Полифункциональное средство для растениеводства

Полифункциональное средство для растениеводства

Реферат

Изобретение относится к биотехнологии и сельскому хозяйству и касается нового штамма споровых бактерий р. Bacillus в качестве средства для повышения продуктивности растений, их защиты от фитопатогенных микроорганизмов, улучшения фосфорного питания и биоремедиации почв.

Современное высокоэффективное сельскохозяйственное производство невозможно без применения удобрений и средств защиты растений.

В настоящее время известно множество микробиологических препаратов для сельского хозяйства различного назначения.

Известны способы повышения плодородия почвы, заключающиеся во внесении в нее вместе с семенами или отдельно от них бактериальных удобрений, способствующих переведению содержащихся в почве питательных веществ в усвояемую для растений форму. Однако эти способы не предусматривают минерализации сложных фосфорорганических соединений.

Известен «Способ получения фосфоробактерина», Авт. св. СССР №97943 (заявка №447504 с пр. 26.01.1952 г.), МКИ⁴ класс 16, 14; автор Менкина Р.А.

В способе бактерии выращивают на картофельной среде, высушивают и смешивают с порошкообразным каолином, служащим субстратом для сохранения спор высушенных бактерий. При использовании фосфоробактерина под его воздействием происходит минерализация сложных фосфорорганических соединений, что приводит к повышению плодородия почвы.

В указанном способе для получения фосфоробактерина был использован штамм бактерий Bacillus megaterium subsp. phosphaticum 49, депонированный во ВНИИСХМ под номером В-318 (указан в «Каталоге культур микроорганизмов Всероссийской коллекции непатогенных микроорганизмов сельскохозяйственного назначения». ВНИИСХМ, Санкт-Петербург - Пушкин, 2010, с.67), который в 2012 г. был перерегистрирован под номером RCAM 00961.

В 1998 г. штамм Bacillus megaterium subsp. phosphaticum 49 институтом ВНИИСХМ был передан Институту микробиологии в Москве, где он значится в Каталоге микроорганизмов Института ИНМИ под рег. номером В-847.

Штамм бактерий Bacillus megaterium subsp. phosphaticum 49 выбран за прототип (Справка о депонировании RCAM 00961 (ранее В-318) прилагается).

Известен также «Способ производства жидкого фосфоробактерина» по Авторскому свидетельству СССР №104997 с приоритетом 14.09.1955 г., МКИ⁴ класс 16, 14, авторы: Чернов А.В., Емельянова А.А. и Доросинский Л.М.

В существующем способе приготовления жидкого фосфоробактерина обязательные компоненты, входящие в состав питательных сред; нуклеинат натрия, дрожжевой автолизат и сахар, являются весьма дефицитными и дорогостоящими материалами, что является серьезным затруднением для массового промышленного производства фосфоробактерина.

Согласно изобретению в способе производства жидкого фосфоробактерина, нуклеинат натрия, дрожжевой автолизат и сахар заменены кукурузно-пшеничным экстрактом с добавлением мелассы.

Также известен «Способ производства сухого фосфоробактерина» по Авторскому свидетельству СССР №112231 с приоритетом от 05.07.1957 г. МКИ⁴ класс 16, 14; авторы: Чернов А.В., Худяков Я.П., Бальшин Р.В.

В указанном способе жидкий фосфоробактерин, получаемый по методу глубинного выращивания микроорганизмов, подвергают сепарированию, в результате чего получают густую массу в виде пасты с влажностью 50-60% с высоким содержанием титра фосфорных бактерий, которую затем сублимируют при 20-25°С, после чего подсушивают при 30-32°С до содержания остаточной влажности комочного продукта 3-3,5% с последующей расфасовкой в герметичную тару. Остаточная влажность обеспечивает сохранность титра фосфорных бактерий при длительном (не менее года) хранении препарата.

Известен также Патент РФ №2327737 на изобретение «Штамм бактерий Bacillus megaterium, мобилизующий фосфор и кремний из объектов литосферы и устойчивый к полигексаметиленгуанидину», МКИ C12N 1/20, C05F 11/08, C12R 1/11, опубликовано 27.06.2008 г.

Изобретение относится к сельскохозяйственной микробиологии и геохимии. Штамм Bacillus megaterium var. phosphaticum BKM В-2357Д способен выщелачивать фосфор и кремний из объектов литосферы и устойчив к полигексаметиленгуанидину. Штамм перспективен для получения бактериального препарата, повышающего приживаемость в почве и урожайность сельскохозяйственных культур, для рекультивации техногенно загрязненных земель, а также в биотехнологических работах в области геохимии.

Известен также Патент РФ №2322061 на изобретение «Биопрепарат для повышения урожайности сельскохозяйственных культур и улучшения качества продукции», МКИ A01N 63/00, C12N 1/20, опубл. 20.04.2008.

Изобретение относится к биотехнологии, в частности, к биопрепаратам эффективных микроорганизмов (ЭМ) для растениеводства и которые могут быть использованы для осенней, весенней и летней обработок почвы, корневой и внекорневой подкормок в период вегетации растений, а также предпосевной обработки семян. Биопрепарат состоит из смеси суспензий следующих штаммов, депонированных в ВКПМ: Agrobacterium tumefaciens B-4116, Agrobacterium radiobacter B-956, Azotobacter chroococcum B-2375, Bacillus thurengiensis B-2918, Bacillus subtillis B-6554, Bacillus subtillis B-4419, Bacillus megaterium B-4440, Bacillus megaterium B-200, Bradyrhizobium japonicum B-1978, Ervinia ananas B-5292, Lactobacillus casei B-3961, Pseudomonas fluorescens B-1138, Rhodopseudomonas palustris B-1620. Изобретение позволяет восстановить плодородие почвы и улучшить ее структуру; увеличить всхожесть семян; укрепить иммунную систему растений, повысить сопротивляемость болезням и вредителям, что значительно увеличивает урожайность и высокое качество получаемого продовольствия.

Известны также зарубежные публикации, в которых описано использование бактерий вида Bacillus megaterium в качестве средства стимуляции роста растений и/или их корней (как, например, в патенте KR 20100963774 В1 от 14.06.2010 г. на штамм Bacillus megaterium KNUC 251 или в заявке на патент США №20130014434, опубликованной 17.01.2013 г., в которой питательная композиция для корней пересаживаемого растения содержит в числе других микроорганизмов бактерии Bacillus megaterium) или в качестве средства для борьбы с болезнями растений (например, в патенте US 054035830, опубликованном 04.04.1995 г. на штамм Bacillus megaterium ATCC 55000 в качестве средства биологической борьбы с заболеваниями сои, вызванных грибом Rhizoctonia Solani).

Однако все известные, в том числе перечисленные выше, штаммы бактерий вида Bacillus megaterium обладают одной или двумя полезными свойствами (стимуляцией роста или улучшения фосфорного питания растений, или защиты от болезнетворных грибов) и не могут быть использованы в растениеводстве в качестве средства для решения комплексной задачи: ростостимулирования, повышения продуктивности растений, их защиты от фитопатогенных микроорганизмов, улучшения фосфорного питания за счет способности мобилизации фосфора из труднодоступных соединений кальция, а также биоремедиации почв, загрязненных пестицидами.

Задачей изобретения является выявление нового штамма бактерий вида Bacillus megaterium, пригодного для использования в сельском хозяйстве и обладающего полифункциональными свойствами: ростостимулирования, повышения продуктивности растений, их защиты от фитопатогенных микроорганизмов, улучшения фосфорного питания за счет способности мобилизации фосфора из труднодоступных соединений кальция, а также биоремедиации почв, загрязненных пестицидами.

Указанная задача решается за счет того, что в качестве полифункционального средства для сельского хозяйства, обладающего ростостимулирующим эффектом растений, улучшающего их фосфорное питание, способствующего повышению их продуктивности, защиты от грибных болезней, а также способствующего биоремедиации почв, загрязненных пестицидами, используют новый штамм споровых бактерий Bacillus megaterium 501 GR.

Штамм споровых бактерий Bacillus megaterium 501 GR был выделен из чернозема обыкновенного среднесуглинистого, занятого яровой пшеницей (Республика Казахстан, Кокчетавская область).

Почвенную суспензию после пастеризации при температуре 80°С высевали на мясо-пептонный агар (МПА). Из выросших на МПА колоний бактерий делали пересевы для получения чистой культуры микроорганизмов, которую хранят на МПА или минеральной среде следующего состава, г/л:

Сахароза	- 10,0
NH4NO3	- 0,5
K2HPO4	- 1,6
KH2PO4	- 0,4
MgSO4	- 0,2
CaCl2	- 0,05 мг
FeSO4	- 0,05 мг
дрожжевой экстракт	- 0,2 г
рН	- 6,8-7,0

Идентификацию бактерий проводили по Определителю Берги.

Культуру Bacillus megaterium выращивали на качалках при скорости вращения 140 об/мин в течение 48 часов.

Штамм споровых бактерий Bacillus megaterium 501 GR был депонирован 09.11.2011 г. в «Ведомственной коллекции полезных микроорганизмов сельскохозяйственного назначения Россельхозакадемии» под регистрационным номером RCAM 00875 (Справка о депонировании RCAM 00875 прилагается).

Штамм бактерий Bacillus megaterium 501 GR характеризуется следующими морфолого-культуральными и физиолого-биохимическими признаками.

Бактерии Bacillus megaterium 501 GR представляют собой неподвижные палочки размером (1,8-2,0)×(4,0-6,0) мкм. Образуют цепочки различной длины. Колонии на МПА размером 3-10 мм, молодые круглые блестящие, по мере старения - складчатые светло-серого цвета. Окраска по Граму - положительная. Образуют эндоспоры, расположенные в средине клетки. Споры выдерживают пастеризацию в течение 10 мин при температуре 80°С. Рост на мясо-пептонном бульоне обильный, в старой культуре осадок в виде хлопьев. Рост на ломтиках картофеля обильный в виде слизистой пленки, цвет светло-серый, поверхность блестящая, складчатая. Рост наблюдается в интервале температур +(4-40)°С, оптимум роста - при +(30-37)°С. Оптимальная кислотность среды при pH 6,8-7,4. Аэроб.

Бактерии разжижают желатин, гидролизуют крахмал, проявляют каталазную и уреазную активность. Целлюлозу не гидролизуют. Сероводород, индол и аммиак не образуют. При потреблении цитрата подщелачивает среду. Растут при 4% концентрации NaCl. В качестве источника углерода используют различные сахара, спирты и органические кислоты.

Солеустойчивость бактерий по градиенту концентраций 2, 4, 8, 16% изучали в жидкой минеральной среде Александера (K₂HPO₄ - 0,16; KH₂PO₄ - 0,04; NH₄NO₃ - 0,05; MgSO₄ - 0,02; СаСО₃ - 0,005; FeSO - 0,05, дрожжевой экстракт - 0,02, сахароза - 1,0%).

Были проведены микровегетационные опыты по влиянию штамма бактерий Bacillus megaterium 501 GR на стимуляцию роста и повышение продуктивности растений - овощных и зеленных культур.

Влияние бактерий штамм Bacillus megaterium 501 GR на прорастание семян растений и формирование корневой системы проводили по методу, описанному в Л [Разумовская В.Г., Чижик Г.Я., Громов Б.В. Лабораторные занятия по почвенной микробиологии. Л.: Изд. Ленингр. университета, 1960 г., 178 с.].

Для изучения влияния штамма Bacillus megaterium 501 GR на рост и накопление биомассы овощных и зеленных культур использовали глиняные сосуды объемом 1,0 л. В опытах использовали дерново-подзолистую почву, смешанную в пропорции 1:1 с произвесткованным торфом. pH_KCl смеси - 6,8.

Состав питательной среды (%): меласса - 2; NaNO₃ - 0,3; KH₂PO₄ - 0,1; MgSO₄ - 0,02; pH - 7-7,5. Возраст культуры - 5 суток, исходный титр - 0,5·10⁹ КОЕ/мл. Статистическую оценку количественных результатов исследований проводили по Л [Доспехов Б.А. 1985 г. Методика полевого опыта, Москва, «Колос», с.336]. Результаты опытов представлены в таблице 1.

Таблица 1
Влияние штамма Вас.megaterium 501 GR на овощные и зеленные культуры
Вариант опыта	Длина корня, мм
Кресс-салат	Огурец	Томат
Контроль (вода)	40	106	7,4
К.ж./вода (1:1)	0	16	0
К.ж./вода (1:5)	10	100	6,4
К.ж./вода (1:25)	58	150	15
К.ж./вода (1:125)	90	130	13

Из таблицы 1 видно, что штамм бактерий Bacillus megaterium 501 GR даже при разведении в 5 раз ингибирует рост корней. При разведении в 25 и 125 раз наблюдается стимулирующий эффект. Длина корней возрастает в 1,5-2,0 раза. Наилучший результат получен на кресс-салате и огурцах. Полученные данные позволяют сделать заключение о том, что этот штамм активно продуцирует физиологически активные вещества, стимулирующие рост растений.

При выращивании рассады пекинской капусты в условиях вегетационного опыта, где жидкая культура бактерий Bacillus megaterium 501 GR с исходным титром бактерий - 0,3·10⁹ КОЕ/мл вносилась в почву из расчета 20 мл на 0,5 кг, измерения проводили через 1 месяц после посадки рассады. Результаты опыта приведены в таблице 2.

Таблица 2
Влияние штамма Bacillus megaterium 501 GR на рост рассады пекинской капусты
Вариант опыта	масса 10 растений, г
без NPK	+NPK
Контроль (вода)	56	93
Bacillus megaterium 501 GR	81	149

Из таблицы 2 видно, что урожай зеленой массы пекинской капусты возрос на 40-60%. Наибольшая эффективность наблюдалась в варианте опыта с полным минеральным удобрением (NPK).

В опыте с сельдереем жидкая культура Bacillus megaterium 501 GR с исходным титром бактерий - 10⁸ КОЕ/мл, разведенной в 5 раз, вносилась в почву при дозе 200 мл/кг при посеве семян и через 2 недели после посева. Измерения проводили через 2 месяца. Результаты опыта приведены в таблице 4.

Таблица 3
Влияние штамма Bacillus megaterium 501 GR на урожай зеленой массы сельдерея
	Масса 1-го растения, г	% к контролю
Контроль	31	100
Припосевная обработка	51	165
Обработка через 2 недели после посева	74	239

В обоих вариантах опыта в зависимости от способа обработки культуральной жидкостью урожай зеленой массы сельдерея увеличился на 165-239%. Причем обработка почвы через 2 недели после посева была более эффективна

Воздействие ростостимулирующего эффекта штамма на прорастание ряда овощных культур и формирование корневой системы растений в зависимости от концентрации бактерий Bacillus megaterium 501 GR, была проверена опытным путем. Семена растений замачивали в культуральной жидкости с титром бактерий 0,3·10⁸, разведенной водой в соотношении 1/10, 1/50, 1/250, и помещали в холодильник, где выдерживали при +6°С в течение 14-16 час. После этого семена проращивали при +(22-24)°С. Измерения длины корней и ростков проводили на 3-4 сутки. Для проростков пшеницы с мочковатой корневой системой учитывали суммарную длину корней. Результаты опытов приведены в таблице 4.

Таблица 4
Влияние Bacillus megaterium 501 GR на проростки растений
Варианты опыта	Длина
Росток	Корень
мм	% к контролю	мм	% к контролю
Кресс-салат
контроль (вода)	18,1	100	47	100,0
к.ж./вода - 1/10	25,8	132,5	64,4	137,0
к.ж./вода - .1/50	22,4	123,8	67,8	144,3
к.ж./вода - 1/250	21,5	118,8	57,1	121,4
Пшеница
контроль (вода)	26,9	100	142	100,0
к.ж./вода - 1/10	33,3	123,8	169,1	119,1
к.ж./вода - .1/50	34,3	126,5	186,2	131,1
к.ж./вода - 1/250	33,7	125,3	171,4	120,7
Огурец
контроль (вода)	9,5	100	50	100,0
к.ж./вода - 1/10	13	136,8	55,1	110,2
к.ж./вода - .1/50	16,6	174,7	61,5	123
к.ж./вода - 1/250	13	136,8	52,6	105,5
Редис
контроль (вода)	7,9	100	36,25	100,0
к.ж./вода - 1/10	8,6	109	31,7	87,4
к.ж./вода - .1/50	9,9	125	54,3	149,8
к.ж./вода - 1/250	10,7	134,4	39,4	108,7
Салат
контроль (вода)	16,1	100	33,5	100,0
к.ж./вода - 1/10	18,1	112,4	32,1	95,8
к.ж./вода - .1/50	22,3	138,5	35	104,5

Как видно из таблицы 4, обработка семян культуральной жидкостью бактерий штамма Bacillus megaterium 501 GR, оказывает положительное действие на их прорастание. Наибольший эффект был получен при замачивании семян в культуральной жидкости, разведенной в 50 раз. При этом после обработки семян культуральной жидкостью Bacillus megaterium 501 GR наблюдалось более интенсивное формирование боковых корешков у всех тестируемых растений, что и обусловливает лучшие условия их развития.

Следовательно, результаты опыта на большой группе сельскохозяйственных культур позволяют сделать заключение, что бактерии Bacillus megaterium 501 GR, продуцируют физиологически-активные вещества, стимулирующие рост, и развитие растений.

Была проверена опытным путем антагонистическая активность штамма бактерий Bacillus megaterium 501 GR по отношению к фитопатогенным грибам. Для этого был проведен скрининг (методом лунок) и дана оценка антагонизма Bacillus megaterium 501 GR по отношению к ряду фитопатогенных грибов. Было установлено, что бактерии оказывают избирательное действие на микромицеты: ингибируют рост мицелия Penicillium rubrum, Monilia laxa, Fusarium solani, но не оказывают отрицательного влияния на штаммы Alternaria alternata и Fusarium oxysporum.

Вместе с тем отмечено, что культура Bacillus megaterium 501 GR не оказывая существенного влияния на рост мицелия Trichoderma viride, подавляет его спорообразования, что важно при формировании фитопатогенного потенциала почвы и делает возможным их использование для биоконтроля ряда заболеваний растений.

Был проведен ряд лабораторных опытов по проверке способности культуры Bacillus megaterium 501 GR лизировать мицелий Fusarium culmorum.

Исследования миколитической активности бактерий проводили на жидких и агаризованных питательных средах по методу агаровых блоков, описанному Сеги [И. Сеги Методы почвенной микробиологии. М.: «Колос», 1983, с.296]. В качестве тест культур использовали грибы рода Fusarium и пекарские дрожжи Sacharomice scerevisiae.

Культуру Fusarium culmorum выращивали 7 суток в стационарных условиях в жидкой минеральной среде следующего состава: (г/л): K₂HPO₄ - 1,6; KH₂PO₄ - 0,4; NH₄NO₃ - 0,5; MgSO₄ - 0,2; CaCl₂ - 0,02; FeCl₂ - 0,02; дрожжевой экстракт - 0,2; сахароза - 10. pH - 6,8-7,0. После этого из колбы сливали культуральную жидкость, сформировавшуюся пленку гриба осторожно промывали той же средой и инокулировали Bacillus megaterium 501 GR. Через 7 суток после инокуляции происходил распад мицелия гриба и гомогенизация его в питательной среде. Сухой вес мицелия в опытном варианте был на 30% ниже контроля.

Аналогичные результаты получены на агаризованной среде того же состава. В этом случае агаризованную питательную среду засевали культурой грибов и спустя 3-5 суток на поверхность выросшего мицелия наносили культуру бактерий Bacillus megaterium 501 GR, наблюдая их рост и лизис грибного мицелия в течение 2-3 недель.

Такая же картина наблюдалась в опытах на дрожжевой среде (пекарские дрожжи Sacharomices cerevisiae), инокулированной Bacillus megaterium 501 GR

Таким образом, исследования, где в качестве тест культур были использованы грибы рода Fusarium и дрожжи, богатые хитином, позволяют сделать заключение, что Bacillus megaterium 501 GR, способен разрушать хитиновый каркас клеточных стенок, продуцируя соответствующие экзоферменты. Это говорит о возможности их использования для профилактики и лечения грибных заболеваний (инфекций) сельскохозяйственных культур.

Были проведены также опыты, оценивающие способность бактерий штамма Bacillus megaterium 501 GR мобилизировать фосфор из труднодоступных соединений кальция путем растворения (солюбилизирования) недоступные для растений фосфаты кальция - Са₃(PO₄)₂. Их проводили по методике Л [Муромцев Г.С. Методы изучения растворения фосфатов кальция микроорганизмами // Микробиология, 1957, т.26, №2, С 172-178] на агаризованной минеральной среде.

Результаты опытов на двух питательных средах показали, что Bacillus megaterium 501 GR в процессе своей жизнедеятельности активно растворяет трехкальциевые фосфаты и переводит их в легкодоступные формы. Последнее характеризует его как активного агента, который может играть существенное значение для повышения эффективности фосфорного питания растений на карбонатных почвах, где имеются существенные запасы фосфора в виде фосфатов кальция. Т.е. была подтверждена активность штамма Bacillus megaterium 501 GR в процессе мобилизации фосфора из труднодоступных соединений кальция.

Известно, что в солонцеватых почвах широкое распространение получили споровые формы бактерий. Была дана оценка роста бактерий Bacillus megaterium 501 GR на питательных средах по градиенту концентрации NaCl. Результаты опыта показали, что при концентрации соли 4% численность бактерий была ниже контроля на 3 порядка, при концентрации выше 8% - рост бактерий практически отсутствовал. Вместе с тем отмечен хороший рост Bacillus megaterium 501 GR, сопоставимый с контролем, при концентрации NaCl 2%, однако при этом наблюдалась задержка спорообразования.

Полученные результаты подтверждают возможность использования бактерий штамма Bacillus megaterium 501 GR в системе фитомелиоративных мероприятий по восстановлению плодородия засоленных почв и, возможно, повышению продуктивности кормовых культур на солонцах.

Начиная с середины 20 века, для борьбы с вредителями с/х культур и сорняками широко применяются химические средств защиты растений. Производство их в настоящее время достигает более 2 млн.т. в год. Среди инсектицидов, используемых для борьбы с вредными насекомыми, одно из ведущих мест занимают органические соединения фосфора. По масштабам применения в сельском хозяйстве они занимают первое место среди пестицидов различных классов, и их мировое производство приближается к 200 тыс.т. в год.

В настоящее время в сельском хозяйстве используется более 200 фосфорорганических соединений. Хорошо известно, что многолетнее массированное применение пестицидов вызвало ряд проблем санитарно-гигиенического и экологического характера. Многие из них отнюдь небезопасны для человека и животных. В частности, некоторые органические соединения фосфора входят в состав боевых отравляющих веществ (люизит, адамсит). Поэтому весьма актуальными являются вопросы безопасности использования пестицидов и их детоксикации в окружающей среде.

Известно, что некоторые штаммы Bacillus megaterium разлагают такие органические соединения фосфора как инозитфосфат, лецитин, фитин, дезоксирибонуклеиновая кислота (ДНК).

В связи с этим в серии лабораторных опытов была проведена оценка способности выделенного штамма Bacillus megaterium 501 GR, разлагать некоторые фосфорорганичские инсектициды. В качестве тест объектов были использованы следующие препараты (50% смачивающийся порошок): актеллик (O,O-Диметил-О-(2-диэтиламино-6-метилпиримидил-4)тиофосфат), базудин (O,O-Диэтил-O-(2изопропип)-4-метилипиримидил-6)тиофосфат), волатон (O,O-Диэтилтиофосфорил)-2-цианобезальдоксим), гардона (O,O-Диметил)-O-(1-(2,4,5-трихлорфенил)-2-хлорэтенил)фосфат), которые в настоящее время широко применяются в практике сельского хозяйства.

Инсектициды вносили в питательную среду (K₂HPO₄ - 1,6; KH₂PO₄ - 0,4; NH₄NO₃ - 0,5; MgSO₄ - 0,2; CaCl₂ - 0,02; FeCl₂ - 0,02; дрожжевой экстракт - 0,2; сахароза - 10%; pH 6,8-7,0; вода водопроводная - 1 л), инкулировали суспензией Bacillus megaterium 501 GR и культивировали в течение 7 суток при температуре 26°С в стационарных условиях.

Результаты опытов представлены в таблице 5.

Таблица 5
Деградация фосфорорганических инсектицидов в культуре Bacillus megaterium 501 GR
Наименование инсектицида	Вариант опыта	Содержание инсектицида, мг/л	Разложилось, % от исходного
исходное	через 7 суток
актеллик	контроль	16,24	14,25	12,2
Bac.m. 501 GR		14,11	13,1
валатон	контроль	45,84	31,75	30,7
Bac.m. 501 GR		22,41	51,1
базудин	контроль	19,5	17,54	10,0
	Bac.m. 501 GR		1,57	91,9
гардона	контроль	38,52	36,54	5,1
	Bac.m. 501 GR		0,92	97,6
гардона	контроль	20,92	20,13	3,7
	Bac.m. 501 GR		9,21	55,9
гардона	контроль	24,76	22,57	8,8
	Bac.m. 501 GR		1,43	94,2
гардона	контроль	68,34	50,56	26,0
	Bac.m. 501 GR		0,00	100,0

Из таблицы 5 видно, что через 7 суток все фосфорорганические инсектициды разложились в культуре Bacillus megaterium 501 GR. Наиболее эффективно идет разложение гардоны и базудина, меньше - волатона.

Таким образом, в результате опытов показано, что Bacillus megaterium 501 GR способен разлагать как природные, так и синтетические органические соединения фосфора. Это позволяет сделать заключение о том, что он может быть использован для повышения эффективности фосфорного питания растений, биоремедиации загрязненных пестицидами почв, а также в технологиях утилизации вышедших из употребления или запрещенных для применения фосфорорганических инсектицидов.

Были проведены опыты по влиянию бактерий Bacillus megaterium 501 GR на разложение гербицидов прометрина и атразина в почве.

В опытах препарат гербицида (прометрин или атразин) (50% с.п.) разводили в 50 мл воды, смешивали с 0,5 кг почвы (дерново-подзолистой), которую помещали в стеклянную посуду(или керамический горшок) емкостью 0,5 л. Через сутки вносили 10 мл культуральной жидкости бактерий Bacillus megaterium 501 GR с титром 0,5·10⁹ KOE/мл, тщательно перемешивали и инкубировали в термостате при 26°С. Влажность почвы составляла 60% от полной влагоемкости. Через некоторое время после инкубации (через 2 недели - прометрин, через 3 недели - атразин) гербицид экстрагировали из почвы ацетоном и определяли его концентрацию методом газожидкостной хроматографии, описанным в Л [Под ред. Клисенко М.А. Методы определения микроколичеств пестицидов в продуктах питания, кормах и внешней среде (Справочное издание). М.: Колос, 1983, 304 с.] Результаты опытов представлены в таблицах 6, 7.

Таблица 6
Эффективность разложения гербицида прометрина в почве бактериями Bacillus megaterium 501 GR
Вариант опыта	Разложено прометрина* через 2 недели
мг/кг	% от исходного
Почва(контроль)	1,5	7,6
Почва + В.megaterium 501 GR	16,6	84,3
*исходная концентрация прометрина - 19,7 мг/кг почвы.

Таблица 7
Эффективность разложения гербицида атразина в почве бактериями Bacillus megaterium 501 GR
Вариант опыта	Разложено атразина* через 3 недели
мг/кг	% от исходного
Почва(контроль)	4,6	30,6
Почва + В.megaterium 501 GR	11,4	76,0
*исходная концентрация атразина - 15,0 мг/кг почвы.

Как видно из таблиц 6 и 7, в обработанной культуральной жидкостью бактерий Bacillus megaterium 501 GR почве, содержание гербицида атразина снизилось по сравнению с контролем в 2,5 раза, а прометрина - в 11 раз, что позволяет сделать вывод об эффективности Bacillus megaterium 501 GR в деградации этих гербицидов.

Кроме того, результаты опытов показали, что Bacillus megaterium 501 GR активно разлагает гербициды прометрин и атразин в различных типах почвы: черноземе обыкновенном, дерново-подзолистой, в торфяном субстрате, при начальной нагрузке бактерий около 10⁷ KOE на г почвы и является перспективным для использования в биотехнологиях биоремедиации почв, загрязненных гербицидами производными симтриазина (прометрином и атразином).

Таким образом, штамм Bacillus megaterium 501 GR, обладая высокой ферментативной активностью, стимулирует рост и развитие сельскохозяйственных растений, повышает их продуктивность, устойчивость к NaCl, способен мобилизировать труднодоступные фосфаты почвы и повышать эффективность фосфорного питания растений, способен разлагать ряд фосфорорганических пестицидов, а также гербициды производные симтриазина, ингибирует рост некоторых фитопатогенных грибов - возбудителей корневых гнилей (миколитическая активность), что позволяет отнести этот штамм к микроорганизмам полифункционального действия. Эти свойства штамма бактерий Bacillus megaterium 501 GR предопределяют возможности его использования для практических целей, в том числе в системе фитомелиоративных мероприятий по восстановлению плодородия даже засоленных почв.

Результаты исследований позволяют сделать вывод, что выявленный штамм бактерий Bacillus megaterium 501 GR является перспективным для разработки на его основе полифункционального биопрепарата для стимулирования роста растений, повышения их продуктивности, повышения эффективности фосфорного питания, защиты от фитопатогенных микроорганизмов, а также для деградации некоторых фосфорорганических инсектицидов и гербицидов в окружающей среде.

При этом титр (количество жизнеспособных клеток и спор) бактерий штамма Bacillus megaterium 501 GR в составе различных биопрепаратов для их эффективного использования должен составлять не менее 10⁸ КОЕ/мл.

Пример получения биопрепарата на основе штамма бактерии Bacillus megaterium 501 GR в гелеобразной форме (Биопрепарат МЕГА)

Гелеобразная форма бактериального препарата МЕГА включает споры бактерий Bacillus megaterium 501 GR, продукты их метаболизма, остаточные количества минеральных солей и сбалансированный состав микроэлементов (Mn, В, Zn, Fe, Cu). В качестве гелеобразующего субстрата используется Na - кабоксиметилцеллюлоза.

Культуру Bacillus megaterium 501 GR пересевают и хранят на питательных средах: МПА или минеральной среде указанного выше состава. Культуры первого пересева на агаризованной питательной среде являются исходными, хранятся в холодильнике при температуре +4°С в течение 1-2 мес. Для получения рабочих культур исходные культуры пересевают на среды со скошенным агаром.

Получение маточной культуры

Д ля получения маточной культуры штамма Bacillus megaterium 501 GR использовали питательную среду следующего состава:

Сахароза	- 10,0
NH4NO3	- 0,5
K2HPO4	- 1,6
KH2PO4	- 0,4
MgSO4	- 0,2
CaCl2	- 0,05 мг
FeSO4	- 0,05 мг
дрожжевой экстракт	- 0,2 г

Питательную жидкую среду стерилизовали при 1 атм 30 мин, pH - 6,8-7,0. Затем в колбах емкостью 250 мл с 25 мл питательной среды провели стерильно инокуляцию чистой культурой штамма Bacillus megaterium 501 GR микробиологической петлей из пробирки со скошенным питательным агаром, и выращивали на круговой качалке при 200 об/мин при +34°С в течение 24 час. Маточную культуру с титром бактерий не менее 10⁸ кл/мл использовали для получения рабочей культуры бактерий.

Получение рабочей культуры

Для получения рабочей культуры бактерий Bacillus megaterium 501 GR использовали питательную среду следующего состава (г/л):

дрожжи пекарские	20
Кукурузная мука	10
(NH4)NO3	0,2
K2HPO4	0,8
KH2PO4	0,2
MgSO4	0,1
MnCl2	0,2 мг
CuSO4	2,0 мг

Питательную среду стерилизовали при 1 атм 30 мин, pH - 6,8-7,0. Рабочую культуру получали в колбах емкостью 1 л, содержащей 100 мл питательной среды, засеянной 10 мл маточной культуры бактерий, выращивали при температуре +34°С на круговой качалке при 220 об/мин. Через 36-48 часов бактерии переходили в споры. Спорообразование контролировали путем прямого микроскопирования культуральной жидкости в камере Горяева и посева на питательные среды после пастеризации при +80°. При достижении концентрации спор в рабочей культуре не менее 90% процесс получения рабочей культуры прекращали. Затем рабочую культуру бактерий разливали в стеклянные колбы над пламенем спиртовки или газовой горелки.

Приготовление геля Na - Карбоксиметилцеллюлозы с микроэлементами

Сначала готовили водный раствор микроэлементов, содержащих (мг/л): MnCl₂ - 1,05; Н₃ВО₃ - 1,5; ZnSO₄ - 0,15, который разливали по 100 мл в колбы емкостью по 250 мл. Затем в эти колбы вносили порошок Na - Карбоксиметилцеллюлозы в количестве 2 г/100 мл, ставили на качалку и перемешивали при 100 об/мин до получения гомогенной прозрачной вязкой массы геля. После этого гель стерилизовали в автоклаве при давлении 1 атм 30 мин.

Приготовление биопрепарата гелеобразной формы на основе штамма бактерий Bacillus megaterium 501 GR (Биопрепарат МЕГА)

В колбы, содержащие 100 мл геля с микроэлементами, вливали по 100 мл рабочей культуры бактерий Bacillus megaterium 501 GR и тщательно перемешивали на качалке в течение 1 часа при 100 об/мин. Полученный таким образом препарат разливали в специально приготовленную стеклянную тару.

В качестве тары, в зависимости от потребностей, в лабораторном варианте использовали стандартные склянки объемом от 40 до 500 мл. Разлив производили в асептических условиях над пламенем спиртовки или газовой горелки. Склянки с биопрепаратом закрывали герметично завинчивающимися крышками с прокладкой.

Полученный описанным способом препарат на основе штамма бактерий Bacillus megaterium 501 GR авторы назвали Биопрепарат МЕГА.

При использовании заявляемого штамма бактерии Bacillus megaterium 501 GR в составе биопрепаратов является важным то, что бактерии образуют споры, что позволяет сохранять эти препараты без потери жизнеспособности бактерий в течение длительного срока.

Срок хранения биопрепарата на основе штамма бактерий Bacillus megaterium 501 GR, полученного описанным способом в гелеобразной форме (МЕГА), составляет не менее 12 месяцев после его получения, в отличие от срока хранения биопрепарата Фосфоробактерина жидкого на основе штамма-прототипа Bacillus megaterium subsp.phosphaticum 49, который подлежит хранению около 2-х недель.

Эффективность биопрепарата МЕГА на основе штамма бактерий Bacillus megaterium 501 GR, полученного указанным выше способом, была проверена в вегетационных и полевых опытах по стандартным методикам.

Были проведены вегетационные опыты по влиянию биопрепарата МЕГА на рост и урожай льна долгунца (сорт «Псковский 359»).

Опыты ставили в теплице с укрытием из полиэтиленовой пленки. Почву (дерново-подзолистую, среднесуглинистую, залежь.) просеивали через грохот с ячейками размером 5 мм, увлажняли до 60% от полной влагоемкости и набивали в сосуды Вагнера, емкостью 4 кг, засевали семенами растений - по 40 растений на сосуд. В течение вегетационного периода поливали водопроводной водой по весу. Повторность - трехкратная.

Варианты опыта: 1. Контроль (исходная почва + известь); 2. исх. почва + известь + биопрепарат МЕГА. Во втором варианте опыта семена растений обрабатывали биопрепаратом, полученным на основе штамма бактерий Bacillus megaterium 501 GR, путем их погружения в гель, после чего семена высевали в почву на глубину 2 см и выращивали до полного созревания.

Результаты опытов по влиянию биопрепарата МЕГА на рост и урожай льна приведены в таблице 8.

Таблица 8
Влияние биопрепарата МЕГА на рост и урожай льна долгунца (сорт «Псковский 359»)
Варианты опыта	Стебель	Семена
масса 20 растений, г	длина, см	Число коробочек на 20 растений, шт.	масса на 20 растений, г
коробочек	семян
Контроль	4,0±0,2	51,5±0,5	58±1	3,8±0,2	2,3±0,1
Биопрепарат МЕГА	5,7±0,7	55,5±0,5	91±10	6,2±0,6	4,1±0,3

Из данных, приведенных в таблице 8 видно, что в варианте опыта при обработке семян льна биопрепаратом МЕГА, полученным на основе штамма бактерий Bacillus megaterium 501 GR, по сравнению с контролем у растений льна заметно увеличилась длина стеблей, количество на нем листьев, размер листьев также увеличился, растения имели более мощную корневую систему, в результате чего наблюдалось более раннее формирование коробочек и их созревание. В итоге под влиянием биопрепарата МЕГА, масса льносоломки возросла на 42% за счет увеличения длины и толщины стебля, количество коробочек на стебле увеличилось на 57%, удельная масса семян увеличилась на 10%, а урожай семян - на 78%, что говорит о значительном повышении урожая льна и более высоком качестве семенного материала.

Полученные данные позволяют сделать заключение о высокой эффективности предпосевной обработки семян льна биопрепаратом МЕГА, полученным на основе штамма Bacillus megaterium 501 GR, и хороших перспективах его использования в льноводстве.

Были проведены также вегетационные опыты по влиянию биопрепарата МЕГА на продуктивность картофеля. Оценку эффективности биопрепарата на развитие растений и урожай картофеля супер-супер элиты, полученного из мини-клубне