Моноклональное антитело, имеющее иммуносупрессивную активность, или его антигенсвязывающий фрагмент

Моноклональное антитело, имеющее иммуносупрессивную активность, или его антигенсвязывающий фрагмент

Иллюстрации

Показать все

Реферат

ССЫЛКА НА СВЯЗАННЫЕ ЗАЯВКИ

По настоящей заявке испрашивается приоритет патентной заявки No. 2010-185406, поданной 20 августа 2010 г. в патентное ведомство Японии, полное содержание которой включено в настоящий документ в качестве ссылки.

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ

Настоящее изобретение относится к моноклональному антителу с очень сильной иммуносупрессивной активностью, или к его антигенсвязывающему фрагменту, и к гибридоме, которая их продуцирует.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

В рамках терапии при трансплантации органов обычно используются различные иммуносупрессивные средства для того, чтобы подавить отторжение органа после его трансплантации. Эти иммуносупрессивные средства включают, например, такролимус (FK506) и циклоспорин А (Jpn J Pharmacol, 71, 89-100, 1996). Однако у обычных иммуносупрессивных средств имеются отрицательные свойства, в том числе выраженные побочные эффекты, такие как стимуляция роста раковых клеток и миелосупрессия; возникновение при их приеме инфекционных заболеваний, а даже необходимость их пожизненного приема (непатентный документ 1: Transplantation, 58, 170-178, 1994).

Кроме того, определение времени прекращения приема иммуносупрессивных средств в целом является достаточно сложным. Например, приживление трансплантата ткани может произойти без длительного введения иммуносупрессивного средства. В этом случае, длительное и безосновательное введение иммуносупрессивного средства может нанести вред пациенту просто из-за токсичности препарата.

С другой стороны, прекращение введения иммуносупрессивного средства может вызвать отторжение успешно трансплантированной ткани. В этом случае повторное введение иммуносупрессивного средства с целью подавления отторжения часто становится не эффективным.

В тоже время, были проведены различные исследования в области трансплантологии органов. Например, было сообщено об успешном приживлении ткани трансплантата с высоким уровнем приживления ткани при трансплантировании у крыс без введения иммуносупрессивных средств в рамках системы ортотопической трансплантации печени (OLT), когда печень крысы донора DA (с MHC гаплотипа RT1a) была трансплантирована крысе-реципиенту PVG (RT1c) (непатентный документ 2: Transplantation, 35, 304-311-1983).

Кроме того, было описано, что отторжение трансплантата на модели трансплантата было подавлено с использованием комбинирования приемов, в том числе при однократном предоперационном введении крысе, у которой может происходить отторжение, сыворотки крови крысы-реципиента PVG, имеющей пересаженную печень от крысы DA (пост-OLT сыворотка), (непатентный документ 3: J.Surg. Res., 80, 58-61, 1998).

Кроме того, описано, что благодаря послеоперационному введению (in vivo) поликлонального антитела против гистона H1 в систему трансплантата сердца крысы DA (RT1a) в крысу LWIS (RT1L), когда обычно происходит отторжение, при этом отторжение подавляется и реципиент выживает (непатентный документ 4: Transplantation, 77, 1595-1603, 2004).

Кроме того, некоторыми авторами настоящего изобретения было описано ингибирование при смешанной реакции культуры лимфоцитов (MLR) при использовании первичной послеоперационной сыворотки крови крысы PVG, и антитело против гистона H1 проявляет супрессивную активность в отношении MLR (патентный документ 1: выложенная заявка на патент Японии No. 2004-149507).

Кроме того, некоторыми авторами настоящего изобретения было описано получение моноклонального антитела против гистона H1, и моноклонального антитела против гистона H1, продуцируемого гибридомой 16G9 (депозитарный номер FERM - BP-10413), которое связывается с пептидом, состоящим из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:1, полученного методом фагового дисплея (патентный документ 2: WO2006/025580).

Кроме того, некоторыми авторами настоящего изобретения было описано получение поликлонального антитела, антигеном которого является пептид, состоящий из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:1 (патентный документ 3: US 2009/0081247, A1).

Однако создание моноклонального антитела с очень высокой иммуносупрессивной активностью, которое может использоваться для подавления отторжения трансплантата при трансплантации органов, является по-прежнему необходимым.

СПИСОК ЦИТИРУЕМЫХ ДОКУМЕНТОВ

НЕПАТЕНТНЫЕ ДОКУМЕНТЫ

Непатентный документ 1: Transplantation, 58, 170-178, 1994

Непатентный документ 2: Transplantation, 35, 304-311, 1983

Непатентный документ 3: J. Surg. Res., 80, 58-61, 1998

Патентный документ 4: Transplantation, 77, 1595-1603, 2004

ПАТЕНТНЫЕ ДОКУМЕНТЫ

Патентный документ 1: Выложенная заявка на патент Японии No. 2004-149507

Патентный документ 2: WO2006/025580

Патентный документ3: US 2009/0081247, A1.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Авторы настоящего изобретения обнаружили новое моноклональное антитело с очень высокой иммуносупрессивной активностью, и его антигенсвязывающий фрагмент, а также продуцирующую их гибридому. Настоящее изобретение основано на этих обнаружениях.

В этой связи, объектом настоящего изобретения является новое моноклональное антитело с очень высокой иммуносупрессивной активностью, его антигенсвязывающий фрагмент, а также продуцирующая их гибридома.

Соответственно, моноклональное антитело по настоящему изобретению или его антигенсвязывающий фрагмент связывается с пептидом, содержащим аминокислотную последовательность SSVLYGGPPSAA (SEQ ID NO:1), или с конъюгатом этого пептида и фармацевтически приемлемого носителя, и моноклональное антитело по настоящему изобретению или его антигенсвязывающий фрагмент имеет более высокую аффинность связывания с коровым гистоном, чем с гистоном H1.

Кроме того, гибридома по настоящему изобретению продуцирует вышеуказанное моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент.

Моноклональное антитело по настоящему изобретению имеет значительную иммуносупрессивную активность и может быть успешно использовано для подавления отторжения трансплантата при трансплантации органов.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ФИГУР

На фиг.1 показаны результаты тестов по идентификации изотипа моноклонального антитела по настоящему изобретению (в дальнейшем также называемого "SSVmAb").

На фиг.2 показаны результаты тестов, где сравнивали аффинности связывания моноклонального антитела по настоящему изобретению (SSVmAb) с гистоном H1 и гистонами H2A, H2B, H3 или H4.

На фиг.3 показаны результаты тестов, где сравнивали аффинности связывания моноклонального антитела, продуцированного гибридомой 16G9 (в дальнейшем также называемой "16G9mAb") с гистоном H1 и с гистонами H2A, H2B, H3 или H4. Гибридома была депонирована под депозитарным номером FERM BP-10413 (Референсная гибридома).

На фиг.4 показаны результаты тестов смешанной реакции лимфоцитов (MLR) с использованием моноклонального антитела по настоящему изобретению (SSV mAb) и антитела 16G9 mAb.

На фиг.5 показаны результаты сравнения, где реакционные способности моноклонального антитела по настоящему изобретению (SSV mAb) и антитела 16G9 mAb по отношению Т-клеток сравнивались при помощи проточной цитометрии.

На фиг.6A показаны результаты тестов MLR в отношении моноклонального антитела по настоящему изобретению (SSV mAb) и реактива контроля (изотип IgG1), с использованием клеток селезенки, в которых синтаза ATP не была нокаутирована за счет малых интерферирующих РНК (миРНК).

На фиг.6B показаны результаты тестов MLR в отношении моноклонального антитела по настоящему изобретению (SSV mAb) и реактива контроля (изотип IgG1), с использованием клеток селезенки, в которых синтаза ATP была нокаутирована за счет малых интерферирующих РНК (миРНК).

ОПИСАНИЕ ВАРИАНТОВ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ

ДЕПОНИРОВАНИЕ

Гибридома по настоящему изобретению представляет собой гибридому "мышь-мышь" SSV-C 93-3, которая была депонирована в патентном депозитарии Национального Института Технологий и Исследований (National Institute of Technology and Evaluation, Patent Microorganisms Depositary (Адрес: Biotechnology Headquarter, 2-5-8 Kazusa Kamatari, Kisarazu-shi, Chiba-ken, Japan)) с первоначальной датой депонирования 17 августа 2010 г., под депозитарным номером BP-972.

МОНОКЛОНАЛЬНОЕ АНТИТЕЛО И ГИБРИДОМА

Одна из особенностей моноклонального антитела по настоящему изобретению или его антигенсвязывающего фрагмента состоит в том, что моноклональное антитело по настоящему изобретению или его антигенсвязывающий фрагмент связывается с пептидом, состоящим из аминокислотной последовательности SSVLYGGPPSAA (SEQ ID NO:1), или с конъюгатом этого пептида и фармацевтически приемлемого носителя, и что моноклональное антитело по настоящему изобретению или его антигенсвязывающий фрагмент имеет более высокую аффинность связывания с коровом гистоном, чем с линкерным гистоном (гистон H1). Авторы настоящего изобретения неожиданно обнаружили, что моноклональное антитело, имеющее такую реакционную способность, или его антигенсвязывающий фрагмент проявляет существенную иммуносупрессивную активность.

Согласно предпочтительному варианту осуществления настоящего изобретения, вышеуказанное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент действует против пептида, состоящего из аминокислотной последовательности SSVLYGGPPSAA (SEQ ID NO:1), или против конъюгата пептида с фармацевтически приемлемым носителем.

Согласно другому предпочтительному варианту осуществления настоящего изобретения, коровый гистон представляет собой гистон H2A, H2B, H3 или H4, и, более предпочтительно, представляет собой гистон H2A, H3 или H4.

Антитело по настоящему изобретению или его антигенсвязывающий фрагмент может также содержать тяжелую цепь и/или легкую цепь. В каждой легкой и тяжелой цепях на их N-конце может присутствовать вариабельная область, и каждая вариабельная область может содержать четыре каркасные области (FR) и три области, определяющие комплементарность (CDR), в чередующемся порядке. Остатки в вариабельной области обычно нумеруют согласно системе, разработанной Kabat и др. Эта система описана в работе Kabat et al., 1987, Sequences of Proteins of Immunological Interest, US Departement of Health and Human Services, NIH, USA. Если не указано иначе, эта система нумерации используется в настоящем описании. Нумерация, основанная на способе Kabat и др., может быть легко выполнена, используя, например, вебсайт <http://www.bioinf.org.uk/abysis/tools/analyze.cgi>.

Нумерация остатков по Kabat не обязательно соответствует непосредственной линейной нумерации остатков аминокислот. У фактической линейной аминокислотной последовательности структурного элемента базовой структуры вариабельной области, каркасной области или CDR может быть меньшее количество аминокислот, или она может иметь дополнительные аминокислоты по сравнению со строгой нумерацией по Kabat, в зависимости от укорачиваний (трункаций) или вставок (инсерций). Для предложенного антитела, правильная нумерация остатков по Kabat будет определяться выравниванием гомологичных остатков последовательности, пронумерованной согласно "стандартной" нумерации по Kabat, и последовательности антитела.

Согласно одному из вариантов осуществления изобретения, вариабельная область легкой цепи антитела по настоящему изобретению или его антигенсвязывающего фрагмента содержит CDR1, состоящую из аминокислотной последовательности RASSSVSYMH (SEQ ID NO:2), CDR2, состоящую из аминокислотной последовательности ATSNLAS (SEQ ID NO:3) и CDR3, состоящую из аминокислотной последовательности QQWSSNPWT (SEQ ID NO:4). Согласно более предпочтительному варианту осуществления изобретения, вышеуказанная вариабельная область легкой цепи содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:6 от положения 23 до положения 128.

Согласно другому варианту осуществления изобретения, вариабельная область тяжелой цепи антитела по настоящему изобретению или его антигенсвязывающего фрагмента содержит CDR1, состоящую из аминокислотной последовательности GYNMN (SEQ ID NO:7), CDR2, состоящую из аминокислотной последовательности NINPYYGSTSYNQKFKG (SEQ ID NO:8) и CDR3, состоящую из аминокислотной последовательности SPYYSNYWRYFDY (SEQ ID NO:9). Согласно более предпочтительному варианту осуществления изобретения, вышеуказанная вариабельная область тяжелой цепи содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:11 от положения 20 до положения 141.

Кроме того, согласно еще более предпочтительному варианту осуществления изобретения, антитело по настоящему изобретению или его антигенсвязывающий фрагмент содержит вариабельную область легкой цепи, содержащую CDR1, состоящую из аминокислотной последовательности RASSSVSYMH (SEQ ID NO:2), CDR2, состоящую из аминокислотной последовательности ATSNLAS (SEQ ID NO:3), и CDR3, состоящую из аминокислотной последовательности QQWSSNPWT (SEQ ID NO:4), и вариабельную область тяжелой цепи, содержащую CDR1, состоящую из аминокислотной последовательности GYNMN (SEQ ID NO:7), CDR2, состоящую из аминокислотной последовательности NINPYYGSTSYNQKFKG (SEQ ID NO:8), и CDR3, состоящую из аминокислотной последовательности SPYYSNYWRYFDY (SEQ ID NO:9).

Кроме того, согласно еще более предпочтительному варианту осуществления изобретения, антитело по настоящему изобретению или его антигенсвязывающий фрагмент содержит вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:6 от положения 23 до положения 128, и вариабельную область тяжелой цепи, содержащей аминокислотную последовательности SEQ ID NO:11 от положения 20 до положения 141.

Кроме того, согласно предпочтительному варианту осуществления настоящего изобретения, вышеуказанное моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент может ингибировать активность ATP-синтазы. Кроме того, согласно более предпочтительному варианту осуществления настоящего изобретения, вышеуказанная ATP-синтаза представляет собой митохондриальную ATP-синтазу.

Вышеуказанные аффинность связывания и ингибирующая активность в отношении активности ATP-синтазы для моноклонального антитела по настоящему изобретению или его антигенсвязывающего фрагмента определены способами, например такими, как описано в экспериментальных примерах 2 и 4 настоящего описания.

Кроме того, моноклональное антитело по настоящему изобретению, предпочтительно, представляет собой химерное антитело, гуманизированное антитело или полностью человеческое антитело. Специалисты в данной области могут получить такие антитела согласно известным технологиям в данной области, как описано, например, в работах Morrison, S.L., Oi, V. T., "immunoglobulin genes" Academic Press (London), 260-274 (1989); Roguska, M. L. et. al., Humanization of murine monoclonal antibodies through variable domain resurfacing, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91, 969-973 (1994); Tomizuka, K. et al. Functional expression and germline transmission of a human chromosome fragment in chimeric mice, Nature Genet., 16, 133-143 (1997); Winter, G. et. al., Making antibodies by phage display technology, Ann. Rev. Immunol., 12, 433-455 (1994); Griffiths, A. D. et. al., Isolation of high affinity human antibodies directly from large synthetic repertoires, EMBO. J., 13, 3245-3260 (1994).

Более того, согласно предпочтительному варианту осуществления настоящего изобретения, вышеуказанный антигенсвязывающий фрагмент, предпочтительно, представляет собой Fab, Fab', (Fab')₂, Fv или scFv.

Кроме того, согласно другому варианту осуществления, настоящее изобретение относится к гибридоме, которая продуцирует вышеуказанное моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент. Также еще, согласно другому предпочтительному варианту осуществления настоящего изобретения, гибридома представляет собой гибридому "мышь-мышь" SSV-C 93-3.

Моноклональное антитело по настоящему изобретению или его антигенсвязывающий фрагмент и гибридома могут быть получены, например, следующим образом. Так, исходно, гибридома по настоящему изобретению может быть получена с использованием в качестве антигена пептида, содержащего аминокислотную последовательность SSVLYGGPPSAA (SEQ ID NO:1) или конъюгата этого пептида с фармацевтически приемлемым носителем, путем слияния клеток плазмы млекопитающего (иммунные клетки), иммунизированного этим сенсибилизирующим антигеном, с клетками миеломы млекопитающего, клонирования и скрининга полученных гибридом. Затем моноклональное антитело по настоящему изобретению можно получать путем культивирования гибридомы по настоящему изобретению и сбора получаемого антитела, продуцируемого гибридомой.

Для иммунизации млекопитающего могут использоваться любые способы введения, обычные в данной области. В частности, эти способы включают внутрибрюшинную инъекцию, внутриселезеночную инъекцию, внутримышечную инъекцию, подкожную инъекцию, внутрикожную инъекцию, пероральное введение, трансмукозальное введение, трансдермальное введение, но внутрибрюшинная инъекция и внутриселезеночная инъекция являются предпочтительными. Интервал между дозировками сенсибилизирующего антигена определяется соответствующим образом в зависимости от дозы сенсибилизирующего антигена, вида млекопитающего и т.п. Например, интервал между дозировками может представлять введение несколько раз в месяц.

Вид млекопитающих, которые будут иммунизированы, не являются ограниченным, но они, предпочтительно, выбраны, например, после рассмотрения вопроса совместимости клеток миеломы, используемых для слияния клеток. Млекопитающие включают, например, мышь, крысу и хомяка. Предпочтительно, млекопитающее представляет собой мышь.

Кроме того, предпочтительно, когда клетки селезенки используются как иммунные клетки.

Клетки миеломы, используемые для настоящего изобретения, включают, например, P3 (P3X63Ag8.653) (J. Immunol., 123,1548, 1978), p3-U1 (Current Topics in Microbiology and Immunology, 81, 1-7,1978), NS-1 (Eur. J. Immunol., 6, 511-519, 1976), MPC-11 (Cell, 8, 405-415, 1976), Sp2/0-Ag14 (Nature, 276, 269-270, 1978), FO (J. Immunol. Meth., 35, 1-21, 1980), S194 (J. Exp. Med., 148, 313-323, 1978) и R210 (Nature, 277, 131-133, 1979). Клетка миеломы, предпочтительно, представляют собой клетки P3 или p3-U1, более предпочтительно, P3.

Иммунные клетки и клетки миеломы могут быть слиты, например, способом согласно Milstein et. al. (Methods Enzymol., 73, 3-46, 1981). В частности, слияние клеток может быть выполнено, например, путем смешивания иммунных клеток и клеток миеломы в среде культивирования в присутствии промотора слияния. Затем, при слиянии клеток, может быть соответствующим образом повторено дополнение среды культивирования и выполнено центрифугирование, для получения гибридом.

Среда культивирования, используемая для слияния клеток, включает, например, среды культивирования, обычно используемые при слиянии клеток, такие как среда культивирования RPMI-1640 и среда культивирования MEM. Кроме того, дополнения из сыворотки крови, например, эмбриональная телячья сыворотка (FBS), могут также использоваться при необходимости.

Температура слияния клеток, предпочтительно, составляет 25-37°C, и, более предпочтительно, 30-37°C.

Отношение клеток миеломы и иммунных клеток в смеси, предпочтительно, составляет приблизительно от 1:1 до 1:10.

Промоторы слияния могут включать, например, полиэтиленгликоль (PEG) и вирус Сендай (HVJ). Промотор слияния, предпочтительно, представляет собой PEG. Молекулярная масса PEG может быть выбрана подходящим образом, и, в частности, средняя молекулярная масса может находиться в интервале приблизительно 1000-6000. Концентрация PEG в среде для культивирования, предпочтительно, составляет приблизительно 30%-60% (масс./об).

Вспомогательные агенты, например, диметилсульфоксид, могут быть соответствующим образом добавлены по желанию к среде культивирования.

Отбор гибридомы по настоящему изобретению может быть выполнен путем культивирования гибридом, полученных слиянием клеток, например, в обычной среде для отбора, такой как среда культивирования HAT, и использования способа лимитирующих разведений для того, чтобы выполнить скрининг, например, на основе показателя, такого как титр антитела против пептида, состоящего из аминокислотной последовательности SSVLYGGPPSAA (SEQ ID NO:1), или против конъюгата пептида с фармацевтически приемлемым носителем. Период культивирования в среде культивирования HAT является достаточным периодом для того, чтобы клетки (неслитые клетки), кроме целевой гибридомы, погибли, и этот период обычно может составлять от нескольких дней до нескольких недель. Гибридома по настоящему изобретению, полученная таким образом, может подвергаться субкультивированию в обычной среде для культивирования, а также может храниться в жидком азоте в течение длительного времени.

Способы сбора моноклонального антитела по настоящему изобретению или его антигенсвязывающего фрагмента включают, например, способ, где гибридома культивируется обычным способом для получения моноклонального антитела и подобного из супернатанта культуры, или способ, где гибридому вводят восприимчивому млекопитающему для пролиферации, и моноклональное антитело и подобное получают из асцитной жидкости. Первый способ в данном изобретении предпочтителен для получения антитела с очень высокой чистотой, в то время как последний способ предпочтителен для продуцирования больших количеств антитела.

Кроме того, моноклональное антитело по настоящему изобретению или его антигенсвязывающий фрагмент могут быть очищены до высокой чистоты способами, такими как высаливание, гельфильтрация и аффинная хроматография.

Моноклональное антитело по настоящему изобретению или его антигенсвязывающий фрагмент обладает существенной иммуносупрессивной активностью, как описано выше. Моноклональное антитело по настоящему изобретению или его антигенсвязывающий фрагмент может использоваться самостоятельно или может использоваться в виде фармацевтической композиции вместе с фармакологически приемлемой добавкой. Поэтому, согласно одному варианту осуществления настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции, содержащей моноклональное антитело по настоящему изобретению или его антигенсвязывающий фрагмент. Кроме того, согласно предпочтительному варианту осуществления настоящего изобретения, вышеуказанная фармацевтическая композиция используется как иммуносупрессивное средство. Кроме того, согласно другому варианту осуществления, настоящее изобретение относится к применению моноклонального антитела по настоящему изобретению для получения фармацевтической композиции.

Фармацевтическая композиция по настоящему изобретению может быть успешно использована для подавления отторжения пересаженных органов, таких как сердце, почка, печень, костный мозг или кожа, или для снижения риска развития отторжения, и дополнительно может использоваться для лечения аутоиммунных заболеваний и т.п. Фармацевтическая композиция по настоящему изобретению может быть получена, например, путем растворения моноклонального антитела по настоящему изобретению в физиологическом растворе для инъекций, дистиллированной воде для инъекций, буферном растворе для инъекций и т.п. Композиция для иммуносупрессии по настоящему изобретению может дополнительно содержать подходящий растворитель, солюбилизатор, консервант, стабилизатор, эмульгатор, средство для суспендирования, успокаивающее средство, средство для поддержания тоничности, буфер, эксципиент, загуститель, окрашивающий агент, известный носитель (различные липосомы, носители на основе полиаминовой кислоты, синтетические макромолекулы, природные полимеры и т.п.) и т.п.

Кроме того, согласно другому варианту осуществления, настоящее изобретение относится к способу лечения млекопитающего, нуждающегося в иммуносупрессии, где способ включает введение эффективного количества моноклонального антитела по настоящему изобретению или его антигенсвязывающего фрагмента. В этом контексте термин "лечение" подразумевает облегчение состояния при установленной патологии. Кроме того, согласно другому варианту осуществления, настоящее изобретение относится к способу снижения риска развития отторжения трансплантата, где способ включает введение эффективного количества моноклонального антитела по настоящему изобретению или его антигенсвязывающего фрагмента млекопитающему, которому трансплантируется орган.

Кроме того, согласно одному из вариантов осуществления, вышеуказанное млекопитающее уже имеет трансплантированный орган. Вышеупомянутые млекопитающие и доноры для трансплантации органа включают человека, свинью и бабуина. Человек является предпочтительным млекопитающим.

Органы для трансплантации включают, например, печень, сердце, почку или кожу.

Кроме того, моноклональное антитело по настоящему изобретению или его антигенсвязывающий фрагмент, можно одновременно или последовательно вводить млекопитающему в комбинации с другими иммуносупрессивными средствами, используемыми при трансплантации органов. Такие другие иммуносупрессивные средства включают, но без ограничения, например, алкилирующие агенты, в частности, циклофосфамид; антиметаболиты, такие как азатиоприн, метотрексат и мизорибин; ингибиторы активности T-клеток, такие как циклоспорин и такролимус; стероиды, такие как преднизолон, метилпреднизолон, мофетил микофенолата и азатиоприн; ингибиторы функционирования поверхности лимфоцитов, такие как басиликсимаб и муромонаб; и их комбинации.

Кроме того, моноклональное антитело по настоящему изобретению или его антигенсвязывающий фрагмент можно вводить системно или местно. Конкретные способы введения включают инфузию, внутривенную инъекцию, внутримышечную инъекцию, подкожную инъекцию, внутрикожную инъекцию, пероральное введение, трансмукозальное введение и трансдермальное введение.

Кроме того, эффективное количество моноклонального антитела по настоящему изобретению или его антигенсвязывающего фрагмента не является конкретным и ограниченным, и может быть соответствующим образом определено специалистом в данной области в зависимости от вида млекопитающего, его состояния, пола, возраста и т.п. Например, такое эффективное количество включает одну или несколько доз из расчета от 0,05 до 40 мг/кг веса тела в день, предпочтительно, от 0,1 до 1,0 мг/кг веса тела в день.

ПРИМЕРЫ

Далее настоящее изобретение будет детально описано со ссылкой на Примеры, но настоящее изобретение не ограничено этими Примерами.

Пример 1: Получение моноклонального антитела (SSV mAb)

Получение антигенного вещества

В качестве антигенного вещества использовался конъюгат пептида, состоящего из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:1, и гемоцианина лимфы фисуреллы (KLH).

При получении антигенного вещества, в первую очередь был синтезирован пептид, состоящий из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:1, при помощи способа твердофазного пептидного синтеза Fmoc (используемая аппаратура - ABI 430, Applied Biosystems). Конъюгат вышеуказанного пептида и KLH (SIGMA) был синтезирован путем перемешивания 5 мг вышеуказанного пептида, приблизительно 20 мг KLH и 30 мкг глутаральдегида (Katayama Chemical Industries Co., Ltd.) в фосфатном буфере (pH 8,0) при комнатной температуре в течение приблизительно 6 часов.

Получение гибридомы

Иммунизация

Была получена суспензия (концентрация антигена - 0,25 мг/мл) путем смешивания 0,8 мл раствора, где антигенное вещество было растворено в PBS (концентрация антигенного вещества - 0,5 мг/мл), и 0,8 мл полного адъюванта Фрейнда (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.). Затем 0,2 мл этой суспензии было интраперитонеально введено мышам BALB/c. Эта суспензия, в том же самом количестве, дополнительно вводилась мышам каждые две недели. Затем, через 16 недель после начала введения, мышам интраперитонеально вводили заключительную дозу в количестве 0,2 мл раствора, где антиген был растворен в PBS (концентрация антигена составила 600-1000 мг/мл). Кровь после ведения отбирали из вены за глазом, и титр антитела был измерен с помощью ELISA. Спустя четыре дня после последнего введения был выполнен забор всей крови, и полученную кровь центрифугировали (2000 оборотов в минуту, 20 минут) для получения антисыворотки, которая использовалась как контрольная антисыворотка в последующих экспериментах. Кроме того, из грызунов, после забора всей крови, были выделены клетки селезенки и полученные клетки селезенки использовались для слиянии клеток следующим образом.

Слияние клеток

Вышеуказанные клетки селезенки и клетки миеломы (P3X63-Ag.8.653) были смешаны в соотношении клетки селезенки:клетки миеломы равном 1:1-1:10, и подвергнуты центрифугированию (1500 оборотов в минуту, 5 минут). После центрифугирования супернатант был удален с использованием аспиратора, и через 1 минуту к осадку клеток был добавлен 1 мл полиэтиленгликоля 4000 (50% раствор в PBS) при 37°C, с получением смешанной жидкости. После хранения этой смешанной жидкости при 37°C в течение 1 минуты, каждые 30 секунд добавляли 1 мл среды для культивирования IMDM (всего 9 мл), и затем все это центрифугировали (1500 оборотов в минуту, 5 минут). После центрифугирования супернатант был удален путем отсасывания, и было добавлено соответствующее количество 15%-ого раствора FCS (JRH BIOSCIENCES), содержащего среду для культивирования IMDM (GIBCO), при 37°C. Полученная суспензия была помещена в 96-луночные планшеты для культивирования из расчета 100 мл для каждого планшета, и культивировалась в течение одного дня в инкубаторе при 37°C в атмосфере 5% CO₂. Кроме того, было добавлено 100 мл среды культивирования HAT (порошок HAT (добавка к среде HAT (x50), SIGMA) был растворен в 10 мл среды для культивирования IMDM без сыворотки, которая затем была разбавлена в 50 раз 10%-ым FCS, содержащим среду культивирования IMDM), и планшеты культивировали в инкубаторе при 37°C в атмосфере 5% CO₂. Среда для культивирования HAT заменялась каждые 2-3 дня, и через 10 дней она была заменена на среду для культивирования HT (порошок HT (добавка к среде HT, SIGMA) был растворен в 10 мл среды для культивирования IMDM без сыворотки, которая затем была разбавлена в 50 раз 10%-ым FCS, содержащим среду культивирования IMDM), и планшеты культивировали в течение трех дней в инкубаторе при 37°C в атмосфере 5% CO₂. Затем среда для культивирования (среда культивирования HT) заменялась каждые 2-3 дня. После подтверждения роста клеток под микроскопом, был собран супернатант культуры (приблизительно 100 мл). Используя супернатант культуры, и путем измерения титров антител, был выполнен скрининг гибридом.

Скрининг клеток гибридом

Измерение титра антител

Буферный раствор, содержащий вышеуказанное антигенное вещество (5 мг) (бикарбонатный буфер: 100 мМ NaHCO₃-NaOH, pH 9,2-9,5; концентрация пептида - 1 мкг/мл), был добавлен в 96-луночный плоскодонный планшет в количестве 50 мкл на лунку, и планшеты хранили при комнатной температуре в течение 2 часов для формирования покрытия. Планшеты были промыты три раза буфером для промывки (PBST), и затем был добавлен блокирующий буфер (3% снятого молока, 1% BSA, PBS) в количестве от 200 до 250 мкл на лунку, для протекания реакции при 4°C в течение одного полного дня, и затем планшеты были промыты три раза. Затем был добавлен супернатант культуры гибридомы в количестве 100 мкл на лунку, для протекания реакции при 37°C в течение 4 часов или при 4°C в течение одного полного дня. После того, как планшеты были промыты три раза, был добавлен анти-IgG мыши, меченный биотином (SIGMA), который был разбавлен в 10000 раз буфером для растворения (10 мМ Трис-HCl (pH 8,0), 0,9% (масс./об) NaCl, 0,05% (масс./об) Tween 20), из расчета 50 мкл на лунку, и планшеты хранили для протекания реакции при комнатной температуре в течение 2 часов. После того, как промывка была выполнена шесть раз, добавляли меченную стрептавидином щелочную фосфатазу, разбавленную в 1000 раз буфером для растворения, из расчета 50 мкл на лунку, и планшеты хранили для протекания реакции при комнатной температуре в течение 1-2 часов. Затем была выполнена шестикратная промывка, и был добавлен флуоресцентный субстратный буфер (субстратный буфер Attophos, Roche Diagnostics) в количестве 50 мкл на лунку, и пластина была помещена в темное место для развития флюоресценции. Интенсивность флюоресценции была измерена при помощи прибора CytoFluorII (PerSeptive Biosystems).

Скрининг гибридом

К лункам 96-луночного планшета для культивирования, которые показали положительный результат в вышеуказанном измерении титра антитела (1×10⁵ клеток/мл), была добавлена среда культивирования IMDM, содержащая 15% FCS, 10% HCF (фактор клонирования гибридом, ORIGIN), в количестве приблизительно 200 клеток на лунку, и планшеты культивировали в инкубаторе при 37°C в атмосфере 5% CO₂. Затем были измерены титры антител, как описано выше, и были отобраны гибридомы, которые продемонстрировали высокий выход антител.

Было дополнительно выполнено лимитирующее разбавление так, чтобы выбранная гибридома была растворена из расчета 0,5-1 клетка/лунка в среде культивирования IMDM, содержащей 15% FCS, 10% HCF. После культивирования в инкубаторе при 37°C в атмосфере 5% CO₂ в течение приблизительно трех-четырех дней, были измерены титры антитела, как описано выше, чтобы выбрать гибридомы, показывающие высокий выход антител. Дополнительно было повторено лимитирующее разбавление, так чтобы получить гибридомы, которые продуцируют моноклональное антитело против вышеуказанного антигенного вещества. Среди них была выбрана гибридома с самым высоким титром антител, и она была обозначена как гибридома "мышь-мышь" SSV-C 93-3.

Получение моноклонального антитела

Гибридому "мышь-мышь" SSV-C 93-3 культивировали с использованием среды культивирования RPMI (1×10⁶ клеток/мл) с 15% FCS. Затем была собрана среда культуры гибридомы, и отфильтрована через фильтр для того, чтобы удалить дебрис погибших клеток. Затем к супернатанту культуры был добавлен сульфат аммония до конечной концентрации 40%, и смесь перемешивали в течение 1 часа при 40°C. После этого было выполнено центрифугирование (3000 g, 30 минут, 4°C) и супернатант был удален для сбора осадка. Осадок был растворен в PBS, в объеме, эквивалентном 1/10 от количества вышеуказанного супернатанта культуры, и раствор был диализирован против PBS в течение ночи.

Далее, вышеуказанный осадок был дважды разбавлен 20 мМ буфером фосфата натрия (pH 7,0), и загружен в активированную колонку HiTrap NHS вместе с 1M буфером Трис-HCl. Затем антитело было элюировано 0,1 M раствором глицин·HCl (pH 2,7), и его собирали в пробирки для фракционирования.

Экспериментальный пример 1: Идентификация изотипа SSV mAb

Чтобы идентифицировать изотип моноклонального антитела (SSV mAb) Примера 1, были выполнены тесты по идентификации изотипа с использованием набора реактивов для изотипирования Mouse Monoclonal Antibody Isotyping Reagents (SIGMA).

Результаты, показанные на фиг.1, демонстрируют, что IgG1 показал самое высокое значение.

Кроме того, когда IgG1 мыши (eBioscience) и моноклональное антитело (SSV mAb) Примера 1 были восстановлены с помощью 2-меркаптоэтанола и проанализированы с помощью электрофореза в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия (SDS-PAGE), полосы, соответствующие тяжелой цепи и легкой цепи, наблюдались в подобных положениях (50 кДа, 25 кДа) для обоих случаев. С другой стороны, подобные группы не наблюдались, когда такой эксперимент проводился с использованием IgM мыши (eBioscience), вместо IgG1 мыши.

Исходя из результатов, представленных на фиг.1, и результатов SDS-PAGE, изотип моноклонального антитела (SSV mAb) Примера 1 был определен как IgG1.

Экспериментальный пример 2: Определение аффинности SSVmAb к коровому гистону

В WO2006/025580 сообщалось о моноклональном антителе (16G9 mAb), продуцируемом гибридомой 16G9 (депозитарный номер FERM BP-10413), как о моноклональном антителе против H1, которое можно использовать для иммуносупрессии, и которое связывается с пептидом, состоящим из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:1.

Поэтому, используя антитело (16G9 mAb) описанное в WO2006/025580, как Ссылочный Пример 1, была сравнена аффинность моноклонального антитела (SSV mAb) Примера 1 к антигену.

В качестве антигена были выбраны гистон H1, который является антигеном Ссылочного Примера 1 (16G9 mAb), и коровые гистоны H2A, H2B, H3 и H4, которые являются антигенными аналогами гистона H1.

Аффинитет между SSV mAb и гистоном H1 или коровыми гистонами был определены при помощи ELISA.

96-луночный планшет был покрыт гистоном H1, H2A, H2B, H3 или H4. Каждый используемый гистон был растворен в 100 мМ буфере на основе карбоната натрия (pH 9,3). Планшет был промыт раствором PBS-Tween 20 (0,05%) и заблокирован раствором, содержащим 3% снятого молока и 1% BSA, в течение 1 часа. К каждой лунке было добавлено 5 мкг/мл SSV mAb, и планшет инкубировали в течение 1 часа. Связанный SSV mAb детектировали с использованием конъюгата антитела против IgG1 мыши и пероксидазы (HRP) (SIGMA), и с инкубированием проб в течение 1 часа. Связанный SSV mAb был обнаружен с использованием раствора субстрата ABTS [2,2'-азино-бис(3-этилбензотиазолин-сульфоновая кислота)], и, используя спектрометр Multiskan Ascent (Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA), было измерено поглощение на 405 нм.

Результаты показаны на фиг. 2 и 3.

Как показано на фиг.2, аффинность для Примера 1 (SSVmAb) к гистонам H2A, H2B, H3 или H4 была выше, чем аффинность к гистону H1.

С другой стороны, как показано на фиг.3, аффинность для Ссылочного Примера 1 (16G9) к гистону H1 была выше, чем аффинность к г