Варианты гемагглютининов вируса свиного гриппа

Варианты гемагглютининов вируса свиного гриппа

Иллюстрации

Показать все

Реферат

ПЕРЕКРЕСТНАЯ ССЫЛКА НА РОДСТВЕННЫЕ ЗАЯВКИ

По этой заявке в соответствии с § 119(e) Капитула 35 Свода законов США испрашивается приоритет временных заявок США №№: 61/220 426, поданной 25 июня 2009 г.; 61/227 986, поданной 23 июля 2009 г.; 61/234 021, поданной 14 августа 2009 г.; и 61/258 890, поданной 6 ноября 2009 г. Содержание каждой из этих заявок специально целиком включено в данное описание в качестве ссылок.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Глобальное распространение вирусов гриппа A (H1N1), происходящих от вируса свиней, среди человеческой популяции в апреле 2009 г. ознаменовало первую пандемию гриппа за последний 41 год. Более 35000 людей были инфицированы этим новым вирусом H1N1 по состоянию на 15 июня 2009 г. В прошлом веке вирус гриппа также был причиной опустошительной пандемии 1918-1919 гг. Кроме того, вирус H1N1, происходящий от вируса свиней, был причиной прерванной пандемии в 1976 г. Вирус гриппа 1918 г. вызвал легкую вспышку заболевания весной 1918 г. и волну смертельных случаев в глобальном масштабе осенью того же года, став причиной смерти 50 млн человек во всем мире. Хотя вирус гриппа H1N1 2009 г., происходящий от вируса свиней, рассматривали в начале 2009 г. как ослабленный, существует вероятность того, что этот вирус может мутировать и стать более вирулентным к осени 2009 г. По этой причине имеется неотложная потребность в разработке эффективной вакцины для профилактики тяжелой пандемии, вызванной вирусами H1N1 2009 г.

Были выделены реассортантные вирусы гриппа с формулой генома 6:2 (имеющие сегменты HA и NA из генома вирусов гриппа A (H1N1), происходящих от вируса свиней, и "скелетные" сегменты ослабленных штаммов вирусов гриппа), полезные для разработки вакцин, живые и инактивированные вакцины, тем не менее, большинство выделенных до сих пор штаммов демонстрируют низкий титр при приготовлении на основе яиц. Те же самые изоляты слабо инфицируют клетки MDCK и формируют маленькие бляшки со слабым цитопатогенным действием. Кроме того, существенная потеря вирусной активности наблюдается после фильтрации вируса. Следовательно, первоначально изолированные штаммы реассортантного вируса гриппа H1N1 являются слабыми кандидатами для разработки вакцинного штамма.

Настоящее изобретение направлено на создание новых и/или вновь выделенных вариантов гемагглютинина H1 вируса свиного гриппа, которые пригодны для применения с целью получения вакцин различного типа, а также в исследованиях, диагностике и т.п. Настоящее изобретение направлено также на создание способов улучшения эффективности репликации вирусов гриппа H1. Другие многочисленные полезные свойства будут понятны при рассмотрении приведенных далее разделов.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Как описано в данном описании, штаммы реассортантного вируса гриппа с формулой генома 6:2, пригодные для применения в разработке вакцин H1N1, получали с применением методов обратной генетики. Первоначально выделенные реассортантные вирусы, содержащие сегменты генома HA и NA дикого типа, которые плохо развивались в яйцах, были модифицированы таким образом, что их развитие в яйцах существенно улучшилось. Анализ последовательностей у модифицированных реассортантных вирусов показал, что аминокислотные замены в положениях 119, 153, 154 и 186 свиного гемагглютинина H1 были ответственны за улучшение развития в яйцах и в клетках MDCK. Было обнаружено, что аминокислотные замены остатка 155 в составе HA, для которых ранее было показано, что они усиливают репликацию вируса свиного гриппа 1976 г., также повышают репликацию реассортантного вируса A/CA/7/09 в яйцах. Вирусы, несущие аминокислотные замены оснований 119 и 186 в составе HA, имели повышенный уровень развития в яйцах без существенного изменения антигенности вируса. Варианты гемагглютинина H1, описанные в данном описании, придают фенотип с повышенным уровнем роста реассортантным вирусам с формулой генома 6:2, содержащим 6 внутренних сегментов генома из штаммов вирусов PR8 или A/Ann Arbor/6/60. Более того, вариантные вирусы, содержащие скелетные сегменты ca A/Ann Arbor/6/60 и вариант гемагглютинина H1, имеющий аминокислотную замену остатка 119 или 186 в составе HA, были ослабленными и обладали очень высокой иммуногенностью у хорьков. Эти данные показывают, что варианты реассортантного вируса гриппа, включающие аминокислотную замену остатка 119 и/или 186 в составе HA, пригодны для разработки вакцины на основе свиного вируса гриппа H1N1 для применения у человека.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение включает полипептидные и полинуклеотидные последовательности гемагглютинина вируса гриппа, а также векторы, вирусы, вакцины, композиции и тому подобное, содержащие такие последовательности, и способы их применения. Дополнительные особенности изобретения более подробно описаны в данном описании.

Одной из особенностей является то, что настоящее изобретение направлено на создание выделенных или рекомбинантных полипептидов гемагглютинина. В одном из вариантов осуществления изобретения выделенный или рекомбинантный полипептид HA по изобретению является полипептидом гемагглютинина H1. В другом варианте осуществления изобретения выделенный или рекомбинантный полипептид HA по изобретению может быть полипептидом гемагглютинина свиного вируса гриппа.

В одном из вариантов осуществления изобретения выделенный или рекомбинантный полипептид HA по изобретению может содержать аминокислоту неприродного происхождения в положении, соответствующем положению аминокислотного остатка 119 в SEQ ID NO:1 или в положении, соответствующем положению аминокислотного остатка 186 в SEQ ID NO:1. В другом варианте осуществления изобретения выделенный или рекомбинантный полипептид HA по изобретению может содержать аминокислоту неприродного происхождения в положении, соответствующем положению аминокислотного остатка 119 в SEQ ID NO:1 и в положении, соответствующем положению аминокислотного остатка 186 в SEQ ID NO:1. В дополнительном варианте осуществления изобретения выделенный или рекомбинантный полипептид HA по изобретению включает по меньшей мере одну аминокислотную замену, выбранную из группы, состоящей из K119E, K119N и A186D.

В конкретном варианте осуществления изобретения выделенный или рекомбинантный полипептид HA по изобретению содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:1, включающую по меньшей мере одну аминокислотную замену, выбранную из группы, состоящей из K119E, K119N и A186D. В другом конкретном варианте осуществления изобретения выделенный или рекомбинантный полипептид HA по изобретению может содержать глутаминовую кислоту (E) в качестве аминокислотного остатка, соответствующего положению аминокислотного остатка 119 в SEQ ID NO:1, и аспарагиновую кислоту (D) в качестве аминокислотного остатка, соответствующего положению аминокислотного остатка 186 в SEQ ID NO:1. В дополнительном конкретном варианте осуществления изобретения выделенный или рекомбинантный полипептид HA по изобретению может содержать аспарагин (N) в качестве аминокислотного остатка, соответствующего положению аминокислотного остатка 119 в SEQ ID NO:1, и аспарагиновую кислоту (D) в качестве аминокислотного остатка, соответствующего положению аминокислотного остатка 186 в SEQ ID NO:1.

В дополнительном варианте осуществления изобретения выделенный или рекомбинантный полипептид HA по изобретению может дополнительно включать замену H273Y.

В дополнительном варианте осуществления изобретения выделенный или рекомбинантный полипептид HA по изобретению может дополнительно включать замену D222G и/или Q223R.

В конкретном варианте осуществления изобретения полипептид HA по изобретению содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:6 или 8. В другом варианте осуществления настоящего изобретения, полипептид HA по изобретению содержит аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 95%, по меньшей мере 98%, по меньшей мере 98,5%, по меньшей мере 99%, по меньшей мере 99,2%, по меньшей мере 99,4%, по меньшей мере 99,6%, по меньшей мере 99,8% или по меньшей мере 99,9% идентичность последовательности относительно аминокислотной последовательности SEQ ID NO:6 или 8. В дополнительном варианте осуществления изобретения полипептид HA по изобретению содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:6 или 8, включающую менее чем 3, менее чем 5, менее чем 10, менее чем 15, менее чем 20, менее чем 25, менее чем 30 аминокислотных замен, делеций или инсерций.

В конкретном варианте осуществления изобретения полипептид HA по изобретению содержит аминокислотную последовательность остатков 1-327 из состава SEQ ID NO:6 или 8. В другом варианте осуществления настоящего изобретения, полипептид HA по изобретению содержит аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 95%, по меньшей мере 98%, по меньшей мере 98,5%, по меньшей мере 99%, по меньшей мере 99,2%, по меньшей мере 99,4%, по меньшей мере 99,6%, по меньшей мере 99,8% или по меньшей мере 99,9% идентичность последовательности относительно аминокислотной последовательности остатков 1-327 из состава SEQ ID NO:6 или 8. В дополнительном варианте осуществления изобретения полипептид HA по изобретению содержит аминокислотную последовательность остатков 1-327 из состава SEQ ID NO:6 или 8, включающую менее чем 3, менее чем 5, менее чем 10, менее чем 15, менее чем 20, менее чем 25, менее чем 30 аминокислотных замен, делеций или инсерций.

Изобретение также включает нуклеиновые кислоты, кодирующие полипептиды по изобретению, и реассортантные или рекомбинантные вирусы гриппа, содержащие такие полипептиды и/или нуклеиновые кислоты по изобретению.

В конкретном варианте осуществления изобретения нуклеиновая кислота по изобретению содержит нуклеотидную последовательность SEQ ID NO:7. В другом варианте осуществления настоящего изобретения нуклеиновая кислота по изобретению содержит нуклеотидную последовательность, имеющую по меньшей мере 95%, по меньшей мере 98%, по меньшей мере 98,5%, по меньшей мере 99%, по меньшей мере 99,2%, по меньшей мере 99,4%, по меньшей мере 99,6%, по меньшей мере 99,8% или по меньшей мере 99,9% идентичности последовательности относительно нуклеотидной последовательности SEQ ID NO:7. В дополнительном варианте осуществления изобретения нуклеиновая кислота по изобретению содержит нуклеотидную последовательность SEQ ID NO:7, содержащую менее чем 3, менее чем 5, менее чем 10, менее чем 15, менее чем 20, менее чем 25, менее чем 30 нуклеотидных замен, делеций или инсерций.

В конкретном варианте осуществления изобретения нуклеиновая кислота по изобретению содержит нуклеотидную последовательность остатков 84-1064 в составе SEQ ID NO:7. В другом варианте осуществления настоящего изобретения, нуклеиновая кислота по изобретению содержит нуклеотидную последовательность, имеющую по меньшей мере 95%, по меньшей мере 98%, по меньшей мере 98,5%, по меньшей мере 99%, по меньшей мере 99,2%, по меньшей мере 99,4%, по меньшей мере 99,6%, по меньшей мере 99,8% или по меньшей мере 99,9% идентичность последовательности относительно нуклеотидной последовательности остатков 84-1064 в составе SEQ ID NO:7. В дополнительном варианте осуществления изобретения нуклеиновая кислота по изобретению содержит нуклеотидную последовательность остатков 84-1064 из состава SEQ ID NO:7, включающую менее чем 3, менее чем 5, менее чем 10, менее чем 15, менее чем 20, менее чем 25, менее чем 30 нуклеотидных замен, делеций или инсерций.

В одном из вариантов осуществления изобретения реассортантный или рекомбинантный вирус гриппа по изобретению содержит 6 внутренних сегментов генома из A/Ann Arbor/6/60, первый сегмент генома, который кодирует полипептид HA, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:6 или 8, и второй сегмент генома, который кодирует полипептид нейраминидазы. В конкретном варианте осуществления изобретения первый сегмент генома может кодировать полипептид HA, который содержит аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 95%, по меньшей мере 98%, по меньшей мере 98,5%, по меньшей мере 99%, по меньшей мере 99,2%, по меньшей мере 99,4%, по меньшей мере 99,6%, по меньшей мере 99,8% или по меньшей мере 99,9% идентичности последовательности относительно аминокислотной последовательности SEQ ID NO:6 или 8. В конкретном варианте осуществления изобретения первый сегмент генома может кодировать полипептид HA, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:6 или 8, включающую менее чем 3, менее чем 5, менее чем 10, менее чем 15, менее чем 20, менее чем 25, менее чем 30 аминокислотных замен, делеций или инсерций. В конкретном варианте осуществления изобретения второй сегмент генома содержит нуклеотидную последовательность SEQ ID NO:5. В конкретном варианте осуществления изобретения полипептид нейраминидазы содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:4. В конкретном варианте осуществления изобретения реассортантный или рекомбинантный вирус гриппа развивается до титра по меньшей мере примерно 7,5 lg БОЕ/мл, по меньшей мере примерно 8 lg БОЕ/мл, по меньшей мере примерно 8,5 lg БОЕ/мл, по меньшей мере примерно 9 lg БОЕ/мл, по меньшей мере примерно 9,5 lg БОЕ/мл, по меньшей мере примерно 10 lg БОЕ/мл, по меньшей мере примерно 10,5 lg БОЕ/мл или по меньшей мере примерно 11 lg БОЕ/мл в яйцах с развивающимся эмбрионом. В конкретном варианте осуществления изобретения реассортантный или рекомбинантный вирус гриппа развивается до титра по меньшей мере примерно 7,5 lg БОЕ/мл, по меньшей мере примерно 8 lg БОЕ/мл, по меньшей мере примерно 8,5 lg БОЕ/мл, по меньшей мере примерно 9 lg БОЕ/мл, по меньшей мере примерно 9,5 lg БОЕ/мл, по меньшей мере примерно 10 lg БОЕ/мл, по меньшей мере примерно 10,5 lg БОЕ/мл или по меньшей мере примерно 11 lg БОЕ/мл в тканевых культурах.

В другом варианте осуществления изобретения реассортантный или рекомбинантный вирус гриппа по изобретению содержит 6 внутренних сегментов генома из A/Ann Arbor/6/60, первый сегмент генома, который кодирует полипептид HA, содержащий аминокислотную последовательность остатков 1-327 в составе SEQ ID NO:6 или 8, и второй сегмент генома, который кодирует полипептид нейраминидазы. В конкретном варианте осуществления изобретения первый сегмент генома может кодировать полипептид HA, который содержит аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 95%, по меньшей мере 98%, по меньшей мере 98,5%, по меньшей мере 99%, по меньшей мере 99,2%, по меньшей мере 99,4%, по меньшей мере 99,6%, по меньшей мере 99,8% или по меньшей мере 99,9% идентичность последовательности относительно аминокислотной последовательности остатков 1-327 в составе SEQ ID NO:6. В конкретном варианте осуществления изобретения первый сегмент генома может кодировать полипептид HA, который содержит аминокислотную последовательность остатков 1-327 в составе SEQ ID NO:6 или 8, включающую менее чем 3, менее чем 5, менее чем 10, менее чем 15, менее чем 20, менее чем 25, менее чем 30 аминокислотных замен, делеций или инсерций. В конкретном варианте осуществления изобретения второй сегмент генома содержит нуклеотидную последовательность SEQ ID NO:5. В конкретном варианте осуществления изобретения полипептид нейраминидазы содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:4. В конкретном варианте осуществления изобретения реассортантный или рекомбинантный вирус гриппа развивается до титра по меньшей мере примерно 7,5 lg БОЕ/мл, по меньшей мере примерно 8 lg БОЕ/мл, по меньшей мере примерно 8,5 lg БОЕ/мл, по меньшей мере примерно 9 lg БОЕ/мл, по меньшей мере примерно 9,5 lg БОЕ/мл, по меньшей мере примерно 10 lg БОЕ/мл, по меньшей мере примерно 10,5 lg БОЕ/мл или по меньшей мере примерно 11 lg БОЕ/мл в яйцах с развивающимся эмбрионом. В конкретном варианте осуществления изобретения реассортантный или рекомбинантный вирус гриппа развивается до титра по меньшей мере примерно 7,5 lg БОЕ/мл, по меньшей мере примерно 8 lg БОЕ/мл, по меньшей мере примерно 8,5 lg БОЕ/мл, по меньшей мере примерно 9 lg БОЕ/мл, по меньшей мере примерно 9,5 lg БОЕ/мл, по меньшей мере примерно 10 lg БОЕ/мл, по меньшей мере примерно 10,5 lg БОЕ/мл или по меньшей мере примерно 11 lg БОЕ/мл в тканевых культурах.

В одном из вариантов осуществления изобретения реассортантный или рекомбинантный вирус гриппа по изобретению содержит 6 внутренних сегментов генома из A/Puerto Rico/8/34, первый сегмент генома, который кодирует полипептид HA, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:6 или 8, и второй сегмент генома, который кодирует полипептид нейраминидазы. В конкретном варианте осуществления изобретения первый сегмент генома может кодировать полипептид HA, который содержит аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 95%, по меньшей мере 98%, по меньшей мере 98,5%, по меньшей мере 99%, по меньшей мере 99,2%, по меньшей мере 99,4%, по меньшей мере 99,6%, по меньшей мере 99,8% или по меньшей мере 99,9% идентичность последовательности относительно аминокислотной последовательности SEQ ID NO:6 или 8. В конкретном примере осуществления первый сегмент генома может кодировать полипептид HA, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:6 или 8, включающую менее чем 3, менее чем 5, менее чем 10, менее чем 15, менее чем 20, менее чем 25, менее чем 30 аминокислотных замен, делеций или инсерций. В конкретном примере осуществления второй сегмент генома содержит нуклеотидную последовательность SEQ ID NO:5. В конкретном варианте осуществления изобретения полипептид нейраминидазы содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:4. В конкретном варианте осуществления изобретения реассортантный или рекомбинантный вирус гриппа развивается до титра по меньшей мере примерно 7,5 lg БОЕ/мл, по меньшей мере примерно 8 lg БОЕ/мл, по меньшей мере примерно 8,5 lg БОЕ/мл, по меньшей мере примерно 9 lg БОЕ/мл, по меньшей мере примерно 9,5 lg БОЕ/мл, по меньшей мере примерно 10 lg БОЕ/мл, по меньшей мере примерно 10,5 lg БОЕ/мл или по меньшей мере примерно 11 lg БОЕ/мл в яйцах с развивающимся эмбрионом. В конкретном варианте осуществления изобретения реассортантный или рекомбинантный вирус гриппа развивается до титра по меньшей мере примерно 7,5 lg БОЕ/мл, по меньшей мере примерно 8 lg БОЕ/мл, по меньшей мере примерно 8,5 lg БОЕ/мл, по меньшей мере примерно 9 lg БОЕ/мл, по меньшей мере примерно 9,5 lg БОЕ/мл, по меньшей мере примерно 10 lg БОЕ/мл, по меньшей мере примерно 10,5 lg БОЕ/мл или по меньшей мере примерно 11 lg БОЕ/мл в тканевых культурах.

В другом варианте осуществления изобретения реассортантный или рекомбинантный вирус гриппа по изобретению содержит 6 внутренних сегментов генома из A/Puerto Rico/8/34, первый сегмент генома, который кодирует полипептид HA, содержащий аминокислотную последовательность остатков 1-327 из состава SEQ ID NO:6 или 8, и второй сегмент генома, который кодирует полипептид нейраминидазы. В конкретном варианте осуществления изобретения первый сегмент генома может кодировать полипептид HA, который содержит аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 95%, по меньшей мере 98%, по меньшей мере 98,5%, по меньшей мере 99%, по меньшей мере 99,2%, по меньшей мере 99,4%, по меньшей мере 99,6%, по меньшей мере 99,8% или по меньшей мере 99,9% идентичности последовательности относительно аминокислотной последовательности остатков 1-327 в составе SEQ ID NO:6 или 8. В конкретном варианте осуществления изобретения первый сегмент генома может кодировать полипептид HA, который содержит аминокислотную последовательность остатков 1-327 в составе SEQ ID NO:6 или 8, включающую менее чем 3, менее чем 5, менее чем 10, менее чем 15, менее чем 20, менее чем 25, менее чем 30 аминокислотных замен, делеций или инсерций. В конкретном варианте осуществления изобретения второй сегмент генома содержит нуклеотидную последовательность SEQ ID NO:5. В конкретном варианте осуществления изобретения полипептид нейраминидазы содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:4. В конкретном примере осуществления изобретения реассортантный или рекомбинантный вирус гриппа развивается до титра по меньшей мере примерно 7,5 lg БОЕ/мл, по меньшей мере примерно 8 lg БОЕ/мл, по меньшей мере примерно 8,5 lg БОЕ/мл, по меньшей мере примерно 9 lg БОЕ/мл, по меньшей мере примерно 9,5 lg БОЕ/мл, по меньшей мере примерно 10 lg БОЕ/мл, по меньшей мере примерно 10,5 lg БОЕ/мл или по меньшей мере примерно 11 lg БОЕ/мл в яйцах с развивающимся эмбрионом. В конкретном варианте осуществления изобретения реассортантный или рекомбинантный вирус гриппа развивается до титра по меньшей мере примерно 7,5 lg БОЕ/мл, по меньшей мере примерно 8 lg БОЕ/мл, по меньшей мере примерно 8,5 lg БОЕ/мл, по меньшей мере примерно 9 lg БОЕ/мл, по меньшей мере примерно 9,5 lg БОЕ/мл, по меньшей мере примерно 10 lg БОЕ/мл, по меньшей мере примерно 10,5 lg БОЕ/мл или по меньшей мере примерно 11 lg БОЕ/мл в тканевых культурах.

В одном из вариантов осуществления изобретения реассортантный или рекомбинантный вирус гриппа по изобретению содержит 6 внутренних сегментов генома из A/Ann Arbor/6/60, первый сегмент генома, содержащий нуклеотидную последовательность SEQ ID NO:7, и второй сегмент генома, который кодирует полипептид нейраминидазы. В еще одном варианте осуществления реассортантный или рекомбинантный вирус гриппа по изобретению содержит 6 внутренних сегментов генома из A/Ann Arbor/6/60, первый сегмент генома, содержащий нуклеотидную последовательность остатков 84-1064 из состава SEQ ID NO:7, и второй сегмент генома, который кодирует полипептид нейраминидазы. В дополнительном варианте осуществления изобретения реассортантный или рекомбинантный вирус гриппа по изобретению содержит 6 внутренних сегментов генома из A/Puerto Rico/8/34, первый сегмент генома, содержащий нуклеотидную последовательность SEQ ID NO:7, и второй сегмент генома, который кодирует полипептид нейраминидазы. В другом варианте осуществления изобретения реассортантный или рекомбинантный вирус гриппа по изобретению содержит 6 внутренних сегментов генома из A/Puerto Rico/8/34, первый сегмент генома, содержащий нуклеотидную последовательность остатков 84-1064 из состава SEQ ID NO:7, и второй сегмент генома, который кодирует полипептид нейраминидазы. В конкретном варианте осуществления изобретения второй сегмент генома содержит нуклеотидную последовательность SEQ ID NO:5. В конкретном варианте осуществления изобретения полипептид нейраминидазы содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:4. В конкретном варианте осуществления изобретения реассортантный или рекомбинантный вирус гриппа развивается до титра по меньшей мере примерно 7,5 lg БОЕ/мл, по меньшей мере примерно 8 lg БОЕ/мл, по меньшей мере примерно 8,5 lg БОЕ/мл, по меньшей мере примерно 9 lg БОЕ/мл, по меньшей мере примерно 9,5 lg БОЕ/мл, по меньшей мере примерно 10 lg БОЕ/мл, по меньшей мере примерно 10,5 lg БОЕ/мл или по меньшей мере примерно 11 lg БОЕ/мл в яйцах с развивающимся эмбрионом. В конкретном варианте осуществления изобретения реассортантный или рекомбинантный вирус гриппа развивается до титра по меньшей мере примерно 7,5 lg БОЕ/мл, по меньшей мере примерно 8 lg БОЕ/мл, по меньшей мере примерно 8,5 lg БОЕ/мл, по меньшей мере примерно 9 lg БОЕ/мл, по меньшей мере примерно 9,5 lg БОЕ/мл, по меньшей мере примерно 10 lg БОЕ/мл, по меньшей мере примерно 10,5 lg БОЕ/мл или по меньшей мере примерно 11 lg БОЕ/мл в тканевых культурах.

Другой особенностью изобретения является то, что оно включает стерильную композицию с одним или несколькими полипептидами, перечисленными выше, или их фрагментами. Изобретение также включает иммуногенные композиции, содержащие иммунологически эффективное количество одного или нескольких полипептидов, описанных выше, а также способы стимуляции иммунной системы пациента для выработки защитного иммунного ответа против вируса гриппа, включающие введение пациенту иммунологически эффективного количества одного или нескольких полипептидов, описанных выше. В конкретном варианте осуществления изобретения иммуногенная композиция по изобретению содержит полипептид, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:6 или 8. В другом варианте осуществления изобретения иммуногенная композиция по изобретению содержит полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 95%, по меньшей мере 98%, по меньшей мере 98,5%, по меньшей мере 99%, по меньшей мере 99,2%, по меньшей мере 99,4%, по меньшей мере 99,6%, по меньшей мере 99,8% или по меньшей мере 99,9% идентичность последовательности относительно аминокислотной последовательности SEQ ID NO:6 или 8. В дополнительном варианте осуществления изобретения иммуногенная композиция по изобретению содержит полипептид, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:6 или 8, включающую менее чем 3, менее чем 5, менее чем 10, менее чем 15, менее чем 20, менее чем 25, менее чем 30 аминокислотных замен, делеций или инсерций. В конкретном варианте осуществления изобретения иммуногенная композиция по изобретению содержит полипептид, содержащий аминокислотную последовательность остатков 1-327 в составе SEQ ID NO:6 или 8. В другом варианте осуществления изобретения иммуногенная композиция по изобретению содержит полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 95%, по меньшей мере 98%, по меньшей мере 98,5%, по меньшей мере 99%, по меньшей мере 99,2%, по меньшей мере 99,4%, по меньшей мере 99,6%, по меньшей мере 99,8% или по меньшей мере 99,9% идентичность последовательности относительно аминокислотной последовательности остатков 1-327 в составе SEQ ID NO:6 или 8. В дополнительном варианте осуществления изобретения иммуногенная композиция по изобретению содержит полипептид, содержащий аминокислотную последовательность остатков 1-327 в составе SEQ ID NO:6 или 8, включающую менее чем 3, менее чем 5, менее чем 10, менее чем 15, менее чем 20, менее чем 25, менее чем 30 аминокислотных замен, делеций или инсерций.

В одном из вариантов осуществления изобретения иммуногенная композиция по изобретению является моновалентной иммуногенной композицией, содержащей один реассортантный вирус гриппа. В одном из вариантов осуществления изобретения иммуногенная композиция по изобретению является тривалентной иммуногенной композицией, содержащей три реассортантных вируса гриппа. В одном из вариантов осуществления изобретения иммуногенная композиция по изобретению является тривалентной иммуногенной композицией, содержащей два реассортантных вируса гриппа A и реассортантный вирус гриппа B. В одном из вариантов осуществления изобретения иммуногенная композиция по изобретению является тривалентной иммуногенной композицией, содержащей реассортантный вирус гриппа A типа H1, реассортантный вирус гриппа A типа H3 и реассортантный вирус гриппа B. В другом варианте осуществления изобретения иммуногенная композиция по изобретению является тетравалентной иммуногенной композицией, содержащей четыре реассортантных вируса гриппа. В одном из вариантов осуществления изобретения иммуногенная композиция по изобретению является тетравалентной иммуногенной композицией, содержащей два реассортантных вируса гриппа A и два реассортантных вируса гриппа B. В одном из вариантов осуществления изобретения иммуногенная композиция по изобретению является тетравалентной иммуногенной композицией, содержащей реассортантный вирус гриппа A типа H1, реассортантный вирус гриппа A типа H3, реассортантный вирус гриппа B линии Виктория и реассортантный вирус гриппа B линии Ямагата. В конкретном примере осуществления изобретения иммуногенная композиция по изобретению содержит реассортантный или рекомбинантный вирус гриппа, который включает сегмент генома, кодирующий полипептид HA, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:6 или 8. В другом варианте осуществления изобретения иммуногенная композиция по изобретению содержит реассортантный или рекомбинантный вирус гриппа, который включает сегмент генома, кодирующий полипептид HA, содержащий аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 95%, по меньшей мере 98%, по меньшей мере 98,5%, по меньшей мере 99%, по меньшей мере 99,2%, по меньшей мере 99,4%, по меньшей мере 99,6%, по меньшей мере 99,8% или по меньшей мере 99,9% идентичность последовательности относительно аминокислотной последовательности SEQ ID NO:6 или 8. В дополнительном варианте осуществления изобретения иммуногенная композиция по изобретению содержит реассортантный или рекомбинантный вирус гриппа, который включает сегмент генома, кодирующий полипептид HA, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:6 или 8, включающую менее чем 3, менее чем 5, менее чем 10, менее чем 15, менее чем 20, менее чем 25, менее чем 30 аминокислотных замен, делеций или инсерций. В конкретном варианте осуществления изобретения иммуногенная композиция по изобретению содержит реассортантный или рекомбинантный вирус гриппа, который включает сегмент генома, кодирующий полипептид HA, содержащий аминокислотную последовательность остатков 1-327 в составе SEQ ID NO:6 или 8. В другом варианте осуществления изобретения иммуногенная композиция по изобретению содержит реассортантный или рекомбинантный вирус гриппа, который включает сегмент генома, кодирующий полипептид HA, содержащий аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 95%, по меньшей мере 98%, по меньшей мере 98,5%, по меньшей мере 99%, по меньшей мере 99,2%, по меньшей мере 99,4%, по меньшей мере 99,6%, по меньшей мере 99,8% или по меньшей мере 99,9% идентичность последовательности относительно аминокислотной последовательности 1-327 в составе SEQ ID NO:6 или 8. В дополнительном варианте осуществления изобретения иммуногенная композиция по изобретению содержит реассортантный или рекомбинантный вирус гриппа, который включает сегмент генома, кодирующий полипептид HA, содержащий аминокислотную последовательность остатков 1-327 в составе SEQ ID NO:6 или 8, включающую менее чем 3, менее чем 5, менее чем 10, менее чем 15, менее чем 20, менее чем 25, менее чем 30 аминокислотных замен, делеций или инсерций.

Дополнительно, изобретение включает реассортантный вирус гриппа, который содержит сегмент генома, кодирующий один или несколько полипептидов, описанных выше. Более того, изобретение включает иммуногенные композиции, содержащие иммунологически эффективное количество такого реассортантного вируса гриппа. Способы стимуляции иммунной системы пациента для выработки защитного иммунного ответа против вируса гриппа, включающие введение иммунологически эффективного количества такого реассортантного вируса гриппа в физиологически приемлемом носителе, также являются частью настоящего изобретения. В одном из вариантов осуществления изобретения реассортантный вирус гриппа по изобретению является реассортантным вирусом с формулой генома 6:2, содержащим 6 внутренних сегментов генома от одного или нескольких донорных вирусов (например, A/AA/6/60 или A/Puerto Rico/8/34, более известного как PR8) и дополнительно включающим 2 сегмента генома (обычно и предпочтительно кодирующих HA и NA или их фрагменты). Иммуногенные композиции, содержащие такой реассортантный (рекомбинантный) вирус, также являются особенностью настоящего изобретения.

В одном из вариантов осуществления изобретения, реассортантный или рекомбинантный вирус гриппа по изобретению содержит 6 внутренних сегментов генома из A/Ann Arbor/6/60 и сегмент генома, кодирующий полипептид HA. Полипептид HA может включать аминокислотную последовательность SEQ ID NO:1, несущую по меньшей мере одну замену, делецию или инсерцию. Полипептид HA может включать аминокислотную последовательность SEQ ID NO:1, несущую замену H273Y. Полипептид HA может включать аминокислотную последовательность SEQ ID NO:1, несущую замену D222G и/или Q223R. Полипептид HA может включать аминокислотную последовательность SEQ ID NO:1, несущую по меньшей мере одну аминокислотную замену, выбранную из группы, состоящей из K119E, K119N и A186D. В конкретном варианте осуществления изобретения реассортантный или рекомбинантный вирус гриппа по изобретению содержит 6 внутренних сегментов генома из A/Ann Arbor/6/60 и сегмент генома, кодирующий полипептид HA, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:1, несущую замены D222G, K119E и A186D. В конкретном варианте осуществления изобретения реассортантный или рекомбинантный вирус гриппа по изобретению содержит 6 внутренних сегментов генома из A/Ann Arbor/6/60 и сегмент генома, кодирующий полипептид HA, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:1, несущую замены Q223R и A186D. В конкретном варианте осуществления изобретения реассортантный или рекомбинантный вирус гриппа по изобретению содержит 6 внутренних сегментов генома из A/Ann Arbor/6/60 и сегмент генома, кодирующий полипептид HA, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:1, несущую замены Q223R, H273Y и A186D. В конкретном варианте осуществления изобретения реассортантный или рекомбинантный вирус гриппа по изобретению содержит 6 внутренних сегментов генома из A/Ann Arbor/6/60 и сегмент HA генома, кодирующий полипептид HA, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:6 или 8. В конкретном варианте осуществления изобретения сегмент HA генома может кодировать полипептид HA, который содержит аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 95%, по меньшей мере 98%, по меньшей мере 98,5%, по меньшей мере 99%, по меньшей мере 99,2%, по меньшей мере 99,4%, по меньшей мере 99,6%, по меньшей мере 99,8% или по меньшей мере 99,9% идентичность последовательности относительно аминокислотной последовательности SEQ ID NO:6 или 8. В конкретном варианте осуществления изобретения сегмент HA генома может кодировать полипептид HA, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:6 или 8, включающую менее чем 3, менее чем 5, менее чем 10, менее чем 15, менее чем 20, менее чем 25, менее чем 30 аминокислотных замен, делеций или инсерций. В конкретном варианте осуществления изобретения сегмент HA генома может кодировать полипептид HA, содержащий аминокислотную последовательность остатков 1-327 в составе SEQ ID NO:6 или 8. В конкретном варианте осуществления изобретения сегмент HA генома может кодировать полипептид HA, который содержит аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 95%, по меньшей мере 98%, по меньшей мере 98,5%, по меньшей мере 99%, по меньшей мере 99,2%, по меньшей мере 99,4%, по меньшей мере 99,6%, по меньшей мере 99,8% или по меньшей мере 99,9% идентичность последовательности относительно аминокислотной последовательности остатков 1-327 в составе SEQ ID NO:6 или 8. В конкретном варианте осуществления изобретения сегмент HA генома может кодировать полипептид HA, который содержит аминокислотную последовательность остатков 1-327 в составе SEQ ID NO:6 или 8, включающую менее чем 3, менее чем 5, менее чем 10, менее чем 15, менее чем 20, менее чем 25, менее чем 30 аминокислотных замен, делеций или инсерций.

В одном из вариантов осуществления изобретения, реассортантный или рекомбинантный вирус гриппа по изобретению содержит 6 внутренних сегментов генома из A/Puerto Rico/8/34 (PR8) и сегмент генома, кодирующий полипептид HA. Полипептид HA может включать аминокислотную последовательность SEQ ID NO:1, несущую по меньшей мере одну замену, делецию или инсерцию. Полипептид HA может включать аминокислотную последовательность SEQ ID NO:1, несущую замену D222G и/или Q223R. Полипептид HA может включать аминокислотную последовательность SEQ ID NO:1, несущую по меньшей мере одну аминокислотную замену, выбранную из группы, состоящей из K119E, K119N и A186D. Полипептид HA может включать аминокислотную последовательность SEQ ID NO:1, несущую замену H273Y. В конкретном примере осуществления изобретения реассортантный или рекомбинантный вирус гриппа по изобретению содержит 6 внутренних сегментов генома из A/Puerto Rico/8/34 (PR8) и сегмент генома, кодирующий полипептид HA, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:1, несущую замены D222G, K119E и A186D. В конкретном варианте осуществления изобретения реассортантный или рекомбинантный вирус гриппа по изобретению содержит 6 внутренних сегментов генома из A/Puerto Rico/8/34 (PR8) и сегмент генома, кодирующий полипептид HA, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:1, несущую замены Q223R и A186D. В конкретном варианте осуществления изобретения реассортантный или рекомбинантный вирус гриппа по изобретению содержит 6 внутренних сегментов генома из A/Puerto Rico/8/34 (PR8) и сегмент генома, кодирующий полипептид HA, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:1, несущую замены Q223R, H273Y и A186D. В конкретном варианте осуществления изобретения реассортантный или рекомбинантный вирус гриппа по изобретению содержит 6 внутренних сегментов генома из A/Puerto Rico/8/34 (PR8) и сегмент HA генома, кодирующий полипептид HA, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:6 или 8. В конкретном варианте осуществления изобретения сегмент HA генома может кодировать полипептид HA, который содержит аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 95%, по меньшей мере 98%, по меньшей мере 98,5%, по меньшей мере 99%, по меньшей мере 99,2%, по меньшей мере 99,4%, по меньшей мере 99,6%, по меньшей мере 99,8% или по меньшей мере 99,9% идентичность последо