Стабильные и растворимые антитела

Стабильные и растворимые антитела

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Перекрестная ссылка на родственные заявки

Согласно §119 раздела 35 свода законов США по настоящей заявке испрашивается приоритет предварительной заявки на патент США № 61/405798, поданной 22 октября 2010, и 61/484749, поданной 11 мая 2011, полное содержания которых приведено в настоящем документе в качестве ссылки.

Область техники

Настоящее изобретение относится к способам уменьшения способности антител к агрегации и к антителам, которые модифицированы так, чтобы уменьшить способность агрегировать. Настоящее изобретение также относится к антителам, которые связываются с фактором альфа некроза опухолей (TNFα). В частности, настоящее изобретение относится к стабильным и растворимым антителам, содержащим модификацию, уменьшающую способность агрегирования, в том числе к антителам в виде scFv и Fab-фрагментов, которые содержат специфические последовательности легкой цепи и тяжелой цепи, которые оптимизированы в отношении стабильности, растворимости и низкой иммуногенности. Кроме того, настоящее изобретение относится к способам диагностики и/или лечения TNF-опосредуемых нарушений.

Предпосылки создания изобретения

Фактор альфа некроза опухолей (TNFα, также известный как кахектин) является природным цитокином млекопитающих, продуцируемым многочисленными типами клеток, в том числе моноцитами и макрофагами в ответ на эндотоксин или другие стимулы. TNFα является основным медиатором воспаления, иммунологических и патофизиологических реакций (Grell, M., et al. (1995) Cell, 83: 793-802).

Растворимый TNFα образуется в результате расщепления трансмембранного белка-предшественника (Kriegler, et al. (1988) Cell 53: 45-53), а секретируемые полипептиды с молекулярной массой 17 кДа собираются в растворимые гомотримерные комплексы (Smith, et al. (1987), J. Biol. Chem. 262: 6951-6954; ради обзоров TNFα см. Butler, et al. (1986), Nature 320: 584; Old (1986), Science 230: 630). Эти комплексы затем связываются с рецепторами, находящимися на множестве клеток. Связывание вызывает большое число провоспалительных эффектов, в том числе (i) выброс других провоспалительных цитокинов, таких как интерлейкин(IL)-6, IL-8 и IL-1, (ii) высвобождение матриксных металлопротеиназ и (iii) повышение экспрессии молекул, вовлекаемых в адгезию к эндотелию, которые дополнительно увеличивают каскад воспалительных и иммунных реакций в результате привлечения лейкоцитов в внесосудистые ткани.

Большое число нарушений связано с повышенными уровнями TNFα, многие из них имеют важное значение в области медицины. Установлено, что экспрессия TNFα повышена при ряде заболеваний человека, включающих хронические заболевания, такие как ревматоидный артрит (RA), воспалительные заболевания кишечника, в том числе болезнь Крона и неспецифический язвенный колит, сепсис, застойную сердечную недостаточность, бронхиальную астму и рассеянный склероз. Трансгенные мыши, несущие ген для TNFα человека, продуцируют высокие уровни TNFα конститутивно, и у них развивается носящий спонтанный характер, деструктивный полиартрит, имеющий сходство с RA (Keffer et al. 1991, EMBO J., 10, 4025-4031). Поэтому TNFα называют провоспалительным цитокином.

В настоящее время общепринято, что TNFα является ключевым фактором в патогенезе RA, который представляет собой хроническое, прогрессирующее и ослабляющее заболевание, характеризующееся воспалением и разрушением множества суставов, при этом системными симптомами являются лихорадка и недомогание и усталость. RA также приводит к хроническому воспалению синовиальной сумки, обычно с прогрессированием до суставного хряща и разрушения кости. Повышенные уровни TNFα обнаружены как в синовиальной жидкости, так и в периферической крови пациентов, страдающих RA. При введении пациентам, страдающим RA, средств, блокирующих TNFα, они уменьшают воспаление, ослабляют симптомы и замедляют разрушение суставов (McKown et al. (1999), Arthritis Rheum. 42: 1204-1208).

Физиологически TNFα также связывают с защитой от конкретных инфекций (Cerami et al. (1988), Immunol. Today 9:28). TNFα высвобождается макрофагами, которые были активированы липополисахаридами грамотрицательных бактерий. Как таковой, TNFα, по-видимому, является имеющим основное значение эндогенным медиатором, вовлеченным в развитие и патогенез эндотоксического шока, связанного с бактериальным сепсисом (Michie, et al. (1989), Br. J. Surg. 76: 670-671; Debets. et al. (1989), Second Vienna Shock Forum, p. 463-466; Simpson, et al. (1989) Crit. Care Clin. 5: 27-47; Waage et al. (1987). Lancet 1: 355-357; Hammerle. et al. (1989) Second Vienna Shock Forum p. 715-718; Debets. et al. (1989), Crit. Care Med. 17: 489-497; Calandra. et al. (1990), J. Infect. Dis. 161: 982-987; Revhaug et al. (1988), Arch. Surg. 123: 162-170).

Установлено, что, как и в случае других систем органов, TNFα также играет ключевую роль в центральной нервной системе, в частности, при воспалительных и аутоиммунных нарушениях нервной системы, включая рассеянный склероз, синдром Гийена-Барра и тяжелой миастении, и при дегенеративных нарушениях нервной системы, включающих болезнь Альцгеймера, болезнь Паркинсона и болезнь Хантингтона. TNFα также вовлечен в нарушения связанных систем сетчатки и мышцы, включающие неврит зрительного нерва, дегенерацию желтого пятна, диабетическую ретинопатию, дерматомиозит, амиотрофический боковой склероз и мышечную дистрофию, а также в повреждения нервной системы, в том числе травматическое повреждение головного мозга, острую травму спинного мозга и удар.

Гепатит является другим, связанным с TNFα воспалительным заболеванием, которое может быть вызвано, среди прочих пусковых механизмов, болезнетворными вирусами, в том числе вирусом Эпштейна-Барра, цитомегаловирусом и вирусами гепатита A-E. Гепатит является причиной острого воспаления печени в области воротной вены и области долек, после чего следует фиброз и развитие опухоли. TNFα может также опосредовать кахексию при раке, которая является самой частой причиной смертности при раке (Tisdale M.J. (2004), Langenbecks Arch Surg. 389: 299-305).

Ключевая роль, которую играет TNFα при воспалении, в клеточных иммунных реакция и патологии многих заболеваний, привела к поиску антагонистов TNFα. Одним из классов антагонистов TNFα, предназначенных для лечения TNFα-опосредуемых заболеваний, являются антитела или фрагменты антител, которые специфически связываются с TNFα и тем самым блокируют их действие. При использовании антител против TNFα было установлено, что блокирование TNFα может устранять эффекты, приписываемые TNFα, в том числе, уменьшает IL-1, GM-CSF, IL-6, IL-8, адгезивные молекулы и разрушение тканей (Feldmann et al. (1997), Adv. Immunol. 1997: 283-350). Среди специфических ингибиторов TNFα, которые недавно появились в продаже, моноклональное, химерное антитело мыши-человека, направленное против TNFα, (инфликсимаб, Remicade^TM; Centocor Corporation/Johnson & Johnson) продемонстрировало клиническую эффективность в лечении RA и болезни Крона. Несмотря на эти достижения, сохраняется необходимость в новых и эффективных формах антител или других антителах для лечения связанных с TNFα нарушений, таких как RA. В частности, существует насущная необходимость в антителах с оптимальными функциональными свойствами для эффективного и длительного лечения артрита и других TNFα-опосредуемых нарушений.

Краткое изложение сущности изобретения

Настоящее изобретение относится к антителам, содержащим по крайней мере одну уменьшающую агрегацию мутацию, и к способам получения таких антител.

В одном из аспектов настоящее изобретение относится к способам уменьшения способности антител к агрегации, включающим введение одной или более уменьшающих агрегацию модификаций в положении остатка, принимающего участие во взаимодействии между вариабельным доменом легкой цепи и вариабельным доменом тяжелой цепи антитела, причем замена уменьшает свободную энергию между вариабельным доменом легкой цепи и вариабельным доменом тяжелой цепи по крайней мере на 0,5 ккал/моль, в связи с чем уменьшается способность к агрегации модифицированного антитела по сравнению с таковой исходного антитела, в котором нет уменьшающей агрегацию модификации(й).

В одном из аспектов способ по настоящему изобретению включает введение одной или более аминокислотных замен в область контакта вариабельного домена легкой цепи (VL) и вариабельного домена тяжелой цепи (VH) антитела, причем одна или более замен находятся в положениях остатков, выбранных для уменьшения свободной энергии между VL и VH по крайней мере на 10%, в связи с чем уменьшается способность к агрегации антитела по сравнению с исходным антителом. В конкретном аспекте последовательность вариабельного домена легкой цепи антитела по крайней мере на 65% идентична последовательности SEQ ID NO:1. В других аспектах последовательность вариабельного домена тяжелой цепи по крайней мере на 85% идентична последовательности SEQ ID NO:3 или последовательности SEQ ID NO:4.

В некоторых аспектах способ по настоящему изобретению включает модифицирование остатка в положении 50 в соответствии с системой нумерации AHo и/или остатка в положении 47 в соответствии с системой нумерации AHo вариабельного домена легкой цепи антитела, в связи с чем уменьшается способность к агрегации антитела по сравнению с исходным антителом. В других аспектах способ по настоящему изобретению, кроме того, включает модифицирование остатков в положениях 12, 103 и 144 в соответствии с системой нумерации AHo вариабельного домена тяжелой цепи.

Настоящее изобретение также относится к антителам с пониженной способностью к агрегации, содержащим одну или несколько уменьшающих агрегацию модификаций. В некоторых аспектах антителом по настоящему изобретению является Fab, Fab', F(ab)'₂, одноцепочечный Fv (scFv), Fv-фрагмент или линейное антитело. В других аспектах настоящее изобретение относится к биспецифической или двухвалентной молекуле, содержащей антитело по настоящему изобретению.

В других аспектах уменьшающая агрегацию модификация находится в положении 50 в соответствии с системой нумерации AHo вариабельного домена легкой цепи. В конкретном аспекте уменьшающая агрегацию модификация содержит аргинин (R) в положении 50 в соответствии с системой нумерации AHo вариабельного домена легкой цепи. Тем не менее, в другом аспекте уменьшающая агрегацию модификация содержит замену лизина (K) на аргинин (R) в положении 50 в соответствии с системой нумерации AHo вариабельного домена легкой цепи.

Тем не менее, в других аспектах уменьшающая агрегацию модификация находится в положении 47 в соответствии с системой нумерации AHo вариабельного домена легкой цепи. В конкретном аспекте уменьшающая агрегацию модификация содержит аргинин (R) в положении 47 в соответствии с системой нумерации AHo вариабельного домена легкой цепи. Тем не менее, в другом аспекте уменьшающая агрегацию модификация содержит замену лизина (K) на аргинин (R) в положении 47 в соответствии с системой нумерации AHo вариабельного домена легкой цепи.

Настоящее изобретение также относится к стабильным и растворимым антителам, специфическим для TNFα, которые содержат необычные последовательности легкой цепи и тяжелой цепи, которые оптимизированы в отношении стабильности, растворимости, in vitro и in vivo связывания с TNFα, и низкой иммуногенности. Указанные антитела предназначены для диагностики и/или лечения TNFα-опосредуемых нарушений. Также изобретение относится к нуклеиновым кислотам, векторам и клеткам-хозяевам для экспрессии рекомбинантных антител, вариабельных доменов легких цепей и вариабельных доменов тяжелых цепей по настоящему изобретению, и к способам их выделения и к применению указанных антител в медицине.

Настоящее изобретение также относится к способам лечения TNFα-опосредуемого нарушения, включающим введение индивиду фармацевтической композиции, содержащей антитело против TNFα по настоящему изобретению. В некоторых аспектах TNF-альфа-опосредуемым нарушением является глазная болезнь, выбранная из группы, состоящей из увеита, болезни Бехчета, ретинита, сухости глаз, глаукомы, синдрома Шегрена, диабетической невропатии, склерита, возрастной дегенерации желтого пятна и кератита.

Конкретные предпочтительные варианты осуществления настоящего изобретения станут очевидными из следующего более подробного описания некоторых предпочтительных вариантов осуществления и формулы изобретения.

Краткое описание чертежей

На фиг. 1 представлены титрационные кривые для положений остатков VL47 (сплошные линии) и VL50 (пунктирные линии) в двух различных молекулах scFv, 34rFW1.4 (черный цвет) и 578rFW1.4 (серый цвет).

Фиг. 2A демонстрирует стабильность 34rFW1.4 в ускоренных условиях, определяемая с помощью анализа с использованием эксклюзионной HPLC после инкубации в течение 2 недель при 40°C и с использованием концентрации, составляющей 60 мг/мл.

Фиг. 2B демонстрирует стабильность 34rFW1.4_VLK50R_DHP в ускоренных условиях, определяемая с помощью анализа с использованием эксклюзионной HPLC после инкубации в течение 2 недель при 40°C и с использованием концентрации, составляющей 60 мг/мл.

Фиг. 3A демонстрирует стабильность 34rFW1.4 в ускоренных условиях, определяемая с помощью анализа с использованием эксклюзионной HPLC после инкубации в течение 2 недель при 40°C и с использованием концентрации, составляющей 40 мг/мл.

Фиг. 3B демонстрирует стабильность 34rFW1.4_VLK50R_DHP в ускоренных условиях, определяемая с помощью анализа с использованием эксклюзионной HPLC после инкубации в течение 2 недель при 40°C и с использованием концентрации, составляющей 40 мг/мл.

Фиг. 4A демонстрирует стабильность 34rFW1.4 в ускоренных условиях, определяемая с помощью анализа с использованием эксклюзионной HPLC после инкубации в течение 2 недель при 40°C и с использованием концентрации, составляющей 20 мг/мл.

Фиг. 4B демонстрирует стабильность 34rFW1.4_VLK50R_DHP в ускоренных условиях, определяемая с помощью анализа с использованием эксклюзионной HPLC после инкубации в течение 2 недель при 40°C и с использованием концентрации, составляющей 20 мг/мл.

Фиг. 5A демонстрирует стабильность 34rFW1.4 в ускоренных условиях, определяемая с помощью анализа с использованием эксклюзионной HPLC после инкубации в течение 2 недель при 40°C и с использованием концентрации, составляющей 60 мг/мл.

Фиг. 5B демонстрирует стабильность 34rFW1.4_VL_K50R в ускоренных условиях, определяемая с помощью анализа с использованием эксклюзионной HPLC после инкубации в течение 2 недель при 40°C и с использованием концентрации, составляющей 60 мг/мл.

Фиг. 6A демонстрирует стабильность 34rFW1.4 в ускоренных условиях, определяемая с помощью анализа с использованием эксклюзионной HPLC после инкубации в течение 2 недель при 40°C и с использованием концентрации, составляющей 40 мг/мл.

Фиг. 6B демонстрирует стабильность 34rFW1.4_VLK50R в ускоренных условиях, определяемая с помощью анализа с использованием эксклюзионной HPLC после инкубации в течение 2 недель при 40°C и с использованием концентрации, составляющей 40 мг/мл.

Фиг. 7A демонстрирует стабильность 34rFW1.4 в ускоренных условиях, определяемая с помощью анализа с использованием эксклюзионной HPLC после инкубации в течение 2 недель при 40°C и с использованием концентрации, составляющей 20 мг/мл.

Фиг. 7B демонстрирует стабильность 34rFW1.4_VLK50R в ускоренных условиях, определяемая с помощью анализа с использованием эксклюзионной HPLC после инкубации в течение 2 недель при 40°C и с использованием концентрации, составляющей 20 мг/мл.

Фиг. 8A демонстрирует стабильность 34rFW1.4 в ускоренных условиях, определяемая с помощью анализа с использованием эксклюзионной HPLC после инкубации в течение 2 недель при 40°C и с использованием концентрации, составляющей 60 мг/мл.

Фиг. 8B демонстрирует стабильность 34rFW1.4_K47R в ускоренных условиях, определяемая с помощью анализа с использованием эксклюзионной HPLC после инкубации в течение 2 недель при 40°C и с использованием концентрации, составляющей 60 мг/мл.

Фиг. 9A демонстрирует стабильность 34rFW1.4 в ускоренных условиях, определяемая с помощью анализа с использованием эксклюзионной HPLC после инкубации в течение 2 недель при 40°C и с использованием концентрации, составляющей 20 мг/мл.

Фиг. 9B демонстрирует стабильность 34rFW1.4_K47R в ускоренных условиях, определяемая с помощью анализа с использованием эксклюзионной HPLC после инкубации в течение 2 недель при 40°C и с использованием концентрации, составляющей 20 мг/мл.

Подробное описание настоящего изобретения

Общей целью настоящего изобретения является получение стабильных и растворимых антител, обладающих пониженной способностью к агрегации в растворе. В предпочтительном варианте осуществления указанным антителом является антитело в виде scFv или Fab-фрагмент. Антитела по настоящему изобретению, предпочтительно, включают легкую и тяжелую цепи, раскрытые в настоящем описании.

Представленное в настоящем описании подробное описание служит примером и предназначено лишь для иллюстративного обсуждения предпочтительных вариантов осуществления настоящего изобретения, и приведено ради предоставления того, что, как полагают, является наиболее рациональным и совершенно понятным описанием принципов и концептуальных аспектов различных вариантов осуществления настоящего изобретения. В этой связи не предпринимается попытка показать структурные детали настоящего изобретения более подробно, чем необходимо для понимания принципов настоящего изобретения, при этом на основании описания в сочетании с чертежами и/или примерами специалисту в данной области будет понятно, каким образом могут быть осуществлены на практике некоторые формы настоящего изобретения.

Для понимания настоящего изобретения ниже определены некоторые термины. Дополнительные определения приведены на всем протяжении подробного описания. Следующие определения и объяснения, как подразумевается и предполагается, являются предпочтительными при любом дальнейшем толковании, если только они явно и однозначно не изменены в следующих примерах, или кроме случаев, когда их использование делает какое-либо толкование бессмысленным или по существу бессмысленным. В тех случаях, когда толкование термина будет бессмысленным или по существу бессмысленным, то определение следует брать из словаря Webster, 3-ье издание или словаря, известного специалистам в данной области, такого как Oxford Dictionary of Biochemistry and Molecular Biology (Ed. Anthony Smith, Oxford University Press, Oxford, 2004).

Используемый в настоящем описании термин «антитело» включает полноразмерные антитела и любой антигенсвязывающий фрагмент (т.е. «антигенсвязывающую часть», «антигенсвязывающий полипептид» или «иммунное связующее вещество») или их одиночную цепь. «Антитело» включает гликопротеин, содержащий по крайней мере две тяжелые (H) цепи и две легкие (L) цепи, взаимно соединенные дисульфидными связями, или его антигенсвязывающую часть. Каждая тяжелая цепь состоит из вариабельной области тяжелой цепи (в настоящем описании сокращенно как V_H) и константной области тяжелой цепи. Константная область тяжелой цепи состоит из трех доменов, CH1, CH2 и CH3. Каждая легкая цепь состоит из вариабельной области легкой цепи (в настоящем описании сокращенно как V_L) и константной области легкой цепи. Константная область легкой цепи состоит из одного домена, CL. V_H- и V_L-области можно далее разделить на участки гипервариабельности, называемые определяющими комплементарность участками (CDR), расположенные вперемежку с областями, которые являются более консервативными, называемыми каркасными областями (FR). Каждая V_H и V_L состоит из трех CDR и четырех FR, расположенных от амино-конца к карбоксильному концу в следующем порядке: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. Вариабельные области тяжелой и легкой цепей содержат домен связывания, который взаимодействует с антигеном. Константные области антител могут опосредовать связывание иммуноглобулина с тканями или факторами хозяина, включающими различные клетки иммунной системы (например, эффекторные клетки) и первый компонент (Clq) классической системы комплемента.

Термин «антигенсвязывающая часть» антитела (или просто «часть антитела») относится к одному или более фрагментам антитела, которые сохраняют способность к специфическому связыванию с антигеном (например, TNF). Было установлено, что функцию антитела, относящуюся к связыванию антигена, могут выполнять фрагменты полноразмерного антитела. Примеры связывающих фрагментов, включаемых в термин «антигенсвязывающая часть» антитела, включают (i) Fab-фрагмент, одновалентный фрагмент, состоящий из V_L-, V_H-, CL- и CH1-доменов; (ii) F(ab')₂-фрагмент, двухвалентный фрагмент, содержащий два Fab-фрагмента, связанных дисульфидным мостиком в шарнирной области; (iii) Fd-фрагмент, состоящий из V_H- и CH1-доменов; (iv) Fv-фрагмент, состоящий из V_L- и V_H-доменов одного плеча антитела, (v) один домен или dAb-фрагмент (Ward et al., (1989) Nature 341: 544-546), который состоит из V_H-домена; и (vi) выделенный определяющий комплементарность участок (CDR) или (vii) комбинацию двух или более выделенных CDR, которые могут быть необязательно соединены с помощью синтетического линкера. Кроме того, хотя два домена Fv-фрагмента, V_L и V_H, кодируются отдельными генами, их можно соединить, используя способы создания рекомбинантных молекул, с помощью синтетического линкера, который позволяет создать их в виде одной белковой цепи, в которой V_L- и V_H-области спарены с образованием одновалентных молекул (известных как одноцепочечный Fv (scFv); см., например, Bird et al. (1988) Science 242: 423-426; и Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 5879-5883). Предполагается, что такие одноцепочечные антитела также включены в термин «антигенсвязывающая часть» антитела. Эти фрагменты антител получают, используя обычные способы, известные специалистам в данной области, и фрагменты подвергают скринингу на предмет полезности таким же образом, как и интактные антитела. Антигенсвязывающие части могут быть получены способами рекомбинантных ДНК или с помощью ферментативного или химического расщепления интактных иммуноглобулинов. Антитела могут быть антителами различных изотипов, например, антителом изотипа IgG (например, подтипа IgG1, IgG2, IgG3 или IgG4), IgA1, IgA2, IgD, IgE или IgM.

Термин «каркасные области» относится к принятым в данной области частям вариабельной области антитела, которые находятся между более дивергентными CDR-участками. Такие каркасные области обычно называют каркасными областями с 1 по 4 включительно (FR1, FR2, FR3 и FR4) и обеспечивают остов для удержания, в трехмерном пространстве, трех CDR, обнаруживаемых в вариабельной области тяжелой или легкой цепи антитела, так что CDR могут образовывать антигенсвязывающую поверхность. Такие каркасные области можно также назвать остовами, поскольку они служат опорой для презентации более дивергентных CDR. В качестве антигенсвязывающих молекул могут использоваться другие CDR и каркасные области суперсемейства иммуноглобулинов, такие как анкириновые повторы и фибронектин (см. также, например, патенты США № 6300064 и 6815540 и публикацию заявки на патент США № 20040132028).

Термин «эпитоп» или «антигенная детерминанта» относится к месту на антигене, в котором иммуноглобулин или антитело специфически связывается (например, с TNF). Эпитоп обычно включает по крайней мере 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 или 15 аминокислот в уникальной пространственной конформации. См., например, Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology, Vol. 66, G. E. Morris, Ed. (1996).

Термины «специфическое связывание», «селективное связывание», «селективно связывается» и «специфически связывается» относятся к связыванию антитела с эпитопом заданного антигена. Обычно антитело связывается с аффинностью (K_D), составляющей приблизительно менее чем 10^-7 M, например, приблизительно менее чем 10^-8 M, 10^-9 M или 10^-10 M или даже меньше, как определено, используя технологию с использованием поверхностного плазмонного резонанса (SPR) в инструментальном средстве BIACORE.

Термин «K_D» относится к константе равновесия при диссоциации конкретного взаимодействия антитела с антигеном. В некоторых вариантах осуществления некоторые антитела по настоящему изобретению связываются с TNF с константой равновесия при диссоциации (K_D), составляющей менее чем приблизительно 10^-7 M, например, менее чем приблизительно 10^-8 M, 10^-9 M или 10^-10 M или даже меньше, например, как определено, используя технологию с использованием поверхностного плазмонного резонанса (SPR) в инструментальном средстве BIACORE.

Как используется в настоящем описании, «идентичность» относится к совпадению последовательностей двух полипептидов, молекул или двух нуклеиновых кислот. Если положение в обеих из двух сравниваемых последовательностей занимает одна и та же мономерная субъединица в виде основания или аминокислоты (например, если положении в каждой из двух молекул ДНК занимает аденин, или положении в каждом из двух полипептидов занимает лизин), то соответствующие молекулы являются идентичными в этом положении. «Процент идентичности» двух последовательностей зависит от числа совпадающих положений, разделяемых двумя последовательностями, разделенного на число сравниваемых положений, x 100. Например, если совпадают 6 из 10 положений в двух последовательностях, то две последовательности являются идентичными на 60%. В качестве примера, последовательности ДНК CTGACT и CAGGTT идентичны на 50% (совпадают 3 из всего 6 положений). Как правило, сравнение осуществляют после выравнивания двух последовательностей для достижения максимальной идентичности. Такое выравнивание можно обеспечить, используя, например, способ Needleman и др. ((1970) J. Mol. Biol. 48: 443-453), просто реализуемый компьютерными программами, такими как программа Align (DNAstar, Inc.). Процент идентичности двух аминокислотных последовательностей можно также определить, используя алгоритм E. Meyers и W. Miller (Comput. Appl. Biosci., 4: 11-17 (1988)), который включен в программу ALIGN (версии 2.0), используя таблицу веса остатков PAM120, штраф за длину пропуска = 12 и штраф за пропуск = 4. Кроме того, процент идентичности двух аминокислотных последовательностей можно определить, используя алгоритм Needleman и Wunsch (J. Mol. Biol. 48: 444-453 (1970)), который включен в программу GAP в пакете программ GCG (доступном на сайте http://www.gcg.com), используя либо матрицу Blossum 62, либо матрицу PAM250, и весовой коэффициент для пропуска, равный 16, 14, 12, 10, 8, 6 или 4, и весовой коэффициент для длины, равный 1, 2, 3, 4, 5 или 6.

«Схожими» последовательностями являются последовательности, которые, при выравнивании, имеют идентичные и схожие аминокислотные остатки, причем схожими остатками являются консервативные замены для соответствующих аминокислотных остатков в выровненной контрольной последовательности. В связи с этим, «консервативной заменой» остатка в контрольной последовательности является замена на остаток, который физически или функционально схож с соответствующим остатком в контрольной последовательности, например, который имеет схожий размер, форму, электрический заряд, химические свойства, включая способность к образованию ковалентных или водородных связей, и т.п. Таким образом, «модифицированной в результате консервативной(ых) замены (замен)» последовательностью является последовательность, которая отличается от контрольной последовательной или последовательности дикого типа тем, что присутствует одна или более консервативных замен. «Процент идентичности» двух последовательностей зависит от числа положений, в которых находятся совпадающие остатки или консервативные замены, разделяемые двумя последовательностями, разделенного на число сравниваемых положений, x 100. Например, если 6 из 10 положений в двух последовательностях совпадают, а в 2 из 10 положений находятся консервативные замены, то две последовательности схожи на 80%.

Используемый в настоящем описании термин «консервативные модификации последовательности», как предполагается, относится к модификациям аминокислот, которые не оказывают отрицательное влияние на характеристики связывания антитела, содержащего эту аминокислотную последовательность, или не изменяют их. Такие консервативные модификации последовательности включают замены, добавления и делеции нуклеотидов и аминокислот. Например, модификации можно ввести с помощью стандартных способов, известных в данной области, таких как сайт-направленный мутагенез и мутагенез с использованием ПЦР. Консервативные аминокислотные замены включают замены, в случае которых аминокислотный остаток заменяют на аминокислотный остаток, имеющий схожую боковую цепь. В данной области были установлены семейства аминокислотных остатков, имеющие схожие боковые цепи. Эти семейства включают аминокислоты с основными боковыми цепями (например, лизин, аргинин, гистидин), кислотными боковыми цепями (например, аспарагиновая кислота, глютаминовая кислота), незаряженными полярными боковыми цепями (например, глицин, аспарагин, глютамин, серин, треонин, тирозин, цистеин, триптофан), неполярными боковыми цепями (например, аланин, валин, лейцин, изолейцин, пролин, фенилаланин, метионин), бета-разветвленными боковыми цепями (например, треонин, валин, изолейцин) и ароматическими боковыми цепями (например, тирозин, фенилаланин, триптофан, гистидин). Таким образом, предсказанный заменимый аминокислотный остаток в конкретном антителе, предпочтительно, заменяют на другой аминокислотный остаток из того же семейства боковых цепей. Способы определения нуклеотидных и аминокислотных консервативных замен, которые не аннулируют связывание с антигеном, хорошо известны в данной области (см., например, Brummell et al, Biochem. 32: 1180-1187 (1993); Kobayashi et al. Protein Eng. 12(10): 879-884 (1999); и Burks et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94: 412-417 (1997)).

Как используется в настоящем описании, «аминокислотная консенсусная последовательность» относится к аминокислотной последовательности, которую можно получить, используя матрицу из по крайней мере двух, а, предпочтительно, более, выровненных аминокислотных последовательностей, и предусматривая пропуски при выравнивании, так что можно определить наиболее часто встречающийся аминокислотный остаток в каждом положении. Консенсусная последовательность представляет собой такую последовательность, которая содержит аминокислоты, которые представлены с наибольшей частотой в каждом положении. В том случае, когда две или более аминокислоты представлены в равной степени в одном положении, консенсусная последовательность включает обе или все из этих аминокислот.

Аминокислотную последовательность белка можно исследовать на различных уровнях. Например, сохраняемость или вариабельность может проявляться на уровне одного остатка, уровне множества остатков, множества остатков с пропусками и т.д. Остатки могут проявлять сохраняемость идентичного остатка или могут быть сохраняемыми на уровне класса. Примеры классов аминокислот включают полярные, но незаряженные R-группы (серин, треонин, аспарагин и глютамин); положительно заряженные R-группы (лизин, аргинин и гистидин); отрицательно заряженные R-группы (глютаминовая кислота и аспарагиновая кислота); гидрофобные R-группы (аланин, изолейцин, лейцин, метионин, фенилаланин, триптофан, валин и тирозин) и особые аминокислоты (цистеин, глицин и пролин). Специалисту в данной области известны другие классы, и их можно определить, используя детерминанты структуры или другие данные для определения заменяемости. В некотором смысле заменяемая аминокислота может относиться к любой аминокислоте, которую можно заменить и которая сохраняет функциональный консерватизм в этом положении.

Однако будет понятно, что биофизические свойства аминокислот одного и того же класса могут отличиться степенью. Например, будет понятно, что некоторые гидрофобные R-группы (например, аланин, серин или треонин) являются более гидрофильными (т.е. имеют большую гидрофильность или меньшую гидрофобность), чем другие гидрофобные R-группы (например, валин или лейцин). Относительную гидрофильность или гидрофобность можно определить, используя признанные в данной области способы (см., например, Rose et al., Science, 229: 834-838 (1985) и Cornette et al., J. Mol. Biol, 195: 659-685 (1987)).

Как используется в настоящем описании, в случае выравнивания одной аминокислотной последовательности (например, первой последовательности V_H или V_L) с одной или более дополнительными аминокислотными последовательностями (например, одной или более последовательностей V_H или V_L в базе данных) положение аминокислоты в одной последовательности (например, первой последовательности V_H или V_L) можно сравнить с «соответствующим положением» в одной или более дополнительных аминокислотных последовательностей. Как используется в настоящем описании, «соответствующее положение» представляет собой эквивалентное положение в сравниваемой последовательности(ях) после оптимального выравнивания последовательностей, т.е. после выравнивания последовательностей для достижения наибольшего процента идентичности или процента схожести.

Термин «молекула нуклеиновой кислоты» относится к молекулам ДНК или молекулам РНК. Молекула нуклеиновой кислоты может быть одноцепочечной или двухцепочечной, но, предпочтительно, является двухцепочечной ДНК. Нуклеиновая кислота является «функционально связанной», когда установлена ее функциональная связь с другой последовательностью нуклеиновой кислоты. Например, промотор или энхансер является функционально связанным с кодирующей последовательностью, если он оказывает влияние на транскрипцию этой последовательности. В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение относится к выделенным молекулам нуклеиновых кислот, которые кодируют антитело по настоящему изобретению, вариабельный домен легкой цепи по настоящему изобретению и/или вариабельный домен тяжелой цепи антитела по настоящему изобретению. В некоторых вариантах осуществления молекула нуклеиновой кислоты по настоящему изобретению кодирует полипептид, содержащий вариабельную область легкой цепи, которая по меньшей мере на 97% идентична SEQ ID NO:2 или SEQ ID NO:14; полипептид, содержащий вариабельную область тяжелой цепи, который по меньшей мере на 95% идентична SEQ ID NO:5; или антитело, которое по меньшей мере на 96% идентично SEQ ID NO:10 или SEQ ID NO:17.

Термин «вектор» относится к молекуле нуклеиновой кислоты, способной к переносу другой нуклеиновой кислоты, с которой она соединена. Одним типом вектора является «плазмида», которая относится к петле кольцевой, двухцепочечной ДНК, в которую можно лигировать дополнительные сегменты ДНК. Другим типом вектора является вирусный вектор, в случае которого дополнительные сегменты ДНК можно лигировать в геном вируса. Некоторые векторы способны к автономной репликации в клетке-хозяине, в которую они введены (например, бактериальные векторы, имеющие бактериальное начало репликации, и эписомные векторы млекопитающих). Другие векторы (например, неэписомные векторы млекопитающих) могут интегрироваться в геном клетки-хозяина после введения в клетку-хозяина и в силу этого реплицируются вместе с геном хозяина.

Термин «клетка-хозяин» относится к клетке, в которую был введен вектор экспрессии. Клетки-хозяева могут включать бактериальные, микробные клетки, клетки растений или животных. Бактерии, которые поддаются трансформации, включают члены Enterobacteriaceae, такие как штаммы Escherichia coli или Salmonella; Bacillaceae, такие как Bacillus subtilis; Pneumococcus; Streptococcus и Haemophilus influenzae. Подходящие микробы включают Saccharomyces cerevisiae и Pichia pastoris. Подходящие линии клеток животных-хозяев включают клетки CHO (линии клеток яичника китайского хомячка) и клетки NS0.

Термины «лечить» и «лечение» относятся к терапевтическим или профилактическим мерам, описываемым в настоящем описании. В способах «лечения» используется введение антитела по настоящему изобретению индивиду, при необходимости такого лечения, например, индивиду с TNFα-опосредуемым нарушением, или индивиду у которого в итоге может возникнуть такое нарушение, для профилактики, лечения, отстрочки наступления, уменьшения тяжести или уменьшения интенсивности одного или нескольких симптомов нарушения, или повторного нарушения, или для увеличения продолжительности жизни индивида сверх ожидаемой продолжительности в отсутствие такого лечения.

Термин «TNF-опосредуемое нарушение» в целом относится к болезненным состояниям и/или симптомам, связанным с TNF, включая любое нарушение, для возникновения, прогрессирования или персистирования симптомов которого требуется участие TNF. Примеры TNF-опосредуемых нарушений включают, но ими не ограничиваются, возрастную дегенерацию желтого пятна, неоваскулярную глаукому, диабетическую ретинопатию, ретинопатию недоношенных, ретролентальную фибр