Композиции без приона на основе наночастиц и способы их получения

Композиции без приона на основе наночастиц и способы их получения

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Родственные заявки

Данная заявка притязает на преимущество приоритета предварительной заявки на патент США № 61/169665, поданной 15 апреля 2009 года, и предварительной заявки на патент США № 61/238052, поданной 28 августа 2009 года, которые полностью включены в настоящее описание изобретения.

Область техники, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение относится к композициям без приона, содержащим наночастицы, включающие альбумин и по существу не растворимые в воде лекарственные средства, к способам получения указанных композиций и способам их применения.

Уровень техники

Прионные заболевания, известные также как трансмиссивные губчатые энцефалопатии (TSE), составляют группу смертельных трансмиссивных нейродегенеративных заболеваний. Конкретные примеры TSE включают болезнь скрепи, поражающую овец и коз, губчатую энцефалопатию крупного рогатого скота (BSE), трансмиссивную энцефалопатию норок, губчатую энцефалопатию кошек и хроническую болезнь, вызывающую истощение (CWD). Заболевания TSE, поражающие человека, могут представлять собой куру, болезнь Крейтцфельда-Якоба (CJD), синдром Герстманна-Страуслера-Шенкера (GSS), смертельную инсомнию и разновидность болезни Крейтцфельда-Якоба (vCJD). vCJD возникла у людей в результате эпидемии BSE в Великобритании и, вероятнее всего, была вызвана потреблением пищевых продуктов, изготовленных из мяса крупного рогатого скота, инфицированного BSE или “коровьим бешенством” (Will et al., (1006) Lancet 347:921-925). Поскольку инкубационный период заболевания при пероральном контактировании может составлять у человека более 20 лет, истинное заболевание vCJD может не проявляться в течение многих лет.

Помимо потребления инфицированных продуктов, изготовленных из мяса крупного рогатого скота, другим способом переноса vCJD от одного человека к другому может быть переливание крови или трансплантация органов (Brown et al. (1998) Transfusion 38:810-816; Diringer et al. (1984) Archives of Virology 82:105-109; Manuelidis et al. (1978) Nature 271:778-779). В середине 1990-х годов возникло опасение, что vCJD может передаваться в результате переливания крови или других фракций крови, полученных у людей, инфицированных TSE. У таких субъектов могут отсутствовать симптомы заболевания в течение длительного времени до проявления клинических признаков и инкубационного периода vCJD, и кровь, полученная у таких доноров, может быть причиной заражения данным заболеванием лиц, которым была перелита кровь или фракции крови донора.

В настоящее время в Соединенном Королевстве Великобритании известны по меньшей мере четыре случая заболевания vCJD вследствие переливания крови. Из 64 человек, которым была перелита кровь 22 доноров, у 4 человек возникла vCJD. В первом случае реципиент заболел через 7 лет после переливания эритроцитов донора, у которого отсутствовали симптомы заболевания, и признаки vCJD появились через 3 года после сдачи крови (Llewely et al. (2004) Lancet 363: 417-421). Во втором случае донор умер от vCJD через два года после сдачи крови, и реципиент умер от аневризма (а не от vCJD) через 5 лет после переливания крови (Peden et al. (2004) Lancet 364: 527-529). При вскрытии реципиента, PrPsc был обнаружен в лимфатическом узле и селезенке, а не в головном мозге. В третьем случае реципиент умер от vCJD через семь с половиной лет после переливания крови донора, у которого vCJD возникла через 20 месяцев после сдачи крови (Wroe et al. (2006) Lancet 368: 2061-2067). Четвертый случай заражения реципиента произошел через восемь с половиной лет после переливания крови того же донора, что и в третьем случае (Health Protection Agency - Health Protection Report, (2007) Vol. 1, No. 3, 26. Информация доступна на сайте http://www.hpa.org.uk/hpr/archives/2007/news2007/news0307.htm).

Общим признаком всех прионных заболеваний является превращение нормального клеточного прионного белка (PrPc) в аномальную изоформу (PrPsc). Считается, что различие между PrPc и PrPsc является чисто структурным, при этом PrPc имеет в основном альфа-спиральную структуру и PrPsc имеет в основном бета-складки, которые часто образуют агрегаты. PrPsc действует в качестве матрицы, вызывающей превращение нормальных белковых молекул в аномальную изоформу, которая затем в свою очередь превращает новый PrPc в PrPsc (Prusiner et al. (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95: 13363-13383). Такой автокаталитический процесс ведет к экспоненциальному образованию нейротоксичных агрегатов PrPsc (Aguzzi et al., (2007) Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 8: 552-561). Лиганды прионного белка и их применение описаны в публикациях WO04/050851, WO06/010915, WO04/090102 и WO06/044459.

Исследования показали, что инфективность приона в крови может проявляться на ранней стадии инкубационного периода данного заболевания (Brown et al. (2006) Blood infectivity in the transmissible spongiform encephalopathies. Chapter 4 In: Turner ML, ed. 95-118). Поскольку может пройти много времени до появления симптомов заболевания, бессимптомно инфицированные субъекты могут все это время считаться здоровыми активными донорами крови. Кроме того, некоторые субъекты могут быть постоянно или временно инфицированы без возникновения заболевания. Поэтому трудно, если вообще возможно, гарантировать, что источники крови для получения фракций крови не содержат приона.

Композиции на основе наночастиц, содержащих альбумин, были созданы в качестве систем доставки по существу не растворимых в воде лекарственных средств. Смотрите, например, патенты США №№ 5916596, 6506405, 6749868 и 6537579, а также публикации патентов США №№ 2005/0004002 и 2007/0082838. В технологии получения наночастиц на основе альбумина использованы уникальные природные свойства белка альбумина, позволяющие переносить и доставлять по существу не растворимые в воде лекарственные средства к очагу заболевания. Указанные наночастицы легко встраиваются в собственные процессы переноса организма и могут использовать свойство опухолей притягивать альбумин, что позволяет доставлять к очагу-мишени активное лекарственное средство в более высоких концентрациях. Кроме того, методы создания наночастиц на основе альбумина позволяют повысить растворимость лекарственного средства без использования токсичных химических веществ, таких как растворители, что потенциально повышает безопасность благодаря устранению побочных эффектов, связанных с использованием растворителей.

Все публикации, патенты, заявки на патент и опубликованные заявки на патент полностью включены в настоящее описание изобретения в качестве ссылки.

Сущность изобретения

Одним объектом настоящего изобретения являются композиции без приона на основе наночастиц (в частности, фармацевтические композиции). Некоторые варианты осуществления изобретения относятся к композиции, содержащей наночастицы, включающие альбумин и по существу не растворимый в воде фармакологически активный агент, при этом в указанной композиции по существу отсутствует прионный белок. В некоторых вариантах осуществления изобретения композиция является стерильной. В некоторых вариантах осуществления изобретения композиция стерилизована фильтрованием. В некоторых вариантах осуществления изобретения композиция дополнительно содержит фармацевтически приемлемый носитель.

В некоторых вариантах осуществления изобретения композиция содержит менее примерно 100 фг/мл прионного белка. В некоторых вариантах осуществления изобретения композиция характеризуется инфективностью приона менее примерно 10 ин.ед.-иц/мл. В некоторых вариантах осуществления изобретения композиция характеризуется инфективностью приона менее примерно 1 LD₅₀/мл.

В некоторых вариантах осуществления изобретения в композиции отсутствует прионный белок по результатам анализа методом циклической амплификации с ошибочной укладкой цепи белка (РМСА). В некоторых вариантах осуществления изобретения в композиции отсутствует прионный белок по результатам анализа методом ИПЦР. В некоторых вариантах осуществления изобретения композиция характеризуется инфективностью приона менее примерно 10 ин.ед.-иц/мл и отсутствием прионного белка по результатам анализа РМСА. В некоторых вариантах осуществления изобретения композиция характеризуется инфективностью приона менее примерно 10 ин.ед.-иц/мл и отсутствием прионного белка по результатам анализа методом ИПЦР.

Композиции по настоящему изобретению обычно по существу не содержат PrPsc. В некоторых вариантах осуществления изобретения композиция также не содержит PrPc. В некоторых вариантах осуществления изобретения молярное соотношение PrPsc и PrPc в композиции не превышает примерно 1:1, в частности, не превышает примерно 1:10, 1:100, 1:1000, 1:10000 или 1:100000.

В некоторых вариантах осуществления изобретения композиция по настоящему изобретению содержат некоторое количество (например, следовое количество) веществ, введенных в процессе удаления приона. Например, некоторые варианты осуществления изобретения относятся к композиции, содержащей наночастицы, включающие альбумин и по существу не растворимый в воде фармакологически активный агент, при этом в указанной композиции по существу отсутствует прионный белок и присутствует некоторое количество (например, следовое количество) лиганда, способного связываться с прионным белком. Некоторые варианты осуществления изобретения относятся к композиции, содержащей наночастицы, включающие альбумин и по существу не растворимый в воде фармакологически активный агент, при этом в указанной композиции по существу отсутствует прионный белок и присутствует некоторое количество (например, следовое количество) носителя (в частности, носителя по настоящему изобретению, включающего смолу). Некоторые варианты осуществления изобретения относятся к композиции, содержащей наночастицы, включающие альбумин и по существу не растворимый в воде фармакологически активный агент, при этом в указанной композиции по существу отсутствует прионный белок и присутствует некоторое количество смолы PRDT (например, следовое количество смолы PRDT). Некоторые варианты осуществления изобретения относятся к композиции, содержащей наночастицы, включающие альбумин и по существу не растворимый в воде фармакологически активный агент, при этом в указанной композиции по существу отсутствует прионный белок и присутствует некоторое количество смолы DRV (например, следовое количество смолы DRV).

В некоторых вариантах осуществления изобретения содержание стабилизатора альбумина в композиции меньше, чем в композиции, в которой альбумин не был очищен в соответствии с процессом удаления приона. Указанные стабилизаторы альбумина включают, например, N-ацетилтриптофанат и каприлат натрия.

В некоторых вариантах осуществления изобретения указанная композиция биологически эквивалента композиции, в которой альбумин не был очищен в соответствии с процессом удаления приона.

Некоторые варианты осуществления изобретения относятся к композиции, содержащей наночастицы, включающие альбумин и по существу не растворимаый в воде фармакологически активный агент, при этом альбумин в композиции был получен в соответствии с процессом удаления приона, который включает приведение исходной композиции альбумина в контакт с лигандом, способным связываться с прионным белком. В некоторых вариантах осуществления изобретения процесс удаления приона дополнительно включает удаление указанного лиганда и связанных с ним белков из композиции альбумина.

Некоторые варианты осуществления изобретения относятся к композиции, содержащей наночастицы, включающие альбумин и по существу не растворимый в воде фармакологически активный агент, при этом альбумин в композиции был получен способом, включающим: а) приведение исходной композиции альбумина в контакт с лигандом, способным связываться с прионным белком с образованием комплекса лиганда с прионным белком, и b) удаление полученного комплекса из исходной композиции.

В некоторых вариантах осуществления изобретения исходная композиция альбумина является продуктом, выделенным из крови. В некоторых вариантах осуществления изобретения исходная композиция альбумина является композицией, полученной из биологической жидкости (такой как кровь). В некоторых вариантах осуществления изобретения альбумин является сывороточным альбумином человека.

В некоторых вариантах осуществления изобретения лиганд является пептидом (в частности, любым пептидом, указанным в таблице 1). В некоторых вариантах осуществления изобретения лиганд является антителом, узнающим прионный белок. В некоторых вариантах осуществления изобретения лиганд является химическим соединением (в частности, соединением на основе триазина). В некоторых вариантах осуществления изобретения лиганд включает аминогруппу, например, аминогруппу в полиамине.

Лиганд может быть присоединен к носителю, включающему, например, колонку, гранулу, матрицу, фильтр и мембрану.

Другим объектом изобретения являются способы получения композиций без приона на основе наночастиц. Например, некоторые варианты осуществления изобретения относятся к способу получения композиции, содержащей наночастицы, включающие альбумин и по существу не растворимый в воде фармакологически активный агент, который состоит в том, что смесь, включающую раствор альбумина и органическую фазу, содержащую по существу не растворимый в воде фармакологически активный агент, диспергированный в органическом растворителе, подвергают воздействию высокого сдвигающего усилия, при этом альбумин был получен способом, включающим удаление прионного белка из исходной композиции альбумина. Некоторые варианты осуществления изобретения относятся к способу получения композиции, содержащей наночастицы, включающие альбумин и по существу не растворимый в воде фармакологически активный агент, который состоит в том, что смесь, включающую раствор альбумина и органическую фазу, содержащую по существу не растворимый в воде фармакологически активный агент, диспергированный в органическом растворителе, подвергают воздействию высокого сдвигающего усилия, при этом альбумин был получен способом, включающим приведение исходной композиции альбумина в контакт с лигандом, способным связываться с прионным белком. Некоторые варианты осуществления изобретения относятся к способу получения композиции, содержащей наночастицы, включающие альбумин и по существу не растворимый в воде фармакологически активный агент, который состоит в том, что смесь, включающую раствор альбумина и органическую фазу, содержащую по существу не растворимый в воде фармакологически активный агент, диспергированный в органическом растворителе, подвергают воздействию высокого сдвигающего усилия, при этом альбумин был получен способом, включающим: а) приведение исходной композиции альбумина в контакт с лигандом, способным связываться с прионным белком, и b) удаление лиганда и связанного с ним белка из исходной композиции.

Некоторые варианты осуществления изобретения относятся к способу получения композиции, содержащей наночастицы, включающие альбумин и по существу не растворимый в воде фармакологически активный агент, который включает: а) удаление прионного белка из исходной композиции альбумина; b) воздействие высоким сдвигающим усилием на смесь, включающую раствор альбумина без приона и органическую фазу, содержащую по существу не растворимый в воде фармакологически активный агент, диспергированный в органическом растворителе. Некоторые варианты осуществления изобретения относятся к способу получения композиции, содержащей наночастиицы, включающие альбумин и по существу не растворимый в воде фармакологически активный агент, который включает: а) приведение исходной композиции альбумина в контакт с лигандом, способным связываться с прионным белком с образованием комплекса лиганда с прионным белком, b) удаление полученного комплекса из исходной композиции альбумина и с) воздействие высоким сдвигающим усилием на смесь, включающую раствор альбумина без приона и органическую фазу, содержащую по существу не растворимый в воде фармакологически активный агент, диспергированный в органическом растворителе.

Некоторые варианты осуществления изобретения относятся к способу получения композиции, содержащей наночастицы, включающие альбумин и по существу не растворимый в воде фармакологически активный агент, который включает: а) приведение раствора альбумина в контакт с лигандом, способным связываться с прионным белком, b) удаление лиганда и связанных с ним белков из раствора альбумина и c) воздействие высоким сдвигающим усилием на смесь, включающую указанный раствор альбумина и органическую фазу, содержащую по существу не растворимый в воде фармакологически активный агент, диспергированный в органическом растворителе. В некоторых вариантах осуществления изобретения смесь по существу не содержит поверхностно-активных веществ.

Прионы могут быть удалены во время образования наночастиц. Например, некоторые варианты осуществления изобретения относятся к способу получения композиции, содержащей наночастицы, включающие альбумин и по существу не растворимый в воде фармакологически активный агент, который включает: а) приведение т смеси, включающей раствор альбумина и органическую фазу, содержащую по существу не растворимый в воде фармакологически активный агент, диспергированный в органическом растворителе, в контак с лигандом, способным связываться с прионным белком. В некоторых вариантах осуществления изобретения указанный способ дополнительно включает: b) удаление из смеси лиганда и связанных с ним белков. В некоторых вариантах осуществления изобретения указанный способ дополнительно включает с) воздействие на смесь высоким сдвигающим усилием. В некоторых вариантах осуществления изобретения смесь по существу не содержит поверхностно-активных веществ.

Прионные белки могут быть также удалены после образования композиции на основе наночастиц. Например, некоторые варианты осуществления изобретения относятся к способу получения композиции, содержащей наночастицы, включающие альбумин и по существу не растворимый в воде фармакологически активный агент, который включает приведение смеси, включающей органическую фазу, содержащую по существу не растворимый в воде фармакологически активный агент, диспергированный в органическом растворителе, и раствор альбумина, в контакт с лигандом, способным связываться с прионным белком, при этом смесь подвергают воздействию высокого сдвигающего усилия до приведения в контакт с лигандом. Некоторые варианты осуществления изобретения относятся к способу получения композиции, содержащей наночастицы, включающие альбумин и по существу не растворимый в воде фармакологически активный агент, который включает: а) воздействие высоким сдвигающим усилием на смесь, включающую органическую фазу, содержащую по существу не растворимый в воде фармакологически активный агент, диспергированный в органической фазе, и раствор альбумина, и b) приведение смеси в контакт с лигандом, способным связываться с прионным белком. В некоторых вариантах осуществления изобретения указанный способ дополнительно включает: с) удаление из смеси лиганда и связанных с ним белков. В некоторых вариантах осуществления изобретения смесь по существу не содержит поверхностно-активных веществ.

Некоторые варианты осуществления изобретения относятся к способу удаления прионного белка из композиции с подозрением на наличие прионного белка, содержащей наночастицы, включающие альбумин и по существу не растворимый в воде фармакологически активный агент, который включает а) приведение композиции на основе наночастиц в контакт с лигандом, способным связываться с прионным белком, b) удаление лиганда и связанных с ним белков из композиции на основе наночастиц. Некоторые варианты осуществления изобретения относятся к способу удаления прионного белка из композиции альбумина с подозрением на наличие аномального прионного белка, который включает: а) приведение композиции альбумина в контакт с лигандом, способным связываться с прионным белком, b) удаление лиганда и связанных с ним белков из композиции альбумина, при этом композицию альбумина используют для получения композиции, содержащей наночастицы, включающие альбумин и по существу не растворимый в воде фармакологически активный агент.

Некоторые варианты осуществления изобретения относятся к способу удаления прионного белка из композиции, содержащей наночастицы, включающие альбумин и по существу не растворимый в воде фармакологически активный агент, который включает: а) определение наличия или отсутствия в композиции прионного белка, b) приведение композиции в контакт с лигандом, способным связываться с прионным белком, и с) удаление из композиции лиганда и связанных с ним белков.

Настоящее изобретение также относится к композициям, полученным при выполнении процесса удаления приона. Например, некоторые варианты осуществления изобретения относятся к композиции, содержащей наночастицы, включающие альбумин и по существу не растворимый в воде фармакологически активный агент, а также лиганд, способный связываться с прионным белком. Некоторые варианты осуществления изобретения относятся к смеси, содержащей наночастицы, включающие альбумин и по существу не растворимый в воде фармакологически активный агент, а также лиганд, способный связываться с прионным белком, присоединенным к носителю, в частности, к одному или нескольким носителям, рассмотренным в настоящем описании изобретения. Некоторые варианты осуществления изобретения относятся к колонке, заполненной композицией, содержащей наночастицы, включающие альбумин и по существу не растворимый в воде фармакологически активный агент, при этом указанная колонка содержит лиганд, способный связываться с прионным белком.

Настоящее изобретение относится также к композициям, полученным способами по настоящему изобретению. Настоящее изобретение относится также к способам применения композиций без приона по настоящему изобретению. Например, некоторые варианты осуществления изобретения относятся к способу введения композиции, содержащей наночастицы, включающие альбумин и по существу не растворимый в воде фармакологически активный агент, в которой по существу отсутствует прионный белок. Некоторые варианты осуществления изобретения относятся к способу лечения болезни (такой как рак), который включает введение композиции, содержащей наночастицы, включающие альбумин и по существу не растворимый в воде фармакологически активный агент, в которой по существу отсутствует прионный белок.

Некоторые варианты осуществления изобретения относятся к способу введения композиции, содержащей наночастицы, включающие альбумин и по существу не растворимый в воде фармакологически активный агент, при этом альбумин в композиции был получен в соответствии с процессом удаления приона, который включает приведение исходной композиции альбумина в контакт с лигандом, способным связываться с прионным белком. В некоторых вариантах осуществления изобретения процесс удаления приона дополнительно включает удаление указанного лиганда и связанных с ним белков из композиции альбумина. Некоторые варианты осуществления изобретения относятся к способу лечения болезни (такой как рак), который включает введение композиции, содержащей наночастицы, включающие альбумин и по существу не растворимый в воде фармакологически активный агент, при этом альбумин в композиции был получен в соответствии с процессом удаления приона, который включает приведение исходной композици альбумиина в контакт с лигандом, способным связываться с прионным белком.

Настоящее изобретение относится также к лекарственным формам (таким как ампулы, например, запаянные ампулы), включающим композиции без приона на основе наночастиц по настоящему изобретению, и наборам, используемым при осуществлении способов по настоящему изобретению. Настоящее изобретение относится также к системам (включая устройства), предназначенным для осуществления одного или нескольких способов по настоящему изобретению.

Вышеуказанные и другие объекты и преимущества настоящего изобретению будут более понятны из последующего подробного описания изобретения и прилагаемой формулы изобретения. Следует отметить, что один, некоторые или все признаки разных вариантов осуществления изобретения могут быть объединены с созданием других вариантов осуществления настоящего изобретения.

Краткое описание чертежей

На фиг.1 показаны вестерн-блоты и гели смолы DVR для SDS-PAGE, стимулированные 0,01% и 0,005% гомогената головного мозга хомячка, страдающего болезнью скрепи, в 20% или 25% растворе альбумина. AMN31 является положительной контрольной смолой. Наблюдаемый сигнал относится к связанной фракции. Символы “-PK” и “+РК” означают отсутствие или наличие расщепления протеиназой К.

На фиг.2 показаны вестерн-блоты и гели смол YVHEA и SYA для SDS-PAGE, стимулированные 0,01% и 0,005% гомогената головного мозга хомячка, страдающего болезнью скрепи, в 20% или 25% растворе альбумина. AMN31 является положительной контрольной смолой. Наблюдаемый сигнал относится к связанной фракции. Символы “-PK” и “+РК” означают отсутствие или наличие расщепления протеиназой К.

На фиг.3 показаны вестерн-блоты и гели смолы D4 для SDS-PAGE, стимулированные 0,01% и 0,005% гомогената головного мозга хомячка, страдающего болезнью скрепи, в 20% или 25% растворе альбумина. AMN31 является положительной контрольной смолой. Наблюдаемый сигнал относится к связанной фракции. Символы “-PK” и “+РК” означают отсутствие или наличие расщепления протеиназой К.

На фиг.4 показана блок-схема процесса удаления TSE в колонке с восстанавливающей прион смолой (колонка PRDT (для диагностики и удаления патогенных микроорганизмов) для 20% раствора альбумина.

На фиг.5 показан хроматографический профиль потенцированного исследования удаления TSE в колонке PRDT для 20% раствора альбумина.

На фиг.6 показано исследование интерференции 20% раствора альбумина методом вестерн-блоттинга с центрифугированием (при наличии или отсутствии 10-кратной концентрации).

На фиг.7 показана блок-схема процесса удаления TSE в колонке с восстанавливающей прион смолой (колонка PRDT) для 25% раствора альбумина.

На фиг.8 показан хроматогорафический профиль потенцированного исследования удаления TSE в колонке PRDT для 25% раствора альбумина.

На фиг.9 показано исследование интерференции 25% раствора альбумина методом вестерн-блоттинга с центрифугированием (при наличии или отсутствии 10-кратной концентрации).

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение относится к композициям без приона (таким как фармацевтические композиции), содержащим наночастицы, включающие альбумин и по существу не растворимые в воде фармакологические активные агенты, и к способам получения композиций без приона.

Одним объектом настоящего изобретения являются композиции (в частности, фармацевтические композиции), содержащие наночастицы, включающие альбумин и по существу не растворимые в воде фармакологически активные агенты, при этом в указанной композиции по существу отсутствует прионный белок.

Другим объектом настоящего изобретения является способ получения композиций без приона (таких как фармацевтические композиции), содержащих наночастицы, включающие альбумин и по существу не растворимый в воде фармакологически активный агент. Настоящее изобретение также относится к композициям, приготовленным соответствующим способом получения.

Другим объектом настоящего изобретения является способ применения композиций без приона (таких как фармацевтические композиции), содержащих наночастицы, включающие альбумин и по существу не растворимый в воде фармакологически активный агент.

Настоящее изобретение также относится к лекарственным формам (таким как ампулы, например, запаянные ампулы), включающим композиции без приона на основе наночастиц по настоящему изобретению, к наборам и системам, используемым при осуществлении способов по настоящему изобретению.

Термин “без приона” использован в настоящем описании изобретения для удобства и обычно служит для описания новых композиций; в определение вышеуказанного термина входят все варианты осуществления изобретения, представленные в настоящем описании изобретения.

Термин “примерно” применительно к использованному значению или параметру служит для описания вариантов, относящихся непосредственно к данному значению или параметру. Например, указание “примерно Х” включает само значение “Х”.

Следует отметить, что объекты и варианты осуществления изобретения, рассмотренные в настоящем описании изобретения, включают определения “состоящий из” и/или “в основном состоящий из”, относящиеся к объектам и вариантам осуществления изобретения.

Композиции без приона на основе наночастиц

Настоящее изобретение относится к композиции (такой как фармацевтическая композиция), содержащей наночастицы, включающие альбумин и по существу не растворимый в воде фармакологически активный агент, при этом в указанной композиции по существу отсутствует прионный белок. В некоторых вариантах осуществления изобретения композиция является стерильной. В некоторых вариантах осуществления изобретения композиция стерилизована фильтрованием. В некоторых вариантах осуществления изобретения композиция дополнительно содержит фармацевтически приемлемый носитель.

В некоторых вариантах осуществления изобретения прионный белок нельзя обнаружить в композиции при помощи метода обнаружения с чувствительностью примерно 100 фг/мл или выше, то есть результат исследования является отрицательным при выполнении анализа методом обнаружения с чувствительностью примерно 100 фг/мл или выше (например, с чувствительностью обнаружения примерно 50 фг/мл, примерно 10 фг/мл, примерно 1 фг/мл, примерно 0,1 фг/мл). Содержание приона в композиции можно обнаружить непосредственно в композиции. Альтернативно композицию можно обработать перед определением, например, концентрировать или обогатить, чтобы облегчить обнаружение и количественное определение прионного белка в композиции.

Одним способом определения наличия или отсутствия в композиции прионного белка является выполнение анализа инфективности in vivo. Напрнимер, инфективность in vivo можно определить, инкубируя испытуемую композицию в таких животных моделях как мышь, норка, хомячок или коза. Инфективность можно определить в виде смертельной дозы (LD₅₀), то есть дозы, которая при введении данным способом (таким как интрацеребральный способ введения) вызывает заболевание у 50% зараженных животных. Альтернативно инфективность можно определить в инфекционных единицах, то есть в виде минимальной инфекционной дозы, способной переносить заболевание от одного экспериментального животного другому животному при данном способе введения. Как правило, 100 ин.ед.-иц/мл (инфекционная единица, определенная при интрацеребральном способе введения) соответствует примерно 10 LD₅₀/мл и 1 пг/мл прионного белка.

Другим способом определения прионного белка в композиции является метод иммунополимеразной цепной реакции (ИПЦР), в котором способность экспоненциальной амплификации ПЦР объединена с обнаружением белков антителами в формате ELISA и использована в модифицированном методе ИПЦР в реальном времени для обнаружения прионного белка на сверхнизких уровнях. Смотрите публикацию Barletta et al., J. Virology Methods, 127 (2005): 154-104. При помощи ИПЦР рекомбинантный PrPc хомячка был обнаружен на уровне 1 фг/мл в расщепленных протеиназой К (РК) гомогенатах головного мозга хомячка, инфицированного болезнью скрепи, разведенных до 10^-8 (приблизительно 10-100 инфекционных единиц), с использованием полуколичественного метода определения зависимости между дозой и эффектом.

В некоторых вариантах осуществления изобретения прионный белок в композиции определяют методом циклической амплификации с ошибочной укладной цепи белка (РМСА). Указанный метод был использован для обнаружения PrPsc в крови. Другие методы, пригодные для определения прионного белка в композиции, включают, не ограничиваясь ими: количественный сэндвич-метод ELISA с использованием усиливающей диссоциацию флуоресценции с временным разрешением; двухцветное флуоресцентное конфокальное сканирование; конформационный иммуноанализ (CDI). Для обнаружения прионных белков в композиции также могут быть использованы такие методы как вестерн-блоттинг, гибридизация с гранулами, анализы сдвига подвижности в геле, флуоресцентные анализы гибридизации in situ (FISH), обнаружение радиоактивных или биолюминесцентных маркеров, ядерный магнитный резонанс, электронный парамагнитный резонанс, спектроскопия в остановленном потоке, хроматография на колонке, капиллярный электрофорез или другие методы.

В некоторых вариантах осуществления изобретения композиция по существу не содержит прионного белка по результатам одного из анализов обнаружения прионных белков (в частности, одного из вышеописанных анализов). В некоторых вариантах осуществления изобретения для исследования композиции могут быть использованы два или большее число анализов, при этом для определения наличия или отсутствия прионного белка в композиции используют корреляцию результатов разных анализов.

Таким образом, некоторые варианты осуществления изобретения относятся к композиции, содержащей наночастицы, включающие альбумин и по существу не растворимый в воде фармакологически активный агент, при этом в композиции по существу отсутствует прионный белок. В некоторых вариантах осуществления изобретения композиция характеризуется инфективностью приона менее примерно 100 фг/мл. В некоторых вариантах осуществления изобретения композиция характеризуется инфективностью приона менее примерно 10 ин.ед.-иц/мл. В некоторых вариантах осуществления изобретения композиция характеризуется инфективностью приона менее примерно 1 LD₅₀/мл. В некоторых вариантах осуществления изобретения в композиции отсутствует прионный белок по результатам анализа методом циклической амплифимкации с ошибочной укладкой цепи белка (РМСА). В некоторых вариантах осуществления изобретения в композиции отсутствует прионный белок по результатам анализа ИПЦР. В некоторых вариантах осуществления изобретения композиция характеризуется инфективностью приона менее примерно 10 ин.ед.-иц/мл и не содержит прионного белка по результатам анализа РМСА. В некоторых вариантах осуществления изобретения композиция характеризуется инфективностью приона менее примерно 10 ин.ед.-иц/мл и не содержит прионного белка по результатам анализа методом ИПЦР. В некоторых вариантах осуществления изобретения композиция не содержит прионного белка на основании стандарта, представленного в Руководстве по исследованию процессов приготовления выделенных из плазмы медицинских продуктов в отношении риска заражения vCJD (CPMP5136/03), которое доступно на сайте http://www.emea.europa.eu/pdfs/human/bwp/513603en.pdf и полностью включено в настоящее описание изобретения.

Композиции по настоящему изобретению обычно по существу не содержат PrPsc. В некоторых вариантах осуществления изобретения в композиции также по существу отсутствует PrPc. В некоторых вариантах осуществления изобретения молярное соотношение PrPsc и PrPc в композиции не превышает примерно 1:1, в частности, не превышает примерно 1:10, 1:100, 1:1000, 1:10000 или 1:100000.

В некоторых вариантах осуществления изобретения в композиции по существу отсутствует прионный белок человека, коровы, овцы и грызуна (такого как хомячок, мышь и норка). В некоторых вариантах осуществления изобретения в композиции по существу отсутствует прионный белок Н-типа, прионный белок L-типа или обоих типов. В некоторых вариантах осуществления изобретения в композиции по существу отсутствует прионный белок, связанный с клеткой, свободный прионный белок или оба прионных белка.

Термин “PrPc” в использованном здесь значении означает молекулу нативного прионного белка, которая обычно экспрессирована в организме млекопитающего. Термин “PrPsc” в использованном здесь значении означает структурно измененную форму молекулы PrPc, которая, как известно, является инфекционной.

Термин "альбумин" в использованном здесь значении означает природный альбумин, и в определение данного