантам сериновых протеаз с аминокислотной последовательностью, содержащей по меньшей мере две аминокислотные замены, где замены сделаны в положениях, эквивалентных положениям в протеазе Cellulomonas 69B4, содержащей аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO:8. Настоящее изобретение дополнительно относится к композициям, содержащим вариант(ы) выделенной сериновой протеазы по меньшей мере с двумя аминокислотными заменами, где замены произведены в положениях, эквивалентных положениям в протеазе Cellulomonas 69B4, содержащей аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO:8. В некоторых предпочтительных вариантах осуществления композиции содержат по меньшей мере один вариант сериновой протеазы, где вариант сериновой протеазы обладает иммунологической перекрестной реактивностью с сериновой протеазой, приведенной в SEQ ID NO:8. В некоторых дополнительных предпочтительных вариантах осуществления последовательность варианта сериновой протеазы содержит замены по меньшей мере в двух положениях аминокислот, выбранных из положений 1, 2, 3, 4, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 18, 19, 22, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 51, 52, 54, 55, 56, 57, 59, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 96, 99, 100, 101, 103, 104, 105, 107, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 121, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165, 166, 167, 168, 170, 171, 172, 175, 176, 177, 179, 180, 181, 182, 183, 184, 185, 186, 187, 188 и 189, где замены сделаны в положениях, эквивалентных положениям в протеазе Cellulomonas 69B4, содержащей аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO:8.

В некоторых предпочтительных вариантах осуществления вариант сериновой протеазы содержит по меньшей мере две замены, выбранные из G12D, R14I, R14L, R14M, R14S, R16I, R16L, R16Q, N24E, N24H, N24M, N24T, N24W, R35E, R35F, R35H, T36S, G49A, G54D, G54L, R61V, A64K, G65Q, Q71F, Y75G, S76A, S76L, S76N, S76T, S76V, R79K, R79T, Q81K, Q81P, T86K, A93G, A93H, A93S, S99A, T109M, N112E, T116E, R123F, R123L, R123Q, R123S, R127A, R127K, R127Q, R159E, R159F, R159G, R159K, R159L, R159Q, R179N, R179Q, I181K, I181Q, I181T, D184N, D184T и S187Q, где замены сделаны в положениях, эквивалентных положениям в протеазе Cellulomonas 69B4, содержащей аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO:8. В некоторых дополнительных предпочтительных вариантах осуществления вариант сериновой протеазы содержит несколько замен, выбранных из R16Q/R35F/R159Q, R16Q/R123L, R14L/R127Q/R159Q, R14L/R179Q, R123L/R127Q/R179Q, R16Q/R79T/R127Q, R16Q/R79T, R35E/R123L/R127Q/R179Q и G12D/R35E/G63R/R79K/T109M, где замены сделаны в положениях, эквивалентных положениям в протеазе Cellulomonas 69B4, содержащей аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO:8. В некоторых предпочтительных вариантах осуществления вариант сериновой протеазы содержит следующие замены R123L, R127Q и R179Q, где замены сделаны в положениях, эквивалентных положениям в протеазе Cellulomonas 69B4, содержащей аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO:8.

В некоторых дополнительных предпочтительных вариантах осуществления вариант сериновой протеазы содержит по меньшей мере две замены, выбранные из D2G, D2Q, V3I, V3L, N7A, N7L, N7S, I11A, I11Q, R14E, N24A, N24E, N24H, N24L, N24M, N24Q, N24T, N24V, T36D, T36F, T36G, T36H, T36I, T36L, T36N, T36P,

T183I, G186E, G186I, G186V, S187P, S187T и S188M, где замены сделаны в положениях, эквивалентных положениям в протеазе Cellulomonas 69B4, содержащей аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO:8.

В некоторых дополнительных вариантах осуществления вариант сериновой протеазы содержит по меньшей мере две замены, выбранные из F1A, F1T, D2A, D2H, D2N, V3T, N7H, N7I, A8G, A8K, T10G, T10K,

T183K, T183M, D184F, D184H, D184Q, D184R, S185I, S185V, S187E и S187L, где замены сделаны в положениях, эквивалентных положениям в протеазе Cellulomonas 69B4, содержащей аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO:8.

В дополнительных вариантах осуществления, вариант сериновой протеазы содержит по меньшей мере две замены, выбранные из

где замены сделаны в положениях, эквивалентных положениям в протеазе Cellulomonas 69B4, содержащей аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO:8. В дополнительных вариантах осуществления вариант сериновой протеазы содержит по меньшей мере две замены, выбранные из F1N, F1P,

R179N, R179S, R179T, R179V, R179W, R179Y, S187E, и S188E, где замены сделаны в положениях, эквивалентных положениям в протеазе Cellulomonas 69B4, содержащей аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO:8.

В некоторых дополнительных вариантах осуществления настоящее изобретение относится к варианту сериновой протеазы, где аминокислотная последовательность протеазы содержит по меньшей мере две замены, выбранные из

Y176P, G186S и S188A, где замены сделаны в положениях, эквивалентных положениям в протеазе Cellulomonas 69B4, содержащей аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO:8. В некоторых вариантах осуществления аминокислотная последовательность варианта сериновой протеазы содержит по меньшей мере две замены, выбранные из

S188V и P189S, где замены сделаны в положениях, эквивалентных положениям в протеазе Cellulomonas 69B4, содержащей аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO:8.

Настоящее изобретение дополнительно относится к варианту сериновой протеазы, где аминокислотная последовательность протеазы содержит по меньшей мере две замены, выбранные из F1T, T10N, R14D, R14G,

R123F, R123H, R123I, R123L, R123N, R123Q, R127A, R127Q, T129S, L142V, N145E, R159D, R159E, R159F, R159N, R159Q, N170D, N170Y, I172T, R179A, R179D, R179E, R179I, R179K, R179M, R179N, R179T, R179V, R179Y, I181L и G186N, где замены сделаны в положениях, эквивалентных положениям в протеазе Cellulomonas 69B4, содержащей аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO:8. В некоторых альтернативных вариантах осуществления аминокислотная последовательность протеазы содержит по меньшей мере две замены, выбранные из F1D, V3L, N7L, A8E, A8G, T10D,

T182V, T183E, T183I и S185N, где замены сделаны в положениях, эквивалентных положениям в протеазе Cellulomonas 69B4, содержащей аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 8. В некоторых дополнительных вариантах осуществления вариант сериновой протеазы содержит по меньшей мере две замены, выбранные из

и S187P, где замены сделаны в положениях, эквивалентных положениям в протеазе Cellulomonas 69B4, содержащей аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO:8.

В некоторых дополнительных вариантах осуществления аминокислотная последовательность варианта сериновой протеазы содержит по меньшей мере две замены, выбранные из F1T, A8D, A8G, T10E, T10L, T10Q, I11L, I11S, I11T, G12D, G12Y, R14E, R14L, R14N, R14P, S15E, R16A, R16G, R16I, R16N, N24L, N24S, V31F, R35A, A38D, A38F, A38N, A38V, A38Y, T40V, A41N, N42H, G49F, G49H, G49S, S51Q, S51T, G54A, G54L, G54M, N55F, R61H, R61K, R61M, R61S, R61T, A64N, A64S, A64T, A64V, A64W, G65R, G65V, V66D, N67F, N67K, N67M, N67Q, N67T, L69W, A70G, A70P, Q71D,

S185I, G186L, S187E, S187Q и S188Q, где замены сделаны в положениях, эквивалентных положениям в протеазе Cellulomonas 69B4, содержащей аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO:8. В некоторых предпочтительных вариантах осуществления аминокислотная последовательность варианта сериновой протеазы содержит по меньшей мере две замены, выбранные из A8R, A8S, A8T, A8V, R14E, R14L, R14M,

R179T, R179V, R179Y, M180D, T182V, T183I, G186E, G186V и S187P, где замены сделаны в положениях, эквивалентных положениям в протеазе Cellulomonas 69B4, содержащей аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 8. В некоторых дополнительных вариантах осуществления аминокислотная последовательность варианта сериновой протеазы содержит по меньшей мере две замены, выбранные из

G186T, S187E, S187T и S188E, где замены сделаны в положениях, эквивалентных положениям в протеазе Cellulomonas 69B4, содержащей аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO:8. В некоторых дополнительных вариантах осуществления аминокислотная последовательность варианта сериновой протеазы содержит по меньшей мере две замены, выбранные из:

T10A, T10G, T10L, I11A, I11S, I11T, G12I,

G186V, где замены сделаны в положениях, эквивалентных положениям в протеазе Cellulomonas 69B4, содержащей аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO:8.

Настоящее изобретение также относится к вариантам сериновых протеаз с улучшенной стабильностью по сравнению с протеазой Cellulomonas 69B4 дикого типа, содержащей аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO:8. В некоторых вариантах осуществления варианты обладают улучшенной термостабильностью по сравнению с протеазой Cellulomonas 69B4 дикого типа, содержащей аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO:8. В некоторых особенно предпочтительных вариантах осуществления варианты содержат несколько замен, выбранных из

где замены сделаны в положениях, эквивалентных положениям в протеазе Cellulomonas 69B4, содержащей аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO:8. В некоторых альтернативных вариантах осуществления варианты обладают улучшенной стабильностью в LAS по сравнению с протеазой Cellulomonas 69B4 дикого типа, содержащей аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO:8. В некоторых особенно предпочтительных вариантах осуществления варианты содержат несколько замен, выбранных из T121E/R123F/R159E,

R14M/S76N/A93G/R127Q/R159K/I181K, R14M/S76N/A93G/R127Y/R159K/I181K и R14M/S76N/G78D/A93G/R127K/R159K/I181K, где замены сделаны в положениях, эквивалентных положениям в протеазе Cellulomonas 69B4, содержащей аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO:8.

Настоящее изобретение также относится к вариантам сериновых протеаз с улучшенной активностью по сравнению с протеазой Cellulomonas 69B4 дикого типа, содержащей аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO:8. В некоторых предпочтительных вариантах осуществления варианты обладают улучшенной казеинолитической активностью по сравнению с протеазой Cellulomonas 69B4 дикого типа, содержащей аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO:8. В некоторых особенно предпочтительных вариантах осуществления варианты содержат несколько замен, выбранных из R14L/R79T, G12D/R35H/R159E, G12D/R35H/R123Q, G12D/R35H/R123F/R159E, G12D/R35H, G12D/R35E/R159E, G12D/R35E/R123Q/R159E, G12D/R35E/R123Q, G12D/R35E, G12D/R35D/R159E, G12D/R35D/R123Q/R159E, G12D/R35D, G12D/R159E, G12D/R14Q/R35H, G12D/R14I/R35H, 024E/G049A/A093H/R127K/A143N/R159K/I181Q, N24M/S76V/A93H/R127K/R159K, R14I/N24E/R35D/A64K/N67A/G78D/R123F/R159K/D184T R127A/R159K, R14I/G65Q и R14I/G65Q/R159K R14I/S76V, где замены сделаны в положениях, эквивалентных положениям в протеазе Cellulomonas 69B4, содержащей аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO:8. В некоторых альтернативных вариантах осуществления варианты обладают улучшенной кератинолитической активностью по сравнению с протеазой Cellulomonas 69B4 дикого типа, содержащей аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO:8. В некоторых особенно предпочтительных вариантах осуществления варианты содержат несколько замен, выбранных из

R14I/T36S/G65Q/R127A/R159K и R35F/R127A/R159K, где замены сделаны в положениях, эквивалентных положениям в протеазе Cellulomonas 69B4, содержащей аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO:8.

Настоящее изобретение также относится к вариантам сериновых протеаз с улучшенной активностью в отношении эффективности стирки по сравнению с протеазой Cellulomonas 69B4 дикого типа, содержащей аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO:8. В некоторых предпочтительных вариантах осуществления варианты содержат несколько замен, выбранных из

и R14M/S76N/G78D/A93G/R127K/R159K/I181K, где замены сделаны в положениях, эквивалентных положениям в протеазе Cellulomonas 69B4, содержащей аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO:8. В некоторых вариантах осуществления варианты обладают улучшенной активностью в отношении эффективности мытья посуды по сравнению с протеазой Cellulomonas 69B4 дикого типа, содержащей аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO:8. В некоторых предпочтительных вариантах осуществления варианты содержат несколько замен, выбранных из R14N/R127K/R159L, R14I/A64K/T86K/N112E/R123F/D184T, G12D/R35E/G63R/R79K/T109M, R14L, G12D/R35E и R14M/S76D/A93H/R127K/R159K/I181K, где замены сделаны в положениях, эквивалентных положениям в протеазе Cellulomonas 69B4, содержащей аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 8. В некоторых предпочтительных вариантах осуществления варианты обладают улучшенной активностью в отношении удаления загрязнений по сравнению с протеазой Cellulomonas 69B4 дикого типа, содержащей аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO:8. В некоторых предпочтительных вариантах осуществления варианты содержат несколько замен, выбранных из:

и R35F/R127A/R159K, где замены сделаны в положениях, эквивалентных положениям в протеазе Cellulomonas 69B4, содержащей аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO:8.

Настоящее изобретение также относится к вариантам сериновых протеаз по меньшей мере с одним измененным свойством поверхности по сравнению с протеазой Cellulomonas 69B4 дикого типа, содержащей аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO:8. В некоторых предпочтительных вариантах осуществления варианты содержат по меньшей мере две замены в участках выбранных из группы, состоящей из 1, 2, 4, 7, 8, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 22, 24, 25, 32, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 57, 59, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 71, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 95, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 123, 124, 126, 127, 128, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 137, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165, 166, 167, 168, 170, 171, 173, 174, 175, 176, 177, 178, 179, 180, 181, 182, 183 и 184, где замены сделаны в положениях, эквивалентных положениям в протеазе Cellulomonas 69B4, содержащей аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO:8.

В некоторых особенно предпочтительных вариантах осуществления варианты протеаз обладают по меньшей мере одним улучшенным свойством по сравнению с протеазой Cellulomonas 69B4 дикого типа, содержащей аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO:8. В некоторых особенно предпочтительных вариантах осуществления по меньшей мере одно улучшенное свойство выбрано из группы, состоящей из кислотостойкости, термостабильности, гидролиза казеина, гидролиза кератина, эффективности очистки и стабильности в LAS.

Настоящее изобретение также относится к экспрессирующим векторам, содержащим полинуклеотидную последовательность, кодирующую варианты сериновых протеаз с аминокислотной последовательностью, содержащей по меньшей мере две аминокислотные замены, где замены сделаны в положениях, эквивалентных положениям в протеазе Cellulomonas 69B4, содержащей аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO:8. Настоящее изобретение также относится к клеткам-хозяевам, содержащим по меньшей мере один экспрессирующий вектор. В некоторых предпочтительных вариантах осуществления клетка-хозяин представляет собой вид Bacillus, тогда как в некоторых других вариантах осуществления клетка-хозяин представляет собой вид Streptomyces, в некоторых других вариантах осуществления клетка-хозяин представляет собой вид Aspergillus, а в некоторых предпочтительных вариантах осуществления клетка-хозяин представляет собой вид Trichoderma. Настоящее изобретение также относится к вариантам сериновых протеаз, продуцируемых клетками-хозяевами.

Настоящее изобретение также относится к композициям, содержащим по меньшей мере часть вариантов сериновых протеаз с аминокислотной последовательностью, содержащей по меньшей мере две аминокислотные замены, где замены произведены в положениях, эквивалентных положениям в протеазе Cellulomonas 69B4, содержащей аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO:8, представленную в настоящем документе.

Настоящее изобретение также дополнительно относится к полинуклеотидным последовательностям, кодирующим варианты сериновых протеаз с аминокислотными последовательностями, содержащими по меньшей мере две аминокислотные замены, где замены сделаны в положениях, эквивалентных положениям в протеазе Cellulomonas 69B4, содержащей аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO:8. Настоящее изобретение дополнительно относится к экспрессирующим векторам, содержащим полинуклеотидную последовательность, кодирующую варианты сериновых протеаз с аминокислотной последовательностью, содержащей по меньшей мере две аминокислотные замены, где замены сделаны в положениях, эквивалентных положениям в протеазе Cellulomonas 69B4, содержащей аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO:8. Настоящее изобретение также относится к клеткам-хозяевам, содержащим по меньшей мере один экспрессирующий вектор. В некоторых предпочтительных вариантах осуществления клетка-хозяин представляет собой вид Bacillus, тогда как в некоторых других вариантах осуществления клетка-хозяин представляет собой вид Streptomyces, в некоторых других вариантах осуществления клетка-хозяин представляет собой вид Aspergillus, а в некоторых предпочтительных вариантах осуществления клетка-хозяин представляет собой вид Trichoderma. Настоящее изобретение также относится к вариантам сериновых протеаз, продуцируемых клетками-хозяевами.

Настоящее изобретение дополнительно относится к чистящим композициям, содержащим варианты сериновых протеаз с аминокислотными последовательностями, содержащими по меньшей мере две аминокислотные замены, где замены произведены в положениях, эквивалентных положениям в протеазе Cellulomonas 69B4, содержащей аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO:8. В некоторых предпочтительных вариантах осуществления чистящие композиции содержат по меньшей мере один вариант сериновой протеазы, где сериновая протеаза обладает иммунологической перекрестной реактивностью с сериновой протеазой, приведенной в SEQ ID NO:8. В некоторых предпочтительных вариантах осуществления замены произведены в положениях, эквивалентных положениям 1, 2, 3, 4, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 18, 19, 22, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 51, 52, 54, 55, 56, 57, 59, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 96, 99, 100, 101, 103, 104, 105, 107, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 121, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165, 166, 167, 168, 170, 171, 172, 175, 176, 177, 179, 180, 181, 182, 183, 184, 185, 186, 187, 188 и 189, в протеазе Cellulomonas 69B4, содержащей аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO:8. В некоторых предпочтительных вариантах осуществления чистящие композиции дополнительно содержат один или несколько дополнительных ферментов или производных ферментов, выбранных из группы, состоящей из протеаз, амилаз, липаз, маннаназ, пектиназ, кутиназ, оксидоредуктаз, гемицеллюлаз и целлюлаз.

Настоящее изобретение также относится к композициям, содержащим варианты сериновых протеаз с аминокислотными последовательностями, содержащими по меньшей мере две аминокислотные замены, где замены прозведены в положениях, эквивалентных положениям в протеазе Cellulomonas 69B4, содержащей аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO:8, и по меньшей мере один стабилизатор. В некоторых предпочтительных вариантах осуществления композиции представляют собой чистящие композиции. В некоторых особенно предпочтительных вариантах осуществления стабилизатор выбран из буры, глицерина и конкурентных ингибиторов. В некоторых дополнительных особенно предпочтительных вариантах осуществления конкурентные ингибиторы стабилизируют варианты сериновых протеаз относительно анионных поверхностно-активных веществ. В некоторых предпочтительных вариантах осуществления вариант сериновой протеазы представляет собой стабильный к автолизу вариант.

Настоящее изобретение также относится к чистящим композициям, содержащим по меньшей мере 0,0001 массового процента вариантов сериновых протеаз с аминокислотными последовательностями, содержащими по меньшей мере две аминокислотные замены, где замены произведены в положениях, эквивалентных положениям в протеазе Cellulomonas 69B4, содержащей аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO:8, и, необязательно, вспомогательный ингредиент. В некоторых предпочтительных вариантах осуществления композиции содержат приблизительно от 0,001 до приблизительно 0,5 массового процента по меньшей мере одного варианта сериновой протеазы. В некоторых предпочтительных вариантах осуществления композиции содержат приблизительно от 0,01 до приблизительно 0,1 массового процента сериновой протеазы. В некоторых дополнительных предпочтительных вариантах осуществления чистящие композиции содержат вспомогательный ингредиент. В некоторых дополнительных предпочтительных вариантах осуществления чистящие композиции содержат достаточное количество модификатора pH с получением композиции с точным значением pH приблизительно от 3 до приблизительно 5, где композиции по существу не содержат веществ, которые гидролизуют при pH приблизительно от 3 до приблизительно 5. В некоторых альтернативных предпочтительных вариантах осуществления чистящие композиции содержат вещества, содержащие поверхностно-активное вещество. В некоторых особенно предпочтительных вариантах осуществления поверхностно-активное вещество содержит поверхностно-активное вещество алкилсульфат натрия, которое содержит этиленоксидную группу.

Настоящее изобретение дополнительно относится к чистящим композициям, содержащим варианты сериновых протеаз с аминокислотными последовательностями, содержащими по меньшей мере две аминокислотные замены, где замены произведены в положениях, эквивалентных положениям в протеазе Cellulomonas 69B4, содержащей аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO:8, где чистящая композиция представляет собой жидкость. В некоторых альтернативных вариантах осуществления чистящая композиция представляет собой порошок, гранулированную или таблетированную композицию.

Настоящее изобретение дополнительно относится к чистящим композициям, содержащим варианты сериновых протеаз с аминокислотными последовательностями, содержащими по меньшей мере две аминокислотные замены, где замены произведены в положениях, эквивалентных положениям в протеазе Cellulomonas 69B4, содержащей аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO:8, где чистящие композиции дополнительно содержат источник пероксида водорода. В некоторых предпочтительных вариантах осуществления источник пероксида водорода содержит по меньшей мере одну персоль, где персоль представляет собой перборат щелочного металла, перкарбонат щелочного металла, перфосфат щелочного металла, персульфат щелочного металла или их смесь. В некоторых особенно предпочтительных вариантах осуществления чистящие композиции дополнительно содержат катализатор отбеливания, активатор отбеливания и/или их смеси.

Настоящее изобретение также относится к способам очистки, включающим в себя этапы: a) приведения поверхности и/или изделия, содержащего ткань, в контакт по меньшей мере с одной чистящей композицией по настоящему изобретению; и b) необязательно промывки и/или ополаскивания поверхности или вещества.

Настоящее изобретение также относится к кормам для животных, содержащим варианты сериновых протеаз с аминокислотными последовательностями, содержащими по меньшей мере две аминокислотные замены, где замены произведены в положениях, эквивалентных положениям в протеазе Cellulomonas 69B4, содержащей аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO:8.

Настоящее изобретение также относится к композициям для обработки тканей и кожи, содержащим варианты сериновых протеаз с аминокислотными последовательностями, содержащими по меньшей мере две аминокислотные замены, где замены произведены в положениях, эквивалентных положениям в протеазе Cellulomonas 69B4, содержащей аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO:8.

Настоящее изобретение также относится к средствам личной гигиены, содержащим варианты сериновых протеаз с аминокислотными последовательностями, содержащими по меньшей мере две аминокислотные замены, где замены произведены в положениях, эквивалентных положениям в протеазе Cellulomonas 69B4, содержащей аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO:8.

ОПИСАНИЕ РИСУНКОВ

На фигуре 1 представлена карта плазмиды pHPLT-ASP-C1-2.

На фигуре 2 представлена карта плазмиды pXX-KpnI.

На фигуре 3 представлена карта плазмиды pHPLT.

На фигуре 4 представлена карта плазмиды pUC18.

На фигуре 5 представлена карта плазмиды pUC18-ASP

На фигуре 6 представлена таблица, демонстрирующая результаты тестов на терготометре, проводимых в отсутствие буфера HEPES (дозировка фермента составляла 0,55 м.д.).

На фигуре 7 представлена таблица, демонстрирующая результаты тестов на терготометре, проводимых в присутствии буфера HEPES (дозировка фермента составляла 0,55 м.д.).

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение относится к новым сериновым протеазам видов Micrococcineae с множественными заменами. В частности, настоящее изобретение относится к сериновым протеазам с множественными заменами, ДНК, кодирующим эти протеазы, векторам, содержащим ДНК, кодирующие протеазы, клеткам-хозяевам, трансформированным ДНК-содержащим вектором и продуцируемым клетками-хозяевами ферментам. Настоящее изобретение также относится к чистящим композициям (например, детергентным композициям), композициям кормов для животных и композициям для обработки тканей и кожи, содержащим эти варианты сериновых протеаз. В особенно предпочтительных вариантах осуществления настоящее изобретение относится к мутантным протеазам (т.е. вариантам протеаз), полученным из протеаз дикого типа, описываемых в настоящем документе. Эти варианты протеаз также находят применение в многочисленных приложениях.

Настоящее изобретение относится к вариантам протеазных ферментов с множественными заменами. Важно, что эти варианты ферментов обладают хорошей стабильностью и протеолитической активностью. Эти варианты ферментов находят применение в различных приложениях, включая в качестве неограничивающих примеров, чистящие композиции, корм для животных, обработку тканей и т.д. Настоящее изобретение также относится к способам получения этих ферментов. В некоторых предпочтительных вариантах осуществления варианты протеаз по настоящему изобретению находятся в чистой или относительно чистой форме.

Настоящее изобретение также относится к нуклеотидным последовательностям, подходящим для получения вариантов протеаз по настоящему изобретению в рекомбинантных организмах. В некоторых вариантах осуществления рекомбинантная продукция предоставляет способы получения вариантов протеаз в рентабельных количествах.

Если не указано иначе, практическое осуществление настоящего изобретения включает общепринятые способы, общеупотребительные в молекулярной биологии, микробиологии и рекомбинантной ДНК, которые известны специалистам в данной области. Такие способы известны специалистам в данной области и описаны в многочисленных руководствах и справочниках (см., например, Sambrook et al., "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", Second Edition (Cold Spring Harbor), [1989]); и Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology" [1987]). Все указанные в настоящем документе патенты, патентные заявки, статьи и публикации, выше и ниже, таким образом, явно включены в настоящий документ в качестве ссылки.

Если в настоящем документе не определено иначе, все технические и научные термины, используемые в настоящем документе, имеют то же значение, как обычно понимает специалист в области, к которой принадлежит настоящее изобретение. Например, в Singleton and Sainsbury, Dictionary of Microbiology and Molecular Biology, 2d Ed., John Wiley and Sons, NY (1994); и Hale and Marham, The Harper Collins Dictionary of Biology, Harper Perennial, NY (1991) специалистам в данной области представлены общие словари многих терминов, используемых в данном изобретении. Хотя в практическом осуществлении настоящего изобретения находят применение любые способы и материалы, подобные или эквивалентные способам и материалам, описываемым в настоящем документе, предпочтительные способы и материалы описаны в настоящем документе. Таким образом, определенные непосредственно ниже термины более полно описаны по отношению к спецификации в целом. Также, как применяют в настоящем документе, если в контексте явно не указано иначе, форма единственного числа включает указание на множественное число. Числовые диапазоны являются включающими в себя числа, определяющие диапазон. Если не указано иначе, нуклеиновые кислоты записывают слева направо в направлении от 5' к 3'; аминокислотные последовательности записывают слева направо в направлении от N-конца к С-концу, соответственно. Следует понимать, что данное изобретение не ограничено конкретными описанными способами, протоколами и реагентами, так как они в зависимости от ситуации, в которой их используют специалисты в данной области, могут варьировать.

Если не указано иначе, в практическом осуществлении настоящего изобретения, применяют общепринятые способы очистки белков, молекулярной биологии, микробиологии, способы рекомбинантной ДНК и секвенирования белков, которые все известны специалистам в данной области.

Кроме того, представленные в настоящем документе заголовки не являются ограничением различных аспектов или вариантов осуществления изобретения, которые могут иметь отношение к спецификации в целом. Таким образом, определенные непосредственно ниже термины более полно определены по отношению к спецификации в целом. Тем не менее, для облегчения понимания изобретения, ниже определен ряд терминов. Дополнительные определения представлены в патентной заявке США с серийным № 10/576331, которая в полном объеме включена в качестве ссылки.

I. Определения

Как применяют в настоящем документе, термины "протеазная" и "протеолитическая активность" относятся к белку или пептиду, демонстрирующему способность гидролизовать пептиды или субстраты с пептидными связями. Существует множество хорошо известных способов измерения протеолитической активности (Kalisz, "Microbial Proteinases", In: Fiechter (ed.), Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology. [1988]). Например, протеолитическую активность можно определять посредством сравнительных анализов, в которых анализируют способность соответствующих протеаз гидролизовать коммерческий субстрат. Иллюстративные субстраты, пригодные для анализа протеазной или протеолитической активности,