Способ получения состава ферментационного бульона

Способ получения состава ферментационного бульона

Иллюстрации

Показать все

Реферат

ПЕРЕКРЕСТНАЯ ССЫЛКА НА СВЯЗАННЫЕ ЗАЯВКИ

По данной заявке испрашивается приоритет по предварительным заявкам США № 61/154235, поданной 20 февраля 2009 года, 61/185865, поданной 10 июня 2009 года, и 61/304219, поданной 12 февраля 2010 года, каждая из которых включена в настоящий документ в качестве ссылки в полном объеме.

1. ОБЛАСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Изобретение относится к композициям ферментационных бульонов и способам их изготовления и применения.

2. УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

В различных процессах культивирования или ферментации микроорганизмов иногда необходимо в ходе процесса ферментации или в завершение процесса ферментации убить активные клетки в смеси. В частности, это справедливо, когда микроорганизмы, содержащие рекомбинантную ДНК, выращивают в качестве продуцирующих хозяев, и желательно предотвратить, чтобы какие-либо жизнеспособные рекомбинантные организмы высвобождались в окружающую среду. Даже если микроорганизмы не содержат рекомбинантную ДНК, часто желательно убить клетки перед переработкой для обеспечения того, чтобы жизнеспособные клетки не попадали в окружающую среду либо в продукте, либо в отходах процесса.

Многие общепринятые способы, требуемые для индукции гибели микроорганизмов, такие как нагревание, являются чрезмерно агрессивными и могут разрушить или изменить желаемый секретируемый продукт до того, как клетки погибают. В этом случае продукт необходимо выделять, не убивая клетки, что требует применения трудоемких и дорогостоящих процедур и оборудования. В патентах США № 5801034 и 5378621 описан способ индукции гибели микробных клеток единичной органической кислотой, имеющей от 1 до 5 атомов углерода. Однако согласно примерам этих патентов оптимальным является высокий уровень органической кислоты и низкое значение pH. Условия низких значений pH часто являются вредоносными для стабильности многих представляющих интерес ферментных продуктов в ферментационной среде, и высокий уровень органической кислоты часто является ингибиторным при последующих применениях, в которых желательно использовать ферментные продукты, таких как ферментация микроорганизма, который продуцирует органическое вещество на субстрате, продуцированном ферментативным катализом с ферментным продуктом. Кроме того, применение высокой концентрации химического агента для индукции гибели микробных клеток может значительно увеличить стоимость продукта, выделенного из ферментационной среды. Таким образом, остается потребность в разработке способов индукции гибели клеток в менее жестких условиях, и является желательной более низкая концентрация химических агентов.

3. КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ СУЩНОСТИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Многие промышленные белки, такие как ферменты, часто поставляют коммерчески в ферментационных бульонах, в которых они продуцированы. Как правило, белки экспрессируются и секретируются клетками (рекомбинантными или нерекомбинантными) в ферментационный бульон, содержащий ферментационную среду и клетки. Часто желательно инактивировать, например убить, клетки перед использованием белков в промышленных применениях, так чтобы реплицирующиеся клетки не попадали в окружающую среду. Настоящее описание направлено на необходимость инактивировать клетки таким образом, чтобы по существу не препятствовать активности белков, например ферментов.

В некоторых аспектах настоящее описание относится к способу получения ферментационного бульона, включающему инкубацию первой смеси, содержащей (a) один или несколько ферментационных бульонов, (b) первый компонент органической кислоты, содержащий по меньшей мере одну органическую кислоту из 1-5 атомов углерода (т.е. органическую кислоту всего с 1-5 атомами углерода в ее основной цепи и боковых цепях) и/или ее соль в количестве от 0,1% до 15% масс. первой смеси, и (c) второй компонент органической кислоты, содержащий по меньшей мере одну органическую кислоту с 6 или более атомами углерода (т.е. органическую кислоту всего с 6 или более атомами углерода в основной цепи или боковых цепях) и/или ее соль в количестве от 0,025% до 5% масс. первой смеси, в течение периода времени и в условиях, которые приводят к снижению количества жизнеспособных клеток, составляющего по меньшей мере 4 log, в указанных одном или нескольких ферментационных бульонах, тем самым получая композицию ферментационного бульона.

В конкретных вариантах осуществления первый компонент органической кислоты находится в диапазоне, в котором нижний предел выбран из 0,1%, 0,2%, 0,25%, 0,3%, 0,35%, 0,4%, 0,5%, 0,75% или 1% и в котором верхний предел независимо выбран из 0,3%, 0,4%, 0,5%, 0,75%, 1%, 2%, 3%, 5%, 7%, 10%, 12% или 15% масс. первой смеси, например в количествах в диапазоне от 0,2% до 1%, от 0,2% до 0,5%, от 0,1% до 10%, от 0,25% до 5% или от 0,3% до 3% масс. первой смеси и т.д.

В конкретных вариантах осуществления второй компонент органической кислоты находится в диапазоне, в котором нижний предел выбран из 0,025%, 0,03%, 0,04%, 0,045%, 0,05%, 0,075%, 0,1%, 0,2%, 0,25%, 0,3%, 0,35%, 0,4%, 0,5%, 0,75% или 1% и в котором верхний предел независимо выбран из 0,1%, 0,2%, 0,3%, 0,4%, 0,5%, 0,75%, 1%, 2%, 3% или 5% масс. первой смеси, например в количествах в диапазоне от 0,04% до 3%, от 0,2% до 0,5%, от 0,1% до 1%, от 0,25% до 5% или от 0,3% до 3% масс. первой смеси и т.д. Допустимо, чтобы эта органическая кислота представляла собой органическую кислоту из 6-10 атомов углерода, органическую кислоту из 6-9 атомов углерода или органическую кислоту из 6-8 атомов углерода. Таким образом, в конкретных вариантах осуществления второй компонент органической кислоты содержит органическую кислоту из 6 атомов углерода и/или ее соль, органическую кислоту из 7 атомов углерода и/или ее соль, органическую кислоту из 8 атомов углерода и/или ее соль, органическую кислоту из 9 атомов углерода и/или ее соль или органическую кислоту из 10 атомов углерода и/или ее соль или состоит из них.

Допустимо, чтобы период времени инкубации находился в диапазоне, в котором нижний предел выбран из 4 часов, 6 часов, 8 часов, 10 часов, 12 часов, 14 часов, 16 часов, 18 часов или 20 часов и в котором верхний предел независимо выбран из 12 часов, 16 часов, 20 часов, 24 часов, 28 часов, 32 часов или 36 часов, например от 4 часов до 36 часов, например от 8 часов до 36 часов, от 20 часов до 28 часов, от 8 часов до 16 часов, от 10 часов до 20 часов, от 16 часов до 30 часов и т.д.

Условия инкубации включают температуру, для которой является допустимым диапазон, в котором нижний предел выбран из 20°C, 22°C, 25°C, 28°C, 30°C, 32°C, 34°C, 36°C, 38°C или 40°C и в котором верхний предел независимо выбран из 28°C, 33°C, 35°C, 40°C, 45°C, 50°C или 55°C, например от 20°C до 50°C, от 25°C до 40°C, от 28°C до 33°C и т.д.

Условия инкубации включают pH, для которого допустимым является диапазон, в котором нижний предел выбран из 3,5, 3,6, 3,7, 3,8, 3,9, 4 или 4,2 и в котором верхний предел независимо выбран из 3,8, 4, 4,2, 4,4, 4,5, 4,6, 4,7, 4,8, 4,9, 5, 5,2 или 5,5, например pH от 3,5 до 5, от 4 до 4,7 или от 4,2 до 4,5. pH можно корректировать в начале инкубации и/или один или несколько раз в ходе инкубации, например, добавлением pH-корректирующего вещества. В конкретных вариантах осуществления pH-корректирующее вещество представляет собой фосфорную кислоту, серную кислоту или гидроксид натрия. Также в настоящем документе предусматривается, что в определенных вариантах осуществления первый и/или второй компонент органической кислоты может участвовать в коррекции pH в начале инкубации и/или в ходе периода инкубации, таким образом частично или полностью устраняя потребность в дополнительных pH-корректирующих средствах.

В некоторых аспектах способы по изобретению приводят к снижению числа жизнеспособных клеток в одном или нескольких ферментационных бульонах в смеси, составляющего по меньшей мере 5 log, 6 log, 7 log или 8 log (логарифмов).

В конкретных вариантах осуществления снижение уровня жизнеспособных клеток в указанной смеси по меньшей мере в 0,25 раза, по меньшей мере в 0,5 раза, по меньшей мере в 1 раз, по меньшей мере в 2 раза, по меньшей мере в 5 раз или по меньшей мере в 10 раз превышает снижение во второй смеси или альтернативной смеси, подвергаемой указанным условиям, которая содержит только один компонент органической кислоты в количестве, составляющем вплоть до общего весового процента первого и второго компонентов органической кислоты в первой смеси. В качестве примера, применение первого количества (например, 1% масс.) первого компонента органической кислоты и второго количества (0,5% масс.) второго компонента органической кислоты применительно к способам по изобретению приводит к большему снижению количества жизнеспособных клеток, чем применение третьего количества, которое составляет вплоть до суммы указанного первого и второго количеств (например, 1,5% масс.) первого компонента органической кислоты или второго компонента органической кислоты отдельно в одних и тех же или сходных условиях.

Способы по настоящему изобретению можно применять для инактивации клеток грибов, например клеток нитчатых грибов. В конкретных вариантах осуществления клетки нитчатых грибов происходят из родов Trichoderma, Aspergillus, Penicillium, Humicola, Chrysosporium или Neurospora. Другие типы клеток, допустимые для способов, составов и композиций по настоящему изобретению, описаны в разделе 5.2.1, ниже.

В конкретных вариантах осуществления первый компонент органической кислоты содержит уксусную кислоту, соль уксусной кислоты, муравьиную кислоту, соль муравьиной кислоты, пропионовую кислоту, соль пропионовой кислоты или смесь двух или более из вышесказанных или состоит из них. В одном из вариантов осуществления первый компонент органической кислоты содержит уксусную кислоту и/или ее соль или состоит из них.

В конкретных вариантах осуществления второй компонент органической кислоты содержит бензойную кислоту, соль бензойной кислоты, циклогексанкарбоновую кислоту, соль циклогексанкарбоновой кислоты, 4-метилвалериановую кислоту, соль 4-метилвалериановой кислоты, фенилуксусную кислоту, соль фенилуксусной кислоты, или смесь двух или более из указанных выше или состоит из них. В одном из вариантов осуществления второй органический компонент содержит бензойную кислоту и/или ее соль, или состоит из них.

В определенных вариантах осуществления способов по настоящему изобретению первый компонент органической кислоты содержит натриевую, калиевую, кальциевую или магниевую соль указанной органической кислоты из 1-5 атомов углерода и/или второй компонент органической кислоты содержит натриевую, калиевую, кальциевую или магниевую соль указанной органической кислоты из 6 или более атомов углерода.

В некоторых конкретных вариантах осуществления первый компонент органической кислоты содержит уксусную кислоту в концентрации 0,2%-0,4% масс. и второй компонент органической кислоты содержит бензоат натрия в концентрации 0,2%-0,4% масс., и/или период времени составляет 24 часа, и/или условия включают температуру 40°C, и/или условия включают pH от 4 до 4,6.

В способах по настоящему изобретению первая смесь также может содержать одно или несколько противомикробных средств, например, для ингибирования роста контаминирующих бактерий или грибов. В конкретных вариантах осуществления одно или несколько противомикробных средств находятся в количестве от 0,0005 до 0,05% масс. первой смеси, например в количестве от 0,001 до 0,025% масс. указанной смеси. В конкретном варианте осуществления противомикробное средство содержит экстракт хмеля, содержащий изо-альфа-кислоты, тетра-изо-альфа-кислоты и/или бета-кислоты. Также в настоящем документе предусматривается, что в определенных вариантах осуществления первый и/или второй компонент органической кислоты может играть противомикробную роль и, таким образом, частично или полностью устранять необходимость в других противомикробных средствах.

Способы по настоящему изобретению, кроме того, могут включать стадию получения первой смеси перед стадией инкубации, описанной выше, например, путем комбинирования одного или нескольких ферментационных бульонов по меньшей мере с одной органической кислотой из 1-5 атомов углерода и/или ее солью, по меньшей мере с одной органической кислотой из 6 или более атомов углерода и/или ее солью и необязательно с одним или несколькими другими реагентами, такими как pH-корректирующее средство и/или противомикробное средство.

В определенных вариантах осуществления способы, описанные в настоящем документе, дополнительно включают стадию культивирования клеток для получения одного или нескольких из ферментационных бульонов, используемых для настоящего изобретения. В качестве неограничивающего примера ферментационные бульоны можно получать согласно любому из способов культивирования клеток, описанных в разделе 5.2.2, ниже. Таким образом, композиции и составы по настоящему изобретению могут включать ферментационные бульоны, полученные способами, описанными в настоящем документе.

Без связи с какой-либо теорией авторы настоящего изобретения полагают, что применение двух компонентов органических кислот, описанных в настоящем документе, приводит к снижению общего компонента органической кислоты, требуемого для достижения инактивации клеток (например, путем снижения числа жизнеспособных клеток на коэффициент 4 log или более, как описано в настоящем документе) по сравнению с использованием одного компонента органической кислоты, и позволяет проведение реакции инкубации при более высоком pH, чем возможно в ином случае, тем самым минимизируя неблагоприятные эффекты на сворачивание и стабильность белков, например ферментов, в исходном ферментационном бульоне. Таким образом, в некоторых аспектах способы по настоящему изобретению проводят в условиях, которые приводят к композиции ферментационного бульона, в котором один или несколько ферментов сохраняют по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95% или по меньшей мере 98% их исходной ферментативной активности.

Кроме того, настоящее изобретение относится к композиции ферментационного бульона, полученной или получаемой способами, описанными в настоящем документе.

Таким образом, в некоторых аспектах, настоящее изобретение относится к композиции, содержащей (a) один или несколько ферментационных бульонов, содержащих клетки; (b) первый компонент органической кислоты, содержащий по меньшей мере одну органическую кислоту из 1-5 атомов углерода и/или ее соль в количестве от 0,2% до 1,5% масс. указанной композиции, (c) второй компонент органической кислоты, содержащий по меньшей мере одну органическую кислоту из 6 или более атомов углерода и/или ее соль в количестве от 0,04% до 0,6% масс. указанной композиции.

В конкретных вариантах осуществления первый компонент органической кислоты находится в диапазоне, в котором нижний предел выбран из 0,1%, 0,2%, 0,25%, 0,3%, 0,35%, 0,4%, 0,5%, 0,75% или 1% и в котором верхний предел независимо выбран из 0,3%, 0,4%, 0,5%, 0,75%, 1%, 2%, 3%, 5%, 7%, 10%, 12% или 15% масс. композиции, например в количествах в диапазоне от 0,2% до 1%, от 0,2% до 0,5%, от 0,1% до 10%, от 0,25% до 5% или от 0,3% до 3% масс. композиции и т.д.

В конкретных вариантах осуществления второй компонент органической кислоты находится в диапазоне, в котором нижний предел выбран из 0,025%, 0,03%, 0,04%, 0,045%, 0,05%, 0,075%, 0,1%, 0,2%, 0,25%, 0,3%, 0,35%, 0,4%, 0,5%, 0,75% или 1% и в котором верхний предел независимо выбран из 0,1%, 0,2%, 0,3%, 0,4%, 0,5%, 0,75%, 1%, 2%, 3% или 5% масс. композиции, например в количествах в диапазоне от 0,04% до 3%, от 0,2% до 0,5%, от 0,1% до 1%, от 0,25% до 5% или от 0,3% до 3% масс. композиции и т.д.

Следует понимать, что компоненты органических кислот в составах и композициях по изобретению, как правило, по меньшей мере частично находятся в диссоциированной форме и, когда такие компоненты находятся в диссоциированной форме, массовый процент компонента относится не к массе диссоциированных ионов (например, катионов), а к массе сухого материала (например, кислоты или соли), используемого для получения композиции или состава. Степень, с которой такие компоненты диссоциируют, зависит от их соответствующих величин pKa. Предпочтительно, чтобы состав или композицию изготавливали в условиях pH и при температуре, при которых по меньшей мере 20%, по меньшей мере 30%, по меньшей мере 40%, по меньшей мере 50%, по меньшей мере 60% или по меньшей мере 70% компонента органической кислоты являются диссоциированными.

В некоторых аспектах композиция по изобретению имеет значение pH, которое находится в допустимом диапазоне, в котором нижний предел выбран из 3,5, 3,6, 3,7, 3,8, 3,9, 4 или 4,2 и в котором верхний предел независимо выбран из 3,8, 4, 4,2, 4,4, 4,5, 4,6, 4,7, 4,8, 4,9, 5, 5,2 или 5,5, например pH от 3,5 до 5, от 4 до 4,7 или от 4,2 до 4,5.

В некоторых аспектах клетки в композиции по изобретению являются преимущественно или полостью нежизнеспособными клетками. Например, в определенных вариантах осуществления, если в композиции присутствуют жизнеспособные клетки, тогда соотношение нежизнеспособных клеток и жизнеспособных клеток в указанной композиции составляет по меньшей мере 10:1, по меньшей мере 50:1, по меньшей мере 100:1, по меньшей мере 1000:1, по меньшей мере 10000:1, по меньшей мере 100000:1 или по меньшей мере 1000000:1.

В некоторых аспектах клетки включают клетки грибов, например клетки нитчатых грибов. В конкретных вариантах осуществления клетки нитчатых грибов происходят из родов Trichoderma, Aspergillus, Penicillium, Humicola, Chrysosporium или Neurospora.

В определенных вариантах осуществления композиций по изобретению первый компонент органической кислоты содержит уксусную кислоту, соль уксусной кислоты, муравьиную кислоту, соль муравьиной кислоты, пропионовую кислоту, соль пропионовой кислоты или смесь двух или более из указанных выше или состоит из них. В конкретном варианте осуществления первый компонент органической кислоты содержит уксусную кислоту и/или ее соль или состоит из них.

В определенных вариантах осуществления композиции по изобретению второй компонент органической кислоты содержит бензойную кислоту, соль бензойной кислоты, циклогексанкарбоновую кислоту, соль циклогексанкарбоновой кислоты, 4-метилвалериановую кислоту, соль 4-метилвалериановой кислоты, фенилуксусную кислоту, соль фенилуксусной кислоты или смесь двух или более из указанных выше или состоит из них. В конкретном варианте осуществления второй компонент органической кислоты содержит бензойную кислоту и/или ее соль или состоит из них.

В определенных вариантах осуществления первый компонент органической кислоты содержит натриевую, калиевую, кальциевую или магниевую соль органической кислоты из 1-5 атомов углерода и/или второй компонент органической кислоты содержит натриевую, калиевую, кальциевую или магниевую соль органической кислоты из 6 или более атомов углерода.

Дополнительные детали и варианты осуществления органических кислот, допустимых в способах и композициях по настоящему изобретению, описаны в разделе 5.2.4 ниже.

В конкретных вариантах осуществления первый компонент органической кислоты содержит уксусную кислоту в концентрации 0,2%-0,4% масс. и/или второй компонент органической кислоты содержит бензоат натрия в концентрации 0,2%-0,4% масс.

Композиции по изобретению могут содержать одно или несколько противомикробных средств. В конкретных вариантах осуществления одно или несколько противомикробных средств представлены в количестве от 0,0005 до 0,05% масс. композиции, например в количестве от 0,001 до 0,025% масс. указанной композиции. В конкретном варианте осуществления противомикробное средство содержит экстракт хмеля, содержащий изо-альфа-кислоты, тетра-изо-альфа-кислоты и/или бета-кислоты.

Ферментационные бульоны, используемые в способах, составах и композициях по изобретению, как правило, содержат один или несколько белков, секретируемых клетками. По меньшей мере один из указанных одного или нескольких белков может экспрессироваться рекомбинантно и/или представляет собой фермент, например экзоглюканазу, эндоглюканазу, гемицеллюлазу или β-глюкозидазу. В определенных вариантах осуществления ферментационные бульоны содержат множество ферментов, экспрессируемых рекомбинантно и секретируемых клетками, например два или более из экзоглюканазы, эндоглюканазы, гемицеллюлазы или β-глюкозидазы. Другие ферменты, присутствие которых является допустимым в композициях по настоящему изобретению, описаны в разделе 5.2.3 ниже. В некоторых аспектах белки составляют от 3 до 30% масс. состава или композиции по изобретению. В конкретных вариантах осуществления белки составляют 5-15% масс., от 7 до 10% масс., от 6 до 12% масс., от 5 до 20% масс., от 10 до 25% масс., от 10 до 20% масс., от 8 до 15% масс. или от 6 до 10% масс. состава или композиции по изобретению.

В определенных конкретных вариантах осуществления композиция по изобретению имеет один, два или все три из следующих видов активности:

(a) активность эндоглюканазы, находящаяся в диапазоне от нижнего предела, выбранного из 2000, 2100, 2200, 2350, 2500 или 2650 CMC Ед/г до верхнего предела, который независимо выбран из 2400, 2600, 2800, 3000, 3200, 3500, 3750 или 4000 CMC Ед/г, например в диапазоне от 2200 CMC Ед/г до 2800 CMC Ед/г, от 2200 CMC Ед/г до 3200 CMC Ед/г, от 2500 до 3500 CMC Ед/г и т.д.;

(b) активность β-глюкозидазы, находящаяся в диапазоне от нижнего предела, который выбран из 300, 375, 450, 475, 500, 525, 550, 600, 650 или 700 pNPG Ед/г, до верхнего предела, который независимо выбран из 475, 525, 575, 635, 700, 775, 800, 850, 900 или 950 pNPG Ед/г, например в диапазоне от 525 pNPG Ед/г до 775 pNPG Ед/г, от 300 pNPG Ед/г до 800 pNPG Ед/г, от 350 pNPG Ед/г до 850 pNPG Ед/г и т.д.; и

(с) активность ксиланазы, находящаяся в диапазоне от нижнего предела, который выбран из 1000, 1250, 1500, 1750, 2000, 2250, 2500, 2750 или 3000 ABX Ед/г, до верхнего предела, который независимо выбран из 2500, 3000, 3500, 4000, 4500, 5000, 5500, 6000 или 7000 ABX Ед/г, например в диапазоне от 2000 ABX Ед/г до 5000 ABX Ед/г, от 1500 ABX Ед/г до 4500 ABX Ед/г, от 3500 ABX Ед/г до 5500 ABX Ед/г и т.д.

В другом аспекте изобретение относится к способу гидролиза целлюлозного материала, включающему контактирование целлюлозного материала с указанными выше композициями ферментационных бульонов. В некоторых вариантах осуществления целлюлозный материал представляет собой материал растительной биомассы, такой как лигноцеллюлозный материал, который необязательно предварительно обработан для усиления ферментативного гидролиза. Таким образом, в некоторых аспектах составы и композиции по изобретению, кроме того, содержат негидролизованный целлюлозный материал, частично гидролизованный целлюлозный материал или по существу полностью гидролизованный (например, >90% гидролизованный или >95% гидролизованный) целлюлозный материал. В конкретных вариантах осуществления частично гидролизованный целлюлозный материал (i) представляет собой целлюлозный материал, гидролизованный на вплоть до 40%, вплоть до 50%, вплоть до 60%, вплоть до 70%, вплоть до 80% или вплоть до 90%; (ii) представляет собой целлюлозный материал, гидролизованный по меньшей мере на 30%, по меньшей мере на 40%, по меньшей мере на 50%, по меньшей мере на 60% или по меньшей мере на 70%; или (iii) является гидролизованным до диапазона, попадающего между парой значений, независимо выбранных из (i) и (ii), например, гидролизованным на 30%-80% или 40%-90%. Следует отметить, что диапазоны масс компонентов (например, органических кислот) составов и композиций, описанных в настоящем документе, как правило, не включают целлюлозные материалы или продукты гидролиза целлюлозных материалов.

Дальнейшие детали и варианты осуществления составов и композиций по настоящему изобретению описаны в разделе 5.3 ниже.

В некоторых аспектах изобретение относится к способам получения органических веществ путем ферментации микроорганизма, который продуцирует органическое вещество в составе или композиции по изобретению. В одном из вариантов осуществления микроорганизм представляет собой этанологенный микроорганизм и органическое вещество представляет собой этанол. Композицию по изобретению можно использовать в реакции одновременного осахаривания и ферментации ("SSF") или в реакции раздельного гидролиза и ферментации ("SHF").

Без связи с какой-либо теорией композиции по изобретению преимущественно содержат меньшее количество ингибиторов ферментации микроорганизмов, чем композиция (обозначаемая в настоящем документе как "альтернативная композиция"), которая сходна или идентична композиции по изобретению, но содержит только один компонент органической кислоты в количестве, инактивирующем или вызывающем гибель клетки в ферментационном бульоне(ах), в альтернативной композиции. Таким образом, в определенных вариантах осуществления выход органического вещества, продуцируемого ферментирующим микроорганизмом в присутствии композиции по изобретению по меньшей мере в 0,25 раза, по меньшей мере в 0,5 раза, по меньшей мере в 1 раз, по меньшей мере в 2 раза, по меньшей мере в 5 раз или по меньшей мере в 10 раз превышает выход органического вещества в присутствии такой альтернативной композиции. В качестве примера, когда для ферментирующего микроорганизма используют композицию по изобретению, содержащую ферменты, первое количество (например, 1% масс.) первого компонента органической кислоты и второе количество (0,5% масс.) второго компонента органической кислоты, выход органического вещества, продуцируемого ферментирующим микроорганизмом, превышает выход, когда используют композицию, содержащую те же ферменты и третье количество, которое составляет вплоть до суммы указанных первого и второго количеств (например, 1,5% масс.) первого компонента органической кислоты или второго компонента органической кислоты отдельно в тех же или сходных условиях.

Таким образом, в определенных вариантах осуществления композиции по настоящему изобретению используют в реакции SSF. Способы включают воздействие на реакционную смесь SSF, содержащую состав или композицию по изобретению, ферментирующий микроорганизм и целлюлозный субстрат, условий SSF. Необязательно, способы включают стадию получения реакционной смеси SSF, например путем комбинирования композиции по изобретению, этанологена и, необязательно, целлюлозного субстрата. В конкретном варианте осуществления условия SSF включают отсутствие дополнительного источника азота. В другом конкретном варианте осуществления условия способствуют как гидролизу целлюлозы в глюкозу и/или гемицеллюлозный сахар (например, ксилозу, арабинозу и/или маннозу), так и превращению глюкозы и/или гемицеллюлозы в органическое вещество (например, этанол). Также настоящее изобретение охватывает реакционные смеси SSF, содержащие композицию по изобретению, ферментирующий микроорганизм и, необязательно, целлюлозный материал, также как и продукты реакции SSF, в которых целлюлозный материал по меньшей мере частично гидролизован и ферментирован.

В других вариантах осуществления композиции по настоящему изобретению используют в реакции SHF. Способы включают воздействие на реакционную смесь SHF, содержащую композицию по изобретению и целлюлозный субстрат, условий SHF. Необязательно, способы включают стадию получения реакционной смеси SHF, например путем комбинирования композиции по изобретению и целлюлозного субстрата. В конкретном варианте условия способствуют гидролизу целлюлозы в глюкозу и/или гемицеллюлозный сахар (например, ксилозу, арабинозу и/или маннозу). Также настоящее изобретение охватывает реакционные смеси SHF, содержащие композицию по изобретению и целлюлозный материал, также как и продукты реакции SHF, в которых целлюлозный материал по меньшей мере частично гидролизован.

Дополнительные детали и варианты осуществления способов гидролиза целлюлозного материала и способов продукции органических веществ описаны в разделах 5.4 и 5.5 ниже.

В другом аспекте изобретение относится к наборам, содержащим упаковку и композицию, реакционную смесь SSF, продукт реакции SSF, реакционную смесь SHF или продукт реакции SHF согласно настоящему изобретению. В некоторых вариантах осуществления набор, кроме того, содержит инструкции по применению в способе продукции органического вещества с помощью ферментирующего микроорганизма, например инструкции по применению в способе продукции этанола с помощью этанологенного микроорганизма, и целлюлозного субстрата, гидролизованного с помощью цельного бульона или композиции с убитыми клетками в наборе. Дополнительные детали и варианты осуществления наборов по настоящему изобретению описаны в разделе 5.6 ниже.

Следующие конкретные варианты осуществления способов, составов и композиций по настоящему изобретению представлены в разделе 5.7 ниже.

4. КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ФИГУР

На фиг.1 показаны эффекты температуры и концентрации химических веществ в составе на индукцию гибели клеток T. reesei.

На фиг.2 показан эффект концентрации бензоата натрия на индукцию гибели клеток T. reesei при 40°C и pH 4.

На фиг.3 показан эффект условий индукции гибели клеток на гибель клеток грибов.

На фиг.4 показаны химические структуры и величины pKa для органических кислот с 6 или более атомами углерода.

На фиг.5 показаны эффекты различных органических кислот с 6 или более атомами углерода на индукцию гибели клеток T. reesei при 40°C и pH 4.

На фиг.6 показана продукция молочной кислоты из L. rhanmosus на промытом гидролизате APB, как описано в примере 2.

На фиг.7 представлена продукция этанола из дрожжей Thermosacc на промытом гидролизате APB, как описано в примере 2.

На фиг.8 представлено накопление глюкозы в процессе ферментации дрожжей Thermosacc на промытом гидролизате APB, как описано в примере 2.

5. ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ

5.1 Определения

Как используют в настоящем документе, термин "клетка-хозяин" относится к клетке или клеточной линии, в которые можно трансфицировать рекомбинантный вектор, экспрессирующий полипептид, для продукции полипептида. Клетки-хозяева включают потомков отдельной клетки-хозяина, и потомки необязательно являются полностью идентичными (по морфологии или полному набору геномной ДНК) исходной родительской клетке вследствие природной, случайной или преднамеренной мутации. Клетка-хозяин включает клетки, трансфицированные или трансформированные in vivo экспрессирующим вектором. "Клетка-хозяин" относится как к клеткам, так и к протопластам, полученным из клеток штамма нитчатых грибов, в частности штамма Trichoderma sp.

Термин "рекомбинантный", когда его используют в отношении клетки, нуклеиновой кислоты, белка или вектора, указывает на то, что клетка, нуклеиновая кислота, белок или вектор модифицированы путем введения гетерологичной нуклеиновой кислоты или белка или изменения нативной нуклеиновой кислоты или белка или что клетка происходит из клетки, модифицированной таким путем. Таким образом, например, рекомбинантные клетки экспрессируют гены, которые не встречаются в нативной (нерекомбинантной) форме клетки, или экспрессируют нативные гены, которые в ином случае аномально экспрессируются, недостаточно экспрессируются или не экспрессируются совсем.

"Нитчатые грибы" относятся ко всем нитчатым формам подотделов Eumycotina и Oomycota (см., Alexopoulos, C.J. (1962), Introductory Mycology, Wiley, New York). Эти грибы характеризуются вегетативным мицелием с клеточной стенкой, состоящей из хитина, бета-глюкана и других сложных полисахаридов. Нитчатые грибы по настоящему изобретению морфологически, физиологически и генетически отличаются от дрожжей. Вегетативный рост нитчатых грибов происходит путем удлинения гифа, а катаболизм углерода является облигатно-аэробным.

Как используют в настоящем документе, термин "Trichoderma" или "Trichoderma sp." относится к любому роду грибов, ранее или в настоящее время классифицируемому как Trichoderma.

Термин "культивирование" относится к выращиванию популяции микробных клеток в допустимых для роста условиях в жидкой или твердой среде.

Как используют в настоящем документе, термины "целлюлозный субстрат" или "целлюлозный материал", используемые в настоящем документе взаимозаменяемо, относятся к материалу, содержащему целлюлозу и/или гемицеллюлозу. Целлюлозный субстрат может представлять собой лигноцеллюлозный материал, который содержит целлюлозу, гемицеллюлозу и бета-глюканы, которые являются сшитыми друг с другом и с лигнином. Такие целлюлозные субстраты также могут содержать другие материалы, такие как пектины, белки, крахмал и липиды, однако, как правило, они содержат целлюлозу, гемицеллюлозу и бета-глюканы в качестве основных компонентов.

"Ферментирующий микроорганизм" относится к любому микроорганизму, допустимому для применения в желаемом процессе ферментации в целях продукции органических веществ.

Термин "ферментационный бульон", как используют в настоящем документе, относится к препарату, продуцируемому посредством ферментации клеток, который не подвергают выделению и/или очистке или подвергают минимальному выделению и/или очистке. Например, ферментационные бульоны получают, когда микробные культуры выращивают до насыщения, инкубируют в условиях ограничения углерода для обеспечения синтеза белка (например, экспрессии клетками-хозяевами ферментов) и секреции его в клеточную культуральную среду. Ферментационный бульон может содержать нефракционированные или фракционированные части ферментационных материалов, образующихся в конце ферментации. Как правило, ферментационный бульон является нефракционированным и содержит использованную культуральную среду и клеточный дебрис, присутствующий после удаления микробных клеток (например, клеток нитчатых грибов), например, центрифугированием. В некоторых вариантах осуществления ферментационный бульон содержит использованную клеточную культуральную среду, внеклеточные ферменты и жизнеспособные и/или нежизнеспособные микробные клетки.

"Этанологенный" относится к способности микроорганизма продуцировать этанол из углевода в качестве основного продукта ферментации. В некоторых вариантах осуществления этанологенные микроорганизмы также можно использовать для продукции других органических веществ.

"Единица карбоксиметилцеллюлозы", или "CMC Ед", относится к единице активности эндоглюканазы, которая высвобождает 1 мкмоль восстанавливающего сахара (экспрессируемого в качестве эквивалентов глюкозы) за одну минуту при 50°С и pH 4,8.

"pVP-глюкозидная единица", или "pMPG Ед", относится к единице активности бета-глюкозидазы, которая высвобождает 1 мкмоль нитрофенола из пара-нитрофенил-B-D-глюкопиранозида при 50°С и pH 4,8.

"Единица ABX", или "ABX Ед", относится к единице активности ксиланазы, которая высвобождает 1 мкмоль эквивалентов восстанавливающего сахара ксилозы из раствора 1% ксилана из древесины березы в 50 мМ Na-цитратном буфере, pH 5,3, при 50°С, при анализе с использованием способа с динитросалициловой кислотой (DNS) (Miller, 1959, Anal Chem., 31: 426-428).

5.2 Способы индукции гибели клеток

Изобретение относится к способам индукции гибели клеток в культуральной среде с получением, тем самым, цельного бульона с убитыми клетками. В некоторых вариантах осуществления способ включает контактирование клеток с комбинацией из первой органической кислоты, имеющей от 1 до 5 атомов углерода, в концентрации от приблизительно 0,2% до приблизительно 1% масс., и второй органической кислоты, имеющей 6 или более атомов углерода, в концентрации от приблизительно 0,04% до приблизительно 0,3% масс. В некоторых вариантах осуществления способ включает контактирование клеток с комбинацией из первой органической кислоты, имеющей от 1 до 5 атомов углерода, в концентрации от приблизительно 0,2% до приблизительно 0,5% масс., и второй органической кислоты, имеющей 6 или более атомов углерода, в концентрации от приблизительно 0,2% до приблизительно 0,5% масс. В других вариантах осуществления способ включает контактирование клеток с органической кислотой, имеющей 6 или более атомов углерода, в концентрации от приблизительно 0,25% до приблизительно 0,5% масс. Способ проводят в течение допустимого периода времени и при допустимых pH и температуре для достижения индукции по существу полной (т.е. снижение количества жизнеспособных клеток по меньшей мере приблизительно на 4, 5 или 6 log после обработки) или полной (т.е. отсутствие жизнеспособных клеток после обработки) гибели клеток. Как правило, pH составляет от приблизительно 3,5 до приблизительно 4,5, от приблизительно 4 до приблизительно 4,4 или от приблизительно 3,9 до приблизительно 4,2, температура составляет от приблизительно 30°C до приблизительно 40°C, и способ проводят при этих pH и температуре в течение от приблизительно 8 до приблизительно 24 часов. В одном из вариантов осущес