Способ получения иммуногенной композиции на основе трех гибридных белков оболочки вируса клещевого энцефалита, определяющих принадлежность к сибирскому (dbd2-d3s), европейскому (dbd2-d3e) и дальневосточному (dbd2-d3d) подтипам вируса; рекомбинантные плазмиды pdbd2-d3s, pdbd2-d3e и pdbd2-d3d; штаммы-продуценты escherichia coli m15 [prep4]; химерные белки и их применение

Способ получения иммуногенной композиции на основе трех гибридных белков оболочки вируса клещевого энцефалита, определяющих принадлежность к сибирскому (dbd2-d3s), европейскому (dbd2-d3e) и дальневосточному (dbd2-d3d) подтипам вируса; рекомбинантные плазмиды pdbd2-d3s, pdbd2-d3e и pdbd2-d3d; штаммы-продуценты escherichia coli m15 [prep4]; химерные белки и их применение

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Изобретение относится к генной инженерии, биохимии, биотехнологии и иммунологии, в частности, к получению синтетических генов D3S, D3E и D3D, оптимизированных для гетерологичной экспрессии в непатогенных лабораторных штаммах Escherichia coli и кодирующих рецептор-связывающие домены III белка Ε оболочки вируса клещевого энцефалита (ВКЭ). На основе генов D3S, D3E и D3D получают рекомбинантные плазмиды pDBD2-D3S, pDBD2-D3E и pDBD2-D3D, которые кодируют бифункциональные рекомбинантные белки, различающиеся по аминокислотному составу в позициях 166, 170, 184, 211 и определяющие принадлежность к трем основным генетическим типам вируса. Изобретение также включает штаммы-продуценты химерных белков Е. coli M15 [pREP4, pDBD2-D3S], Ε. coli M15 [pREP4, pDBD2-D3E] и Ε. coli M15 [pREP4, pDBD2-D3D], а также способ иммобилизации, концентрирования и очистки полученных белков на декстрансодержащем сорбенте.

Изобретение относится непосредственно к рекомбинантным белкам DBD2-D3S, DBD2-D3E и DBD2-D3D, предназначенным для использования в качестве антигенов, иммобилизованных в лунках 96-луночного планшета или стрипах, в составе набора диагностических маркеров для выявления антител к ВКЭ в сыворотке крови и ликворе человека методом ИФА, а также к иммуногенной композиции, содержащей иммобилизованные на декстране рекомбинантные белки и направленной на специфическую активацию иммунитета и формирование иммунологической памяти в отношении вируса. Сущность изобретения состоит в способе получения штаммов-продуцентов, обеспечивающих высокий уровень продукции рекомбинантных белковых антигенов DBD2-D3S, DBD2-D3E и DBD2-D3D, с целью последующего использования для иммунопрофилактики ВКЭ, дифференциальной диагностики флавивирусных инфекций и оценки напряженности иммунитета.

Описание изобретения

Область техники, к которой относится изобретение

Изобретение относится к генной инженерии, биохимии, биотехнологии и иммунологии, в частности, к получению синтетических генов D3S, D3E и D3D, рекомбинантных плазмид pDBD2-D3S, pDBD2-D3E и pDBD2-D3D, кодирующих слитые с декстрансвязывающим доменом белковые антигены домена III белка Ε оболочки ВКЭ Сибирского, Европейского и Дальневосточного подтипов, а также штаммов-продуцентов химерных белков DBD2-D3S, DBD2-D3E и DBD2-D3D Escherichia coli, обеспечивающих высокий уровень экспрессии целевых продуктов - белковых антигенов трех различных подтипов ВКЭ, которые могут быть получены, иммобилизованы и очищены с использованием декстрансодержащего сорбента.

Уровень техники

ВКЭ является членом семейства флавивирусов (Flaviviridae, род Flavivirius). Помимо ВКЭ к роду Flavivirus относится еще более 60 видов вирусов, в том числе вирус японского энцефалита, желтой лихорадки, Западного Нила, Дэнге, Омской геморрагической лихорадки и другие. Все эти вирусы вызывают тяжелые заболевания человека и активно изучаются. Так, например, ВКЭ широко представлен на обширной территории Евразийского континента (на территории многих Европейских стран, России, Восточной Азии и Японии) [1-3] и может приводить к развитию тяжелых форм энцефалита, таких как менингеальная, полиомиелитическая, полиоэнцефало-миелитическая и церебральная, с серьезными последствиями до полной инвалидизации и смерти, что обуславливает социальную значимость данной флавивирусной инфекции в эндемичных областях.

Несмотря на относительно невысокую заболеваемость клещевым энцефалитом (КЭ) в Центральном и Дальневосточном федеральных округах, на территории ряда субъектов этих округов часто регистрируют летальные исходы. При этом одним из основных факторов, обусловливающих неблагополучную эпидемиологическую обстановку по КЭ в России, является недостаточная иммунизация населения на эндемичных по ВКЭ территориях субъектов Российской Федерации [4].

В России для специфической профилактики КЭ разрешены к использованию следующие вакцинные препараты: отечественные цельновирионные вакцины - клещевого энцефалита культуральная очищенная концентрированная инактивированная сухая (Предприятие по производству бактерийных и вирусных препаратов (ФГБУ «ИПВЭ им. М.П.Чумакова» РАМН, Россия) и Энцевир (НПО «Вирион», Россия), и зарубежные - ФСМЕ-Иммун («Baxter», Австрия) и Энцепур («Novartis», Германия), основным компонентом которых является поверхностный антиген ВКЭ, полученный после разрушения размноженного в культуре клеток вируса. При этом для производства отечественных вакцин используются штаммы ВКЭ Дальневосточного генетического типа Софьин (выделен из мозга умершего больного на Дальнем Востоке в 1937 г.) и 205 (выделен от клеща Ixodes persulcatus в Хабаровском крае в 1973 г.). В свою очередь, для производства зарубежных вакцин в Австрии и Германии применяют штаммы западноевропейского генетического типа: Найдорф (выделен от клеща Ixodes ricinus в 1971 г.) и К23 (выделенный от клеща Ixodes ricinus в 1975 г.).

Для выявления инфицирования вирусом и установления диагноза КЭ повсеместно используются лабораторные методы иммуноферментного анализа (ИФА) антигенов ВКЭ, преимущественно к поверхностному гликопротеину Е, а также антител к антигенам ВКЭ в сыворотке крови и ликворе пациента (тест-системы «Векто-ВКЭ-IgG-CTpHn» и «Векто-ВКЭ-IgM-CTpHn» фирмы Вектор-Бест, Новосибирск, Россия, www.vector-best.ru; «FSME/TBEV IgG ELISA» и «FSME/TBEV IgM ELISA» фирмы HYCOR Biomedical Inc., США, www.hycorbiomedical.com).

В настоящее время производство инактивированных вакцин и диагностических тест-систем, основным компонентом которых является вирионный антиген ВКЭ, связано с культивированием инфекционных штаммов вируса, который относится к патогенам II группы, что требует обеспечения особых условий безопасности в соответствии с требованиями Санитарных правил 1.3.1285-03 для работы с I-II группой патогенности. Культивирование инфекционных штаммов ВКЭ представляет собой сложный производственно-технологический процесс, который требует использования дорогих питательных сред или куриных SPF (specific pathogen free) эмбрионов, многоэтапных схем очистки и применения токсичных веществ (формальдегида) для инактивации вирусных частиц, при этом выделение и очистка антигенных компонентов производится на основе сложных многостадийных процессов, требующих дорогого оборудования и сорбентов. Кроме того, при любом производстве биопрепаратов, связанном с культивированием высоко патогенных микроорганизмов, существует опасность заражения персонала и контаминации окружающей среды.

Производство инактивированных вакцинных препаратов также предполагает использование высоко вариабельной последовательности вирионного белка Ε определенного штамма ВКЭ, что приводит к формированию ненапряженного иммунитета к остальным подтипам вируса, наличие которого обуславливает снижение вероятности развития КЭ или его тяжести, но не дает гарантии предотвращения заболевания [5]. При этом вакцинные штаммы были выделены 40-70 лет назад и с тех пор культивировались в лаборатории, что привело к их отличиям от циркулирующих в природе современных штаммов, что, в свою очередь, может являться причиной детектируемых случаев заболевания КЭ среди полностью привитых людей [6-8].

Помимо этого имеются многочисленные данные о поствакцинальных осложнениях различной степени тяжести после проведения иммунопрофилактики инактивированными препаратами против ВКЭ, развитие которых в большинстве случаев связано с недостаточной степенью очистки вакцин от яичных белков, компонентов клеток вирусных частиц и антибиотиков, используемых в технологическом процессе наращивания патогенных штаммов [9].

В случае диагностических тест-систем для определения антигенов ВКЭ и антител к ним в сыворотке крови и ликворе пациента с использованием лабораторных методов ИФА к недостаткам диагностики можно отнести высокую стоимость анализа, поскольку для его проведения требуются высокоочищенные антигены и антитела (патенты RU 2402606, RU 2016897, RU 2359269). При этом необходимость использования формальдегида для инактивации вируссодержащих культуральных жидкостей, из которых впоследствии получают препараты вирионного антигена ВКЭ, приводит к возникновению множественных модификаций белка Ε по ключевым аминокислотным остаткам - Lys и Arg, что может обуславливать изменение нативной структуры белка и его антигенных свойств, и, как следствие, приводить к формированию ненапряженного иммунитета при проведении вакцинопрофилактики, а также затруднять определение антител к структурному белку Ε ВКЭ в сыворотках человека при использовании в диагностических тест-системах.

Несмотря на наличие эффективных и относительно безопасных вакцин для специфической профилактики большинства известных флавивирусных инфекций и накопленный опыт по их разработке и применению, продолжается поиск новых подходов к созданию вакцинных препаратов. Актуальность исследований обусловлена высокой распространенностью флавивирусов и отсутствием универсальных вакцин против нескольких подтипов вируса, производство которых было бы эффективным и безопасным, при этом выработка иммунного ответа была бы как минимум равноценна таковой при индукции стандартными инактивированными вакцинными препаратами.

Разработка вакцин нового поколения ведется по нескольким направлениям:

- Производство новых ослабленных или инактивированных вакцин: патенты на изобретения CN 102397539 A, CN 102329782 A; US 8241638; RU 2230573 C1, RU 2070929 C1.

- Конструирование рекомбинантных вирусов, содержащих клонированные гены наиболее распространенных флавивирусов в составе вируса осповакцины или других дефектных в репликации флавивирусов: патенты на изобретения US 8227587; RU 2208635 С2, RU 2136312 C1.

- Оптимизация условий культивирования: патент на изобретение RU 2203089 С2.

- ДНК-вакцины: патенты на изобретения US 20030022849 A1; RU 2112038 C1.

- Субъединичные препараты: патенты на изобретения ЕР 2345665 A3; US 8221768, US 6432411 B1, US 20130295162 A1; RU 2084242 C1.

1. Иммуногенные композиции на основе живых ослабленных и инактивированных вакцин

Для создания живых ослабленных и инактивированных вакцин продолжаются поиски ослабленных штаммов флавивирусов Денге, вируса Западного Нила, ВКЭ и вируса Лангат. В последнее время широкое распространение получил подход сайт-направленного мутагенеза, при использовании которого нуклеотидные замены вводят в клонированные полноразмерные ДНК-копии геномов флавивирусов, а последующая транскрипция in vitro при помощи фаговых РНК-полимераз и введение РНК в эукариотические клетки могут приводить к появлению инфекционно ослабленных вирусов. Достижения в области генной инженерии позволяют использовать различные аттенуированные ДНК- и РНК-содержащие вирусы в качестве векторов для экспрессии чужеродной генетической информации [10]. Кандидаты в живые вакцины против флавивирусных инфекций могут быть также получены на основе рекомбинантного вируса осповакцины, экспрессирующего ген поверхностного гликопротеина Ε или ген протеазы NS3. Так, например, известно изобретение RU 2136312 C1, которое предназначено для специфической иммунопрофилактики КЭ и описывает интраназальный способ иммунизации живой рекомбинантной вакциной против КЭ на основе вируса осповакцины.

Очевидными недостатками рекомбинантных вирусов являются дорогостоящая процедура их получения в клеточных культурах и выработка слабого иммунного ответа из-за кратковременной одновременной экспрессии генов нескольких вирусов. Применение живых аттенуированных вакцин также ограничено из-за возможности реверсии инфекционного агента к дикому типу (патент RU 2070929 C1).

Отдельно следует отметить, что в соответствии с рекомендациями Всемирной организации здравоохранения (ВОЗ) с 1995 г. разработка вакцин проводится с использованием в качестве субстрата не куриных эмбрионов, а перевиваемых культур клеток, аттестованных в соответствии с международными требованиями к клеточным субстратам [11]. Такие культуры клеток обладают рядом преимуществ, но при этом могут накапливать посторонние агенты из питательных сред, сывороток, трипсина и т.п. в процессе серийного пассирования. Кроме того, применение любых культур клеток сопряжено с риском их контаминации [12].

Таким образом, в связи с существующими трудностями, работ, посвященных созданию новых живых вакцин на основе природных аттенуированных флавивирусов, в настоящее время становится все меньше (патенты CN 102329782 A; US 8241638).

2. ДНК-вакцины

Преимуществами генной иммунизации являются простота получения ДНК-вакцин. Использование плазмидных векторов для клонирования различных вирусных генов под контролем сильных промоторов, узнаваемых эукариотическими РНК-полимеразами, в значительной мере упрощает способ получения и сокращает сроки на разработку потенциальных вакцин. Отсутствие необходимости работы с патогенными вирусами или бактериями и дорогостоящей процедуры очистки антигенов позволяет существенно снизить себестоимость рекомбинантных ДНК-вакцин [13, 14].

В состав ДНК-вакцин входят гены поверхностных относительно консервативных гликопротеинов, находящихся на поверхности вирионов и инфицированных клеток. Наиболее консервативными генами флавивирусов являются Ε (42% гомологии среди различных видов рода Flavivirus), NS1 (42%), NS3 (44%) и NS5 (55%). Так, например, известно изобретение RU 2112038 C1, которое описывает способ получения рекомбинантной плазмидной ДНК pC-NS3, обеспечивающей интеграцию комплекса генов С, PrM, Е, NS1, NS2A, NS2B и NS3 ВКЭ в геном вируса осповакцины. После проведения вакцинации рекомбинантный вирус осповакцины должен обеспечивать экспрессию комплекса антигенов ВКЭ в клетках иммунизированного организма, что, в свою очередь, должно способствовать формированию протективного иммунитета против заражения ВКЭ. При этом следует отметить, что высокомолекулярные молекулы ДНК являются слабыми иммуногенами из-за подвижной конформации в растворе. Кроме того, механизм проникновения ДНК в клетки иммунизируемого организма недостаточно ясен.

Помимо этого экзогенные ДНК могут деградировать в эукариотических клетках под действием нуклеаз, есть риск возникновения мутаций в ДНК-последовательности, а также возможно исчезновение нереплицирующихся плазмид из-за последовательного уменьшения их относительных количеств в процессе деления эукариотических клеток. Таким образом, нестабильность, многочисленные мутации и возможность встраивания плазмид в клеточные хромосомы может обуславливать снижение защитного эффекта генной иммунизации.

3. Субъединичные вакцины

Субъединичные вакцины получают на основе как рекомбинантных, так и нативных флавивирусных белков (патент RU 2084242 C1), выделенных из культур инфицированных клеток методами аффинной хроматографии с различными вариантами элюции (патент RU 2230573 C1). Рекомбинантные белки Ε (патент US 6432411 В1), prM (патент US 8221768) и NS1 (патент ЕР 2345665 A3), а также фрагменты белков Ε и NS1 могут быть использованы для специфической профилактики флавивирусных инфекций.

Наработку рекомбинантных белков можно проводить как в трансформированных бактериальных клетках, так и в трансфицированных эукаритических клетках, в частности, в клетках насекомых (патент US 6432411 В1). Подобные генно-инженерные аналоги описаны для всех флавивирусных белков, однако, несмотря на их иммуногенные свойства, только введение белков Μ, Ε и NS1 рода Flavivirus обеспечивает защиту от инфекции.

Флавивирусные антигены также могут формировать частицы, содержащие белки Ε и PrM/М. Иммунизация экспериментальных животных такими вирусоподобными частицами позволяет обеспечить защитный гуморальный иммунный ответ [15], однако стоимость получения и очистки вирусоподобных частиц, состоящих из структурных гликопротеинов флавивирусов, очень высока, поэтому широкое применение таких вакцин не представляется возможным.

Отдельно следует отметить, что, поскольку РНК-содержащим флавивирусам свойственны генетическая изменчивость и вариабельность, в настоящее время продолжается поиск наиболее консервативных фрагментов вирусных белков, локализованных на поверхности оболочки вирионов или инфицированных клеток и включающих эпитопы для вирус-нейтрализующих и протективных антител. При этом основной мишенью вируснейтрализующих антител является белок Ε оболочки вируса, а именно дистальный домен III, который отвечает за связывание нейтрализующих вирус иммунопротективных антител, в связи с чем в последнее время все большее развитие получают подходы к созданию вакцин, основанные на получении именно рекомбинантного домена III вирионного белка Ε [16-18]. В основе этих работ лежит исследование Bhardwaj и соавт. [19], в котором было показано, что домен III белка Ε вируса Лангат (относящегося к группе флавивирусов) образует в растворе правильно уложенную и стабильную пространственную структуру, соответствующую структуре домена в кристаллизованном полноразмерном белке Ε [20]. Также в работе [19] на культуре клеток было показано, что домен III обладает защитным эффектом от вирусов, переносимых клещами. Эта работа показала, что домен III белка Ε может быть перспективен для разработки новых вакцин.

В работе Chu и соавт. [17] рекомбинантный домен III белка Ε вируса лихорадки Западного Нила был протестирован на мышах линии BALB/C в качестве потенциального компонента субъединичной вакцины. Иммунизация мышей рекомбинантным доменом III белка Ε в сочетании с олигодезоксинуклеотидами CpG ODN, используемыми в качестве адъюванта, приводила к появлению у иммунизированных мышей высокого титра нейтрализующих антител к вирусу лихорадки Западного Нила. Селезеночные макрофаги, выделенные из иммунизированных мышей (домен III белка Ε с CpG ODN в качестве адъюванта, либо только домен III белка Е), показывали высокий уровень пролиферации Т-клеток в присутствии домена III белка Ε по сравнению с контрольными группами. Также селезеночные макрофаги, полученные от иммунизированных мышей, обнаруживали высокий уровень экспрессии цитокинов. При этом селезеночные макрофаги мышей, иммунизированных только доменом III, показывали преимущественно Тh1 тип иммунного ответа, а селезеночные макрофаги мышей, иммунизированных доменом III белка Ε в сочетании с CpG ODN в качестве адъюванта, демонстрировали высокий уровень как Тh1, так и Th2 цитокинов. Таким образом, было показано, что иммунизация мышей рекомбинантным доменом III белка Ε предотвращает инфекцию соответствующего вируса в отсутствие полноразмерного белка Ε или вирусных частиц. Добавление CpG ODN в качестве адъюванта усиливало иммунный ответ. В работе Chiang и соавт. [16, 18] описана разработка вакцины против вируса Денге, основанной на использовании консенсусной последовательности к 4 подтипам вируса Денге домена III белка Ε в мультифазной эмульсионной системе, при этом авторами было показано, что титр нейтрализующих антител получается невысоким, что определяет необходимость ревакцинаций.

Несомненными достоинствами рекомбинантных белков являются их безопасность при производстве и применении, а также низкая себестоимость вследствие использования стандартных генно-инженерных подходов при их конструировании и очистке. В свою очередь недостатком рекомбинантных белков является их относительно низкая иммуногенность. При этом данный недостаток может быть преодолен при использовании адъювантов [17, 18].

4. Применение аффинных доменов, полисахаридных сорбентов и молекулярных адъювантов

Субъединичные генно-инженерные препараты, содержащие протективные антигены, представляют большой интерес и обладают такими существенными преимуществами как низкая реактогенность, высокая чистота получаемого продукта, а также безопасность для людей с ослабленным иммунитетом. Основным способом получения таких антигенов является клонирование генов целевых белков в клетки непатогенных микроорганизмов и получение на их основе штаммов-продуцентов. При этом на этапе получения рекомбинантных антигенов могут возникать различные биотехнологические сложности: низкий уровень синтеза, нестабильность чужеродного белка, многостадийное выделение и очистка целевых продуктов.

Одним из часто применяемых способов решения этих проблем является использование технологии создания слитных (химерных) белков. Данная технология основана на соединении в одной рамке трансляции нескольких генов - гена целевого продукта (антигена) и гена белка-носителя, что приводит к синтезу химерного белка.

Внедрение хроматографических методов способствовало развитию tag-аффинных систем, позволяющих проводить выделение и очистку белков методом аффинной хроматографии. Известные аффинные домены имеют разный химический состав, молекулярную массу, неодинаковые условия элюирования и позволяют решать основные биотехнологические задачи. Среди больших аффинных доменов (12 кДа и более) широко распространены и активно используются в биотехнологии карбогидрат-связывающие домены, взаимодействующие с такими сорбентами как кристаллическая и некристаллическая целлюлоза, β-1,3-глюкан и смешанный β-1,3-1,4-глюкан, ксилан, маннан, крахмал (патенты US 6174700, US 6331416, US 6048715, US 20100317588).

Возможность применения природного полисахаридного сорбента для повышения иммуногенности была показана в работах профессора А.Е. Гурвича, в лаборатории которого впервые химическим способом были получены белково-целлюлозные комплексы и изучены их иммуногенные свойства [21]. Была продемонстрирована принципиально более высокая иммуногенность белково-полисахаридных комплексов по сравнению с иммуногенностью свободных неиммобилизованных антигенов (патент RU 01669918 C1).

В последние годы также большое внимание уделяется исследованию и возможному применению молекулярных адъювантов, обладающих иммуномодулирующей активностью и способных поляризовать иммунный ответ по Th1- или Th2-типу. Данный эффект достигается за счет стимуляции врожденного иммунитета молекулярными адъювантами: консервативными структурами микроорганизмов РАМР (pathogen associated molecular patterns) или сигналами опасности DAMP (danger associated molecular pattern), распознаваемыми специальными рецепторами (pattern recognition receptors - PRR - TLR, NLR и др.), или цитокинами. Так, например, повышение иммуногенности вакцины было отмечено при использовании комплекса рекомбинантных цитокинов IL-1β, IL-2 и TNFα человека [22]: исследуемые препараты цитокинов повышали протективный эффект вакцин против КЭ, оцениваемый по уровню резистентности мышей линии BALB/c к заражению штаммом Абсеттаров ВКЭ по сравнению с животными, иммунизированными вакциной без адъюванта.

В свою очередь, одним из наиболее применяемых в настоящее время адъювантов являются олигонуклеотиды с CpG-мотивами [23]. Для усиления иммуномодулирующих свойств CpG ODN возможно конъюгирование с высокомолекулярными соединениями или наночастицами [24]. Добавление CpG-ДНК к вакцинным препаратам смещает баланс иммунного ответа в сторону Th1, а именно увеличивает продукцию IgG2a по сравнению с IgG1 и синтез ИФН-γ (патенты US 20050043529 A1, US 20090087446 A1, US 8227446 B2, US 8263091 В2).

Таким образом, в настоящее время представляется актуальной разработка недорогой в производстве вакцины против КЭ, которая будет оказывать протективное действие после проведения нескольких иммунизаций и обеспечивать формирование длительного иммунитета, при этом эффективность выработки иммунного ответа будет равноценна таковому при иммунизации инактивированными вакцинными препаратами.

Прототипом настоящего изобретения в части использования для иммунопрофилактики является способ получения четырехвалентной вакцины против вируса Денге, которая включает в себя полипептиды домена III (dIII) вирионного белка Ε для каждого из серотипов вируса DEN1-DEN4 (патент US 20130295162 A1). Также к прототипам можно отнести изобретение, описанное в международной заявке на патент WO2012118559, которое относится к созданию иммуногенных композиций и вакцин против флавивирусных инфекций, а именно к улучшению вакцин против лихорадки Денге и разработке вакцин с повышенной иммуногенностью на основе слитых бивалентных белков флагеллина и вируса Денге, которые могут быть объединены с другими моно- и бивалентными антигенами вируса с целью производства поливалентной вакцины.

Прототипом настоящего изобретения в части использования для дифференциальной диагностики флавивирусных инфекций и оценки напряженности иммунитета является способ идентификации иммуноглобулинов, выработка которых происходит в ответ на специфическую иммунизацию или заражение вирусом, с использованием иммобилизованных антигенных композиций на основе домена III белка Ε оболочки флавивирусов на примере детекции серокомплекса ВКЭ и вирусов лихорадки Западного Нила (патент US 7785799 В2). При этом способ, описанный изобретением US 7785799 В2, не предполагает антигенной дифференциации разных штаммов ВКЭ, поскольку антигенные препараты, которые предполагаются к использованию для определения антител класса IgG к ВКЭ, содержат не уникальные, а унифицированные последовательности, характеризующиеся высокой консервативностью среди разных флавивирусов.

Также, согласно описанию изобретения US 7785799 В2, рекомбинантные домены III белка Ε оболочки вируса Западного Нила и серокомплекса ВКЭ могут быть экспрессированы в Е. coli в виде слитых белков для последующего получения растворимого белка, который далее может быть очищен. При этом на данный момент отсутствуют оптимизированные методики получения, выделения и очистки антигенных детерминант структурных фрагментов белка Ε оболочки ВКЭ в необходимой для сохранения антигенных свойств конформации, что не позволяет принципиально снизить трудозатраты на их производство, и, как следствие, определяет ряд ресурсных, спросовых и экологических ограничений на рынке вакцинных препаратов и лабораторной диагностики.

В связи с этим актуальной задачей является разработка антигенного препарата на основе отдельных белковых компонентов оболочки ВКЭ и декстрансвязывающего домена DBD2, определяющего способность рекомбинантного белка взаимодействовать с декстрансодержащим сорбентом, с высоким уровнем экспрессии и стабильности этих белков в бактериальной системе, с высокой степенью очистки и стабильности компонентов.

Такой способ обеспечивается настоящим изобретением. То есть техническим результатом заявленной группы изобретений является, в частности, разработка антигенного препарата на основе отдельных белковых компонентов оболочки ВКЭ и декстрансвязывающего домена DBD2, определяющего способность рекомбинантного белка взаимодействовать с декстрансодержащим сорбентом, с высоким уровнем экспрессии и стабильности этих белков в бактериальной системе, с высокой степенью очистки и стабильности компонентов и создание на его основе недорогой в производстве вакцины против КЭ, которая будет оказывать протективное действие после проведения нескольких иммунизаций и обеспечивать формирование длительного иммунитета, при этом эффективность выработки иммунного ответа будет равноценна таковому при иммунизации инактивированными вакцинными препаратами.

Раскрытие изобретения: сущностью изобретения является способ создания синтетических генов D3S, D3D и D3E, рекомбинантных плазмид pDBD2-D3S, pDBD2-D3E и pDBD2-D3D, кодирующих слитые с декстрансвязывающим доменом белковые антигены домена III белка Ε оболочки ВКЭ Сибирского, Европейского и Дальневосточного подтипов, а также штаммов-продуцентов химерных белков DBD2-D3S, DBD2-D3E и DBD2-D3D Escherichia coli, обеспечивающих высокий уровень экспрессии целевых продуктов - белковых антигенов трех различных подтипов ВКЭ, которые могут быть получены, иммобилизованы и очищены с использованием декстрансодержащего сорбента.

Таким образом, еще одним техническим результатом является создание новых генов, кодирующих белки рецептор-связывающего домена III белка Ε оболочки ВКЭ, позволяющих оптимизировать процесс воспроизведения указанных белков в клетках Е. coli.

В основе изобретения лежит подход конструирования химерных белков из нескольких модулей (белковых доменов) за счет соединения в одной трансляционной рамке двух и более генов - гена смыслового белка (антигена) и гена, кодирующего белок-носитель, который аффинно взаимодействует с определенным сорбентом. В результате, при индукции экспрессии генов в бактериальной системе синтезируется химерный рекомбинантный белок.

Фрагменты гликопротеина Ε оболочки ВКЭ, используемые для включения в состав набора диагностических маркеров и иммуногенной композиции для профилактики КЭ, были выбраны на основе данных литературы и результатов биоинформатического анализа строения вирусов КЭ, обнаруженных на территории Российской Федерации:

1. Белок Ε оболочки ВКЭ является наиболее значимым компонентом внешней поверхности вириона, поскольку играет ключевую роль в процессах сборки вирусной частицы, в связывании вируса с клеточной поверхностью и в последующем слиянии вирусной и клеточной мембран, определяя тем самым тропизм вируса. На поверхности вируса белок Ε представляет собой отдельную объемную единицу, состоящую из комплекса двух молекул вирусного белка Е, при этом каждая молекула белка Ε в димере представляет собой продолговатую структуру, состоящую из трех доменов (Ι-ΙΙΙ) и собранную определенным образом из единой полипептидной цепи (Фиг. 1).

2. Домен III белка Ε представляет собой достаточно автономную структуру и может быть отщеплен от остальной части белковой молекулы трипсиновой обработкой нативного вириона или синтезирован отдельно методами генной инженерии, при этом технически возможно воссоздать необходимую конформацию данного антигенного домена с присущей ему иммунохимической активностью, нейтрализация которой происходит впоследствии специфическими антителами, что дает основание использовать структурный домен III белка Ε оболочки ВКЭ в качестве минимально необходимого и достаточного компонента для создания субъединичной вакцины [25].

3. В соответствии с молекулярно-генетическими маркерами выделяют 3 основных генетических типа ВКЭ - Сибирский, Европейский и Дальневосточный подтипы вируса, при этом в последнее время по результатам таксономических исследований различных штаммов ВКЭ предполагаются к существованию 5 генетических типов, в том числе штаммы 178-79 и 886-84 (Фиг. 2). При этом из представленного на рисунке филогенетического дерева, построенного на основе аминокислотных последовательностей домена III белка Ε оболочки ВКЭ методом Neighbor-Joining, следует, что по последовательности домена III белка Ε оболочки ВКЭ можно выделить только три основных подтипа вируса, тогда как штаммы, относящиеся по аминокислотной последовательности домена III к 4 и 5 подтипу, сходны со штаммами Дальневосточного подтипа. Таким образом, для максимального покрытия изменчивости ВКЭ необходимо и достаточно использовать по одной последовательности каждого генетического типа, а именно последовательности домена III белка Ε оболочки ВКЭ классических Сибирского, Европейского и Дальневосточного штаммов вируса.

Фрагменты генов гликопротеина Ε оболочки ВКЭ, кодирующие рецептор-связывающие домены III и определяющие принадлежность к Сибирскому (D3S), Европейскому (D3E) и Дальневосточному (D3D) подтипам вируса, были получены синтетическим способом. Для обеспечения высокого уровня экспрессии генов в гетерологичной бактериальной системе проводили оптимизацию кодонов под Escherichia coli. Спланированные синтетические гены D3S, D3E и D3D отличались от генов нативного гликопротеина Ε по нуклеотидному составу, но сохраняли кодируемые аминокислотные последовательности (последовательности №1-3 соответственно; здесь и далее жирным шрифтом указаны характеристические аминокислотные остатки, которые позволяют отнести последовательность к Сибирскому (A-T-T-I, белок D3S), Европейскому (T-A-T-I, белок D3E) или Дальневосточному (T-I-A-M, белок D3D) подтипу вируса). Идентичность нуклеотидных последовательностей генов белков D3S, D3E и D3D была подтверждена секвенированием.

Далее были получены рекомбинантные белки, состоящие из двух компонентов: аффинного декстрансвязывающего домена DBD2 декстрансукразы Leuconostoc citreum КМ20 и последовательности рецептор-связывающего домена III белка Ε оболочки ВКЭ, определяющей принадлежность к Сибирскому (D3S), Европейскому (D3E) или Дальневосточному (D3D) подтипу вируса. Использование предварительно спланированных последовательностей генов белка Ε оболочки ВКЭ позволило получить эффективные штаммы-продуценты, синтезирующие 20-30% рекомбинантных антигенов DBD2-D3S, DBD2-D3E и DBD2-D3D от тотального белка клетки.

В синтезируемых химерных белках первый белковый домен сформирован из последовательности декстрансвязывающего домена декстрансукразы из Leuconostoc citreum КМ20, которая определяет способность продукта взаимодействовать с декстрансодержащим сорбентом (аминокислотные остатки 1-140). Далее следует соединяющая (спейсерная) аминокислотная последовательность из нескольких чередующихся остатков глицина и серина (Gly-Ser спейсер, остатки 141-150), а также второй белковый домен, представляющий собой последовательности рецептор-связывающего домена III белка Ε оболочки ВКЭ (остатки 151-255), различающиеся по аминокислотному составу в позициях 166, 170, 184 и 211, характеристические остатки в которых позволяют отнести последовательность к одному из трех генетических типов: Α-Τ-Τ-Ι - к наиболее распространенному Сибирскому варианту (рекомбинантный белок DBD2-D3S с молекулярной массой 28 кДа, последовательность №4), Τ-Α-Τ-Ι - к Европейскому варианту (белок DBD2-D3E, последовательность №5) и Τ-Ι-Α-Μ - к Дальневосточному подтипу вируса (белок DBD2-D3D, последовательность №6). Белковые продукты нарабатываются в непатогенных лабораторных штаммах Е. coli.

Наличие в составе рекомбинантных белков DBD2 позволяет проводить их иммобилизацию на декстрансодержащем носителе, в результате которой происходит одновременная очистка, концентрирование и стабилизация белкового продукта, а также обеспечивается защита от протеаз бактерий-продуцентов. Иммобилизация на декстрановом сорбенте происходит за счет присутствия в рекомбинантном белке декстрансвязывающего домена декстрансукразы из Leuconostoc citreum КМ20, который обладает высоким сродством к декстранам и обеспечивает связывание химерного белка с носителем, при этом исходные антигенные свойства функционально активного белкового домена не нарушаются. Очистка рекомбинантных антигенов включает иммобилизацию белков DBD2-D3S, DBD2-D3E и DBD2-D3D, входящих в состав клеточных экстрактов штаммов Е. coli M15 [pREP4, pDBD2-D3S], Ε. coli Μ15 [pREP4, pDBD2-D3E] и Ε. coli M15 [pREP4, pDBD2-D3D] соответственно, на декстрановом сорбенте в процессе инкубации за счет аффинного взаимодействия с последующей отмывкой от несвязавшихся бактериальных белков, при этом происходит концентрирование, очистка и выделение целевого продукта.

Помимо использования декстрансодержащего носителя для одновременного выделения и очистки антигенного препарата с сохранением нативной структуры, в составе иммуногенной композиции декстран может выполнять роль адъюванта, обеспечивающего укрупнение антигенов (патент RU 2520737), а также их депонирование, обуславливая эффективный эндоцитоз компонентов иммуногенной композиции антиген-презентирующими клетками и способствуя, таким образом, активации гуморального иммунитета и иммунологической памяти [26-27]. При этом к преимуществам использования декстранов для иммобилизации антигенов и последующего включения в состав иммуногенной композиции для профилактики КЭ можно отнести биосовместимость и биодеградируемость данной группы полисахаридов.

Иммобилизированные на декстране антигены представляют собой суспензию сорбента с адсорбированными на нем белками. В свою очередь, неиммобилизованные на декстране антигены в свободном состоянии представляют собой растворы с определенной ионной силой, свободные от примесей липополисахаридов и ДНК штамма-продуцента.

Таким образом, еще одним техническим результатом заявляемой группы изобретений является получение оптимальных для гетерологичной экспрессии синтетических фрагментов домена III белка Ε оболочки ВКЭ; создание штаммов Е. coli, обеспечивающих высокий уровень продукции рекомбинантных белковых антигенов DBD2-D3S, DBD2-D3E и DBD2-D3D, определяющих принадлежность к Сибирскому, Европейскому и Дальневосточному генетическим типам вируса соответственно; использовать простую и эффективную схему очистки рекомбинантных белков; создание наборов диагностических маркеров и иммуногенных композиций на основе рекомбинантных белков, в том числе иммобилизованных на декстране.

Указанный результат достигается посредством синтеза рекомбинантных б