Пептиды foxm1 и вакцины, содержащие их

Пептиды foxm1 и вакцины, содержащие их

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Область техники

Приоритет

Настоящая заявка утверждает преимущество Предварительной заявки США No. 61/153408, поданной 18 февраля 2009 года, полное содержание которой включено в данное описание посредством ссылки.

Настоящее изобретение относится к области биологической науки, в частности, к области терапии онкологических заболеваний. В частности, настоящее изобретение относится к новым пептидам, которые чрезвычайно эффективны в качестве противораковых вакцин, и лекарственным средствам для лечения и предупреждения опухолей.

Предпосылки изобретения

Было показано, что CD8 положительные ЦТЛ узнают эпитопные пептиды, полученные из опухолеспецифических антигенов (ОСА), на молекуле класса I главного комплекса гистосовместимости (ГКГС), а затем уничтожают опухолевые клетки. С момента обнаружения семейства меланомных антигенов (MAGE) как первого примера ОСА при помощи иммунологических подходов были обнаружены многие другие ОСА (NPL 1: Boon T, Int J Cancer 1993 May 8, 54(2): 177-80; NPL 2: Boon T & van der Bruggen P, J Exp Med 1996 Mar 1, 183(3): 725-9), и в настоящее время некоторые из ОСА находятся в процессе клинических исследований как иммунотерапевтические мишени.

Идентификация новых ОСА, которые индуцируют сильные и специфические противоопухолевые иммунные ответы, обеспечивает дальнейшее развитие клинического применения стратегии пептидных вакцинаций при различных типах рака (NPL 3: Harris CC, J Natl Cancer Inst 1996 Oct 16, 88(20): 1442-55; NPL 4: Butterfield LH et al, Cancer Res 1999 Jul 1, 59(13): 3134-42; NPL 5: Vissers JL et al., Cancer Res 1999 Nov 1, 59(21): 5554-9; NPL 6: van der Burg SH et al., J Immunol 1996 May 1, 156(9): 3308-14; NPL 7: Tanaka F et al., Cancer Res 1997 Oct 15, 57(20): 4465-8; NPL 8: Fujie T et al., Int J Cancer 1999 Jan 18, 80(2): 169-72; NPL 9: Kikuchi M et al., Int J Cancer 1999 May 5, 81(3): 459-66; NPL 10: Oiso M et al., Int J Cancer 1999 May 5, 81(3): 387-94).До настоящего времени сообщалось о нескольких клинических испытаниях с использованием этих опухолеспецифических антигенов. К сожалению, до сих пор в этих испытаниях противораковых вакцин можно было наблюдать лишь низкие частоты реального ответа (NPL 11: Belli F et al., J Clin Oncol 2002 Oct 15, 20(20): 4169-80; NPL 12: Coulie PG et al., Immunol Rev 2002 Oct, 188: 33-42; NPL 13: Rosenberg SA et al., Nat Med 2004 Sep, 10(9): 909-15).

Подходящий ОСА необходим для пролиферации и выживания раковых клеток, как мишени для иммунотерапии, поскольку использование таких ОСА может свести к минимуму хорошо известный риск иммунного избежания раковых клеток, присущего удалению, мутированию или супрессии ОСА, как последствие проводимой в терапевтических целях иммунной селекции.

Список цитирования

Непатентная литература

[NPL 1] Boon T, bit J Cancer 1993 May 8, 54(2): 177-80;

[NPL 2] Boon T & van der Braggen P, J Exp Med 1996 Mar 1, 183(3): 725-9;

[NPL 3] Harris CC, J Natl Cancer Inst 1996 Oct 16, 88(20): 1442-55;

[NPL 4] Butterfield LH et al., Cancer Res 1999 Jul 1, 59(13): 3134-42;

[NPL 5] Vissers JL et al., Cancer Res 1999 Nov 1, 59(21): 5554-9;

[NPL 6] van der Burg SH et al., J Immunol 1996 May 1, 156(9): 3308-14;

[NPL 7] Tanaka F et al., Cancer Res 1997 Oct 15, 57(20): 4465-8;

[NPL 8] Fujie T et al., Int J Cancer 1999 Jan 18, 80(2): 169-72;

[NPL 9] Kikuchi M et al., Int J Cancer 1999 May 5, 81(3): 459-66;

[NPL 10] Oiso M et al., Int J Cancer 1999 May 5, 81(3): 387-94) ;

[NPL 11] Belli F et al., J Clin Oncol 2002 Oct 15, 20(20): 4169-80;

[NPL 12] Coulie PG et al., Immunol Rev 2002 Oct, 188: 33-42;

[NPL 13] Rosenberg SA et al., Nat Med 2004 Sep, 10(9): 909-15).

Краткое описание изобретения

Настоящее изобретение основывается, в частности, на открытии подходящих мишеней иммунотерапии. Поскольку ОСА обычно воспринимаются иммунной системы в качестве «своих» и, вследствие этого, зачастую не обладают иммуногенностью, открытие соответствующих мишеней является чрезвычайно важным. Как отмечалось выше, FOXM1 (SEQ ID NO: 34, кодируемая геном с GenBank Accession No. NM_202002.1 (SEQ ID NO: 33)) был идентифицирован как активируемый в раковых тканях, таких как острый миелоидный лейкоз (AML), рак мочевого пузыря, рак молочной железы, рак шейки матки, холангиоцеллюлярный рак, хронический миелоидный лейкоз (CML), колоректальный рак, рак пищевода, рак желудка, рак желудка диффузного типа, рак печени, немелкоклеточный рак легкого (NSCLC), лимфома, остеосаркома, рак яичников, рак поджелудочной железы, рак предстательной железы, почечная карцинома, мелкоклеточный рак легкого (SCLC), опухоль мягких тканей и опухоль яичка. Таким образом, FOXM1 представляет собой подходящую мишень иммунотерапии.

Настоящее изобретение основывается, по меньшей мере, частично, на идентификации специфических эпитопных пептидов FOXM1, которые обладают способностью индуцировать цитотоксические Т-лимфоциты (ЦТЛ), специфические для FOXM1. Как подробно обсуждается ниже, мононуклеарные клетки периферической крови (PBMC), полученные от здоровых доноров, стимулировали при помощи HLA-A*2402-связывающихся подходящих пептидов, полученных из FOXM1. Затем были образованы линии ЦТЛ со специфической цитотоксичностью в отношении HLA-А24-положительных клеток-мишеней, подвергнутых импульсному взаимодействию с каждым из подходящих пептидов. Данные результаты показывают, что эти пептиды представляют собой HLA-А24-рестриктированные эпитопные пептиды, которые могут индуцировать сильные и специфические иммунные ответы в отношении клеток, экспрессирующих FOXM1. Эти результаты показывают, что FOXM1 является сильным иммуногеном и его эпитопы представляют собой эффективные мишени для иммунотерапии опухолей.

Соответственно, предметом настоящего изобретения является предоставление выделенных пептидов, связывающихся с HLA-антигеном, которые представляют собой FOXM1 (SEQ ID NO: 34) или его фрагменты. Предполагается, что настоящие пептиды обладают способностью индуцировать ЦТЛ. Их можно использовать для индуцирования ЦТЛ ex vivo или можно вводить субъекту для индукции иммунного ответа против раков, таких как острый миелоцитарный лейкоз, рак мочевого пузыря, рак молочной железы, рак шейки матки, холангиоцеллюлярный рак, хронический миелоцитарный лейкоз, колоректальный рак, рак пищевода, рак желудка, рак желудка диффузного типа, рак печени, NSCLC, лимфома, остеосаркома, рак яичников, рак поджелудочной железы, рак предстательной железы, почечная карцинома, SCLC, опухоль мягких тканей и опухоль яичка. Предпочтительно, пептиды представляют собой нонапептиды или декапептиды, и более предпочтительно, состоят из последовательности аминокислот, выбранной из группы SEQ ID NO: 2, 7, 8, 16, 25, 30 и 31, демонстрирующих сильную способность индуцирования ЦТЛ.

Настоящее изобретение предусматривает модифицированные пептиды, обладающие аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 2, 7, 8, 16, 25, 30 и 31, где одна, две или несколько аминокислот заменены или добавлены, при условии, что модифицированные пептиды сохраняют исходную способность индуцировать ЦТЛ.

Далее, настоящее изобретение предоставляет выделенные полинуклеотиды, кодирующие любой из пептидов по настоящему изобретению. Эти полинуклеотиды можно использовать для индуцирования или подготовки антиген-экспрессирующих клеток (АПК) со способностью индуцировать ЦТЛ или можно вводить субъекту для индуцирования иммунного ответа против рака, а также для настоящих пептидов.

При введении субъекту настоящие пептиды представляются на поверхности АПК и затем индуцируют ЦТЛ, нацеленные на соответствующие пептиды. Таким образом, аспектом настоящего изобретения является предоставление композиций или веществ, включая любые пептиды или полинуклеотиды по настоящему изобретению, для индуцирования ЦТЛ. Кроме того, композиции или вещества, включая любые из пептидов или полинуклеотидов, можно применять для лечения и/или предупреждения онкологических заболеваний, таких как AML, рак мочевого пузыря, рак молочной железы, рак шейки матки, холангиоцеллюлярный рак, CML, колоректальный рак, рак пищевода, рак желудка, рак желудка диффузного типа, рак печени, NSCLC, лимфома, остеосаркома, рак яичников, рак поджелудочной железы, рак предстательной железы, почечная карцинома, мелкоклеточный рак легкого (SCLC), опухоль мягких тканей и опухоль яичка, и/или для предупреждения послеоперационных рецидивов этих. Таким образом, еще одним предметом настоящего изобретения является предоставление фармацевтических композиций и веществ для лечения и/или для профилактики онкологических заболеваний, и/или для предупреждения их послеоперационных рецидивов, которые включают любой из пептидов или полинуклеотидов по настоящему изобретению. Вместо настоящих пептидов или полинуклеотидов или в дополнение к настоящим пептидам или полинуклеотидам настоящие фармацевтические композиции или вещества могут включать, в качестве активных ингредиентов, АПК или экзосомы, которые представляют любой из настоящих пептидов.

Пептиды или полинуклеотиды по настоящему изобретению можно использовать для индуцирования АПК, которые представляют на своей поверхности комплекс HLA-антигена и настоящего пептида, например, путем контактирования АПК, полученных от субъекта, с настоящим пептидом или введения полинуклеотида, кодирующего настоящий пептид, в АПК. Такие АПК обладают высокой способностью индуцировать ЦТЛ против пептидов-мишеней и пригодны для иммунотерапии рака. Таким образом, еще одним предметом настоящего изобретения является предоставление способов индуцирования АПК, способных индуцировать ЦТЛ, а также АПК, полученных этими способами.

Еще одним предметом настоящего изобретения является предоставление способа индуцирования ЦТЛ, который включает стадию совместного культивирования CD8-положительных клеток с АПК или экзосомами, представляющими пептид по настоящему изобретению на своей поверхности, или стадию введения гена, который включает полинуклеотид, кодирующий субъединицу Т-клеточного рецептора (ТКР), связывающийся с настоящим пептидом. ЦТЛ, получаемые настоящими способами, также находят применение при лечении и/или предупреждении раков, таких как AML, рак мочевого пузыря, рак молочной железы, рак шейки матки, холангиоцеллюлярный рак, CML, колоректальный рак, рак пищевода, рак желудка, рак желудка диффузного типа, рак печени, NSCLC, лимфома, остеосаркома, рак яичников, рак поджелудочной железы, рак предстательной железы, почечная карцинома, мелкоклеточный рак легкого, опухоль мягких тканей и опухоль яичка. Таким образом, еще одним предметом настоящего изобретения является предоставление ЦТЛ, получаемых настоящими способами.

Более того, еще одним предметом настоящего изобретения является предоставление способов индуцирования иммунного ответа против раков, которые включают в себя способы введения веществ или композиций, содержащих FOXM1 или фрагменты этого, полинуклеотиды, кодирующих FOXM1 или фрагменты этого, или экзосомы или АПК, представляющие FOXM1 или фрагменты этого.

Настоящее изобретение можно применять к любому заболеванию, связанному со сверхэкспрессией FOXM1, включая рак, такой как AML, рак мочевого пузыря, рак молочной железы, рак шейки матки, холангиоцеллюлярный рак, CML, колоректальный рак, рак пищевода, рак желудка, рак желудка диффузного типа, рак печени, NSCLC, лимфома, остеосаркома, рак яичников, рак поджелудочной железы, рак предстательной железы, почечная карцинома, мелкоклеточный рак легкого, опухоль мягких тканей и опухоль яичка.

Следует понимать, что как предшествующее краткое описание настоящего изобретения, так и следующее ниже подробное описание представляют собой типичные варианты осуществления и не ограничивают настоящее изобретение или других альтернативных вариантов осуществления настоящего изобретения.

Краткое описание чертежей

Различные аспекты и приложения настоящего изобретения станут очевидными для любого специалиста в данной области после рассмотрения краткого описания фигур и подробного описания настоящего изобретения и его предпочтительных вариантов осуществления, которые следуют.

[фиг.1a-f] Фиг.1 показывает фотографии, демонстрирующие результаты интерферон-гамма ELISPOT-анализа на ЦТЛ, индуцированных пептидами, полученными из FOXM1. ЦТЛ в лунках с номерами #1, #4 и #7, стимулированные пептидами FOXM1-А24-9-262(SEQ ID NO: 2) (a), #7 - FOXM1-А24-9-351(SEQ ID NO: 7) (b), #5 - FOXM1-А24-9-57(SEQ ID NO: 8) (c), #3 - FOXM1-А24-10-240(SEQ ID NO: 16) (d), #6 - FOXM1-А24-10-318(SEQ ID NO: 25) (e) и #4 - FOXM1-А24-10-390(SEQ ID NO:30) (f), продемонстрировали сильное продуцирование интерферона-гамма по сравнению с контролем, соответственно.

[фиг. 1g-h] ЦТЛ в лунках с номерами #4 с FOXM 1-А24-10-238(SEQ ID NO:31) (g) продемонстрировали сильное продуцирование интерферона-гамма по сравнению с контролем, соответственно. Наоборот, в качестве типичного случая отрицательных данных, не было показано специфическое продуцирование интерферона-гамма от ЦТЛ, стимулированных пептидом FOXM1-А24-9-316(SEQ ID NO: 1) против подвергнутых импульсному взаимодействию с пептидом клеток-мишеней (h). На фигурах, «+» указывает на продуцирование интерферона-гамма против клеток-мишеней, подвергнутых импульсному воздействию с соответствующим пептидом, и «-» указывает на продуцирование интерферона-гамма против клеток-мишеней, не подвергнутых импульсному воздействию никаким пептидом. Площадь лунки этих изображений показывает, что клетки из соответствующих лунок были размножены, чтобы образовать линии ЦТЛ.

[фиг.2] Фигура 2 показывает линейные графики, демонстрирующие продуцирование интерферона-гамма линиями ЦТЛ, стимулированными пептидами FOXM1-А24-9-262(SEQ ID NO: 2) (a), FOXM1-А24-10-240(SEQ ID NO: 16) (b), FOXM1-А24-10-318(SEQ ID NO: 25) (c) и FOXM1-А24-10-238(SEQ ID NO:31) (d), детектируемое при помощи интерферон-гамма ИФА-анализа. Она продемонстрировала, что линии ЦТЛ, образованные путем стимулирования каждым пептидом, показали сильное продуцирование интерферона-гамма по сравнению с контролем. На фигурах, «+» указывает на продуцирование интерферона-гамма против клеток-мишеней, подвергнутых импульсному воздействию с соответствующим пептидом, и «-» указывает на продуцирование интерферона-гамма против клеток-мишеней, не подвергнутых импульсному воздействию никаким пептидом.

[фиг.3] Фигура 3 демонстрирует продуцирование интерферона-гамма клонами ЦТЛ, образованными ограниченным разведением из линий ЦТЛ, стимулированных пептидами FOXM1-А24-9-262(SEQ ID NO: 2) (a), FOXM1-А24-10-240(SEQ ID NO: 16) (b) и FOXM1-А24-10-238(SEQ ID NO: 31) (c). Она продемонстрировала, что линии ЦТЛ, образованные путем стимулирования каждым пептидом, показали сильное продуцирование интерферона-гамма по сравнению с контролем. На фигурах, «+» указывает на продуцирование интерферона-гамма против клеток-мишеней, подвергнутых импульсному воздействию с соответствующим пептидом, и «-» указывает на продуцирование интерферона-гамма против клеток-мишеней, не подвергнутых импульсному воздействию никаким пептидом.

[фиг.4] Фигура 4 показывает линейные графики, демонстрирующие специфическую ЦТЛ-активность в отношении клеток-мишеней, которые экзогенно экспрессируют FOXM1 и HLA-A*2402. Клетки COS7, трансфицированные HLA-A*2402 или полноразмерным геном FOXM1, были подготовлены в качестве контроля. Клон ЦТЛ, образованный с пептидом FOXM1-А24-9-262(SEQ ID NO: 2), демонстрировал специфическую ЦТЛ-активность в отношении клеток COS7, трансфицированных как FOXM1, так и HLA-A*2402 (черный ромб). С другой стороны, не было зафиксировано никакой значительной специфической ЦТЛ-активности в отношении клеток-мишеней, экспрессирующих либо HLA-A*2402 (белый треугольник), либо FOXM1 (белый круг).

Описание вариантов осуществления

Несмотря на то что любые способы и материалы, аналогичные или эквивалентные тем, которые описаны в настоящем документе, могут быть использованы в практике или тестировании вариантов осуществления настоящего изобретения, сейчас описываются предпочтительные способы, приборы и материалы. При этом до описания настоящих материалов и способов следует понимать, что настоящее изобретение не ограничивается конкретными размерами, формами, величинами, материалами, методиками, протоколами и т.п., описанными в данном документе, поскольку они могут меняться в соответствии со стандартным экспериментированием и оптимизацией. Следует также понимать, что терминология, используемая при описании, предназначена лишь для целей описания конкретных версий или вариантов осуществления и не предназначена для ограничения объема настоящего изобретения, который ограничивается только прилагаемыми пунктами формулы изобретения.

Раскрытие каждой публикации, патента или заявки на патент, упомянутых в данном описании, специально включено здесь посредством ссылки в полном объеме. При этом ничто в настоящем документе не может быть истолковано в качестве признания того, что настоящее изобретение не дает права датировать более ранним числом такое раскрытие на основании изобретения или до изобретения.

В случае конфликта настоящее описание, включая определения, должно являться определяющим. Кроме того, материалы, способы и примеры приведены только в качестве иллюстрации и не предназначены для ограничения.

I. Определения

Формы единственного числа, как используется здесь, означают «по меньшей мере один», если иное специально не указано.

Термины «полипептид», «пептидные» и «белок» используются взаимозаменяемо в данном документе по отношению к полимеру из аминокислотных остатков. Термины относятся к аминокислотным полимерам, в которых один или несколько аминокислотных остатков представляет собой модифицированный остаток или не встречающийся в природе остаток, такой как искусственный химический миметик соответствующей аминокислоты естественного происхождения, а также к аминокислотным полимерам естественного происхождения.

Термин «аминокислоты», как используется здесь, относится к аминокислотам естественного происхождения и синтетическим аминокислотам, а также к аналогам аминокислот и миметикам аминокислот, которые функционируют аналогично аминокислотам естественного происхождения. Аминокислоты естественного происхождения представляют собой аминокислоты, кодируемые генетическим кодом, а также аминокислоты, модифицированные после трансляции в клетках (например, гидроксипролин, гамма-карбоксиглутаминовая кислота, и О-фосфосерин). Выражение «аминокислотный аналог» относится к соединениям, которые обладают той же основной химической структурой (альфа-углеродный атом, связанный с водородом, карбоксильная группа, аминогруппа и R-группа), что и у аминокислоты естественного происхождения, но имеет модифицированную R-группу или модифицированный каркас (например, гомосерин, альфа-аминокапроновая кислота, метионин, сульфоксид, метионинметилсульфоний). Выражение «миметик аминокислоты» относится к химическим соединениям, которые имеют отличные структуры, но аналогичные с обычными аминокислотами функции.

Аминокислоты могут называться здесь по их широко известным трехбуквенным символам или однобуквенными символами, рекомендованными Биохимической номенклатурной комиссией IUPAC-IUB.

Термины «ген», «полинуклеотидов», «нуклеотиды» и «нуклеиновые кислоты» используются взаимозаменяемо здесь и, если специально не указано, сходно с аминокислотами называют по их общепринятым однобуквенным кодам.

Если не определено иначе, термин «рак» относится к ракам, сверхэкспрессирующим ген FOXM1, примеры которых включают, в качестве неограничивающих примеров, AML, рак мочевого пузыря, рак молочной железы, рак шейки матки, холангиоцеллюлярный рак, CML, колоректальный рак, рак пищевода, рак желудка, рак желудка диффузного типа, рак печени, NSCLC, лимфома, остеосаркома, рак яичников, рак поджелудочной железы, рак предстательной железы, почечная карцинома, мелкоклеточный рак легкого, опухоль мягких тканей и опухоль яичка.

Если не определено иначе, термины «цитотоксический Т-лимфоцит», «цитотоксическая Т-клетка» и «ЦТЛ» используются взаимозаменяемо здесь, и, если иное специально не указано, относятся к подгруппе Т-лимфоцитов, которые способны распознавать «не свои» клетки (например, опухолевые клетки, инфицированные вирусом клетки) и индуцировать гибель таких клеток.

Если не определено иначе, все технические и научные термины, используемые в настоящем документе, имеют такой же смысл, как это обычно понимается любым специалистом в области, к которой относится настоящее изобретение.

II. Пептиды

Для демонстрации того, что пептиды, полученные из FOXM1, действуют в качестве антигенов, узнаваемых ЦТЛ, пептиды, полученные из FOXM1 (SEQ ID NO: 34) анализировали для определения того, представляли ли они собой антигенные эпитопы, рестриктированные по HLA-А24, которые представляют собой часто встречающиеся аллели HLA (Date Y et al., Tissue Antigens 47: 93-101, 1996; Kondo A et al., J Immunol 155: 4307-12, 1995; Kubo RT et al., J Immunol 152: 3913-24, 1994).

HLA-А24-связывающие подходящие пептиды, полученные из FOXM1, определяли по их аффинности связывания с HLA-А24. Следующие пептиды представляют собой подходящие пептиды:

После стимуляции Т-клеток in vitro дендритными клетками (ДК), нагруженными этими пептидами, были успешно образованы ЦТЛ с использованием каждого из следующих пептидов:

Эти образованные ЦТЛ демонстрируют сильную специфическую ЦТЛ-активность в отношении клеток-мишеней, подвергавшихся импульсному взаимодействию с соответствующими пептидами. Эти результаты показывают, что FOXM1 представляет собой антиген, узнающийся ЦТЛ, и что проверенные пептиды являются эпитопными пептидами FOXM1, рестриктированными по HLA-А24.

Поскольку ген FOXM1 сверхэкспрессируется в раковых клетках, таких как AML, рак мочевого пузыря, рак молочной железы, рак шейки матки, холангиоцеллюлярный рак, CML, колоректальный рак, рак пищевода, рак желудка, рак желудка диффузного типа, рак печени, NSCLC, лимфома, остеосаркома, рак яичников, рак поджелудочной железы, рак предстательной железы, почечная карцинома, мелкоклеточный рак легкого, опухоль мягких тканей и опухоль яичка, и не экспрессируется в большинстве нормальных органов, он представляет собой хорошую мишень для иммунотерапии. Таким образом, настоящее изобретение предоставляет нанопептиды (пептиды, состоящие из девяти аминокислотных остатков), и декапептиды (пептиды, состоящие из десяти аминокислотных остатков), соответствующие ЦТЛ-распознаваемым эпитопам FOXM1. Альтернативно, настоящее изобретение предоставляет выделенный пептид, который связывается с HLA-антигеном и индуцирует цитотоксические Т-лимфоциты (ЦТЛ), где пептид состоит из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 34 или является ее иммунологически активным фрагментом. Предпочтительные примеры нанопептидов и декапептидов по настоящему изобретению включают те пептиды, которые состоят из аминокислотной последовательности, выбранной из SEQ ID NO: 2, 7, 8, 16, 25, 30 и 31.

В большинстве случаев можно использовать программы из системы программного обеспечения, доступные, например, в Интернете, такие как программы, описанные в in Parker КС et al, J Immunol 1994 Jan 1, 152(1): 163-75, Buus et al. (Tissue Antigens., 62:378-84, 2003) и Nielsen et al. (Protein Sci, 12:1007-17, 2003, Bioinformatics, 20(9): 1388-97, 2004), для расчета аффинностей связывания между различными пептидами и HLA-антигенами in silico. Аффинность связывания с HLA-антигенами можно определять, как описано, например, в ссылках на Parker KC et al., J Immunol 1994 Jan 1, 152(1): 163-75; и Kuzushima K et al., Blood 2001, 98(6): 1872-81. Способы определения аффинности связывания описаны, например, в: Journal of Immunological Methods, 1995, 185: 181-190; Protein Science, 2000, 9: 1838-1846. Вследствие этого с помощью таких программ из системы программного обеспечения можно выбрать фрагменты, полученные из FOXM1, которые обладают высокой аффинностью связывания с HLA-антигенами. Таким образом, настоящее изобретение охватывает пептиды, состоящие из любых фрагментов, полученные из FOXM1, которые связываются с HLA-антигенами, выявленными с помощью таких известных программ. Пептидом по настоящему изобретению может являться пептид, состоящий из полноразмерного FOXM1.

Пептиды по настоящему изобретению могут быть фланкированы дополнительными аминокислотными остатками, при условии, что получающийся пептид сохраняет свою способность индуцировать ЦТЛ. Аминокислотные остатки, фланкирующие настоящие пептиды, могут состоять из любых видов аминокислот, при условии, что они не влияют на способность исходного пептида индуцировать ЦТЛ. Таким образом, настоящее изобретение охватывает пептиды, которые включают в себя пептиды, полученные из FOXM1, и обладают аффинностью связывания с HLA-антигенами. В основном такие пептиды меньше, чем около 40 аминокислот, часто меньше, чем около 20 аминокислот, и обычно меньше, чем около 15 аминокислот.

В большинстве случаев, модификация одного, двух или нескольких аминокислот в пептиде не будет влиять на функцию пептида, а в некоторых случаях будет даже усиливать нужную функцию исходного пептида. В самом деле, модифицированные пептиды (т.е., пептиды, состоящие из последовательности аминокислот, в которой один, два или несколько аминокислотных остатков были модифицированы (т.е., заменены, удалены, добавлены или встроены по сравнению с исходной контрольный последовательностью), как известно, сохраняют биологическую активность исходного пептида (Mark et al., Proc Natl Acad Sci USA 1984, 81: 5662-6; Zoller and Smith, Nucleic Acids Res 1982, 10: 6487-500; Dalbadie-McFarland et al., Proc Natl Acad Sci USA 1982, 79: 6409-13). Таким образом, в одном варианте осуществления пептиды по настоящему изобретению могут обладать как способностью индуцировать ЦТЛ, так и аминокислотной последовательностью, выбранной из SEQ ID NO: 2, 7, 8, 16, 25, 30 и 31, где добавлена, встроена и/или заменена одна, две или даже несколько аминокислот.

Специалисты в данной области признают, что отдельные добавления или замены в аминокислотной последовательности, которые изменяют одну аминокислоту или небольшой процент аминокислот, имеют тенденцию к сохранению свойств боковой цепи исходной аминокислоты. Как таковые, их часто называют «консервативными заменами», или «консервативными модификациями», при которых изменение белка дает в результате модифицированный белок, имеющих функции, аналогичные функциям исходного белка. В рассматриваемой области известны списки консервативных замен, обеспечивающих функционально сходные аминокислоты. Примеры особенностей боковых цепей аминокислот, желательных для консервативности, включают, например, гидрофобные аминокислоты (A, I, L, M, F, P, W, Y, V), гидрофильные аминокислоты (R, D, N, C, E, Q, G, H, K, S, T), и боковые цепи, имеющие следующие общие функциональные группы или характеристики: алифатическая боковая цепь (G, A, V, L, I, P); боковая цепь, содержащая гидроксильную группу (S, T, Y); боковая цепь, содержащая атом серы (C, M); боковая цепь, содержащая карбоновую кислоту и амид (D, N, E, Q); боковая цепь, содержащая основание (R, K, H); и боковая цепь, содержащая ароматическую группу (H, F, Y, W). Кроме того, каждая из следующих восьми групп содержит аминокислоты, которые в рассматриваемой области принимаются в качестве консервативных замен друг для друга:

1) Аланин (А), Глицин (G);

2) Аспарагиновая кислота (D), Глутаминовая кислота (E);

3) Аспарагин (N), Глутамин (Q); 4) Аргинин (R), Лизин (K);

5) Изолейцин (I), Лейцин (L), Метионин (M), Валин (V);

6) Фенилаланин (F), Тирозин (Y), Триптофан (W);

7) Серин (S), Треонин (T); и

8) Цистеин (C), Метионин (М) (см., например, Creighton, Proteins 1984).

Такие консервативно модифицированные пептиды рассматриваются также как пептиды по настоящему изобретению. При этом пептиды по настоящему изобретению не ограничиваются этим и могут включать неконсервативные модификации, при условии, что модифицированный пептид сохраняет способность индуцировать ЦТЛ исходного пептида. Более того, модифицированные пептиды не должны исключать ЦТЛ-индуцирующих пептидов полиморфных вариантов, межвидовых гомологов и аллелей FOXM1.

Для сохранения необходимой способности индуцировать ЦТЛ можно изменять (вставлять, удалять, добавлять и/или заменять) небольшое число (например, 1, 2 или несколько) или небольшой процент аминокислот. В настоящем документе термин «несколько» означает 5 или меньше аминокислот, например, 4, 3 или меньше. Доля аминокислот, подлежащих модифицированию, составляет предпочтительно 20% или меньше, более предпочтительно 15% или меньше, даже более предпочтительно 10% или меньше, или от 1% до 5%.

Более того, в пептидах по настоящему изобретению можно встраивать, замещать или добавлять аминокислотные остатки, или аминокислотные остатки можно удалять для обеспечения более высокой аффинности связывания. При использовании в контексте иммунотерапии, настоящие пептиды должны быть представлены на поверхности клетки или экзосомы, предпочтительно в качестве комплекса с HLA-антигеном. В дополнение к пептидам, которые обнаруживаются в природе, поскольку закономерность последовательностей пептидов, обнаруживаемых путем связывания с HLA-антигенами, уже известна (J Immunol 1994 года, 152: 3913; Immunogenetics 1995, 41: 178; J Immunol 1994 г., 155: 4307), модификации, основанные на такой закономерности, можно вводить в иммуногенные пептиды по настоящему изобретению. Например, для увеличения HLA-А24-связывания может быть желательна замена второй с N-конца аминокислоты фенилаланином, тирозином, метионином или триптофаном, и/или аминокислоты на C-конце фенилаланином, лейцином, изолейцином, триптофаном или метионином. Таким образом, пептиды, имеющие аминокислотные последовательности, выбранные из группы, состоящей из SEQ ID NO: 2, 7, 8, 16, 25, 30 и 31, где вторая аминокислота с N-конца аминокислотной последовательности SEQ ID NO заменяется фенилаланином, тирозином, метионином или триптофаном, и пептидами, и/или где C-конец аминокислотной последовательности SEQ ID NO заменяется фенилаланином, лейцином, изолейцином, триптофаном или метионином, охватываются настоящим изобретением.

Настоящее изобретение также рассматривает добавление одной, двух или нескольких аминокислот с N- и/или C-конца описанных пептидов. Такие модифицированные пептиды, обладающие высокой аффинностью связывания с HLA-антигеном и сохранившие способность индуцировать ЦТЛ, также включены в настоящее изобретение.

При этом в случае, когда пептидная последовательность идентична части аминокислотной последовательности эндогенного или экзогенного белка, имеющего отличные функции, могут индуцироваться побочные эффекты, такие как аутоиммунные расстройства и/или аллергические симптомы по отношению к определенным веществам. Поэтому предпочтительно сначала провести поиски гомологий с использованием имеющихся баз данных, чтобы избежать ситуации, при которой последовательность пептида соответствует аминокислотной последовательности другого белка. В случае, когда из поисков гомологий становится ясно, что не существует пептид даже с отличиями в 1 или 2 аминокислоты по сравнению с реальным пептидом, реальный пептид можно изменить в целях повышения его аффинности связывания с HLA-антигенами, и/или увеличения его способности индуцировать ЦТЛ без какой-либо опасности таких побочных эффектов.

Несмотря на то что ожидается, что пептиды, обладающие высокой аффинностью связывания с HLA-антигенами, как описано выше, будут очень эффективными, подходящие пептиды, которые выбирают в зависимости от наличия высокой аффинности связывания в качестве индикатора, дополнительно проверяют на наличие способности индуцировать ЦТЛ. В настоящем документе выражение «способность индуцировать ЦТЛ» указывает на способность пептида индуцировать ЦТЛ, в случае представленности на антигенпредставляющих клетках (АПК). Кроме того, «способность индуцировать ЦТЛ» включает в себя способность пептида индуцировать активацию ЦТЛ, пролиферацию ЦТЛ, способствовать ЦТЛ-лизису клеток-мишеней и увеличивать продукцию гамма-интерферона ЦТЛ.

Подтверждение способности индуцировать ЦТЛ достигается путем индуцирования АПК, несущих ГКГС-антигены человека (например, B-лимфоцитов, макрофагов и дендритных клеток (ДК)), или, более конкретно, ДК, полученных из мононуклеарных лейкоцитов периферической крови человека, и после стимуляции пептидами, смешивания с CD8-положительными клетками, а затем измерения гамма-интерферона, продуцированного и высвобожденного цитотоксическими Т-лимфоцитами против клеток-мишеней. В качестве реакционной системы можно использовать трансгенных животных, которые были выведены для экспрессии HLA-антигена человека (например, те, которые описаны в BenMohamed L, Krishnan R, Longmate J, Auge C, Low L, Primus J, Diamond DJ, Hum Immunol 2000 Aug, 61(8): 764-79, родственные статьи, книги Linkout Induction of CTL response by a minimal epitope vaccine in HLA A*0201/DRl transgenic mice: dependence on HLA class II restricted T(H) response. Например, клетки-мишени можно метить радиоактивным изотопом ⁵¹Cr и подобным, и цитотоксическую активность можно рассчитать по радиоактивности, высвобожденной из клетки-мишени. Альтернативно, способность индуцировать ЦТЛ можно оценивать путем определения гамма-интерферона, продуцированного и высвобожденного ЦТЛ в присутствии АПК, которые несут иммобилизованные пептиды, и визуализации зоны ингибирования на среде с помощью моноклональных антител против IFN-гамма.

Как результат проверки способности пептидов индуцировать ЦТЛ, как описано выше, было обнаружено, что нонапептиды или декапептиды, выбранные из пептидов, состоящих из аминокислотных последовательностей, показанных SEQ ID NO: 2, 7, 8, 16, 25, 30 и 31, демонстрировали чрезвычайно высокую способность индуцировать ЦТЛ, а также высокую аффинность связывания с HLA-антигеном. Таким образом, эти пептиды являются примером предпочтительного варианта осуществления настоящего изобретения.

Более того, результаты анализа гомологий показали, что эти пептиды не имеют значительной гомологии с пептидами, полученными от любых других известных генных продуктов человека. Это снижает возможность неизвестных или нежелательных иммунных реакций в случае применения для иммунотерапии. В силу вышесказанного, и с этой точки зрения эти пептиды находят применение для вызывания иммунитета против FOXM1 у больных раком. Итак, пептиды по настоящему изобретению, предпочтительно, пептиды, состоящие из последовательности аминокислот, выбранных из группы, состоящей из SEQ ID NO: 2, 7, 8, 16, 25, 30 и 31.

В дополнение к модификации настоящих пептидов, рассмотренных выше, описанные пептиды дополнительно могут быть связаны с другими веществами, при условии, что они сохраняют способность индуцировать ЦТЛ исходного пептида. К типичным веществам относятся: белки, пептиды, липиды, сахара и цепи сахаров, ацетильные группы, природные и синтетические полимеры и др. Настоящие пептиды могут содержать модификации, такие как гликозилирование, окислении боковой цепи и/или фосфорилирование; при условии, что модификации не уничтожают биологическую активность исходного пептида. Такие типы модификаций могут придавать дополнительные функции (например, функции мишени и функции доставки) и/или стабилизировать пептиды.

Например, для увеличения стабильности полипептида in vivo, как известно в рассматриваемой области, вводятся D-аминокислоты, миметики аминокислоты или аминокислоты, отсутствующие в природе; эта концепция также может быть принята для настоящих полипептидов. Стабильность полипептида можно определить рядом способов. Например, для проверки стабильности можно использовать пептидазы и различные биологические среды, такие как сыворотка и плазма крови человека (смотри, например, Verhoef et al., Eur J Drug Metab Pharmacokin 1986, 11: 291-302).

Более того, как отмечалось выше, среди модифицированных пептидов, которые подвергались заменам, удалениям или добавлениям одного, двух или нескольких аминокислотных остатков, можно проводить скрининг или отбирать пептиды, обладающие той же или более высокой активностью по сравнению с исходными пептидами. Вследствие этого настоящее изобретение также предоставляет способ скрининга и отбора модифицированных пептидов, обладающих той же или более высокой активностью по сравнению с исходными. Например, способ может включать в себя стадии:

а: замена, удаление или добавление, по меньшей мере, одного аминокислотного остатка у пептида по настоящему изобретению:,

b: определение активности указанного пептида:,

c: отбор пептида, обладающего той же или более высокой активностью по сравнению с исходным.

Здесь, пептиды по настоящему изобретению также могут описываться как «пептид(ы) FOXM1» или «полипептид(ы) FOXM1».

III. Подготовка пептидов FOXM1

Пептиды по настоящему изобретению можно подготовить с использованием известных способов. Например, пептиды можно подготовить синтетически, с помощью технологии рекомбинантных ДНК или химического синтеза. Пептиды по настоящему изобретению можно синтезировать по отдельности или в качестве больших полипептидов, состоящих из двух или нескольких пептидов. Затем пептиды можно выделить, т.е. очистить или отделить так, чтобы в существенной степени освободить от других природных белков клеток-хозяев и их фрагментов, или каких-либо других химически