Способ и устройство для изготовления сахарного раствора

Способ и устройство для изготовления сахарного раствора

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Область техники

Настоящее изобретение относится к способу изготовления сахарного раствора из целлюлозы и к устройству для этого способа.

Уровень техники

Способы ферментативного производства химических продуктов с использованием сахаров в качестве исходных материалов применяют для изготовления разнообразных промышленных материалов. В настоящее время в качестве сахаров, используемых как исходные материалы для ферментации, в промышленности применяют сахара, полученные из пищевых материалов, таких как сахарный тростник, крахмал и сахарная свекла. Однако, учитывая, что ожидается увеличение цен на продукты питания вследствие грядущего роста мирового населения, или что с этической точки зрения сахара как промышленные материалы могут конкурировать с сахарами как продуктами питания, в будущем должен быть разработан способ эффективного производства сахарного раствора из возобновляемых непищевых ресурсов, то есть содержащей целлюлозу биомассы, или способ использования полученного сахарного раствора как исходный материал для ферментации в целях эффективной переработки сахарного раствора в промышленные материалы.

Примеры описанных способов изготовления сахарного раствора из содержащей целлюлозу биомассы включают способы изготовления сахарных растворов путем кислотного гидролиза целлюлозы и гемицеллюлозы с использованием концентрированной серной кислоты (патентные документы 1 и 2) и способ, в котором содержащую целлюлозу биомассу подвергают гидролитической обработке, используя разбавленную серную кислоту, и затем подвергают ферментативной обработке целлюлазой или аналогичным ферментом для получения сахарного раствора (непатентный документ 1). Кроме того, примеры описанных способов без использования кислоты включают способ, в котором содержащую целлюлозу биомассу гидролизуют, используя докритическую воду при температуре, составляющей приблизительно от 250°C до 500°C, для изготовления сахарного раствора (патентный документ 3), способ, в котором содержащую целлюлозу биомассу подвергают обработке докритической водой и затем ферментативной обработке для получения сахарного раствора (патентный документ 4), и способ, в котором содержащую целлюлозу биомассу подвергают гидролитической обработке сжатой горячей водой при температуре от 240°C до 280°C и затем ферментативной обработке для получения сахарного раствора (патентный документ 5).

В последние годы всесторонне исследуют способы гидролиза биомассы, которые используют меньше энергии и оказывают меньшее воздействие на окружающую среду, но обеспечивают высокие выходы сахара. Однако указанные способы с использованием ферментов имеют недостаток, который заключается в высокой стоимости ферментов.

Для решения этих технических проблем предложены способы извлечения и повторного использования ферментов, применяемых в гидролизе. Примеры таких описанных способов включают способ, в котором непрерывное разделение твердых и жидких фаз осуществляют, используя центробежный фильтр, и полученный сахарный раствор фильтруют через ультрафильтрационную мембрану для извлечения ферментов (патентный документ 6), способ, в котором поверхностно-активное вещество поступает на стадии ферментативного осахаривания для подавления адсорбции фермента, и в результате этого повышается эффективность извлечения (патентный документ 7), способ, в котором остаток, полученный ферментативным осахариванием, подвергают электрической обработке для извлечения ферментативного компонента (патентный документ 8), и способ, в котором остаток, полученный ферментативным осахариванием, снова поступает в следующую партию биомассы, и в результате чего повторно используются ферменты (патентный документ 9).

Документы уровня техники

Патентные документы

Патентный документ 1: японская переведенная выложенная патентная заявка согласно PCT № 11- 506934

Патентный документ 2: японский патент № 2005-229821 A

Патентный документ 3: японский патент № 2003-212888 A

Патентный документ 4: японский патент № 2001-95597 A

Патентный документ 5: японский патент № 3041380 B

Патентный документ 6: японский патент № 2006-87319

Патентный документ 7: японский патент № 63-87994 A

Патентный документ 8: японский патент № 2008-206484 A

Патентный документ 9: японский патент № 55-144885 A

Непатентные документы

Непатентный документ 1: A. Aden и др. «Проект переработки лигноцеллюлозной биомассы в этанол и экономика с использованием прямоточного предварительного гидролиза разбавленной кислотой и ферментативного гидролиза для кукурузной соломы», технический отчет NREL, 2002 г.

Сущность изобретения

Проблемы, решаемые изобретением

Разработаны описанные выше способы производства сахарных растворов путем извлечения/повторного использования фермента, но эффекты этих способов оказались недостаточными с точки зрения уменьшения количества используемого фермента. Таким образом, цель настоящего изобретения заключается в том, чтобы разработать способ, в котором эффект уменьшения количества фермента превышает уровни, достигнутые в традиционных способах.

Средства решения проблем

Авторы настоящего изобретения проводили интенсивные исследования для решения вышеуказанных проблем и в результате изобрели способ гидролиза целлюлозы с использованием мицелиальной полученной из грибов целлюлазы в качестве карбогидразы, и этот способ включает: стадию добавления карбогидразы к целлюлозе для осуществления первичного гидролиза и последующего подвергания первичного гидролизата разделению твердых и жидких фаз для получения первичного сахарного раствора и твердых веществ; стадию добавления воды к твердым веществам и осуществления вторичного гидролиза с последующим подверганием вторичного гидролизата разделению твердых и жидких фаз для получения вторичного сахарного раствора и остатка; и стадию фильтрования первичного сахарного раствора и/или вторичного сахарного раствора через ультрафильтрационную мембрану и извлечения карбогидразы на стороне подачи и извлечения сахарного раствора на стороне фильтрата.

Таким образом, настоящее изобретение содержит перечисленные ниже компоненты (1)-(13).

(1) Способ изготовления сахарного раствора с использованием в качестве карбогидразы полученной из мицелиальных грибов целлюлазы для гидролиза целлюлозы, причем способ включает:

стадию добавления указанной карбогидразы к целлюлозе для осуществления первичного гидролиза и последующего подвергания первичного гидролизата разделению твердых и жидких фаз для получения первичного сахарного раствора и твердых веществ;

стадию добавления воды к твердым веществам и осуществления вторичного гидролиза с последующим подверганием вторичного гидролизата разделению твердых и жидких фаз для получения вторичного сахарного раствора и остатка; и

стадию фильтрования первичного сахарного раствора и/или вторичного сахарного раствора через ультрафильтрационную мембрану, извлечения карбогидразы на стороне подачи и извлечения сахарного раствора на стороне фильтрата.

(2) Способ изготовления сахарного раствора по п. (1), в котором полученная из мицелиальных грибов целлюлаза представляет собой полученную из грибов Trichoderma целлюлазу.

(3) Способ изготовления сахарного раствора по п. (1) или (2), в котором целлюлозу получают из обработанного продукта, полученного из биомассы аммиачной обработкой, гидротермальной обработкой или обработкой разбавленной серной кислотой.

(4) Способ изготовления сахарного раствора по любому из пп. (1)-(3), в котором вторичный гидролиз представляет собой гидролиз в присутствии одного или более веществ, выбранных из группы, которую составляют неорганические соли (за исключением солей кальция), гидрофильные органические растворители, аминокислоты и неионные поверхностно-активные вещества, и сахарные растворы, включающие эти вещества.

(5) Способ изготовления сахарного раствора по п. (4), в котором неорганическая соль (неорганические соли) (за исключением солей кальция) представляет(-ют) собой одно или более веществ, выбранных из группы, которую составляют соли натрия, соли калия, соли магния, соли серной кислоты, соли аммония, соли хлористоводородной кислоты, соли фосфорной кислоты, соли уксусной кислоты и соли азотной кислоты.

(6) Способ изготовления сахарного раствора по п. (5), в котором неорганическая соль (неорганические соли) (за исключением солей кальция) представляет(-ют) собой одно или более веществ, выбранных из группы, которую составляют хлорид натрия, ацетат натрия, сульфат натрия, гидросульфат натрия, дигидрофосфат натрия, гидрофосфат натрия, хлорид калия, хлорид аммония, гидрофосфат калия, сульфат аммония, хлорид магния и сульфат магния.

(7) Способ изготовления сахарного раствора по п. (4), в котором гидрофильный органический растворитель (гидрофильные органические растворители) представляет(-ют) собой одно или более веществ, выбранных из группы, которую составляют метанол, этанол, 1-пропанол, изопропанол, N,N-диметилформамид, бутанол, ацетон, ацетонитрил, этиленгликоль и глицерин.

(8) Способ изготовления сахарного раствора по п. (4), в котором аминокислота (аминокислоты) представляет(-ют) собой одно или более веществ, выбранных из группы, которую составляют аргинин, цистеин, глютаминовая кислота, гистидин и лизин.

(9) Способ изготовления сахарного раствора по любому из пп. (1)-(8), в котором разделение твердых и жидких фаз первичного гидролизата и/или вторичного гидролизата представляет собой пресс-фильтрацию.

(10) Способ изготовления сахарного раствора по любому из пп. (1)-(9), причем способ включает стадию фильтрования сахарного раствора через обратноосмотическую мембрану и/или нанофильтрационную мембрану для концентрирования сахарного раствора.

(11) Устройство для способа изготовления сахарного раствора по любому из пп. (1)-(10), причем устройство включает в качестве компонентов реакционный бак с мешалкой для первичного гидролиза; устройство для разделения твердых и жидких фаз; бак вторичного гидролиза или пресс-фильтр для вторичного гидролиза; устройство (устройства) разделения твердых и жидких фаз для первичного гидролизата и/или вторичного гидролизата; и устройство с ультрафильтрационной мембраной для отделения карбогидразы и сахарного раствора от первичного сахарного раствора и/или вторичного сахарного раствора.

(12) Устройство для способа изготовления сахарного раствора по любому из пп. (1)-(10), причем устройство включает в качестве компонентов реакционный бак для первичного гидролиза; пресс-фильтр, содержащий питающий бак с теплой водой; циркуляционную линию для циркуляции фильтрата из пресс-фильтра в питающий бак с теплой водой; и устройство с ультрафильтрационной мембраной для отделения карбогидразы и сахарного раствора от первичного сахарного раствора и/или вторичного сахарного раствора.

(13) Устройство по п. (11) или (12), включающее в качестве компонента устройство концентрирования сахарного раствора, снабженное обратноосмотической мембраной и/или нанофильтрационной мембраной для концентрирования сахарного раствора, полученного с помощью устройства с ультрафильтрационной мембраной.

Эффект изобретения

В настоящем изобретении после первичного гидролиза следует разделение твердых и жидких фаз, и остаточные ферментативные компоненты, содержащиеся в полученных твердых веществах, используют для осуществления вторичного гидролиза. Так создается 1) эффект увеличения выхода сахара и 2) эффект увеличения извлеченного количества фермента. Таким образом, настоящее изобретение имеет экономическое преимущество по сравнению с традиционными технологиями.

Краткое описание чертежей

Фиг. 1 представляет схематический чертеж, изображающий вариант осуществления способа изготовления сахарного раствора по изобретению.

Фиг. 2 представляет схематический чертеж, изображающий вариант осуществления устройства для осуществления способа изготовления сахарного раствора по изобретению.

Фиг. 3 представляет схематический чертеж, изображающий вариант осуществления устройства для осуществления способа изготовления сахарного раствора по изобретению.

Фиг. 4 представляет схематический чертеж, изображающий вариант осуществления, в котором вторичный гидролиз в способе изготовления сахарного раствора по изобретению осуществляют в камере пресс-фильтра.

Фиг. 5 представляет схематический чертеж, изображающий вариант осуществления устройства для осуществления способа изготовления сахарного раствора по изобретению.

Фиг. 6 представляет схематический чертеж, изображающий вариант осуществления устройства для осуществления способа изготовления сахарного раствора по изобретению.

Фиг. 7 представляет схематический чертеж, изображающий вариант осуществления, в котором вторичный гидролиз в способе изготовления сахарного раствора по изобретению осуществляют в камере пресс-фильтра.

Фиг. 8 представляет схематический чертеж, изображающий вариант осуществления устройства для осуществления способа изготовления сахарного раствора по изобретению.

Фиг. 9 представляет чертеж, изображающий результаты анализа фермента, содержащегося во вторичном сахарном растворе, полученном способом изготовления сахарного раствора по изобретению.

Фиг. 10 представляет схематический чертеж, изображающий вариант осуществления, в котором вторичный гидролиз в способе изготовления сахарного раствора по изобретению осуществляют в баке вторичного гидролиза, который отделен от бака первичного гидролиза.

Фиг. 11 представляет схематический чертеж, изображающий вариант осуществления, в котором вторичный гидролиз в способе изготовления сахарного раствора по изобретению осуществляют в баке вторичного гидролиза, который отделен от бака первичного гидролиза.

Фиг. 12 представляет схематический чертеж, изображающий вариант осуществления, в котором вторичный гидролиз в способе изготовления сахарного раствора по изобретению осуществляют в баке вторичного гидролиза, который отделен от бака первичного гидролиза.

Фиг. 13 представляет схематический чертеж, изображающий вариант осуществления, в котором первичный гидролиз и вторичный гидролиз в способе изготовления сахарного раствора по изобретению осуществляют в одном баке.

Фиг. 14 представляет схематический чертеж, изображающий вариант осуществления, в котором устройство с микрофильтрационной мембраной установлено выше по потоку относительно устройства с ультрафильтрационной мембраной.

Фиг. 15 представляет схематический чертеж, изображающий вариант осуществления, в котором фильтрование в поперечном потоке осуществляют, используя микрофильтрационный мембранный модуль.

Фиг. 16 представляет схематический чертеж, изображающий вариант осуществления, в котором тупиковое фильтрование осуществляют, используя микрофильтрационный мембранный модуль.

Наилучший способ осуществления изобретения

Большие количества целлюлозных материалов содержат травяные биомассы, такие как багасса (выжимки от получения сахара из тростника), просо прутьевидное, слоновая трава, эриантус сахаристый, кукурузная солома, рисовая солома и пшеничная солома; и древесные биомассы, такие как деревья и отходы от строительных материалов. Эти содержащие целлюлозу биомассы можно предпочтительно использовать в качестве исходных материалов в настоящем изобретении.

Содержащая целлюлозу биомасса содержит, помимо целлюлозы и гемицеллюлозы (далее в настоящем документе используется общий термин «целлюлоза» для обозначения целлюлозы и гемицеллюлозы), лигнин и другие вещества, которые представляют собой ароматические макромолекулы. Таким образом, в тех случаях, когда полученную из биомассы целлюлозу используют в качестве исходного материала для сахарного раствора в способе изготовления сахарного раствора по изобретению, эффективность ферментативного гидролиза можно повышать посредством предварительной обработки. Примеры способов предварительной обработки содержащей целлюлозу биомассы включают кислотную обработку, обработку серной кислотой, обработку разбавленной серной кислотой, щелочную обработку, обработку гидроксидом натрия, аммиачную обработку, гидротермальную обработку, обработку докритической водой, пульверизационную обработку и паровую обработку. В настоящем изобретении, способ предварительной обработки предпочтительно представляет собой аммиачную обработку, гидротермальную обработку или обработку разбавленной серной кислотой.

Аммиачную обработку осуществляют согласно японским патентам № 2008-161125 и № 2008-535664 A. Например, к биомассе добавляют аммиак в концентрации, составляющей от 0,1 до 15 масс. %, и обработку осуществляют при температуре от 4 до 200°C, предпочтительно от 90 до 150°C. Добавляемый аммиак может находиться в состоянии жидкости или газа. Кроме того, форма добавляемого аммиака может представлять собой чистый аммиак или водный раствор аммиака. Кратность обработки не ограничена, и обработку можно осуществлять однократно или многократно. В частности, в тех случаях, когда обработку осуществляют два или большее число раз, условия первой обработки могут отличаться от условий второй и последующей обработок. Обработанный продукт, полученный посредством аммиачной обработки, необходимо направлять на нейтрализацию аммиака или удаление аммиака в целях дальнейшего осуществления реакции ферментативного гидролиза. Нейтрализацию аммиака можно осуществлять как после отделения твердых веществ от гидролизата путем разделения твердых и жидких фаз или в состоянии, в котором содержатся твердые вещества. Кислотный реагент, используемый для нейтрализации, не является ограниченным. Аммиак можно удалять, выдерживая обработанный аммиаком продукт при пониженном давлении, обеспечивая испарение аммиака и его переход в газообразное состояние. Отделенный аммиак можно извлекать и повторно использовать.

В случае обработки разбавленной серной кислотой концентрация серной кислоты составляет предпочтительно от 0,1 до 15 масс. %, предпочтительнее от 0,5 до 5 масс. %. Температуру реакции можно устанавливать в интервале от 100 до 300°C, и ее предпочтительно устанавливают в интервале от 120 до 250°C. Время реакции можно устанавливать в интервале от 1 секунды до 60 минут. Кратность обработки не является ограниченной, и можно осуществлять однократную или многократную обработку. В частности, в тех случаях, когда обработку осуществляют два или более раз, условия для первой обработки могут отличаться от условий для второй и последующей обработок. Поскольку гидролизат, полученный посредством обработки разбавленной серной кислотой, содержит кислоту, необходима нейтрализация для последующего осуществления реакции гидролиза с целлюлазой или в целях использования гидролизата в качестве исходного материала для ферментации.

В случае гидротермальной обработки воду добавляют таким образом, что содержащая целлюлозу биомасса составляет от 0,1 до 50 масс. %, и обработку затем осуществляют при температуре от 100 до 400°C в течение от 1 секунды до 60 минут. При осуществлении обработки в условиях такой температуры происходит гидролиз целлюлозы. Кратность обработки не является ограниченной, и можно осуществлять однократную или многократную обработку. В частности, в тех случаях, когда обработку осуществляют два или более раз, условия для первой обработки могут отличаться от условий для второй и последующей обработок.

Целлюлаза, используемая в настоящем изобретении, представляет собой полученную из мицелиальных грибов целлюлазу. Примеры мицелиальных грибов включают микроорганизмы, такие как Trichoderma, Aspergillus, Cellulomonas, Clostridium, Streptomyces, Humicola, Acremonium, Irpex, Mucor и Talaromyces. Поскольку эти микроорганизмы выделяют целлюлазу в культуральную среду, можно использовать культуральную среду, поскольку она представляет собой неочищенную полученную из мицелиальных грибов целлюлазу, или можно очищать культуральную среду и готовить составы для использования в виде смеси, содержащей полученную из мицелиальных грибов целлюлазу. В тех случаях, когда полученную из мицелиальных грибов целлюлазу используют в качестве очищенного и составленного продукта, можно добавлять помимо фермента другое вещество (другие вещества), такие как ингибитор протеазы, диспергатор, солюбилизатор и/или стабилизатор, для приготовления состава, содержащего целлюлазу.

Полученная из мицелиальных грибов целлюлаза, используемая в настоящем изобретении, предпочтительно представляет собой целлюлазу, которую выделяют грибы Trichoderma (далее в настоящем документе называется полученная из грибов Trichoderma целлюлаза). В настоящем изобретении полученная из грибов Trichoderma целлюлаза предпочтительно представляет собой целлюлазу, полученную из грибов Trichoderma reesei, и конкретные примеры предпочтительных микроорганизмов Trichoderma, из которых получают целлюлазу, включают Trichoderma reesei QM9414, Trichoderma reesei QM9123, Trichoderma reesei RutC-30, Trichoderma reesei PC3-7, Trichoderma reesei CL-847, Trichoderma reesei MCG77, Trichoderma reesei MCG80 и Trichoderma viride QM9123. Целлюлазу можно также получать из мутантного штамма, происходящего из описанных выше микроорганизмов Trichoderma, причем данный мутантный штамм получают путем мутагенеза, используя мутаген, ультрафиолетовое облучение или подобное средство, чтобы повысить способность производить целлюлазу.

Полученная из мицелиальных грибов целлюлаза представляет собой ферментативную композицию, включающую множество ферментативных компонентов, таких как целлобиогидролаза, эндоглюканаза, экзоглюканаза, β-глюкозидаза, ксиланаза и ксилозидаза, причем данная ферментативная композиция обладает активностью, чтобы гидролизовать и осахаривать целлюлозу. Поскольку полученная из мицелиальных грибов целлюлаза включает такое множество ферментативных компонентов и обеспечивает при разложении целлюлозы эффективный гидролиз целлюлозы вследствие их комбинированного эффекта или комплементарного эффекта, полученную из мицелиальных грибов целлюлазу предпочтительно используют в настоящем изобретении.

Целлобиогидролаза представляет собой общий термин для целлюлаз, которые гидролизуют целлюлозу с концевых участков. Группа ферментов, принадлежащих к целлобиогидролазе, описывается номером EC: EC 3.2.1.91.

Эндоглюканаза представляет собой общий термин для целлюлаз, которые гидролизуют молекулярные цепи целлюлозы с их центральных участков. Группа ферментов, принадлежащих к эндоглюканазе, описывается номером EC: EC 3.2.1.4.

Экзоглюканаза представляет собой общий термин для целлюлаз, которые гидролизуют молекулярные цепи целлюлозы с их концевых участков. Группа ферментов, принадлежащих к экзоглюканазе, описывается номером EC: EC 3.2.1.74.

β-глюкозидаза представляет собой общий термин для целлюлаз, которые воздействуют на целлоолигосахариды или целлобиозу. Группа ферментов, принадлежащих к β-глюкозидазе, описывается номером EC: EC 3.2.1.21.

Ксиланаза представляет собой общий термин для целлюлаз, которые воздействуют на гемицеллюлозу или, в частности, ксилан. Группа ферментов, принадлежащих к ксиланазе, описывается номером EC: EC 3.2.1.8.

Ксилозидаза представляет собой общий термин для целлюлаз, которые воздействуют на ксилоолигосахариды. Группа ферментов, принадлежащих к ксилозидазе, описывается номером EC: EC 3.2.1.37.

Такие компоненты полученной из мицелиальных грибов целлюлазы можно разделять, используя известный способ, такой как гель-фильтрация, ионный обмен или двухмерный электрофорез, и разделенные компоненты можно направлять на анализ последовательности аминокислот (анализ концевых атомов N, анализ концевых атомов C или масс-спектрометрический анализ), за которым следует сравнение последовательностей с базой данных.

Ферментативную активность полученной из мицелиальных грибов целлюлазы можно оценивать на основании ее гидролитической активности по отношению к полисахаридам, такой как активность разложения Avicel, активность разложения карбоксиметилцеллюлозы (CMC), активность разложения целлобиозы, активность разложения ксилана и активность разложения маннана. Основные компоненты целлюлазы, определяющие активность разложения Avicel, представляют собой целлобиогидролазу и экзоглюканазу, которые разлагают целлюлозу с ее концевых участков. Основные компоненты целлюлазы, определяющие активность разложения ксилана, представляют собой ксиланазу и ксилозидазу. Основной компонент целлюлазы, определяющий активность разложения целлобиозы, представляет собой β-глюкозидазу. Основные компоненты целлюлазы, определяющие активность разложения CMC, представляют собой целлобиогидролазу, экзоглюканазу и эндоглюканазу. Термин «основной» в настоящем документе используют для обозначения того, что компонент (компоненты) принимает/принимают участие в разложении в наиболее высокой степени, хотя и другие ферментативные компоненты также принимают участие в разложении.

В качестве полученной из мицелиальных грибов целлюлазы предпочтительно используют неочищенный ферментативный продукт. Неочищенный ферментативный продукт выделяют из культуральной надосадочной жидкости, полученной после культивирования микроорганизмов, принадлежащих к роду мицелиальных грибов, в течение заданного периода в среде, приготовленной таким образом, что микроорганизмы производят целлюлазу. Используемые компоненты среды не являются ограниченными, и можно обычно использовать среду с добавкой целлюлозы, чтобы способствовать производству целлюлазы. В качестве неочищенного ферментативного продукта культуральную жидкость можно использовать в неизменном виде, или культуральную надосадочную жидкость обрабатывают, удаляя только мицелиальные грибы, которые можно предпочтительно использовать.

Массовые соотношения ферментативных компонентов в неочищенном ферментативном продукте не являются ограниченными, и, например, культуральная жидкость, полученная из грибов Trichoderma reesei, содержит от 50 до 95 масс. % целлобиогидролазы, а также содержит в качестве других компонентов эндоглюканазу, β-глюкозидазу и подобные ферменты. Микроорганизмы, принадлежащие к роду Trichoderma, выделяют сильные компоненты целлюлазы в культуральную жидкость, в то время как активность β-глюкозидазы в культуральной жидкости является низкой, поскольку β-глюкозидаза удерживается в клетках или на поверхностях клеток. Таким образом, β-глюкозидазу из различных видов или из одного вида можно добавлять в неочищенный ферментативный продукт. В качестве β-глюкозидазы из различных видов можно предпочтительно использовать β-глюкозидазу, полученную из Aspergillus. примеры β-глюкозидазы, полученной из Aspergillus, включают Novozyme 188, который поставляет на продажу фирма Novozyme. Способ добавления β-глюкозидазы из различных видов или из одного вида в неочищенный ферментативный продукт может представлять собой способ, в котором ген вводят в микроорганизм, принадлежащий к Trichoderma, чтобы осуществлять генетическую рекомбинацию микроорганизма таким образом, что β-глюкозидаза выделяется в культуральную жидкость, и микроорганизм, принадлежащий к Trichoderma, затем культивируют с последующим отделением культуральной жидкости.

В настоящем изобретении гидролиз целлюлозы, используя полученную из мицелиальных грибов целлюлазу, осуществляют в две стадии, то есть осуществляют первичный гидролиз и вторичный гидролиз. Эти стадии далее описаны по порядку.

Первичный гидролиз в настоящем изобретении означает, что карбогидразу добавляют к целлюлозе, которая не вступала в контакт с карбогидразой, чтобы осуществлять гидролиз. Фермент, используемый для первичного гидролиза, может представлять собой вышеупомянутый свежий фермент или извлеченный фермент, и, учитывая уменьшение количества используемого фермента, в частности количества используемого свежего фермента, предпочтительно использовать смесь извлеченного фермента и свежего фермента.

Температура реакции во время первичного гидролиза составляет предпочтительно от 40 до 60°C, и, особенно в тех случаях, когда используют полученную из грибов Trichoderma целлюлазу, температура реакции предпочтительнее составляет от 45 до 55°C.

Время реакции первичного гидролиза составляет предпочтительно от 2 часов до 200 часов. В тех случаях, когда время реакции составляет менее чем 2 часов, выход сахара оказывается недостаточным, что не является предпочтительным. С другой стороны, в тех случаях, когда время реакции составляет более чем 200 часов, ферментативная активность уменьшается, что не является предпочтительным, поскольку в вышеупомянутом вторичном гидролизе выход сахара оказывается недостаточным, и фермент невозможно извлекать.

Значение pH во время первичного гидролиза составляет предпочтительно от 4,0 до 5,5. В тех случаях, когда полученную из грибов Trichoderma целлюлазу используют в качестве полученной из мицелиальных грибов целлюлазы, оптимальное значение pH реакции составляет 5,0, но, особенно в случае первичного гидролиза, pH изменяется во время гидролиза. Таким образом, предпочтительно осуществлять гидролиз, поддерживая при этом постоянное значение pH, используя кислоту или щелочь.

Первичный гидролизат содержит первичный сахарный раствор и твердые вещества, и твердые вещества содержат полисахаридные компоненты, такие как неразложившаяся целлюлоза и гемицеллюлоза, и компоненты, которые невозможно первоначально разлагать с помощью карбогидразы, такие как лигнин. Кроме того, относительно большое количество полученной из мицелиальных грибов целлюлазы адсорбируется на твердых веществах. Таким образом, в настоящем изобретении, чтобы осуществлять вышеупомянутый вторичный гидролиз, используя полисахаридные компоненты и полученную из мицелиальных грибов целлюлазу, которая содержится в твердых веществах, полученных первичным гидролизом, полученные твердые вещества извлекают путем разделения твердых и жидких фаз. Примеры способов разделения твердых и жидких фаз включают центрифугирование и пресс-фильтрацию, и в настоящем изобретении является предпочтительным извлечение твердых веществ путем пресс-фильтрации.

Причина, по которой пресс-фильтрация является предпочтительной для разделения твердых и жидких фаз, заключается в том, что 1) может быть достигнут высокий выход сахарного раствора. Цель настоящего изобретения состоит в том, чтобы обеспечить повышенное извлечение сахара и извлечение фермента по сравнению с показателями традиционных технологий. Таким образом, способ разделения твердых и жидких фаз представляет собой предпочтительный способ, который позволяет единовременно извлекать большее количество компонентов сахарного раствора. Извлечение компонентов сахарного раствора путем разделения твердых и жидких фаз можно усовершенствовать, в частности, увеличивая количество воды, добавляемой после вторичного гидролиза. Однако увеличение количества добавляемой воды вызывает уменьшение концентрации сахара во вторичном сахарном растворе, что не является предпочтительным. Таким образом, в целях уменьшения количества используемой воды при одновременном достижении высокого извлечения сахара разделение твердых и жидких фаз предпочтительно осуществляют посредством пресс-фильтра. Еще одна причина, по которой пресс-фильтрация является предпочтительной, заключается в том, что 2) можно получать прозрачный фильтрат. В настоящем изобретении первичный сахарный раствор и/или вторичный сахарный раствор, полученный посредством разделения твердых и жидких фаз, фильтруют через ультрафильтрационную мембрану для извлечения ферментативных компонентов. Сахарный раствор, пропускаемый через ультрафильтрационную мембрану, предпочтительно содержит лишь небольшие количества твердых веществ и мелкодисперсных компонентов в целях предотвращения засорения мембраны, и в случае фильтрования в пресс-фильтре фильтрат содержит лишь небольшие количества твердых веществ и мелкодисперсных компонентов, и его можно, таким образом, предпочтительно использовать в настоящем изобретении.

Вторичный гидролиз в настоящем изобретении означает, что второй гидролиз осуществляют для твердых веществ, полученных путем разделения твердых и жидких фаз первичного гидролизата, используя только полученную из мицелиальных грибов целлюлазу, адсорбированную на твердых веществах. Таким образом, при вторичном гидролизе гидролиз твердых веществ осуществляют только с адсорбированным ферментом без дополнительного введения карбогидразы.

По сравнению с традиционными технологиями (в которых осуществляют только первичный гидролиз) настоящее изобретение отличается тем, что вторичный гидролиз осуществляют без дополнительного введения фермента, чтобы повысить выход сахара и/или коэффициент извлечения фермента. Производство сахара и/или извлечение фермента можно, разумеется, осуществлять также и в традиционных технологиях, но посредством осуществления вторичного гидролиза по изобретению можно извлекать больше сахара и фермента. Основная причина этого заключается в предотвращении ингибирования фермента путем отделения полученного сахара. Гидролизат после первичного гидролиза содержит большое количество компонентов сахара. Осуществляя разделение твердых и жидких фаз для удаления сахаров (глюкоза, ксилоза и олигосахариды), полученных путем гидролиза, и вводя дополнительное количество воды, можно уменьшать концентрацию полученных сахаров, содержащихся в качестве компоненты раствора. Таким путем можно предотвращать ингибирование фермента продуктами, и вторичный гидролиз можно в достаточной степени осуществлять, используя только фермент, адсорбированный на твердых веществах. Таким образом, даже при таком же количестве использованного фермента, как в традиционной технологии, можно извлекать больше сахара и/или фермента путем осуществления вторичного гидролиза по изобретению.

Количество воды, добавляемой по изобретению, не является ограниченным, и добавление предпочтительно осуществляют таким образом, что концентрация твердых веществ перед вторичным гидролизом составляет от 1 масс. % до 20 масс. %. В тех случаях, когда концентрация твердых веществ составляет более чем 20 масс. %, и в тех случаях, когда концентрация твердых веществ составляет менее чем 1 масс. %, выход сахара и/или извлеченное количество фермента может быть низким, что является неэффективным и нежелательным.

Температура реакции во время вторичного гидролиза составляет предпочтительно от 40 до 60°C, и, в частности, в тех случаях, когда используют полученную из грибов Trichoderma целлюлазу, температура реакции составляет предпочтительнее от 40 до 55°C, наиболее предпочтительно около 50°C.

Время реакции вторичного гидролиза составляет предпочтительно от 5 до 180 минут. В тех случаях, когда время реакции составляет менее чем 5 минут, эффективность извлечения адсорбированного фермента является низкой, при этом даже в тех случаях, когда реакцию осуществляют в течение не менее чем 180 минут, эффективность извлечения адсорбированного фермента не увеличивается, что является неэффективным.

Значение pH во время вторичного гидролиза составляет предпочтительно от 6,0 до 8,0. В тех случаях, когда полученную из грибов Trichoderma целлюлазу используют в качестве полученной из мицелиальных грибов целлюлазы, оптимальное значение pH реакции составляет 5,0 и, в частности, в случае первичного гидролиза, реакцию предпочтительно осуществляют при pH 5,0. С другой стороны, при вторичном гидролизе, поскольку основная цель представляет собой извлечение адсорбированного фермента, реакцию предпочтительно осуществляют при значении pH в интервале от 6,0 до 8,0, в котором эффективность извлечения адсорбированного фермента является высокой. При pH, составляющем менее чем 6,0, количество извлекаемого фермента уменьшается, в то время как при pH, составляющем более чем 8,0, карбогидраза дезактивируется, что не является предпочтительным. Таким образом, при pH в интервале от 6,0 до 8,0 степень дезактивации карбогидразы является предельно низкой, и эффективность извлечения карбогидразы может быть высокой.

Вторичный гидролизат содержит вторичный сахарный раствор и твердые вещества, и, аналогично случаю первичного гидролиза, их можно