Рекомбинантная вакцина от птичьего гриппа и её применение

Рекомбинантная вакцина от птичьего гриппа и её применение

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Перекрестные ссылки на родственные заявки

Настоящая заявка притязает на преимущество от Предварительной заявки US Serial No.61/118,492, поданной 28 ноября 2008 г.

Область техники, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение охватывает вакцины против гриппа, в частности вакцины от птичьего гриппа. Вакцины могут представлять собой рекомбинантные птичьи вакцины.

Уровень техники

Птичий грипп - это грипп, который вызывают вирусы, приспособившиеся к птицам. Вирус птичьего гриппа (AIV) представляет собой РНК-вирус, принадлежащий к семейству Orthomyxoviridae, который классифицируется как вирус гриппа типа А, что относится к его нуклеопротеиду и мембранным белкам. AIV имеет липидную оболочку, в которой есть два особых гликопротеида:гемагглютинин (НА), который облегчает проникновение вируса в клетки хозяина, и нейраминидаза (NA), которая способствует высвобождению его потомства из инфицированных клеток (de Jong et al., J Clin Vrol. 2006, 35 (1):2-13). Подтип H5N1 (вирус, содержащий НА5 и NA1) конкретно связывали с недавними вспышками в Азии, России, на Ближнем Востоке, в Европе и Африке (Olsen et al., Science 2006, 312 (5772):384-388).

Очень патогенный вирус гриппа А подтипа H5N1 и есть новый вирус птичьего гриппа, вызывающий всеобщую озабоченность как потенциальная угроза пандемии. H5N1 уже погубил миллионы домашних птиц во все возрастающем числе стран по всей Азии, Европе и Африке. Эксперты в области здравоохранения озабочены тем, что совместное существование вирусов гриппа человека и вирусов птичьего гриппа (особенно H5N1) создает возможность для обмена генетического материала между видоспецифичными вирусами, возможно, создавая новые вирулентные штаммы гриппа, которые легко передаются и детальны для человека (Food Safety Research Information Office. "A Focus on Avian Influenza". Created May 2006, updated November 2007).

Co времени первой вспышки H5N1 в 1997 г. отмечалось все большее число случаев передачи HPAI H5N1 от птиц к человеку, вызывающих клинически тяжелые и смертельные инфекции. Тем не менее, поскольку существует значительный межвидовой барьер между птицами и человеком, вирус не так легко переходит на людей. Несмотря на то, что миллионы птиц заразились вирусом со времени его открытия, чуть больше 200 человек умерли от птичьего гриппа в Индонезии, Лаосе, Вьетнаме, Румынии, Китае, Турции и России.

Недавно поводились исследования растений в качестве источника получения терапевтических средств, таких как вакцины, антитела и биофармацевтические препараты. Однако получение вакцин, антител, белков и биопрепаратов из растений находится далеко от лечебного процесса, и существует множество препятствий, обычно связанных с таким получением вакцин. Ограничения для успешного производства растительных вакцин включают низкий выход биопродукта или экспрессируемого антигена (Chargelegue et al., Trends in Plant Science 2001, 6, 495-496), нестабильность белков, неустойчивость качества продукта (Schillberg et al., Vaccine 2005, 23, 1764-1769) и недостаточная способность получения вирусоподобных продуктов ожидаемого размера и иммуногенности (Amtzen et al., Vaccine 2005, 23, 1753-1756).

Учитывая подверженность животных, включая человека, к AIV, необходим способ профилактики инфицирования AIV и защиты животных. Соответственно, существует потребность в способах получения эффективных вакцин против гриппа.

Сущность изобретения

Предусмотрены композиции, включающие полипептид гриппа и его фрагменты и варианты. Полипептид или антиген вырабатывается в растениях и является высоко иммуногенным и протективным.

Полипептиды и их фрагменты и варианты могут быть составлены в виде вакцин и/или фармацевтических или иммунологических композиций. Такие вакцины или композиции могут применяться для вакцинации животных и обеспечения защиты против гомологичных и гетерологичных штаммов гриппа.

Способы изобретения включают способы применения, включающие введение животным эффективного количества антигенного полипептида либо его фрагмента или варианта для выработки защитного иммуногенного ответа. Способы также включают способы получения антигенных полипептидов в растениях ряски. После продукции в ряске антигенный полипептид может быть частично или существенно очищен для применения в качестве вакцины или иммунологической композиции.

Также предусмотрены наборы, включающие по меньшей мере один антигенный полипептид либо его фрагмент или вариант и инструкции по применению.

Краткое описание фигур

Следующее подробное описание, представленное для примера, но не предназначенное для ограничения изобретения лишь конкретными описанными воплощениями, лучше всего можно понять в сочетании с прилагаемыми чертежами.

На фиг.1 представлена таблица, в которой приведены SEQ ID NO, соотнесенные с последовательностями полинуклеотидов и белков.

На фиг.2 представлена синтетическая (оптимизированная по кодонам) и мутированная последовательность ДНК, кодирующей гемагглютинин (НА) вируса H5N1 А/курица/Индонезия/7/2003 (SEQ ID NO:1).

На фиг.3 представлены нативные и синтетические/мутированные последовательности белка H5N1 А/курица/Индонезия/7/2003 (НА).

На фиг.4 представлена последовательность кДНК гена НА вируса дикого типа (нативного) А/курица/Индонезия/7/2003 (H5N1) (номер доступа в GenBank EF473080) (SEQ ID NO:3).

На фиг.5 представлены сопоставление белковых последовательностей НА и таблица идентичности последовательностей.

На фиг.6 представлена последовательность вектора MerB01 (SEQ ID NO:6).

На фиг.7 представлена карта вектора MerB01.

На фиг.8 представлены сопоставление последовательностей ДНК и таблица идентичности последовательностей.

На фиг.9 представлены типичная чашка при скрининге положительных трансгенных растений на НА и результаты определения НА.

На фиг.10 представлены результаты определения НА у трансгенных растений, экспрессирующих НА вируса H5N1.

На фиг.11 представлена таблица, в которой приведен ожидаемый выход заданных композиций.

На фиг.12-14 представлены результаты анализа ингибирования гемагглютинации, проведенного с различными антителами.

На фиг.15 представлены SDS-PAGE (окрашивание серебром) и western-блот.

На фиг.16 представлена western-гибридизация с использованием различных сывороток.

На фиг.17 представлен анализ иммунолокализации экспрессированного в Lemna НА с помощью моноклонального антитела против гемагглютинина Н5 вируса гриппа А/Вьетнам/1203/04.

На фиг.18 представлена таблица, в которой приведена схема вакцинации при исследовании иммуногенности.

На фиг.19 представлена сводка данных по защите после провоцирующей пробы с HPAI H5N1.

На фиг.20 представлены титры ингибирования гемагглютинации (log2) от сывороток, взятых на 35-й день у кур, вакцинированных полученным в Lemna НА.

На фиг.21 представлена таблица, в которой приведены сводные серологические данные по образцам, взятым до провоцирующей пробы на 42-й день и после пробы на 56-й день.

Раскрытие сущности изобретения

Предусмотрены композиции, включающие антиген гриппа и его фрагменты и варианты, вызывающие иммуногенный ответ у животных. Антигенные полипептиды либо их фрагменты или варианты могут вырабатываться в растениях ряски. Антигенные полипептиды либо их фрагменты или варианты могут быть составлены в виде вакцин либо фармацевтических или иммунологических композиций и могут применяться для выработки защитного иммунитета у животных. В одном воплощении полипептидным антигеном является полипептид гемагглютинина либо его активный фрагмент или вариант.

Предусматривается, что антигенные полипептиды или антигены изобретения могут представлять собой полные полипептиды либо их активные фрагменты или варианты. Под "активными фрагментами" или "активными вариантами" подразумевается то, что эти фрагменты или варианты сохраняют антигенный характер полипептида. Таким образом, настоящее изобретение охватывает любые полипептиды, антигены, эпитопы или иммуногены гриппа, вызывающие иммуногенный ответ у животных. Полипептид, антиген, эпитоп или иммуноген гриппа может представлять собой любой полипептид, антиген, эпитоп или иммуноген гриппа, как-то белок, пептид либо его фрагмент или вариант, который вызывает, индуцирует или стимулирует иммуногенный ответ у животных.

Антигенным полипептидом, представляющим особый интерес, является гемагглютинин (НА). Гемагглютинин гриппа означает такой тип гемагглютинина, который находится на поверхности вирусов гриппа. Он представляет собой антигенный гликопротеид и отвечает за связывание вируса с инфицируемыми клетками. Существуют различные антигены НА, любой из которых может использоваться при воплощении изобретения. Представляет интерес НА из H5N1, сильно патогенного вируса птичьего гриппа. В частности, НА может быть выделен из H5N1 штамма А/курица/Индонезия/7/2003. Однако при воплощении изобретения можно использовать НА из других вирусов гриппа (т.е. H1-Н16), включая H1, Н3, Н5, Н6, Н7, Н9 и т.п. Также предусматривается, что можно использовать предшественников любых белков НА.

НА представляет собой гомотримерный трансмембранный белок с эктодоменом, состоящим из глобулярной головки и стержня (стволового участка). Оба участка несут N-связанные олигосахариды, которые играют важную роль в биологической функции НА (Schuize I.T., J Infect Dis, 1997. 176 Suppi 1:p.S24-8; Deshpande K.L. et al., PNAS USA, 1987, 84 (1):p.36-40). Среди различных подтипов вируса гриппа А имеется значительная изменчивость в сайтах гликозилирования головки, тогда как олигосахариды стержня более консервативны и необходимы для активности слияния (Ohuchi R. et al., J Virol, 1997, 71 (5):p.3719-25). Гликаны вблизи эпитопов антигенного пептида влияют на распознавание антител (Skehel J.J. et al., PNAS USA, 1984, 81 (6):p.1779-83), а гликаны вблизи от протеолитического сайта модулируют расщепление и влияют на инфекционность вируса гриппа (Deshpande K.L. et al., 1987). Анализ нуклеотидных последовательностей 62 генов Н5 подтверждает гипотезу о том, что дополнительное гликозилирование возле участка связывания с рецептором в глобулярной головке НА является адаптацией вируса вслед за межвидовым переносом от диких птиц, в частности водоплавающих птиц, к домашним птицам (Banks J. et al., Avian Dis, 2003, 47 (3 Suppl):p.942-50).

Для белка НА вируса гриппа идентифицировано более 150 В-клеточных эпитопов, а также 113 CD4+ и 35 CD8+ Т-клеточных эпитопов, однако сообщалось только об ограниченном числе эпитопов для штаммов/подтипов вируса птичьего гриппа (Bui H.H. et al., PNAS USA, 2007, 104 (1):р.246-51). Изучение сайтов аминокислотных замен в естественных и отобранных с помощью моноклональных антител антигенных вариантах показало, что все антигенные сайты находятся на поверхности мембранного дистального домена НА1 и преимущественно окружают сайты связывания с рецептором. Имеются две заметные особенности антигенных сайтов:петлеобразная структура некоторых из них и наличие углеводородных боковых цепей (Skehel J.J. et al., Annu Rev Biochem, 2000, 69:p.531-69). Описана локализация и тонкая структура двух антигенных сайтов Н5 (Kaverin N.V. et al., J Gen Virol, 2002. 83 (Pt 10):p.2497-505). Сайт 1 представляет собой экспонированную петлю, включающую остатки 140-145 НА1, которые соответствуют антигенным сайтам А Н3 и Са2 H1, а сайт 2 состоит из двух подсайтов, причем один (остатки 156 и 157 НА1) соответствует сайту В у подтипа Н3, а другой (остатки 129-133 НА1) соответствует сайту Sa у подтипа H1. Исследование по картированию эпитопов свидетельствует о том, что антигенная структура НА у недавно выделенного H5N1 существенно отличается от малопатогенного штамма Н5 и быстро эволюционирует (Kaverin N.V. et al., J Virol, 2007. 81 (23):p.12911-7). Анализ консервативности эпитопов свидетельствует о том, что для Т-клеточных эпитопов вероятен значительный уровень перекрестной реактивности между штаммами, но он гораздо меньше для Ab-эпитопов. При использовании библиотеки перекрывающихся пептидов впервые был идентифицирован Т-клеточный эпитоп AIV, представляющий собой 15-мерный пептид -Н5246-260 внутри домена НА1, который индуцирует действие Т-клеток у цыплят, иммунизированных против НА Н5 (Haghighi H.R. et al., PLoS ONE, 2009. 4 (11):p.e7772).

Отметим, что в данном раскрытии изобретения и особенно в формуле и/или пунктах такие термины, как "составляют", "составлен", "составляющий" и им подобные могут иметь значения, придаваемые им в Патентном законодательстве США, напр., они могут означать "включают", "включен", "включающий" и им подобные; а такие термины, как "состоящий в основном из" и "состоит в основном из" имеют значения, придаваемые им в Патентном законодательстве США, напр., они разрешают элементы, не указанные прямо, но исключают элементы, встречающиеся на предшествующем уровне техники или затрагивающие основные или новые характеристики изобретения.

Если не указано иначе, все технические и научные термины, используемые в настоящем изобретении, имеют те же самые значения, которые обычно понимаются специалистами в той области, к которой относится данное изобретение. Значения единственного числа включают и значения множественного числа, если из контекста четко не следует иное. Точно так же слово "или" может включать "и", если из контекста четко не следует иное.

Под "животными" подразумеваются млекопитающие, птицы и др. Животные или организмы хозяина включают млекопитающих и человека. Животные могут быть выбраны из группы, состоящей из лошадиных (напр., лошади), псовых (напр., собак, волков, лис, койотов, шакалов), кошачьих (напр., львов, тигров, домашних кошек, диких кошек, других больших кошек и иных кошачьих, включая гепардов и рысей), овечьих (напр., овец), бычьих (напр., крупного рогатого скота), свиных (напр., свиней), птиц (напр., кур, уток, гусей, индеек, перепелок, фазанов, попугаев, зябликов, ястребов, ворон, страусов, эму и казуаров), приматов (напр., просимид, долгопятов, макак, гиббонов, человекообразных обезьян) и рыб. Термин "животные" также включает индивидуальных животных на всех стадиях развития, включая эмбриональные и зародышевые стадии.

Термины "белок", "пептид", "полипептид" и "фрагмент полипептида" в настоящем изобретении применяются взаимозаменяемым образом к полимерам аминокислотных остатков любой длины. Полимеры могут быть линейными или разветвленными, они могут содержать модифицированные аминокислоты или аналоги аминокислот и могут прерываться другими химическими молекулами, чем аминокислоты. Термины также охватывают полимеры аминокислот, подвергнутые модификации естественным образом или вмешательством, к примеру, образованием дисульфидной связи, гликозилированием, липидированием, ацетилированием, фосфорилированием или любой иной манипуляцией или модификацией типа конъюгирования с меченым или биоактивным компонентом.

Антигенные полипептиды по изобретению способны давать защиту от гриппа. То есть они способны стимулировать иммунные ответы у животных. Под "антигеном" или "иммуногеном" подразумевается субстанция, вызывающая специфический иммунный ответ у животного-хозяина. Антиген может составлять целый организм, убитый, ослабленный или живой; субъединица или часть организма; рекомбинантный вектор, содержащий вставку с иммуногенными свойствами; кусок или фрагмент ДНК, способный вызвать иммунный ответ при предоставлении животному-хозяину; полипептид, эпитоп, гаптен или любая их комбинация. С другой стороны, иммуноген или антиген может содержать токсин или антитоксин.

Термин "иммуногенный или антигенный полипептид" в настоящем изобретении охватывает полипептиды, иммунологически активные в том смысле, что при введении хозяину они способны вызывать иммунный ответ гуморального и/или клеточного типа против белка. Предпочтительно фрагмент белка таков, что он обладает практически той же иммунологической активностью, что и целый белок. Таким образом, фрагмент белка по изобретению содержит или состоит в основном или состоит по меньшей мере из одного эпитопа или антигенной детерминанты. Термин "иммуногенный или антигенный" полипептид в настоящем изобретении включает полную последовательности белка, его аналоги или его иммуногенные фрагменты. Под "иммуногенным или антигенным фрагментом" понимается фрагмент белка, который содержит один или несколько эпитопов и тем самым вызывает иммунологический ответ, описанный выше. Такие фрагменты могут быть идентифицированы при помощи любого количества методик картирования эпитопов, хорошо известных в данной области. Напр., см. Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology, Vol.66 (Glenn E.Morris, Ed., 1996). К примеру, линейные эпитопы могут быть определены, напр., путем одновременного синтеза большого количества пептидов на твердых подложках, причем эти пептиды соответствуют частям молекулы белка, и проведения реакции пептидов с антителами, когда пептиды все еще прикреплены к подложкам. Такие методики известны и описаны, к примеру, в U.S. Pat. No.4,708,871; Geysen et al, 1984; Geysen et al., 1986. Точно так же конформационные эпитопы легко идентифицируются путем определения пространственной конформации аминокислот, напр., методом рентгеноструктурного анализа и 2-мерного ядерного магнитного резонанса. Напр., см. Epitope Mapping Protocols, supra. Способы, особенно применимые к белкам Т. parva, полностью описаны в PCT/US2004/022605, включенном путем ссылки во всей полноте.

Как уже обсуждалось, изобретение охватывает активные фрагменты и варианты антигенных полипептидов. Так, термин "иммуногенный или антигенный полипептид" также предусматривает делеции, вставки и замены в последовательности, если только полипептид продолжает вызывать выработку иммунологического ответа, как описано. Термин "консервативная вариация" обозначает замену одного аминокислотного остатка другим биологически сходным остатком либо замену нуклеотида в нуклеотидной последовательности таким образом, чтобы кодируемый аминокислотный остаток не изменялся либо заменялся на другой биологически сходный остаток. В этом смысле особо предпочтительные замены в общем будут консервативными по природе, то есть это замены, которые имеют место внутри семейства аминокислот.К примеру, аминокислоты в общем делятся на четыре семейства:(1) кислые - аспартат и глутамат; (2) основные - лизин, аргинин, гистидин; (3) неполярные - аланин, валин, лейцин, изолейцин, пролин, фенилаланин, метионин, триптофан; и (4) незаряженные полярные - глицин, аспарагин, глутамин, цистин, серин, треонин, тирозин. Фенилаланин, триптофан и тирозин иногда классифицируют как ароматические аминокислоты. Примеры консервативных вариаций включают замену одного гидрофобного остатка, такого как изолейцин, валин, лейцин или метионин, на другой гидрофобный остаток, или замену одного полярного остатка на другой полярный остаток, как-то замену аргинина на лизин, глутаминовой кислоты на аспарагиновую кислоту или глутамина на аспарагин и т.д.; или подобную консервативную замену аминокислоты на структурно родственную аминокислоту, которая не будет иметь большого эффекта на биологическую активность. Таким образом, белки с практически такой же аминокислотной последовательностью, что и контрольная молекула, но содержащие замены второстепенных аминокислот, которые практически не влияют на иммуногенность белка, попадают под определение контрольного полипептида. Все полипептиды, образованные такими модификациями, включены в настоящее изобретение. Термин "консервативная вариация" также включает применение замещенных аминокислот вместо незамещенных исходных аминокислот при условии, что антитела против замещенного полипептида также будут обладать иммунореактивностью к незамещенному полипептиду.

Термин "эпитоп" относится к тому сайту на антигене или гаптене, с которым взаимодействуют специфичные В-клетки и/или Т-клетки. Термин также применяется взаимозаменяемым образом с "антигенной детерминантой" или "сайтом антигенной детерминанты". Антитела, распознающие один и тот же эпитоп, могут быть идентифицированы методом простого иммуноанализа, показывающим способность одного антитела блокировать связывание другого антитела с антигеном мишени.

"Иммунологический ответ" на композицию или вакцину - это развитие в организме хозяина клеточного и/или опосредованного антителами иммунного ответа на данную композицию или вакцину. Обычно "иммунологический ответ" включает один или несколько из следующих эффектов:образование антител, В-клеток, хелперных Т-клеток и/или цитотоксических Т-клеток, направленных конкретно на антиген или антигены, включенные в данную композицию или вакцину. Предпочтительно у хозяина должен проявляться терапевтический либо защитный иммунологический ответ таким образом, что будет усиливаться сопротивляемость к новой инфекции и/или будет уменьшаться клиническая тяжесть заболевания. Такая защита будет проявляться уменьшением или отсутствием симптомов, обычно проявляющихся у инфицированного хозяина, более коротким сроком выздоровления и/или снижением титра вируса у инфицированного хозяина.

Синтетические антигены также включены в это определение, например, полиэпитопы, фланкирующие эпитопы и другие рекомбинантные или синтетически полученные антигены. Напр., см. Bergmann et al., 1993; Bergmann et al., 1996; Suhrbier, 1997; Gardner et al., 1998. Иммуногенные фрагменты для целей настоящего изобретения обычно включают по меньшей мере 3 аминокислоты, по меньшей мере 5 аминокислот, по меньшей мере 10-15 аминокислот или 15-25 аминокислот или более аминокислот в молекуле. Не существует критической верхней границы для длины фрагмента, который может составлять почти полную последовательность белка или даже слитый белок, содержащий по меньшей мере один эпитоп белка.

Соответственно, полинуклеотид, экспрессирующий эпитоп, имеет такую минимальную структуру, которая содержит или состоит в основном или состоит из нуклеотидов, кодирующих эпитоп или антигенную детерминанту полипептида гриппа. Полинуклеотид, кодирующий фрагмент полипептида гриппа, может содержать или состоять в основном или состоять из как минимум 15 нуклеотидов, примерно 30-45 нуклеотидов, примерно 45-75 или по меньшей мере 57, 87 или 150 последовательных или смежных нуклеотидов в последовательности, кодирующей полипептид. При воплощении изобретения можно использовать такие методы определения эпитопов, как создание библиотек перекрывающихся пептидов (Hemmer et al., 1998), Pepscan (Geysen et al., 1984; Geysen et al., 1985; Van der Zee R. et al., 1999; Multipin^®™. Peptide Synthesis Kits de Chiron) и алгоритмы (De Groot et al., 1999; PCT/US 2004/022605).

Термины "нуклеиновая кислота" и "полинуклеотид" относятся к РНК или ДНК, линейным или разветвленным, однонитчатым или двунитчатым, либо к их гибридам. Термин также охватывает гибриды РНК/ДНК. Неограничивающими примерами полинуклеотидов являются:гены или фрагменты генов, экзоны, интроны, мРНК, тРНК, рРНК, рибозимы, кДНК, рекомбинантные полинуклеотиды, разветвленные полинуклеотиды, плазмиды, вектора, выделенная ДНК любой последовательности, выделенная РНК любой последовательности, зонды из нуклеиновых кислот и праймеры. Полинуклеотид может содержать модифицированные нуклеотиды, как-то метилированные нуклеотиды и аналоги нуклеотидов, урацил, другие сахара и соединительные группы типа фторорибозы и тиолата и нуклеотидные ветки. Последовательность полинуклеотидов может быть дополнительно модифицирована после полимеризации, как-то посредством конъюгации с меченой компонентой. Другие типы модификаций, охватываемые данным определением, включают кэпы, замены одного или нескольких природных нуклеотидов их аналогами и введение средств для присоединения полинуклеотида к белкам, ионам металлов, меченым компонентам, другим полинуклеотидам или к твердой подложке. Полинуклеотиды могут быть получены химическим синтезом либо происходить из микроорганизма.

Термин "ген" применяется в широком смысле для обозначения любых сегментов полинуклеотидов, связанных с биологической функцией. При этом гены включают интроны и экзоны, как в геномной последовательности, либо только кодирующие последовательности, как в кДНК, и/или регуляторные последовательности, необходимые для их экспрессии. Например, ген также означает фрагмент нуклеиновой кислоты, который экспрессирует мРНК или функциональную РНК либо кодирует определенный белок, а также включает регуляторные последовательности.

Изобретение также включает комплементарные нити полинуклеотидов, кодирующих антиген, эпитоп или иммуноген гриппа. Комплементарная нить может быть полимером любой длины, а также содержать дезоксирибонуклеотиды, рибонуклеотиды и аналоги в любой комбинации.

"Выделенный" биологический компонент (как-то нуклеиновая кислота или белок или органелла) означает такой компонент, который был существенно выделен или очищен от других биологических компонентов в тех клетках организма, в которых этот компонент встречается в природе, например, других хромосомных и внехромосомных ДНК и РНК, белков и органелл. К "выделенным" нуклеиновым кислотам и белкам относятся нуклеиновые кислоты и белки, очищенные стандартными методами очистки. Термин также охватывает нуклеиновые кислоты и белки, полученные по рекомбинантной технологии, а также химическим синтезом.

Термин "очищенный" в настоящем изобретении не требует абсолютной чистоты, скорее он служит относительным термином. Так, например, очищенным препаратом полипептида является такой, в котором полипептид является более обогащенным, чем в своем естественном окружении. То есть этот полипептид отделен от других клеточных компонентов. Под практически очищенным подразумевается то, что было удалено по меньшей мере 60%, 70%, 80%, 90%, 95% или по меньшей мере 98% или больше клеточных компонентов или материалов. Точно так же полипептид может быть частично очищенным. Под частично очищенным подразумевается то, что было удалено менее 60% клеточных компонентов или материалов. То же самое касается полинуклеотидов. Полипептиды, приведенные в настоящем изобретении, могут быть очищены любым известным способом.

Как отмечено выше, антигенными полипептидами либо их фрагментами или вариантами являются антигенные полипептиды гриппа, продуцируемые в ряске. Фрагменты и варианты приведенных полинуклеотидов и кодируемых ими полипептидов также охватываются настоящим изобретением. Под "фрагментом" имеется в виду часть полинуклеотида или часть кодируемой им антигенной последовательности аминокислот.Фрагменты полинуклеотидов могут кодировать фрагменты белков, сохраняющие биологическую активность нативного белка, поэтому они обладают иммуногенной активностью, как отмечено выше. Фрагменты последовательностей полипептидов сохраняют способность вызывать защитный иммунитет у животных.

"Варианты" служат для обозначения существенно сходных последовательностей. У полинуклеотидов варианты включают делеции и/или вставки одного или нескольких нуклеотидов по одному или нескольким сайтам в нативном полинуклеотиде и/или замены одного или нескольких нуклеотидов по одному или нескольким сайтам в нативном полинуклеотиде. В настоящем изобретении "нативный" полинуклеотид или полипептид содержит природную последовательность нуклеотидов или аминокислот, соответственно. Варианты определенного полинуклеотида по изобретению (то есть контрольного полинуклеотида) также можно оценивать путем сравнения степени идентичности последовательности между полипептидом, кодируемым вариантом полинуклеотида, и полипептидом, кодируемым контрольным полинуклеотидом. "Вариант" белка означает белок, полученный из нативного белка путем делеции или вставки одной или нескольких аминокислот по одному или нескольким сайтам в нативном белке и/или замены одной или нескольких аминокислот по одному или нескольким сайтам в нативном белке. Варианты белков, охваченные настоящим изобретением, являются биологически активными, то есть они способны вызывать иммунный ответ.

Гомологи полипептидов гриппа из птиц, свиней, лошадей, кошек, собак, уток, индеек, кур, перепелок и других видов, включая диких животных, входят в рамки настоящего изобретения. В настоящем изобретении термин "гомологи" включает ортологи, аналоги и паралоги. Термин "аналоги" относится к двум полинуклеотидам или полипептидам, имеющим одинаковые или близкие функции, но возникших по отдельности в неродственных организмах. Термин "ортологи" относится к двум полинуклеотидам или полипептидам из разных видов, но возникших из общего предкового гена при расхождении видов. В норме ортологи кодируют полипептиды, имеющие одинаковые или сходные функции. Термин "паралоги" относится к двум полинуклеотидам или полипептидам, возникшим путем дупликации в геноме. Паралоги обычно имеют разные функции, но эти функции могут быть связанными. Аналоги, ортологи и паралоги полипептида гриппа дикого типа могут отличаться от полипептида гриппа дикого типа посттрансляционными модификациями, различиями в аминокислотной последовательности или тем и другим. В частности, гомологи по изобретению обычно проявляют идентичность последовательности по меньшей мере на 80-85%, 85-90%, 90-95% или 95%, 96%, 7%, 98% или 99% со всей или частью последовательности полипептида или полинуклеотида гриппа дикого типа и проявляют сходные функции. Варианты включают аллельные варианты. Термин "аллельные варианты" относится к полинуклеотидам или полипептидам, содержащим полиморфизмы, вызывающие изменения аминокислотной последовательности белка и существующие в природной популяции (напр., вида или разновидности вируса). Такие природные аллельные варианты, как правило, вносят 1-5% вариаций в полинуклеотиде или полипептиде. Аллельные варианты могут быть идентифицированы при секвенировании данной последовательности нуклеиновой кислоты у целого ряда различных видов, что легко выполняется при помощи гибридизационных зондов для идентификации генетических локусов одного и того же гена у этих видов. Предусматривается, что все такие вариации нуклеиновых кислот и возникающие при этом полиморфизмы или вариации аминокислот, которые являются результатом естественной аллельной изменчивости и не изменяют функциональную активность данного гена, входят в рамки изобретения.

В настоящем изобретении термин "производное" или "вариант" относится к полипептидам или нуклеиновым кислотам, кодирующим полипептиды, содержащим одну или несколько консервативных изменений аминокислот или других небольших модификаций, при которых (1) соответствующий полипептид обладает практически эквивалентной функцией в сравнении с полипептидом дикого типа или (2) антитело против этого полипептида проявляет иммунореактивность к полипептиду дикого типа. Эти варианты или производные включают полипептиды, содержащие небольшие модификации первичной аминокислотной последовательности полипептидов гриппа, которые могут давать пептиды, обладающие практически эквивалентной активностью по сравнению с соответствующим немодифициованным полипептидом. Такие модификации могут быть преднамеренными, как при направленном мутагенезе, или спонтанными. Термин "вариант" также предусматривает делеции, вставки и замены в последовательности, если только полипептид продолжает вызывать иммунологический ответ, как описано. Термин "вариант" также включает такие модификации полипептида, при которых природный сигнальный пептид заменяется на гетерологичный сигнальный пептид, что облегчает экспрессирование или секрецию полипептида из организма хозяина. Он также включает такие модификации полипептида, при которых трансмембранный домен и/или цитоплазматический хвост заменяется на сходную гетерологичную последовательность, что облегчает мембранную экспрессию полипептида в организме хозяина.

Термин "консервативная замена" обозначает замену аминокислотного остатка другим биологически сходным остатком или замену нуклеотида в последовательности нуклеиновой кислоты, при которой кодируемый аминокислотный остаток не изменяется или заменяется на другой биологически сходный остаток. В этом отношении особенно предпочтительные замены в общем должны быть консервативными по природе, как описано выше.

Полинуклеотиды изобретения включают последовательности, которые являются результатом вырожденности генетического кода, напр., оптимизированного употребления кодонов у определенного хозяина. В настоящем изобретении "оптимизированные" относятся к полинуклеотидам, подвергнутым генетической инженерии для усиления их экспрессии у данного вида. Для получения оптимизированных полинуклеотидов, кодирующих полипептиды гриппа, последовательность ДНК гена белка вируса гриппа можно модифицировать так, чтобы она:1) содержала кодоны, которые предпочтительны у сильно экспрессируемых генов у данного вида; 2) имела практически такое же содержание А+Т или G+C в составе оснований нуклеотидов, как у данного вида; 3) образовала последовательность инициации данного вида; или 4) устранить последовательности, которые вызывают дестабилизацию, неправильное полиаденилирование, деградацию и экстерминацию РНК либо образуют вторичные структуры типа шпилек или сайты сплайсинга РНК. Усиление экспрессии белка гриппа у данного вида достигается использования частоты распределения употребительности кодонов у эукариот и прокариот или у определенного вида. Термин "частота предпочтительного употребления кодонов" относится к проявляемой клетками определенного хозяина предпочтительности употребления нуклеотидных кодонов для определения данной аминокислоты. Существует 20 природных аминокислот, большинство которых определяются более чем одним кодоном. Поэтому все вырожденные последовательности нуклеотидов включены в изобретение, если только последовательность аминокислот полипептида гриппа, кодируемого последовательностью нуклеотидов, будет функционально неизмененной.

Степень идентичности между двумя последовательностями аминокислот может быть установлена с помощью программы попарного сравнения BLAST и матрикса blosum62 из NCBI (Национального центра информации по биотехнологии), используя стандартные параметры (напр., см. алгоритм BLAST или BLASTX, доступный на сервере NCBI (Bethesda, MD, США), а также в Altschul et al.; при этом в настоящем документе об использовании алгоритма или BLAST или BLASTX и матрикса blosum62 говорится с помощью термина "бласт").

"Идентичность" в отношении последовательностей может относиться к количеству положений с идентичными нуклеотидами или аминокислотами, деленному на количество нуклеотидов или аминокислот в более короткой из двух последовательностей, при этом совмещение двух последовательностей может проводиться в соответствии с алгоритмом Вилбура и Липмана (Wilbur and Lipman), например, при размере окна в 20 нуклеотидов, длине слова в 4 нуклеотида и штрафе за пробел в 4 балла, а анализ с помощью компьютера и интерпретацию данных о последовательности, включая их сопоставление, можно удобно проводить с помощью коммерчески доступных программ (напр., комплекта Intelligenetics™ Suite, Intelligenetics Inc., CA). Когда говорят, что последовательности РНК являются сходными или имеют какую-то степень идентичности или гомологичности последовательности с последовательностями ДНК, то тимидин (Т) в последовательности ДНК считается равным урацилу (U) в последовательности РНК. Таким образом, последовательности РНК входят в рамки изобретения и могут быть выведены из последовательностей ДНК, полагая тимидин (Т) в последовательности ДНК равным урацилу (U) в последовательности РНК.

Степень идентичности или степень схожести между двумя аминокислотными последовательностями либо степень идентичности между двумя нуклеотидными последовательностями можно определить с помощью пакета программ Vector NTI (Invitrogen, 1600 Faraday Ave., Carlsbad, CA).

В следующих документах представлены алгоритмы для сравнения относительной идентичности или гомологичности последовательностей, а кроме того или наряду с вышесказанным положения этих ссылок можно использовать для определения степени гомологичности или идентичности:Needleman SB and Wunsch CD; Smith TF and Waterman MS; Smith TF, Waterman MS and Sadler JR; Feng DF and Dolittle RF; Higgins DG and Sharp PM; Thompson JD, Higgins DG and Gibson TJ; Devereux J, Haeberlie P and Smithies О. И без излишнего экспериментирования специалисты могут воспользоваться многими другими программами или ссылками для определения степени гомологичности.

Реакции гибридизации могут проводиться в условиях различной "жесткости". Условия, повышающие жесткость реакции гибридизации, хорошо известны. Например, см. "Molecular Cloning:A Laboratory Manual", 2nd edition (Sambrook et al., 1989).

Вектор" означает плазмиду из рекомбинантной ДНК или РНК или вирус, содержащие гетерологичный полинуклеотид для доставки в клетки мишени in vitro либо in vivo. Гетерологичный полинуклеотид может содержать представляющие интерес посл