Hyr1 в качестве мишени для активной и пассивной иммунизации против candida

Hyr1 в качестве мишени для активной и пассивной иммунизации против candida

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Сведения относительно финансирования исследования государством

Данное изобретение было создано при поддержке государством грантами Министерства Здравоохранения R21 AI066010, R01 AI067703, R01 AI063503, и R03 AI083251. Правительство США имеет права на данное изобретение.

Область техники

Настоящее изобретение относится к белкам клеточной оболочки гифа Candida, к антителам, полученным в результате иммунного ответа на вакцинацию с белками клеточной оболочки гифа Candida, и к способам профилактики и/или лечения кандидоза и других бактериальных инфекций с белками клеточной оболочки гифа Candida.

Уровень техники

Все документы, указанные в настоящем изобретении, или указанные части, включены в настоящем изобретении посредством ссылок, включая предварительную заявку США с порядковым номером 61/223,005, поданную 3 июля 2009. Никакой документ, однако, не признан известным уровнем техники для заявленного изобретения.

Приблизительно 60,000 случаев диссеминированного кандидоза происходит ежегодно в Соединенных Штатах Америки [1], в результате чего затрачиваются миллиарды долларов на медицинскую помощь. С учетом 40% смертности от подобных инфекций, существует необходимость выявления новых профилактических средств или терапевтических мишеней для воздействия.

Основным иммунологическим защитным механизмом против диссеминированного кандидоза является фагоцитарный киллинг организма [2.3]. Только фагоцитарные клетки способны на непосредственный киллинг Candida in vitro [4]. Кроме того, в течение тридцати минут внутривенного введения Candida мышам, кроликам, собакам или людям, дрожжевые грибки сохраняются внутри ретикулоэндотелиальной системы, особенно в печени. Печень, с высоким содержанием макрофагов Купффера, способна очистить 99,9% дрожжевых грибков в системе воротной вены в течение одного прохода [5], что подчеркивает эффективность фагоцитарного защитного механизма против грибов. Таким образом, резистентность С. albicans к фагоцитарному киллингу является важнейшей вирулентной функцией организма.

Гликозилфосфатидилинизитол (GPI)-закрепленные белки клеточной поверхности, находятся на главной границе раздела между патогеном и хозяином, что делает эти белки возможными участниками во взаимодействии хозяин-патоген [6].

Идентификация эффекторов в регуляторном пути организма, которые участвуют в вирулентности, обеспечивает возможность для терапевтического воздействия с помощью способов или композиций, которые превосходят существующие противогрибковые средства. Идентификация белков клеточной поверхности или белков, относящихся к гифам, которые влияют на регуляторный путь, связанный с вирулентностью, является особенно перспективным потому, что характеристика белка позволяет осуществлять иммунотерапевтические методы, которые с большой вероятностью превосходят или оказывают синергическое действие с существующими противогрибковыми средствами при борьбе с кандидозной инфекцией.

Вирулентность С. albicans регулируется несколькими предполагаемыми вирулентными факторами, среди которых прилипание к компонентам хозяина и способность превращаться из дрожжевых грибков в гифы являются наиболее важными при определении патогенности. Несмотря на то, что эффективные противогрибковые средства существуют, которые являются бактерицидными по отношению к Candida, смертность, вызываемая кандидемией составляет приблизительно 38%, даже при лечении сильными противогрибковыми веществами, таким как амфотерицин В. Также, существующие вещества, такие как амфотерицин В, обычно проявляют нежелательную токсичность. Хотя дополнительные противогрибковые препараты, которые могут быть разработаны, являются менее токсичными, чем амфотерицин В, маловероятно, что эти вещества будут более эффективными. Поэтому, любая пассивная или активная иммунотерапия для лечения или профилактики диссеминированного кандидоза является преспективной альтернативой стандартной противогрибковой терапии.

Таким образом, существует необходимость в эффективных иммуногенах, которые обеспечат хозяину иммунную защиту и пассивную иммунологическую защиту против Candida и других иммуногенных подобных патогенов. Настоящее изобретение отвечает этим требованиям и также имеет соответствующие преимущества.

Сущность изобретения

Настоящее изобретение относится к полипептидным антигенам HYR1 Candida и терапевтическому применению подобных антигенов. Полипептидные антигены HYR1 настоящего изобретения могут быть использованы для лечения или профилактики инфекции Candida у субъекта.

При помощи скрининга новых систем условной гиперэкспрессии/супрессии, направленного на GPI - закрепленные белки на C. albicans, авторы изобретения идентифицировали HYR1 как вирулентный фактор. HYR1 является ко-экспрессирующим геном гифа, нулевой мутантный штамм которого не отображает каких- либо морфологических нарушений in vitro [7]. Ниже авторы приводят результаты, наглядно показывающие, что HYR1 является посредником резистентности к фагоцитарному киллингу in vitro, модулирует тканевую грибковую нагрузку in vivo и является, таким образом, мишенью вакцины для облегчения тяжести диссеминированного кандидоза.

Определения

Термин «HYR1» полипептид означает полипептид, который по существу идентичен аминокислотной последовательности SEQ ID NO:1. Желательно, чтобы полипептид HYR1 имел, по меньшей мере, 70, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% или даже 100% идентичности с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:1.

Термин «фрагмент полипептида HYR1» или «фрагмент HYR1» означает фрагмент полипептида HYR1, содержащий менее, чем 937, 936 или 935 аминокислот. Преимущественно, фрагменты HYR1 составляют от 300 до 350 или от 250 до 500 аминокислот в длину. Желательно, чтобы фрагмент был менее чем 937, 936, 935, 934, 933, 932, 931 или 930, 920, 910, 900, 890, 880, 870, 860, 850, 840, 830, 820, 810, 800, 790, 780, 770, 760, 750, 740, 730, 720, 710, 700, 690, 680, 670, 660, 650, 640, 630, 620, 610, 600, 590, 580, 570, 560, 550, 540, 530, 520, 510, 500, 490, 480, 470, 460, 450, 440, 430, 420, 410, 400, 390, 380, 370, 360, 350, 340, 330, 320, 310, 300, 290, 280, 270, 260, 250, 240, 230, 220, 210, 200, 190, 180, 170, 160, 150, 140, 130, 120, 110, 100, 90, 80, 70, 60, 50, 40, 30, 25, 20, 15, или 10 аминокислот и, желательно, являлся иммуногенным. Фрагмент HYR1, например, может содержать одну или более консервативных аминокислотных замен в последовательности SEQ ID NO:2. Дополнительные желательные фрагменты HYR1 содержат одну или более консервативных аминокислотных замен в последовательности SEQ ID NO:2 и/или, по меньшей мере, одну фланкирующую аминокислоту (например, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 фланкирующих аминокислот) на N- и/или С- конце последовательности SEQ ID No:2. Другие предпочтительные фрагменты HYR1 содержат семь и более последовательных аминокислот последовательности SEQ ID NO:2.

Неограничивающие примеры фрагмента HYR1 включают аминокислоты 1-40, 10-50, 20-60, 30-70, 40-80, 50-90, 60-100, 70-110, 80-120, 90-130, 100-140, 110-150, 120-160, 130-170, 140-180, 150-190, 160-200, 170-210, 180-220, 190-230, 200-240, 210-250, 220-260, 230-270, 240-280, 250-290 и 260-300, 270-310, 280-320, и 290-331 последовательности SEQ ID NO:2; и эти фрагменты имеют одну или более следующих особенностей: одну или более консервативных аминокислотных замен (например, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 или 16 консервативные аминокислотные замены) в последовательности SEQ ID NO:2; одну или более аминокислот (например, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 или 16 аминокислот) усеченных на N- и/или С-конце последовательности SEQ ID NO:2; и, по меньшей мере, одну фланкирующую аминокислоту (например, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 фланкирующих аминокислот) на N- и/или С-конце последовательности SEQ ID NO:2.

Термин «практически идентичный» означает полипептид, проявляющий, по меньшей мере, 50%, желательно 60%, 70%, 75% или 80%, более желательно 85%, 90% или 95%, и наиболее желательно 99% идентичности аминокислотной последовательности к указанной аминокислотной последовательности. Длина сравниваемых последовательностей, как правило, по меньшей мере, 10 аминокислот, желательно, по меньшей мере, 15 заменимых аминокислот, более желательно, по меньшей мере, 20, 25, 50, 75, 90, 100, 150, 200, 250, 275, 300, 310, 315, 320, 325, 330, 335, 340, 345 или 350 заменимых аминокислот, и наиболее желательно, полная длина аминокислотной последовательности.

Идентичность последовательности может быть измерена при использовании компьютерной программы анализа последовательности по умолчанию (например, Sequence Analysis Software Package of the Genetics Computer Group, University of Wisconsin Biotechnology Center, 1710 University Avenue, Madison, WI 53705). Такая компьютерная программа может противопоставлять похожие последовательности, устанавливая степень гомологии различных замен, делеций и других модификаций. Множественные последовательности могут быть также выравнены с использованием программы Clustal W(1.4) (производство Julie D. Thompson и Toby Gibson of the European Molecular Biology Laboratory, Germany и Desmond Higgins of European Bioinformatics Institute, Cambridge, UK), путем ввода парного выравнивания режимом «медленно», параметры парного выравнивания включают штраф на внесение делеции в выравнивание 10.0 и штраф на продолжение выравнивания 0.1, а также задают сходную матрицу «blosum». Дополнительно, параметры множественного выравнивания могут включать штраф на внесение делеции в выравнивание 10.0, штраф на продолжение выравнивания 0.1, а также задают сходную матрицу «blosum», замедляют расхождения до 40% и протяженность разрыва до 8.

Термин «консервативная аминокислотная замена», используемый в данной заявке, означает замену в аминокислотной последовательности аминокислоты на другую в пределах семейства аминокислот, а именно родственных по химическим свойствам их боковых цепей.

Генетически закодированные аминокислоты можно подразделить на четыре семейства: кислые (аспартат, глутамат), основные (лизин, аргинин, гистидин), неполярные (аланин, валин, лейцин, изолейцин, пролин, фенилаланин, метионин, триптофан) и полярные незаряженные (глицин, аспарагин, глутамин, цистеин, серии, треонин, тирозин). Фенилаланин, триптофан и тирозин иногда группируют как ароматические аминокислоты. Аналогично, аминокислоты могут также разделять на следующие группы: кислые (аспартат, глутамат), основные (лизин, аргинин, гистидин), алифатические (глицин, аланин, валин, лейцин, изолейцин, серин, треонин), с серином и треонином не обязательно группируют отдельно как алифатическую гидроксильную; ароматические (фенилаланин, тирозин, триптофан); амиды (аспарагин, глутамин); и серосодержащие (цистен, метионин).

Любое изменение в аминокислотной последовательности, приводящее к функциональным гомологам, может быть определено путем оценки способности различных пептидов функционировать некоторым образом подобно белку дикого вида, используя стандартные способы, такие как исследования, описанные здесь.

Желательное осуществление настоящего изобретения включает, по меньшей мере, одну консервативную аминокислотную замену в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:1 или 2; и, более желательно, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 консервативных аминокислотных замен в последовательности SEQ ID NO:1 или 2.

Термин «фланкирующая аминокислота» означает аминокислоту в полипептидной последовательности, которая непосредственно прилегающую на N-или С-конце той или иной определенной последовательности. Желательно, фланкирующая аминокислота находится на N- и/или С-конце аминокислотной последовательности SEQ ID NO:1 или 2 или их фрагмента; и более предпочтительно, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 фланкирующие аминокислоты находятся на N- и/или С-конце аминокислотной последовательности SEQ ID NO:1 или 2, или их фрагмента.

Используемый в данной заявке термин «белок слияния» относится к полипептиду, состоящему из (1) полипептида HYR1, фрагмента HYR1; и (2) партнера слияния.

Используемый в данной заявке термин «партнер слияния» относится к гетерологичной последовательности, которая может сливаться с полипептидом HYR1 или фрагментом HYR1. Примеры партнеров слияния описаны в данной заявке и включают определение маркеров, стабилизацию доменов или последовательностей, которые способствуют производству или очистке белков.

Используемый в данной заявке термин «иммунный ответ» относится к активации иммунной системы организма в ответ на антиген или возбудитель инфекции. У позвоночных он может включать, но не ограничиваться ими, одну или более следующих: мутация нативных В-клеток в В-клетках памяти; производство антител клетками плазмы (эффекторные В-клетки); индукция клеточного иммунитета; активация и освобождение цитокина CD4⁺ Т-клетками; активация и освобождение цитокина CD4⁺ Т-клетками; пополнение цитокинов и активация фагоцитарных клеток (например, макрофагов, нейтрофилов, эозинофилов); и/или активация комплемента.

Термин «иммуногенный» означает любую субстанцию, способную индуцировать иммунный ответ у субъекта.

Термин «фармацевтически приемлемая соль» означает любую нетоксичную кислотно-аддитивную соль или металлокомплекс, используемые в фармацевтической индустрии. Примеры кислотно-аддитивных солей включают органические кислоты, такие как уксусная, молочная, памовая, малеиновая, лимонная, яблочная, аскорбиновая, янтарная, бензойная, пальмитиновая, пробковая, салициловая, винная, матансульфоновая, толуолсульфокислая или трифторуксусная кислоты или в этом роде; полимерные кислоты, такие как дубильная кислота, карбоксиметилцеллюлоза или в этом роде; и неорганические кислоты, такие как солярная кислота, бромистоводородная кислота, серная кислота, фосфорная кислота или в этом роде. Металлокомплексы включают цинк, железо и тому подобное.

Термин «фармацевтически приемлемый носитель» означает любой раствор, используемый для растворения и доставки вещества субъекту. Предпочтительно, фармацевтически приемлемым носителем является солевой раствор. В предпочтительном осуществлении, фармацевтически приемлемый носитель включает адъювант. Примеры адъювантов описаны в данной заявке. Другие физиологически приемлемые носители и композиции на их основе известны специалисту в данной области техники и описаны, например, в Remington's Pharmaceutical Sciences, (20th edition), ed. A. Gennaro, 2003, Lippincott Williams & Wilkins.

Термин «выделенный» означает белок (или его фрагмент), выделенный из компонентов, которые естественным образом сопровождают его. Как правило, полипептид является по сути выделенным, когда он составляет, по меньшей мере на 60% по весу, свободный от белков и естественных органических молекул, с которыми он естественным образом связывается. Определение также распростроняется и на полипептид, отделенный от его фланкирующих аминокислот (например, для аминокислотной последовательности, выделение относится к последовательности, которая свободна от фланкирующих аминокислот, с которыми последовательность естественным образом связывается в полипептиде). Предпочтительно, полипептид, по меньшей мере, на 75%, более предпочтительно, по меньшей мере, на 90% и наиболее предпочтительно, по меньшей мере, на 99% по весу выделен. Выделенный полипептид может быть получен стандартными способами, например, путем экстракции из естественных источников (например, очистка клеток, инфицированных Candida), путем экпрессии рекомбинантных нуклеиновых кислот, кодирующих фрагмент HYR1; или слиянием его белков путем химического синтеза полипептида. Степень чистоты может быть измерена любым подходящим способом, например, колоночной хроматографией, электрофорезом в полиакриламидном геле или HPLC анализом.

Термин «терапевтически эффективное количество» означает количество иммуногенного соединения (например, полипептида, фрагмента, белка слияния или вакцины), необходимого для получения у субъекта одного или более следующих эффектов: иммунного ответа; снижения уровня инфекции Candida (например, уменьшение, по меньшей мере, на 5%, 10%, 20% или 30%; более желательно, на 40%, 50%, 60% или 70%; и наиболее желательно на 80% или 90%); ослабление (например, по меньшей мере, на 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% или даже 100% снижение) одного или более симптомов инфекции Candida у пациента; или повышение устойчивости к новой инфекции Candida (например, увеличение, по меньшей мере, на 5%, 10%, 20%, 30%, 40% или 50%; более желательно, на 60%, 70%, 80%, or 90%; или, наиболее желательно, на 100%, 200% или 300%).

Другие признаки и преимущества настоящего изобретения будут очевидны из следующего Подробного Описания, чертежей и формулы изобретения.

Краткое описание чертежей

Фигура 1. Условная экспрессия HYR1 усиливает опосредованный киллинг C. albicans нейтрофилами и макрофагами. (А) Подтверждение условной сверхэкспрессии/супрессии HYR1 штамма СААН-31. Результаты RT-ПЦР демонстрируют сверхэкспрессию HYR1 гена в -DOX среде и недостаток экспрессии в+DOX среде. Фрагмент EFB1 был ко- амплифицирован и служил в качестве контроля. Отсутствие загрязнения геномной ДНК при приготовлении кДНК проверяли отсутствием 919 bp полоски, содержащейся в интроне EFB1. ТНЕ31 был контрольным штаммом дикого типа. (Б) Штаммы C. albicans выращивали в YPD с DOX (супрессия HYR1) и без DOX (сверхэкспрессия HYR1) при 30°С всю ночь и затем совместно культивировали с нейтрофилами человека; (В) C.albicans совместно культивировали с HL-60 производными нейтрофилов; (Г) с HL-60 производными макрофагов.

Фигура 2. Экспрессия HYR1 Candida albicans увеличивает резистентность к киллингу нейтрофилами человека в bcr1 нулевых-мутантах или штамме С. glabrata. (A и Б) Автономная экспрессия HYR1 в штамме С albicans, лишенном bcr1, полностью комплементарна повышенной восприимчивости родительского штамма к резистентности нейтрофильного киллинга. Штаммы С. albicans DAY 18 5 (дикий тип), CJN702 (bcr1 нулевой мутант) и CJN698 (BCR1 комплементарный) CJN114, CJN1153, CJN1222, CJN1259, CJN1276, CJN1281 и CJN1288 (автономно экспрессируют ALS1, ALS3, HWP1, HYR1, RBT5, СНТ2 и ЕСЕ1 в bcr1 с теневым фенотипом нулевого мутанта, соответственно) выращивают в YPD всю ночь при 30°С. Данные отображаются в виде среднего значения ± вероятность. *Р<0.04 по сравнению с диким типом и BCR1-дополненным. (В) Гетерологичная экспрессия гена HYR1 С. albicans повышает резистентность С. glabrata к HL-60 производными нейтрофилов опосредованному киллингу. *Р<0.0001.

Фигура 3. Обнаружение экспрессии HYR1 при диссеминированном кандидозе, хотя эта экспрессия была изначально ингибирована нейтрофилами in vitro. (А) Почки, печень, легкие, селезенка и мозги были собраны через 6 или 24 часа после внутривенного инфицирования С. albicans. Гнездовая RT- ПЦР была использована для определения экспрессии HYR1. EFB1 С. albicans и конструктивный ген мыши G3PDH были использованы в качестве контроля. + означает инфицированные мыши, в то время как - означает неинфицированные мыши. (Б) HL-60 производные нейтрофилов ингибируют экспрессию HYR1 С. albicans. Дикий тип С. albicans культивировали в RPMI 1640 с добавлением 10% объединенной сывороткой человека. Без нейтрофилов экпрессия HYR1 была определена после получасовой индукции. С нейтрофилами, экпрессия HYR1 ингибировалась два часа.

Фигура 4. Экпрессия HYR1 in vivo и его действие на грибковую нагрузку. Для определения экпрессии HYR1 в процессе диссеминированного кандидоза, почки, печень, легкие, селезенка и мозги были собраны через 6 или 24 часа после внутривенного инфицирования С. albicans. Гнездовая RT-ПЦР была использована для определения экспрессии HYR1. EFB1 С. albicans и конструктивный ген мыши G3PDH были использованы в качестве контроля. + означает инфицированные мыши, в то время как - означает неинфицированные мыши (А). Условная экспрессия HYR1 повышает грибковую нагрузку в органах с распространением тканевых фагоцитов. Нагрузка С. albicans в печени и селезенке иммунокомпетентных мышей (n=8 в группе), инфицированных HYR1 С. albicans или контрольным штаммом, выращенных в условиях условной экпресии (-DOX) или супрессии (+DOX) (А) и экпресия HYR1 in vivo (Б). Печень и селезенку собрали в тот же день после инфицирования. На оси Y отображены нижние пределы обнаружения исследования. Данные отображаются в виде среднего значения ± вероятность. *Р<0.0001 по сравнению с не экспрессирующим HYR1 штаммом (HYR1-DOX) или контрольным штаммом.

Фигура 5. Непрямая иммунофлюоресценция с анти-Hyr1p сывороткой показывает проявление экспрессии Hyr1p в гифах С, albicans. Формирование гифа было вызвано инкубацией С. albicans в RPMI 1640 в течении 90 минут. Клетки окрашивали с либо предварительно абсорбированной анти-HYR1 сывороткой hyr1 нулевого мутанта (1:1000) или анти-белком, приготовленным из сыворотки пустого плазмидного клона (отрицательный контроль) с последующей окраской Alex меченных анти-мышиных Ab.

Фигура 6. Рекомбинантный N- концевой Hyr1p (rHyr1p-N) отличается защищенностью от мышинного гематогенного диссеминированного кандидоза. (А) Выживаемость мышей (8 мышей в группе), вакцинированных rHyr1p-N, смешанного с полным или неполным адъювантом Фрейда и инфицированные в хвостовую вену с 2.2×10⁵ бластоспор SC5314 Candida albicans. (Б) Выживаемость мышей (8 мышей в группе, исключая контрольную группу, в которой 17 мышей), вакцинированных rHyr1p-N или нейтрализованным rHyr1p-N, смешанным с 0.1% гидрокисью алюминия, и инфицированных с 7×10⁵ бластоспорами 15563 Candida albicans. *Р<0.001 логарифмический ранговый критерий. (В) Эффективность вакцинации или контроля F(ab)'₂ на блокирование нейтрофильного киллинга мыши С. albicans, условно экспрессирующей или супрессирующей Hyr1. Контроль показывает исследование, выполненное при отсутствии любого F(ab)'₂. Данные отображаются в виде среднего значения±вероятный диапазон. *Р=0.001 по тесту Манна-Уитни.

Подробное описание изобретения

Candida albicans является распространненным патогеном у людей. Так например, С. albicans, хотя в повседневной жизни безобидный условно-патогенный микроорганизм, в различных условиях может стать причиной целого ряда заболеваний от поверхностной кожно-слизистой инфекции, такой как вагинальный и/или орофарингиальный кандидоз, до глубокого органного поражения диссеминированным кандидозом. До вызывания болезни, грибы колонизируются в желудочно-кишечном тракте и иногда поражают кожные и слизистые оболочки. Соединение с слизистой поверхностью хозяина является ключевым требованием для этого первоначального шага. После колонизации, С. albicans попадает в кровоток путем инфицирования внутрисосудистой системы или перемещается через слизистую желудочно-кишечного тракта, поврежденную химиотерапией или стресс-язвой. Микроорганизмы затем распространяются по кровотоку, связываются и проникают внутрь васкулярного эндотелия, чтобы выйти из сосудистой сети, и попадают вглубь органов, таких как печень, селезенка и почки.

Определение и функциональная характеристика фрагмента HYR1, описанная здесь, позволяет этому полипептиду эффективно применяться в лечении кандидоза.

Природа патогенеза С. albicans, за счет присоединения к эндотельным клеткам, рассмотрена в патенте США No.5,578,309, который специально включен здесь в качестве ссылки в полном объеме. Для описания гена HYR1 и его характеристики, включая характеристику продукции гена, см. Bailey et al. (Journal of Bacteriology 178:5353-5360,1996).

Изобретение относится к вакцине, содержащей выделенный фрагмент HYR1 и, необязательно, адъювант в фармацевтически приемлемой среде. Вакцина может содержать фрагмент HYR1, полученный из вида Candida, такого как Candida albicans, Candida krusei, Candida tropicalis, Candida glabrata или Candida parapsilosis.

В изобретении применяют продукт последовательности гена HYR1 С. albicans в качестве вакцины для лечения, предупреждения или облегчения диссеминированного кандидоза. Вакцина является эффективной против различных штаммов С. albicans, a также против различных видов Candida.

Таким образом, согласно одному аспекту, изобретение относится к фрагменту HYR1 эффективному, разработанному в виде фармацевтической композиции и вводимому как вакцина с содержанием или без адъюванта. Фрагмент HYR1 может быть кандидозного происхождения и может быть получен, например, из видов, принадлежащих к классу Candida, например, Candida parapsilosis, Candida krusei, Candida glabrata и Candida tropicalis. Фрагмент HYR1 может быть получен в выделенной или очищенной форме и, таким образом, согласно одному из вариантов изобретения, фрагмент HYR1, разработанный в виде вакцины, вызывает иммунный ответ у пациента на вызванный иммунный ответ против Candida.

Изобретение также относится к способу лечения или предупреждения диссеминированного кандидоза. Способ включает введение иммуногенного количества вакцины HYR1 фрагмента. Вакцину можно вводить с содержанием или без адъюванта. Фрагмент HYR1 может быть получен из различных штаммов Candida, a также из различных видов Candida, таких как Candida albicans, Candida krusei, Candida tropicalis, Candida glabrata и Candida parapsilosis.

Эффективность вакцины заявленного изобретения против различных штаммов Candida, различных видов Candida, других бактериальных и инфекционных возбудителей и их разнообразной иммунной активности оценивают в соответствии со стандартными способами такими, как описано ниже.

Учитывая сведения и методологические руководства, приводимые в данном документе, специалисту в данной области техники очевидно, что иммуннотерапевтические способы, известные из уровня техники, могут применяться с одним или более фрагментами HYR1 в фармацевтически приемлемой композиции, вводимой в качестве вакцины с содержанием или без адъюванта. При осуществлении настоящего изобретения, термины «фармацевтическая» или «фармацевтически приемлемая» означают композиции, разработанные известными нетоксичными способами и, при необходимости, используются с носителями или добавками, которые безопасны для введения людям. Введение может производиться с использованием хорошо известных способов применения, включая, например, внутривенное, внутримышечное, внутрибрюшинное или подкожной инъекции. Указанные вакцины настоящего изобретения также могут содержать буферы, соли и другие растворители, известные специалисту в данной области техники, для сохранения активности вакцины в растворе. Аналогично, любые из большого числа адъювантов, известных из уровня техники, могут быть использованы в вакцине настоящего изобретения для выявления, активации или усиления терапевтически эффективного иммунного ответа, способного ослаблять или блокировать связывание, проникновение и/или инфицирование Candida с восприимчивой клеткой хозяина.

При этом, модификации, которые по существу не влияют на осуществление вариантов настоящего изобретения, также включены в формулу изобретения. Таким образом, следующие примеры предназначены для иллюстрации, но не ограничивающие настоящее изобретение.

Пример 1

Hyr1p Candida albicans придает резистентность к нейтрофильному киллингу и является мишенью вакцины.

Как описано выше, Candida albicans является наиболее частой причиной инвазивной грибковой инфекции у людей. Неясно, как С. albicans избегает фагоцитарной атаки и выживает в неблагоприятной кровенной среде в течение опасной для жизни системной инфекции. Применяя генетическую стратегию условной сверхэкспрессии/супрессии, авторы изобретения обнаружили, что ген HYR1 снижает фагоцитарный киллинг С. albicans in vitro и повышает тканевую грибковую нагрузку in vivo. Согласно с позитивной регуляцией транскрипционного фактора Bcr1p, HYR1 комплементарен гипервосприимчивости к фагоцитарному опосредованному киллингу bcr1 нулевого мутанта С. albicans in vitro. Кроме того, гетерологичная экспрессия HYR1 в Candida glabrata приводит организм к большей резистентности к нейтрофильному киллингу. В заключении, вакцинация рекомбинантным Hyr1p значительно защищает мышей против гематогенного диссеминированного кандидоза. Таким образом, Hyr1 является важным вирулентным фактором для С. albicans, служащим посредником резистентности к фагоцитарному киллингу. Hyr1 является, соответственно, мишенью для вакцины или других иммунологических или низкомолекулярных вмешательств для улучшения последствий диссеминированного кандидоза.

Результаты

Условная экспрессия HYR1 в бластоспорах значительно усиливает резистентность С. albicans к фагоцит- опосредованному киллингу in vitro.

Изучая функции HYR1, авторы изобретения создали условно сверхэкспрессирующий/супрессирующий штамм С. albicans, СААН-31. В СААН-31 одна аллель HYR1 контролировалась тетрациклиновым регулятором (ТК)-промотера, а другая аллель была нарушена. Полуколичественным RT-ПЦР авторы изобретения подтвердили, что HYR1 в большом количестве экспрессировался, когда бластоспоры СААН-31 росли в среде без DOX, и не определялся в присутствии DOX (Фиг.1А). Как и предполагалось, HYR1 не был обнаружен в бластоспорах дикого типа (ТНЕ31), потому что HYR1 является ко-экспрессирующим геном гиф (Фиг.1А).

Штамм СААН-31, условно сверхэкспрессирующий HYR1, и контрольный ТНЕ31 дикого типа имеют одинаковые темпы роста, независимо от присутствия или отсутствия DOX (время удвоения для контрольного штамма дикого типа без DOX=1.51±0.29 ч и с DOX=1.51±0.38 ч; время удвоения для штамма СААН-31 без DOX=1.39±0.30 ч и с DOX=1.35±0.19 ч). Авторы изобретения также определили влияние сверхэкспрессии HYR1 на нормальное накопление других GPI-закрепленных белков на клеточной поверхности. Прямой иммунофлюоресценцией авторы изобретения подтвердили, что сверхэкспрессия HYR1 не вляет на накопление GPI- закрепленных белков Alsip (данные не представлены) [8].

В продолжении многократного скрининга на вирулентно-ассоциированные фенотипы, авторы изобретения определили влияние условной сверхэкспрессии HYR1 на киллинг кандидоза фагоцитами человека. HYR1- эпрессирующий С. albicans (СААН-31-DOX) был значительно более резистентен к нейтрофил - опосредованному киллингу человека, чем дикий тип С. albicans (который не экпрессирует HYR1 в фазе бластоспор) и HYUR1-супрессорный С. albicans (СААН-31+DOX) (Фиг.1Б). Этот фенотип был не связан с DOX, в то время как киллинг не значительно различался между контрольным диким типом и HYR1-супрессорным С. albicans (+DOX).

Авторы также выполнили исследование киллинга кандидоза с использованием HL-60 клеточной линии, которая может быть дифференцирована в либо нейтрофил-подобные или макрофаг-подобные клетки [9, 10]. Как и только что собранные человеческие нейтрофилы, условная сверхэкспрессия HYR1 уменьшает киллинг бластоспор С. albicans обоими HL-60 нейтрофил-подобными (Фиг.1В) и макрофаг-подобными (Фиг.1Г) клетками in vitro.

Гипер-восприимчивость к нейтрофильному киллингу bcr1 нулевого мутанта С. albicans была дополнена экспрессией HYR1 in vitro.

Поскольку, HYR1 является геном, регулирующим последующие звенья сигнальных каскадов положительного транскрипционного регулятора Bcrip [17], авторы и изобретения предположили, что разрушение bcr1 усилит восприимчивость к нейтрофильному киллингу, при условии стимуляции дикого типа С. albicans экспрессировать HYR1 (т.е. в процессе формирования гиф). Поэтому, авторы индуцировали С. albicans в форме зародышевой трубки, инкубируя клетки в RPMI с добавлением 10% FBS при 37°С в течение 40 минут. Эти условия, как известно, индуцируют экспрессию HYR1 [18] и, в результате чего, зародышевая трубка становится достаточно короткой, что бы не формировались обширные гифы, таким образом, представляется возможность количественно описать колониеобразующие единицы (CFUs) в нашем киллинговом исследовании. Авторы изобретения сравнили нейтрофильный киллинг штамма bcr1 нулевого мутанта (CJN702), BCR1 комплементарного штамма в bcr1 теневом фенотипе нулевого мутанта (CJN698) и дикого типа штамма С. albicans (DAY185). Bcr1 нулевой мутант был гипервосприимчивым к нейтрофил-опосредованному киллингу по сравнению с BCR1-комплементарным и контрольным штаммом дикого типа (Фиг.2А). Кроме того, гипервосприимчивый к киллингу bcr1-лишенный С. albicans был полностью комплементарен автономной экспрессии HYR1 в bcr1 теневом фенотипе мутанта, но не другими клеточно-поверхностными кодирующими генами, регулирующими Bcrip [17] (Фиг.2А и 2Б).

Резистентность сверхэспресиирующего HYR1 С. albicans к фагоцитарному киллингу может быть воспроизведена гетероэкспрессией HYR1 в С. glabrata

Далее, определяя вирулентность фенотипа, опосредованного HYR1, авторы изобретения экспрессировали гетерологичный ген в BG14 С. glabrata [19], используя плазмиду pGRB2.2, несущую основной промотер PGK.1 [11]. Авторы также произвели трансформацию BG14 С. glabrata с пустой плазмидой в качестве отрицательного контроля. Экспрессия HYR1 в С. glabrata привела к 75% снижению к киллингу HL-60-производными нейтрофилов in vitro, по сравнению с С. glabrata, трансформированной с пустой плазмидой (Фиг.2В).

Нейтрофилы подавляют кандидозную экспрессию HYR1

Поскольку, условная сверхэкспрессия HYR1 присваивает Candida резистентность к нейтрофил-опосредованному киллингу, авторы изобретения применяли RT-ПЦР для исследования экспрессии HYR1 дикого типа С. albicans (SC5314) в ответ на HL-60-производные нейтрофилов in vitro. HYR1 экспрессировался в ближайшие 30 минут после воздействия среды, содержащей сыворотку, и непрерывно интенсивно экспрессировался в течение 2.5 часов в процессе культивирования (Фиг.3А). Однако, когда С. albicans подвергается воздействию HL-60-производных нейтрофилов при культивировании, даже в присутствии сыворотки, экспрессия HYR1 ингибировалась в течение 2 часов при совместном культивировании.

Дикий тип С. albicans экспрессирует HYR1 в процессе гематогенного диссеминированного кандидоза, в результате чего увеличивается тканевая грибковая нагрузка в органах с высоким содержанием фагоцитов.

Для определения экспрессии HYR1 в процессе гематогенного диссеминированного кандидоза, 5 главных органов - мозг, печень, легкое, селезенка и почки были собраны у мыши, инфицированной диким штаммом С. albicans, после 6 и 24 часов инфицирования. Улучшенное гнездовое RT-ПЦР исследование [20] применяли для оценки экспрессии HYR1 in vivo. Экспрессия HYR1 была определена во всех пяти органах (Фиг.3Б).

Сверхэкспрессия HYR1 увеличивала, а супрессия HYR1 снижала грибковую нагрузку в печени и селезенке (Фиг.4А). Кроме того, авторы изобретения подтвердили, что сверхэкспрессирующий штамм имеет значительно выше уровень HYR1, чем штамм дикого типа в печени; супрессированный штамм показывал тенденцию к снижению уровня (Фиг.4Б). В отличии от этого, экспрессия HYR1 не значительно изменяет грибковую нагрузку в почках (данные не показаны), орган без постоянных фагоцитов.

rHyr1p-N в качестве возможной вакцины

На основе анализа последовательности, Hyr1p является, предположительно, клеточно-поверхностным белком [7]. Для подтверждения этого, авторы изобретения получили рекомбинантный N- концевой Hyr1p в E.coli, трансформированных с экспрессирующим клоном, который включает 25-350 аминокислот, кодирующих последовательность (rHyr1p-N). Сыворотка от мышей, иммунизированных rHyr1p-N, была предварительно абсорбирована против hyr1 нулевого мутанта С. albicans [7], с последующим непрямым иммуно-окрашиванием гиф дикого типа. Авторы обнаружили, что клеточная оболочка гиф дикого типа С. albicans была сильно окрашена (Фиг.5), подтверждая, что их клеточная поверхность экспрессирует и, следовательно, подвергает воздействию иммунную систему.

Поскольку Hyr1p является клеточно-поверхностным белком, который придает резистентность к фагоцитарному киллингу киндидоза, авторы изобретения стремились определить его способность в качестве возможной вакцины. Мышей вакцинировали rHyr1p с добавлением адъюванта или только адъювантом. Две недели спустя после повторной иммунизации, мышей инфицировали через хвостовую вену высоко вирулентным SC5314 С. albicans. Вакцинация rHyr1p-N заметно улучшает выживаемость мышей по сравнению с вакцинированными только адъювантом (62.5 и 0% выживаемости за 35 дней, соответственно) (Фиг.6А).

Вакцинация rHyr1p-N, смешанного с полным или неполным адъювантом Фрейда или алюминием, заметно улучшает выживаемость мышей по сравнению с вакцинированными одним любым адъювантом (Фигура 6А и 6Б).

Сыворотка анти-rHyr1p усиливает нейтрофильный киллинг у мышей, непосредственно ингибируя функцию Hyr1p резистентности нейтрофилов.

Защитный эффект вакцины rHyr1p-N показывает, что сыворотка анти-rHyr1p возможно может нейтролизовать защитную функцию Hyr1p в С. albicans. Для определения могут ли антитела анти-rHyr1p непосредственно ингибировать функцию Hyr1p, авторы изобретения выделили и приготовили фрагменты F(ab)'₂ из общих IgG мыши, иммунизированной rHyr1p-N или контролем (приготавливается производством из клеток E.coli, транформированных с пустой плазмидой). Авторы обнаружили, что F(ab)'₂ из иммунной, но не контрольной, сыворотки способны к восстановлению нейтрофильного киллинга штамма с условной сверхэкспрессией HYR1 до уровня, приравненному к супрессированному штамму (Фигура 6В).

Заключение

В данном исследовании авторы изобретения показали, что HYR1 ко-экспрессирующий ген гиф [7, 21], кодирующий кандидозный фагоцитарный резистентный фактор. Условная экспрессия HYR1 в бластоспорах Candida является причиной грибов, более резистентных к фагоцитарному киллингу, по сравнению с бластоспорами дикого типа С. albicans. Кроме того, функция HYR1 в С. albicans повторяется в гетерологичной экспрессии гена С. glabrata in vitro. Авторы также обнаружили, что штамм, лишенный Bcr1p, транскрипционный фактор которого позитивно регулирует экспрессию HYR1 [17], проявляет усиление восприимчивости к фагоцит-опосредованному киллингу. Гипер- восприимчивость к фагоцитарному ки