Антитело против c-met

Антитело против c-met

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Настоящее изобретение относится к новому бивалентному антителу, способному к специфичному связыванию с рецептором c-Met человека и/или способному к специфичному ингибированию тирозинкиназной активности данного рецептора, а также к аминокислотной и нуклеиново-кислотной последовательности, кодирующей данное антитело. Более конкретно антитело в соответствии с изобретением способно к ингибированию димеризации c-Met. Изобретение также включает применение данного антитела в качестве лекарства для профилактического и/или терапевтического лечения раков или любой патологии, связанной с гиперэкспрессией данного рецептора, а также способы и наборы для диагностики заболевания, связанного с гиперэкспрессией c-Met. Изобретение, наконец, включает препараты и/или композиции, содержащие такое антитело в комбинации с другими антителами и/или химическими соединениями, направленными против других факторов роста, вовлеченных в прогрессирование или метастаз опухоли, и/или соединениями и/или противораковыми агентами или агентами, конъюгированными с токсинами, и их применение для предупреждения и/или лечения определенных раков.

Агенты, направленные на рецепторные тирозинкиназы (RTK), такие как ингибиторы трастузумаб, цетуксимаб, бевацизумаб, иматиниб и гефитиниб, показали интерес к направленности данного класса белков на лечение избранных раков.

c-Met является прототипным членом подсемейства RTK, которое также включает RON и SEA. Семейство c-Met RTK структурно отличается от других семейств RTK и является единственным известным высоко аффинным рецептором к фактору роста гепатоцитов (HGF), также называемому рассеивающим фактором (SF) [D.P. Bottaro et al, Science 1991, 251:802-804; L. Naldini et al, Eur. Mol. Biol. Org. J. 1991, 10:2867-2878]. c-Met и HGF распространенно экспрессируются в ряде тканей, и их экспрессия в норме ограничена клетками эпителиального и мезенхимального происхождения соответственно [M.F. Di Renzo et al., Oncogene 1991, 6:1997-2003; E. Sonnenberg et al, J. Cell. Biol. 1993, 123:223-235]. Оба они требуются для нормального развития млекопитающих, и показано,. что они особенно важны при миграции клеток, морфогенетической дифференциации и организации трехмерных тубулярных структур, а также при росте и ангиогенезе [F. Baldt et al, Nature 1995, 376:768-771; С.Schmidt et al, Nature. 1995:373:699-702; Tsarfaty et al, Science 1994, 263:98-101]. Хотя показано, что контролируемая регуляция с-Met и HGF важна при развитии млекопитающих, поддержании и репарации тканей [Nagayama Т., Nagayama M., Kohara S., Kamiguchi H., Shibuya M., Katoh Y., Itoh J., Shinohara Y., Brain Res. 2004, 5;999(2): 155-66; Tahara Y., Ido A., Yamamoto S., Miyata Y., Uto H., Hori Т., Hayashi K., Tsubouchi H., J Pharmacol Exp Ther. 2003, 307(1): 146-51], нарушение их регуляции считают причиной прогрессирования раков.

Аберрантная передача сигнала, направляемая неправильной активацией с-Met, является одной из наиболее частых аберраций, наблюдаемых при раках человека, и играет критическую роль в канцерогенезе и метастазах [Birchmeier et al., Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 2003, 4:915-925; L. Trusolino and Comoglio P. M., Nat Rev. Cancer. 2002, 2(4):289-300].

Неправильная активация c-Met может возникать в результате лиганд-зависимых и независимых механизмов, которые включают гиперэкспрессию c-Met и/или паракринную или аутокринную активацию, или посредством прироста функциональных мутаций [J.G. Christensen, Burrows J. and Salgia R., Cancer Latters. 2005, 226:1-26]. Однако олигомеризация рецептора c-Met в присутствии или в отсутствие лиганда необходима для регуляции связывающего сродства и кинетики связывания киназы с АТФ и содержащими тирозин пептидными субстратами [Hays JL, Watowich SJ, Biochemistry, 2004 Aug 17, 43:10570-8]. Активированный c-Met рекрутирует сигнальные эффекторы к его сайту множественной стыковки, расположенному в цитоплазматическом домене, приводя в результате к активации нескольких ключевых путей передачи сигнала, включая Ras-MAPK, PI3K, Src и Stat3 [Gao CF, Vande Woude GF, Cell Res. 2005, 15(1):49-51; Furge KA, Zhang YW, Vande Woude GF, Oncogene. 2000, 19(49):5582-9]. Эти пути существенны для пролиферации опухолевых клеток, инвазии и ангиогенеза и для уклонения от апоптоза [Furge KA, Zhang YW, Vande Woude GF, Oncogene, 2000, 19(49):5582-9; Gu H., Neel BG, Trends Cell Biol. 2003 Mar, 13(3): 122-30; Fan S., Ma YX, Wang JA, Yuan RQ, Meng Q., Cao Y., Laterra JJ, Goldberg ID, Rosen EM, Oncogene. 2000 Apr 27, 19(18):2212-23]. Кроме того, уникальным аспектом передачи сигнала c-Met относительно других RTK является его описанное взаимодействие с фокальными адгезионными комплексами и не киназными партнерами связывания, такими как интегрины α6β4 [Trusolino L., Bertotti A., Comoglio PM, Cell. 2001, 107:643-54], CD44v6 [Van der Voort R., Taher ТЕ, Wielenga VJ, Spaargaren M., Prevo R., Smit L., David G., Hartmann G, Gherardi E., Pals ST, J. Biol. Chem. 1999, 274(10):6499-506], плексин В1 или семафорины [Giordano S., Corso S., Conrotto P., Artigiani S., Gilestro G., Barberis D., Tamagnone L., Comoglio PM, Nat Cell Biol. 2002, 4(9):720-4; Conrotto, P., Valdembri D., Corso S., Serini G., Tamagnone L., Comoglio PM, Bussolino F., Giordano S., Blood. 2005, 105(11):4321-9; Conrotto P., Corso S., Gamberini S., Comoglio PM, Giordano S., Oncogene. 2004, 23:5131-7], что может дополнительно способствовать комплексности регуляции клеточной функции этим рецептором. Наконец, последние данные демонстрируют, что c-Met может быть вовлечен в устойчивость опухоли к гефитинибу или эрлотинибу, что позволяет предположить, что комбинация соединения, направленная как на EGFR, так и на c-Met, могла бы представлять значительный интерес [Engelman JA et al, Science, 2007, 316:1039-43].

В последние несколько лет множество различных стратегий разработано для аттенуации передачи сигнала c-Met в раковых клеточных линиях. Эти стратегии включают i) нейтрализующие антитела против c-Met или HGF/SF [Сао В., Su Y., Oskarsson M., Zhao P., Kort EJ, Fisher RJ, Wang LM, Vande Woude GF, Proc Natl Acad Sci USA. 2001, 98(13):7443-8; Martens Т., Schmidt NO, Eckerich C, Fillbrandt R., Merchant M., Schwall R., Westphal M., Lamszus K., Clin Cancer Res. 2006, 12(20):6144-52] или применение антагониста HGF/SF NK4 для предотвращения связывания лиганда с c-Met [Kuba K., Matsumoto K., Date K., Shimura H., Tanaka M., Nakamura Т., Cancer Res., 2000, 60:6737-43], ii) низкомолекулярные ингибиторы сайта связывания АТФ с c-Met, которые блокируют киназную активность [Christensen JG, Schreck R., Burrows J., Kuruganti P., Chan E, Le P., Chen J., Wang X., Ruslim L., Blake R., Lipson KE, Ramphal J., Do S., Cui JJ, Cherrington JM, Mendel DB, Cancer Res. 2003, 63:7345-55], iii) сконструированный полипептид домена SH2, который препятствует доступу к множественному докинг-сайту и РНКи или рибозим, которые снижают экспрессию рецептора или лиганда. Большинство этих подходов проявляют селективное ингибирование c-Met, приводящее в результате к ингибированию опухоли и показывают, что c-Met может представлять интерес для терапевтического вмешательства в рак.

Среди молекул, созданных для направления на c-Met, некоторые являются антителами. Наиболее широко описанным является антитело против c-Met 5D5, полученное фирмой Genentech [WO 96/38557], которое ведет себя как сильный агонист при отдельном добавлении в различных моделях и как антагонист при использовании в виде Fab фрагмента. Моновалентная сконструированная форма этого антитела, описанная как 5D5 с одним плечом (OA5D5) и продуцированная в виде рекомбинантного белка в E.coli, также является объектом заявки на патент [WO 2006/015371] фирмы Genentech. Однако данная молекула, которую нельзя рассматривать как антитело в связи с ее особым каркасом, также проявляет мутации, которые могли бы быть иммуногенными у людей. Что касается активности, эта не гликозилированная молекула не обладает эффекторными функциями, и, наконец, нет четких данных, демонстрирующих, что OA5D5 ингибирует димеризацию c-Met. Кроме того, при тестировании в модели G55 in vivo на клеточной линии глиобластомы, которая экспрессирует c-Met, но не экспрессирует мРНК и белок HGF, и которая растет независимо от лиганда, анти-c-Met с одним плечом не обладает значимым эффектом на рост опухоли G55, что позволяет предположить, что OA5D5 действует, прежде всего, посредством блокирования связывания HGF и неспособен к направленности на опухоли, активированные независимо от HGF [Martens Т. et al, Clin. Cancer Res., 2006, 12(20):6144-6152].

Другое антитело, направленное на c-Met, описано фирмой Pfizer как антитело, действующее "преимущественно как антагонист c-Met и в некоторых случаях как агонист c-Met" [WO 2005/016382]. Никаких данных, показывающих какой-либо эффект антител Pfizer на димеризацию c-Met, в данной заявке не описано.

Одним из новаторских аспектов настоящего изобретения является создание химерного и/или гуманизированного моноклонального антитела без собственной агонистической активности, и ингибирующего димеризацию c-Met. Более конкретно новаторским аспектом настоящего изобретения является создание химерного и/или гуманизированного моноклонального антитела с антагонистической активностью и ингибированием димеризации c-Met.

В дополнение к направленности на лиганд-зависимые опухоли, данный подход будет также нарушать лиганд-независимые активации c-Met вследствие его гиперэкспрессии или мутаций внутриклеточных доменов, которые остаются зависимыми от олигомеризации для передачи сигнала. Другим аспектом активности этого антитела могло бы быть стерическое затруднение взаимодействия c-Met с его партнерами, которое приведет в результате к нарушению функций c-Met. Это антитело является гуманизированным и сконструировано преимущественно, но не ограниченно этим, как IgG1 человека с приобретением эффекторных функций, таких как АЗКЦ и КЗЦ, в дополнение к функциям, связанным со специфичной блокадой рецептора c-Met.

Авторы изобретения неожиданно впервые смогли создать химерное и/или гуманизированное моноклональное антагонистическое антитело, способное к связыванию с c-Met, но также способное к ингибированию димеризации c-Met, где данное моноклональное антитело является бивалентным в противоположность существующим антагонистическим антителам, направленным против c-Met. Если верно, что, как иногда предполагали на предшествующем уровне техники, антитело, способное к ингибированию димеризации c-Met его партнерами, может представлять интерес, антитело, способное осуществлять это, никогда не было ни описано, ни четко предложено. Кроме того, что касается специфичности антитела, было вовсе неочевидно достижение успеха в создании такого активного бивалентного антитела.

Как было объяснено выше, ингибирование димеризации c-Met является главным аспектом изобретения, поскольку такие антитела представляют действительный интерес для более широкой группы пациентов. Не только лиганд-зависимый, c-Met-активированный рак, как это было до настоящего изобретения, но также лиганд-независимый, c-Met-активированный рак можно лечить антителами, полученными способом по настоящему изобретению.

Антитела оценивали с помощью анализа BRET на клетках, экспрессирующих оба гена c-Met-RLuc/c-Met-YFP, и отбирали на их способность ингибировать по меньшей мере 40%, предпочтительно 45%, 50%, 55% и наиболее предпочтительно 60% сигнала BRET.

Технология BRET известна как репрезентативная для димеризации белков [Angers et al, PNAS, 2000, 97:3684-89].

Технология BRET хорошо известна специалистам в данной области техники и подробно описана в приведенных ниже примерах. Более конкретно BRET (резонансный перенос энергии биолюминесценции, Bioluminescence Resonance Energy Transfer) представляет собой нерадиоактивный перенос энергии, происходящий между биолюминесцентным донором (люциферазой Renilla (Rluc)) и флуоресцентным акцептором, мутантом GFP (зеленого флуоресцентного белка), или YFP (желтым флуоресцентным белком). В настоящем случае использовали EYFP (усиленный желтый флуоресцентный белок). Эффективность переноса зависит от ориентации и расстояния между донором и акцептором. Поэтому перенос энергии может происходить только тогда, когда две молекулы находятся в тесной приближенности (1-10 нм). Это свойство используют для создания анализов взаимодействия между белками. Действительно, чтобы исследовать взаимодействие между двумя партнерами, первый генетическим путем сливают с люциферазой Renilla, а второй с желтым мутантом GFP. Слитые белки обычно, но не обязательно экспрессируют в клетках млекопитающих. В присутствии его субстрата, проникающего через мембрану (целентеразина) Rluc испускает синий свет. Если мутант GFP находится ближе, чем на 10 нм от Rluc, может происходить перенос энергии, и можно обнаружить дополнительный желтый сигнал. Сигнал BRET измеряют как отношение между светом, испускаемым акцептором, и светом, испускаемым донором. Таким образом, сигнал BRET возрастает, когда два слитых белка приводят в близкий контакт, либо если конформационное изменение приводит Rluc и мутант GFP в более близкий контакт.

Если анализ BRET составляет предпочтительную форму осуществления, любой способ, известный специалистам в данной области техники, можно использовать для измерения димеризации c-Met. Без ограничения можно упомянуть следующие технологии: FRET (резонансный перенос энергии флуоресценции), HTRF (гомогенная времяпролетная флуоресценция), FLIM (микроскопия на основе измерения времени жизни флуоресценции) или SW-FCCS (одноволновая спектроскопия кросс-корреляции флуоресценции).

Можно также использовать другие классические технологии, такие как совместная иммунопреципитация, альфа-скрининг, химическое сшивание, двойная гибридизация, аффинная хроматография, ELISA или Far Вестерн-блоттинг.

Термины "антитело", "антитела" или "иммуноглобулин" используют взаимозаменяемо в самом широком смысле, и они включают моноклональные антитела (например, полноразмерные или интактные моноклональные антитела), поликлональные антитела, поливалентные антитела или мультиспецифические антитела (например, биспецифические антитела, если они проявляют желаемую биологическую активность).

Более конкретно такую молекулу составляет гликопротеин, содержащий по меньшей мере две тяжелые (Н) цепи и две легкие (L) цепи, взаимно соединенные дисульфидными связями. Каждая тяжелая цепь состоит из вариабельной области (или домена) тяжелой цепи (в данной заявке сокращенно HCVR или VH) и константной области тяжелой цепи. Константная область тяжелой цепи состоит из трех доменов, СН1, СН2 и СН3. Каждая легкая цепь состоит из вариабельной области легкой цепи (в данной заявке сокращенно LCVR или VL) и константной области легкой цепи. Константная область легкой цепи состоит из двух доменов CL. Области VH и VL можно дополнительно разделить на гипервариабельные участки, называемые участками определения комплементарности (CDR), чередующиеся с участками, которые являются более консервативными, называемыми каркасными участками (FR). Каждая VH и VL состоит из трех CDR и четырех FR, расположенных от амино-конца к карбокси-концу в следующем порядке: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. Вариабельные области тяжелых и легких цепей содержат связывающий домен, который связывается с антигеном. Константные области антител могут опосредовать связывание иммуноглобулина с тканями или факторами хозяина, включая различные клетки иммунной системы (например, эффекторные клетки) и первый компонент (Clq) классической системы комплемента.

Тяжелые цепи иммуноглобулинов можно разделить на три функциональных области: область Fd, шарнирную область, и область Fc (кристаллизуемый фрагмент). Область Fd содержит домены VH и СН1 ив комбинации с легкой цепью образует Fab - антигенсвязывающий фрагмент. Фрагмент Fc ответственен за эффекторные функции иммуноглобулина, которые включают, например, фиксацию комплемента и связывание с распознаванием рецепторов Fc эффекторных клеток. Шарнирная область, обнаруженная в иммуноглобулинах классов IgG, IgA и IgD, действует как гибкий спейсер, который дает возможность участку Fab свободно перемещаться в пространстве относительно области Fc. Шарнирные домены являются структурно различными, варьируя как по последовательности, так и по длине среди классов и подклассов иммуноглобулинов.

Согласно кристаллографическим исследованиям шарнирную область иммуноглобулина можно дополнительно подразделить структурно и функционально на три области: верхнюю шарнирную, сердцевину и нижнюю шарнирную (Shin et al, Immunological Reviews 130:87, 1992). Верхняя шарнирная область включает аминокислоты от карбокси-конца СН1 до первого остатка в шарнирной области, который ограничивает движение, обычно до первого остатка цистеина, который образует межцепочечную дисульфидную связь между двумя тяжелыми цепями. Длина верхней шарнирной области коррелирует с сегментной гибкостью антитела. Сердцевинная шарнирная область содержит дисульфидные мостики между тяжелыми цепями. Нижняя шарнирная область соединяет амино-конец домена СН2 и включает его остатки. Сердцевинная шарнирная область IgG1 человека содержит последовательность Cys-Pro-Pro-Cys, которая при димеризации вследствие образования дисульфидной связи приводит в результате к циклическому октапептиду, который считают действующим в качестве поворотной точки, таким образом, придавая гибкость. Конформационные изменения, допустимые структурой, и гибкость полипептидной последовательности шарнирной области иммуноглобулина могут влиять на эффекторные функции участка Fc антитела.

Термин "моноклональное антитело" используют в соответствии с его обычным значением для обозначения антитела, полученного из популяции по существу однородных антител, то есть индивидуальные антитела, составляющие эту популяцию, идентичны за исключением возможных встречающихся в природе мутаций, которые могут присутствовать в минорных количествах. Иными словами, моноклональное антитело состоит из однородного антитела, полученного в результате пролиферации единственного клона клеток (например, клеток гибридомы, эукариотических клеток-хозяев, трансфицированных ДНК, кодирующей однородное антитело, прокариотических клеток-хозяев, трансфицированных ДНК, кодирующей однородное антитело, и т.д.), которое, как правило, характеризуется тяжелыми цепями одного класса и подкласса и легкими цепями одного типа. Моноклональные антитела высоко специфичны, поскольку направлены против одного антигена. Кроме того, в противоположность препаратам поликлональных антител, которые типично включают различные антитела, направленные против различных детерминантов или эпитопов, каждое моноклональное антитело направлено против единственного детерминанта на антигене.

В настоящем описании термины полипептиды, полипептидные последовательности, аминокислотные последовательности, пептиды и белки, присоединенные к соединениям антитела или к их последовательности, взаимозаменяемы.

Изобретение относится к моноклональному антителу или к бивалентному функциональному фрагменту или к его производному, способному ингибировать димеризацию c-Met, и включающему тяжелую цепь, содержащую CDR-H1, CDR-H2 и CDR-H3 с соответствующими аминокислотными последовательностями SEQ ID No. 1, 2 и 3 или последовательностью, обладающей по меньшей мере 80% идентичностью после оптимального выравнивания с последовательностями SEQ ID No. 1, 2 и 3; и легкую цепь, содержащую CDR-L1, CDR-L2 и CDR-L3 с соответствующими аминокислотными последовательностями SEQ ID No. 5, 6 и 7 или последовательностью, обладающей по меньшей мере 80% идентичностью после оптимального выравнивания с последовательностями SEQ ID No. 5, 6 или 7, где данное антитело дополнительно характеризуется тем, что оно также включает шарнирную область, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID No. 56.

Более конкретно изобретение относится к моноклональному антителу или к бивалентному функциональному фрагменту или к его производному, как описано выше, характеризующемуся тем, что оно также включает шарнирную область, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID No. 57.

Иными словами, изобретение относится к моноклональному антителу или к бивалентному функциональному фрагменту или к его производному, способному ингибировать димеризацию c-Met и включающему тяжелую цепь, содержащую CDR-H1, CDR-H2 и CDR-Н3 с соответствующими аминокислотными последовательностями SEQ ID No. 1, 2 и 3 или последовательностью, обладающей по меньшей мере 80% идентичностью после оптимального выравнивания с последовательностями SEQ ID No. 1, 2 и 3; и легкую цепь, содержащую CDR-L1, CDR-L2 и CDR-L3 с соответствующими аминокислотными последовательностями SEQ ID No. 5, 6 и 7 или последовательностью, обладающей по меньшей мере 80% идентичностью после оптимального выравнивания с последовательностями SEQ ID No. 5, 6 или 7, где данное антитело дополнительно характеризуется тем, что оно также включает шарнирную область, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID No. 57.

Более конкретно изобретение относится к моноклональному антителу или к бивалентному функциональному фрагменту или к его производному, как описано выше, характеризующемуся тем, что оно также включает шарнирную область, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID No. 21.

Иными словами, изобретение относится к моноклональному антителу или к бивалентному функциональному фрагменту или к его производному, способному ингибировать димеризацию c-Met и включающему тяжелую цепь, содержащую CDR-H1, CDR-H2 и CDR-H3 с соответствующими аминокислотными последовательностями SEQ ID No. 1, 2 и 3 или последовательностью, обладающей по меньшей мере 80% идентичностью после оптимального выравнивания с последовательностями SEQ ID No. 1, 2 и 3; и легкую цепь, содержащую CDR-L1, CDR-L2 и CDR-L3 с соответствующими аминокислотными последовательностями SEQ ID No. 5, 6 и 7 или последовательностью, обладающей по меньшей мере 80% идентичностью после оптимального выравнивания с последовательностями SEQ ID No. 5, 6 или 7, где данное антитело дополнительно характеризуется тем, что оно также включает шарнирную область, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID No. 21.

Как будет очевидно специалисту в данной области техники, консенсус-последовательности SEQ ID No. 57 и 21 включены в консенсус-последовательность SEQ ID No. 56.

Таблица 1

#01

#02

#03

#04

#05

#06

#07

#08

#09

#10

#11

#12

#13

#14

SEQID

XI

Х2

X3

С

Х5

Х6

Х7

Х8

Х9

С

Х11

Х12

С

Х14

SEQID

XI

Х2

X3

C

Х5

Х6

Х7

Х8

Х9

C

P

Р

C

Р

SEQID

XI

Х2

X3

C

Х5

-

С

Х8

Х9

C

Х11

Х12

C

Х14

Для SEQ ID No. 56:
X1: P, R, C, -	X5: D, C, G, -	X8: H, V, K, -	X12: P, -
X2: K, С, R, -	X6: K, C, -	X9: T, C, E, P, -	X14: P, T
X3: S, С, D, -	X7: Т, С, -	X11: P, I

Выражение "функциональные фрагменты и производные" подробно определено ниже в настоящем описании.

Под участками CDR или CDR(s) подразумевают указывать гипервариабельные участки тяжелых и легких цепей иммуноглобулинов, которые определены с помощью IMGT.

Уникальная нумерация IMGT определена для сравнения вариабельных доменов любых рецепторов антигенов, типов цепи или видов [Lefranc M.-P., Immunology Today 18, 509 (1997); Lefranc M.-P., The Immunologist, 7, 132-136 (1999); Lefranc, M.-P., Pommie, С, Ruiz, M., Giudicelli, V., Foulquier, E., Truong, L., Thouvenin-Contet, V. and Lefranc, Dev. Comp. Immunol, 27, 55-77 (2003)]. В уникальной нумерации IMGT консервативные аминокислоты всегда имеют одно и то же положение, например, цистеин 23 (1st-CYS), триптофан 41 (CONSERVED-TRP), гидрофобная аминокислота 89, цистеин 104 (2nd-CYS), фенилаланин или триптофан 118 (J-PHE или J-TRP). Уникальная нумерация IMGT обеспечивает стандартизованное определение границ каркасных областей (FR1-IMGT: положения 1-26, FR2-IMGT: 39-55, FR3-IMGT: 66-104 и FR4-IMGT: 118-128) и областей определения комплементарности: CDR1-IMGT: 27-38, CDR2-IMGT: 56-65 и CDR3-IMGT: 105-117. Поскольку гэпы представляют собой незанятые положения, длины CDR-IMGT (показанные между скобками и определенные точками, например, [8.8.13]) становятся критической информацией. Уникальную нумерацию IMGT используют в 2D графических представлениях, обозначенных как IMGT Colliers de Perles [Ruiz, M. and Lefranc, M.-P., Immunogenetics, 53, 857-883 (2002); Kaas, Q. and Lefranc, M.-P., Current Bioinformatics, 2, 21-30 (2007)], и в 3D структурах в IMGT/3Dstructure-DB [Kaas, Q., Ruiz, M. and Lefranc, M.-P., T cell receptor and MHC structural data. Nucl. Acids. Res., 32, D208-D210 (2004)].

Существует три CDR тяжелой цепи и 3 CDR легкой цепи. Термин CDR используют в данной заявке с целью указания, в соответствии с ситуацией, одного из трех участков или нескольких, либо даже всех этих участков, которые содержат большинство аминокислотных остатков, ответственных за связывание по сродству антитела к антигену или к эпитопу, который оно распознает.

Под "процентом идентичности" между двумя нуклеиново-кислотными или аминокислотными последовательностями в смысле настоящего изобретения подразумевают указывать процент нуклеотидов или идентичных аминокислотных остатков между двумя сравниваемыми последовательностями, полученный после наилучшего выравнивания (оптимального выравнивания), где этот процент является исключительно статистическим, и различия между двумя последовательностями распределены случайно и по всей их длине. Сравнения последовательностей между двумя нуклеиново-кислотными или аминокислотными последовательностями традиционно осуществляют путем сравнения этих последовательностей после того, как они оптимально выровнены, где данное сравнение можно проводить по сегментам или с помощью "окна сравнения". Оптимальное выравнивание последовательностей для сравнения можно осуществлять, в дополнение к ручному способу, с помощью алгоритма локальной гомологии Smith and Waterman (1981) [Ad. App. Math. 2:482], с помощью алгоритма локальной гомологии Neddleman and Wunsch (1970) [J. Mol. Biol. 48: 443], с помощью метода поиска подобий Pearson and Lipman (1988) [Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444), с помощью компьютерного программного обеспечения, использующего эти алгоритмы (GAP, BESTFIT, FASTA и TFASTA в Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI, или еще с помощью программного обеспечения BLAST N или BLAST Р).

Процент идентичности между двумя нуклеиново-кислотными или аминокислотными последовательностями определяют путем сравнения этих двух последовательностей, выровненных оптимально, и в которых сравниваемая нуклеиново-кислотная или аминокислотная последовательность может содержать добавления или делеции по отношению к референсной последовательности для оптимального выравнивания между двумя последовательностями. Процент идентичности вычисляют путем определения числа идентичных положений, для которых нуклеотид или аминокислотный остаток идентичен между двумя последовательностями, деления этого числа идентичных положений на общее число положений в окне сравнения и умножения полученного результата на 100, чтобы получить процент идентичности между двумя последовательностями.

Например, возможно использовать программу BLAST, "BLAST 2 sequences" (Tatusova et al, "Blast 2 sequences - a new tool for comparing protein and nucleotide sequences", FEMS Microbiol Lett. 174:247-250), доступную на сайте http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ gorf/bl2.html, где используемыми параметрами являются параметры по умолчанию (в частности, параметры "штраф на открытие гэпа": 5 и "штраф на удлинение гэпа": 2; где выбранная матрица представляет собой, например, матрицу "BLOSUM 62", предложенную программой), где процент идентичности между двумя сравниваемыми последовательностями вычисляется непосредственно программой.

В качестве аминокислотной последовательности, обладающей по меньшей мере 80%, предпочтительно 85%, 90%, 95% и 98% идентичностью с референсной аминокислотной последовательностью, предпочтительны те, которые имеют относительно референсной последовательности определенные модификации, в частности, делецию, добавление или замену по меньшей мере одной аминокислоты, укорочение или удлинение. В случае замены одной или более чем одной последовательной или не последовательной аминокислоты предпочтительны замены, при которых замененные аминокислоты заменены "эквивалентными" аминокислотами. Выражение "эквивалентные аминокислоты" в данной заявке предназначено для указания любой аминокислоты, которая может быть заменена любой из аминокислот базовой структуры, но без существенного модифицирования биологических активностей соответствующих антител, и как будет определено ниже, в частности, в примерах. Эти эквивалентные аминокислоты могут быть определены, основываясь либо на их структурной гомологии с аминокислотами, которые они заменяют, либо на результатах сравнительных исследований биологической активности между различными антителами, которые можно осуществить.

Для примера можно упомянуть возможности замены, которую можно осуществить, не приводя в результате к значительному модифицированию биологической активности соответствующего модифицированного антитела.

В качестве не ограничивающего примера в приведенной ниже таблице 2 даны возможности замены, согласованной с сохранением биологической активности модифицированного антитела. Обратные замены, конечно, также возможны при тех же условиях.

Таблица 2
Исходный остаток	Замена(ы)
Ala (A)	Val, Gly, Pro
Arg (R)	Lys, His
Asn (N)	Gln
Asp (D)	Glu
Cys (С)	Ser
Gln (Q)	Asn
Glu (G)	Asp
Gly (G)	Ala
His (H)	Arg
He (I)	Leu
Leu (L)	Ile, Val, Met
Lys (K)	Arg
Met (M)	Leu
Phe (F)	Tyr
Pro (P)	Ala
Ser (S)	Thr, Cys
Thr (T)	Ser
Trp (W)	Tyr
Tyr (Y)	Phe, Trp
Val (V)	Leu, Ala

В данной заявке должно быть понятно, что изобретение не относится к антителам в природной форме, то есть, что они не находятся в их природном окружении, но что они могут быть выделены или получены путем очистки из природных источников, или, кроме того, получены путем генетической рекомбинации или путем химического синтеза, и что они поэтому могут содержать неприродные аминокислоты, как описано далее.

Должно быть также понятно, как упомянуто выше, что изобретение относится более конкретно к химерному и/или к гуманизированному бивалентному антителу или к любому бивалентному функциональному фрагменту или производному с антагонистической активностью. Бивалентные антитела предшествующего уровня техники являются агонистами или частичными агонистами. Моноклональное антитело по изобретению, включающее модифицированную шарнирную область, как описано выше, то есть включающее шарнирную область, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID No. 56, 57 или 21, является новым и представляет такую особенность, что оно обладает улучшенной антагонистической активностью по сравнению с химерным или гуманизированным антителом 224G11 без такой модифицированной шарнирной области, как будет очевидно из приведенных ниже примеров.

В противоположность предшествующему уровню техники, авторы изобретения получили улучшенную антагонистическую активность без модификации формата антитела. Действительно, на ближайшем уровне техники, представленном антителом 5D5, было необходимо разработать моновалентный фрагмент антитела, чтобы получить антагонистическую активность. В настоящей заявке за счет использования шарнирной области по изобретению возможно впервые получить полноразмерное бивалентное антитело с повышенной антагонистической активностью, и это противоречит общим знаниям.

В предпочтительной форме осуществления антитело по изобретению включает каркасную область, содержащую аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID No. 22-28 и 58-72, или последовательность, обладающую по меньшей мере 80% идентичностью после оптимального выравнивания с последовательностями SEQ ID No. 22-28 и 58-72.

Для лучшей ясности в приведенных ниже таблицах 3 и 4 перегруппированы аминокислотные последовательности и нуклеотидные последовательности различных предпочтительных шарнирных областей по изобретению.

Таблица 3
SEQ ID No.	Аминокислоты	SEQ ID No.	Нуклеотиды
22	RKCCVECPPCP	29	AGGAAGTGCTGTGTGGAGTGCCCCCCCTGCCCA
23	PRDCGCKPCICT	30	CCCCGGGACTGTGGGTGCAAGCCTTGCATTTGTACC
24	PKSCGCKPCICT	31	CCCAAGAGCTGTGGGTGCAAGCCTTGCATTTGTACC
25	PKSCGCKPCICP	32	CCAAAGAGCTGCGGCTGCAAGCCTTGTATCTGTCCC
26	PRDCGCKPCPPCP	33	CCACGGGACTGTGGCTGCAAGCCCTGCCCTCCGTGTCCA
27	PRDCGCHTCPPCP	34	CCCAGAGACTGTGGGTGTCACACCTGCCCTCCTTGTCCT
28	PKSCDCHCPPCP	35	CCCAAAAGCTGCGATTGCCACTGTCCTCCATGTCCA

Таблица 4
SEQ ID No.	Аминокислоты	SEQ ID No.	Нуклеотиды
58	CKSCDKTHTCPPCP	73	TGCAAGAGCTGCGACAAGACCCACACCTGTCCCCCCTGCCCT
59	PCSCDKTHTCPPCP	74	CCCTGCAGCTGCGACAAGACCCACACCTGTCCCCCCTGCCCT
60	PKCCDKTHTCPPCP	75	CCCAAGTGCTGCGACAAGACCCACACCTGTCCCCCCTGCCCT
61	PKSCCKTHTCPPCP	76	CCTAAGAGCTGTTGCAAGACCCACACCTGTCCCCCCTGCCCT
62	PKSCDCTHTCPPCP	77	CCCAAGAGCTGCGACTGCACCCACACCTGTCCCCCCTGCCCT
63	PKSCDKCHTCPPCP	78	CCCAAGAGCTGCGACAAGTGCCACACCTGTCCCCCCTGCCCT
64	PKSCDKTHCCPPCP	79	CCCAAGAGCTGCGACAAGACCCACTGCTGTCCCCCCTGCCCT
65	KCDKTHTCPPCP	80	AAGTGCGACAAGACCCACACCTGTCCCCCCTGCCCT
66	PKSCDCHTCPPCP	81	CCCAAGAGCTGCGACTGCCACACCTGTCCCCCCTGCCCT
67	PKSCDCTHCPPCP	82	CCCAAGAGCTGCGACTGCACCCACTGCCCCCCCTGCCCT
68	PCSCKHTCPPCP	83	CCCTGCAGCTGCAAGCACACCTGTCCCCCCTGCCCT
69	PSCCTHTCPPCP	84	CCTAGCTGCTGCACCCACACCTGTCCCCCCTGCCCT
70	PSCDKHCCPPCP	85	CCCAGCTGCGACAAGCACTGCTGCCCCCCCTGCCCT
71	PKSCTCPPCP	86	CCCAAGAGCTGCACCTGTCCCCCTTGTCCT
72	PKSCDKCVECPPCP	87	CCCAAGAGCTGCGATAAGTGCGTGGAGTGCCCCCCTTGTCCT

В соответствии с первым подходом антитело будет определено последовательностью его тяжелой цепи. Более конкретно антитело по изобретению или любое из его функциональных фрагментов или производных характеризуется тем, что оно включает тяжелую цепь, содержащую по меньшей мере один CDR, выбранный из CDR, содержащих аминокислотные последовательности SEQ ID No. 1-3.

Упомянутые последовательности приведены ниже:

SEQ ID No. 1:	GYIFTAYT
SEQ ID No. 2:	IKPNNGLA
SEQ ID No. 3:	ARSEITTEFDY

В соответствии с предпочтительным аспектом антитело по изобретению или любое из его функциональных фрагментов или производных включает тяжелую цепь, содержащую по меньшей мере один, предпочтительно два и более предпочтительно три CDR, выбранных из CDR-H1, CDR-H2 и CDR-H3, где:

- CDR-H1 содержит аминокислотную последовательность SEQ ID No. 1,

- CDR-H2 содержит аминокислотную последовательность SEQ ID No. 2,

- CDR-H3 содержит аминокислотную последовательность SEQ ID No. 3.

При втором подходе антитело теперь будет определено последовательностью его легкой цепи. Более конкретно в соответствии со вторым конкретным аспектом изобретения антитело по изобретению или любое из его функциональных фрагментов или производных характеризуется тем, что оно включает легкую цепь, содержащую по меньшей мере один CDR, выбранный из CDR, содержащих аминокислотную последовательность SEQ ID No. 5-7.

Упомянутые последовательности являются следующими:

SEQ ID No. 5:	ESVDSYANSF
SEQ ID No. 6:	RAS
SEQ ID No. 7:	QQSKEDPLT

В соответствии с другим предпочтительным аспектом антитело по изобретению или любое из его функциональных фрагментов или производных включает тяжелую цепь, содержащую по меньшей мере один, предпочтительно два и более предпочтительно три CDR, выбранных из CDR-L1, CDR-L2 и CDR-L3, где:

- CDR-L1 содержит аминокислотную последовательность SEQ ID No. 5,

- CDR-L2 содержит аминокислотную последовательность SEQ ID No. 6,

- CDR-L3 содержит аминокислотную последовательность SEQ ID No. 7.

Гибридома мыши, способная секретировать моноклональные антитела в соответствии с настоящим изобретением, в частности, гибридома мышиного происхождения, была депонирована в CNCM (Институт Пастера, Париж, Франция) 03/14/2007 под номером CNCM 1-3731.

В настоящем изобретении IgG1 предпочтителен для получения эффекторных функций, и наиболее предпочтительно АЗКЦ и КЗЦ.

Специалисту в данной области техники известно, что эффекторные функции включают, например, связывание Clq; комплементзависимую цитотоксичность (КЗЦ); связывание рецептора Fc; антителозависимую клеточную цитотоксичность (ADCC); фагоцитоз; и понижающая регуляция рецепторов клеточной поверхности (например, рецептора В-клеток; BCR).

Антитела в соответствии с настоящим изобретением предпочтительно представляют собой специфичные моноклональные антитела, в частности, мышиного, химерного или гуманизированного происхождения, которые могут быть получены в соответствии со стандартными способами, хорошо известными специалистам в данной области техники.

Как правило, для получения моноклональных антител или их функциональных фрагментов или производных, в частности, мышиного происхождения, возможно сделать ссылку на методы, которые описаны, в частности, в руководстве "Antibodies" (Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor NY, pp.726, 1988), или на метод получения из гибридом, описанный Kohler and Milstein (Nature, 256:495-497, 1975).

Моноклональные антитела в соответствии с изобретением могут быть получены, например, из животной клетки, иммунизированной против c-Met или одного из его фрагментов, содержащих эпитоп, специфично распознаваемый моноклональными антителами в соответствии с изобретением. c-Met или одно из его фрагментов можно, в частности, продуцировать в соответствии с обычными рабочими способами, путем генетической рекомбинации, начиная с нуклеиново-кислотной последовательности, содержащейся в последовательности кД