Слитный белок антиангиогенного индуцирующего фактора и его применение

Слитный белок антиангиогенного индуцирующего фактора и его применение

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Область техники, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение относится к слитым белкам, подавляющим индуцирующие ангиогенез факторы, и их применению. В частности, настоящее изобретение относится к слитым белкам, которые ингибируют множество ангиогенных факторов, и их применению. Более конкретно, настоящее изобретение относится к слитым белкам рецепторов VEGF и FGF и их применению в лечении заболеваний, связанных с нарушением ангиогенеза.

Уровень техники

Ангиогенез является одним из основных факторов, приводящих к росту и метастазированию злокачественной опухоли [1]. Процесс ангиогенеза регулируется многими факторами: некоторые из них стимулируют ангиогенез, в то время как другие факторы ингибируют ангиогенез; таким образом, регуляция ангиогенеза является очень сложным динамическим равновесным процессом [2]. Основной целью антиангиогенной терапии является остановка роста опухоли за счет блокирования стимулирующих ангиогенез факторов или предотвращения ангиогенеза опухоли при помощи использования ингибиторов ангиогенеза. В настоящее время известно большое количество стимулирующих ангиогенез факторов таких как, пример, фактор роста сосудистого эндотелия (VEGF), фактор роста фибробластов (FGF), фактор роста гепатоцитов (HGF), DDR1, EphA1, EphA2, EphAS, EphB1, EphB4, EGFR, HER-2, ErbB3, MET, RON, CSF1R, KIT, PDGFR-A, PDGFR-B, ТЕК, Tie-1 и т.п., которые способны стимулировать деление и дифференцировку клеток сосудистого эндотелия и морфогенез кровеносных сосудов. Известно, что среди этих факторов самым специфическим ангиогенным фактором и самым эффективным фактором роста является VEGF [3, 4].

В гипоксической среде внутри опухолевой ткани клетками этой ткани секретируется большое количество VEGF, которые индуцируют деление и миграцию сосудистых эндотелиоцитов, приводя к образованию сосудистой сети опухоли. В ходе большого количества экспериментов с использованием животных было показано, что ингибирование VEGF может предотвращать ангиогенез, а также подавлять рост опухоли. По этой причине VEGF и его рецепторы стали важной мишенью для антиангиогенных лекарственных средств. К настоящему времени в клинических испытаниях было показано, что антиангиогенные лекарственные средства обладают необычайной эффективностью, включая бевацизумаб (известный как Авастин), который способен блокировать непосредственно VEGF и ингибировать ангиогенез опухоли. Продажа бевацизумаба была разрешена Управлением по надзору за качеством пищевых продуктов и лекарственных средств США в 2004 в качестве лекарственного средства первой линии для лечения рака прямой кишки, это был первый разрешенный для коммерческого использования препарат, предупреждающий канцерогенез за счет ингибирования ангиогенеза. Авастин представляет собой гуманизированное анти-VEGF моноклональное антитело, который производится известной американской биотехнологической компанией Genentech. В III фазе крупномасштабных клинических испытаний было показано, что комбинированное с химиотерапией лечение Авастином может существенно удлинять время жизни пациентов с различными видами рака, том числе раком прямой кишки, легких, молочной железы почек и т.д. [5, 6] Клинический успех авастина является исторически значимым, являясь демонстрацией того, что антиангиогенная терапия, мишенью которой является сосудистая система опухоли, является клинически эффективным мероприятием и обеспечивает новый подход к лечению опухолей. В западных странах авастин уже нашел широкое применение в терапии опухолей и является одним из лекарственных средств, удерживающих лидирующее положение на мировом рынке.

На последней фазе клинических испытаний с участием людей, помимо авастина, находится еще несколько лекарственных средств, подавляющих передачу сигналов VEGF, клиническое применение которых ожидается в течение следующих нескольких лет. В настоящее время на III фазе крупномасштабных клинических испытаний, среди прочих препаратов, находится афлиберцепт (также известный как VEGF-Trap), разработанный американской биотехнологической компанией Regeneron совместно с компанией Sanofi-Aventis [7]. На III фазе клинических испытаний также находится лекарственное средство IMC-1121B (имклон), представляющее собой моноклональное антитело к VEGF рецептору II (VEGFR2) [8]. Эти новые лекарственные средства несомненно обеспечат новые возможности для терапии рака, а также надежду для пациентов.

Использование анти-VEGF препарата позволило достичь большого прогресса в лечении рака, однако в клинических испытаниях было показано, что анти-VEGF терапия также имеет существенные ограничения. С точки зрения эффективности лечения опухоли авастин способен увеличить время выживания у 50% пациентов с раком прямой кишки примерно на 3-4 месяца [9, 10], и на 7-8 месяцев у 5% пациентов с раком груди [11], и следовательно, авастин не способен эффективно подавлять рост кровеносных сосудов в опухолях в течение длительного времени. Таким образом, проблема, требующая решения заключается в том, как улучшить эффективность антиангиогенной терапии, при этом не менее важной является задача изучения и разработки антиангиогенных препаратов следующего поколения.

Основные причины, приводящие к неудачам в лечении анти-VEGF препаратами или появлению резистентности, могут быть связаны с регуляцией ангиогенеза опухоли, опосредованной множеством факторов. Хотя VEGF играет важную роль в ангиогенезе, он не является единственным фактором, стимулирующим ангиогенез. Тем не менее, в силу гетерогенности опухолевых клеток, сложности микроокружения опухоли и ответных компенсаторных механизмов тела при длительном подавлении активности VEGF могут экспрессироваться другие стимулирующие ангиогенез факторы [12], и, таким образом, рост кровеносной системы опухоли перестает зависеть от пути передачи VEGF сигналов. Группа Hanahan изучала изменение факторов ангиогенеза, экспресируемых опухолью, во время лечения опухоли поджелудочной железы анти-VEGFR2 препаратами, показав, что во время лечения анти-VEGF препаратами наблюдается изменение уровня экспрессия нескольких генов, причем экспрессия FGF-2 значительно усиливается. Было показано, что в резистентной к лечению анти-VEGF препаратами опухоли уровень экспрессии FGF, в частности FGF-2, увеличивается настолько, что процесс ангиогенеза вновь активируется, но после блокирования пути передачи сигналов FGF происходит подавление репопуляции опухоли [13]. Отсюда следует, что сверхэкспрессия FGF-2 тесно связана со способностью опухоли избегать лечения анти-VEGF препаратами. Следовательно, пролиферативные сосудистые заболевания, такие как опухоли, можно лечить более эффективно путем одновременного ингибирования как VEGF, так и FGF-2.

В настоящее время, в области изучения антагонизма, направленного на ингибирование двух или множества мишеней, достигаемого благодаря применению лекарственного средства на основе низкомолекулярного активного соединения достигнут некоторый прогресс, и продемонстрировано, что противоопухолевый эффект, достигаемый в результате одновременного подавления действия как VEGF, так и FGF-2, превосходит эффект, получаемый в результате противоопухолевой терапии, нацеленной на единственную мишень [14]. Однако отсутствие специфичности в действии низкомолекулярных многоцелевых антагонистов может приводить к появлению непредвиденных побочных эффектов, которые порой могут проявляться только на поздней стадии клинических исследований, и, таким образом, их применение является очень рискованным. В то же время, лекарственные средства на основе макромолекулярных белков, в частности Fc-слитого белка и моноклонального антитела, имеют преимущества, не свойственные лекарственным средствам, созданным на основе низкомолекулярных активных соединений, такие как высокая специфичность и длительный in vivo период полувыведения и т.д., что делает их важным объектом изучения и разработки лекарственных средств.

Фактор роста фибробластов (FGF) относится к семейству гепарин-связывающих факторов роста, которое у млекопитающих состоит из 22 членов (FGF 1-14, 16-23). FGF выполняет множество важных биологических функций, таких как размножение, дифференцировка и миграция клеток, ангиогенез и онкогенез. Многие биологические функции FGF осуществляются через связывание и активацию FGF рецепторов клеточной поверхности (FGFR). (См, например, Eswarakumar et al. Cytokine Growth Factor Rev.16:139-149, 2005). Рецепторы фактора роста фибробластов (FGFR) представляют собой рецепторы, которые связываются с членами семейства факторов роста фибробластов. Часть рецепторов факторов роста фибробластов участвует в развитии патологического процесса. У млекопитающих к ним относятся 4 гена FGFR: fgfRl-fgfR4. Рецепторы факторов роста фибробластов состоят из внеклеточного домена, трансмембранного домена и внутриклеточного домена. Члены семейства FGFR отличаются друг от друга лиганд-связывающими свойствами и киназными доменами. Однако имеют одинаковые внеклеточные домены. В составе их внеклеточных доменов различают три иммуноглобулин-подобных (Ig-подобных) домена: первый Ig-подобный домен, второй Ig-подобный домен и третий Ig-подобный домен, при этом между первым и вторым Ig-подобными доменами имеется последовательность. Эта последовательность, расположенная между первым и вторым Ig-подобными доменами, в настоящем описании названа участком промежуточной функциональной последовательности Ig-подобного домена FGFR. Этот участок промежуточной функциональной последовательности содержит область кислых аминокислот, названную кислым боксом (АВ).

Учитывая важное влияние VEGF и FGF (особенно FGF-2) на ангиогенез опухоли, авторами изобретения было выдвинуто предположение, что лекарственные средства на основе макромолекулярных белков, ингибирующие ангиогенную активность как VEGF, так и FGF (особенно FGF-2), смогут оказывать более сильное ингибирующее действие на ангиогенез опухоли и позволят достигнуть улучшенного терапевтического эффекта в медицинской практике. Однако на сегодняшний день нет ни одной публикации, описывающей успешно сконструированный макромолекулярный слитый белок, подавляющий активность как VEGF, так и FGF. Следовательно, настоящее изобретение направлено на изучение вопроса создания Fc-слитого белка, который способен одновременно подавлять ангиогенную активность как VEGF, так и FGF (особенно FGF-2), при этом указанный слитый белок способен одновременно блокировать путь передачи сигналов как VEGF, так и FGF благодаря специфичности и высокой аффинности к этим рецепторам. Слитый белок, одновременно подавляющий ангиогенную активность как VEGF, так и FGF, полностью состоит из последовательности человеческого белка и обладает превосходными фармакокинетическими свойствами Fc-слитого белка, демонстрируя при этом благоприятные фармацевтические параметры и хорошие возможности для применения в клинике. В то же время, аффинность слитого белка, направленного на подавление ангиогенной активности двух мишеней, зависит от правильной конфигурации белка, при этом рецепторный сегмент в таком слитом белке обнаруживает тенденцию к потере лиганд-связывающей способности. Следовательно, разработка лекарственного средства, содержащего высокоэффективный слитый белок, который мог бы специфично подавлять как VEGF, так и FGF (например, FGF-2), сопряжена с трудностями. На первой стадии этого исследования было сконструировано более 20 слитых белков, содержащих разные VEGFR сегменты, сегменты FGFR и Fc IgG1, и был получен слитый белок, обладающий высокой аффинностью как к VEGF, так и к FGF (в частности, к FGF-2).

Несмотря на наличие публикаций, описывающих многочисленное количество ингибирующих ангиогенез слитых белков, например, FGFR-слитый белок (WO/2008/065543), Notch3-слитый белок (WO/2010/021729). VEGFR-слитый белок (WO/2010/105573), LK8-слитый белок (WO/2008/075833) и т.д., все эти слитые белки направлены на одну мишень, при этом ингибирование ангиогенеза реализуется за счет слияния части единственного ингибитора ангиогенеза с Fc-сегментом иммуноглобулина. Отсутствуют публикации уровня техники, описывающие слитый белок, эффективность ингибирования ангиогенеза которого достигалась бы за счет ингибирования двух мишеней благодаря успешному слиянию двух структурных единиц ингибирующих образование кровеносных сосудов. Автору изобретения впервые удалось достичь слияния по меньшей мере двух ингибирующих ангиогенез структурных единиц, выделенных из по меньшей мере двух ингибиторов ангиогенеза, для получения слитого белка, ингибирующего две мишени, а также ингибирующего ангиогенез, и неожиданно получить отличный эффект. Следовательно, настоящее изобретение обеспечивает новое направление в разработке лекарственных средств, ингибирующих ангиогенез.

Сущность изобретения

Один из аспектов настоящего изобретения относится к слитому белку, содержащему по меньшей мере две ингибирующие ангиогенез структурные единицы, полученные по меньшей мере из двух ингибиторов ангиогенеза. В одном из вариантов осуществления изобретения указанный слитый белок ингибирует ангиогенез. В другом варианте осуществления указанный слитый белок связывается с FGF и VEGF in vivo и/или in vitro.

В одном из вариантов осуществления изобретения заявленный слитый белок содержит по меньшей мере две ингибирующие ангиогенез структурные единицы, полученные из по меньшей мере двух ингибиторов ангиогенеза, где указанные по меньшей мере два ингибитора ангиогенеза выбирают из группы состоящей из: VEGFR, например, VEGFR1, VEGFR2, VEGFR3, и FGFR, например, FGFR1, FGFR2, FGFR4. Слитый белок по изобретению предпочтительно содержит по меньшей мере две ингибирующие ангиогенез структурные единицы, полученные из VEGFR1, VEGFR2 и FGFR1. Более предпочтительно, слитый белок по изобретению содержит две ингибирующие ангиогенез структурные единицы, полученные из VEGFR1, VEGFR2 и FGFR1, где одна из ингибирующих ангиогенез структурных единиц получена из VEGFR1 и VEGFR2, в то время как другая получена из FGFR1.

В другом варианте осуществления изобретения слитый белок по изобретению содержит по меньшей мере две ингибирующие ангиогенез структурные единицы, полученные из по меньшей двух ингибиторов ангиогенеза, где по меньшей два ингибитора ангиогенеза представляют собой растворимый сегмент ингибирующего ангиогенез рецептора, причем указанный растворимый сегмент рецептора, например, может быть выбран из группы, состоящей из: DDR1, EphA1, EphA2, EphAS, EphB1, EphB4, EGFR, HER-2, ЕrbВ3, FGFR1, FGFR2, FGFR4, MET, RON, CSF1R, KIT, PDGFR-A, PDGFR-B, ТЕК, Tie-1, HGF, VEGFR1, VEGFR2, VEGFR3 и их аллельных вариантов. В одном из конкретных вариантов осуществления указанный ингибитор ангиогенеза представляет собой ингибирующий ангиогенез рецептор VEGFR И FGFR.

В некоторых вариантах осуществления слитый белок по изобретению содержит по меньшей мере две ингибирующие ангиогенез структурные единицы, полученные из по меньшей мере двух (предпочтительно, двух или трех) ингибиторов ангиогенеза, где по меньшей мере две ингибирующие ангиогенез структурные единицы содержат по меньшей мере одну ингибирующую ангиогенез структурную единицу, полученную из внеклеточного домена VEGFR, и по меньшей мере одну ингибирующую ангиогенез структурную единицу, полученную из внеклеточного домена FGFR, при этом, внеклеточный домен VEGFR предпочтительно представляет собой внеклеточный домен VEGFR1, VEGFR2 и/или VEGFR3, а внеклеточный домен FGFR предпочтительно представляет собой внеклеточный домен FGFR1 и/или FGFR2.

В некоторых вариантах осуществления слитый белок по изобретению содержит по меньшей мере две ингибирующие ангиогенез структурные единицы, полученные из по меньшей мере двух (предпочтительно, двух или трех) ингибиторов ангиогенеза, где по меньшей мере две ингибирующие ангиогенез структурные единицы содержат по меньшей мере одну ингибирующую ангиогенез структурную единицу, полученную из внеклеточного домена VEGFR1 и/или VEGFR2, и одну ингибирующую ангиогенез структурную единицу, полученную из внеклеточного домена FGFR1.

В некоторых вариантах осуществления часть, полученная из внеклеточного домена VEGFR (такого как VEGFR1 и/или VEGFR2), содержит один или более элементов, выбранных из группы, состоящей из, или состоит из: первого Ig-подобного домена VEGFR (такого как VEGFR1 или VEGFR2) или его фрагмента, второго Ig-подобного домена VEGFR (такого как VEGFR1 или VEGFR2) или его фрагмента, третьего Ig-подобного домена VEGFR (такого как VEGFR1 или VEGFR2) или его фрагмента, четвертого Ig-подобного домена VEGFR (такого как VEGFR1 или VEGFR2) или его фрагмента, пятого Ig-подобного домена VEGFR (такого как VEGFR1 или VEGFR2) или его фрагмента, шестого Ig-подобного домена VEGFR (такого как VEGFR1 или VEGFR2) или его фрагмента и седьмого Ig-подобного домена VEGFR (такого как VEGFR1 или VEGFR2) или его фрагмента.

В некоторых вариантах осуществления часть, полученная из внеклеточного домена FGFR (такого как FGFR1), содержит один или более элементов, выбранных из группы, состоящей из, или состоит из: первого Ig-подобного домена FGFR (такого как FGFR1) или его фрагмента, где указанная часть получена из участка промежуточной функциональной последовательности Ig-подобного домена FGFR (такого как FGFR1), второго Ig-подобного домена FGFR (такого как FGFR1) или его фрагмента и третьего Ig-подобного домена FGFR (такого как FGFR1) или его фрагмента. В частности, домены и/или сегменты, содержащиеся в слитом белке по изобретению, могут быть связаны друг с другом непосредственно и/или через линкеры. В одном из конкретных вариантов осуществления слитый белок по изобретению содержит часть, полученную из участка промежуточной функциональной последовательности Ig-подобного домена FGFR (такого как FGFR1); предпочтительно, указанная часть, полученная из участка промежуточной функциональной последовательности Ig-подобного домена FGFR (такого как FGFR1), не содержит кислый бокс (АВ). В одном из конкретных вариантов осуществления часть, полученная из участка промежуточной функциональной последовательности имеет последовательность, выбранную из группы, состоящей из: аминокислотной последовательности, соответствующей положениям 134-162, положениям 145-162 или положениям 151-162 SEQ ID NO:1.

В одном из вариантов осуществления часть, полученная из внеклеточного домена VEGFR, содержит: второй Ig-подобный домен VEGFR1 или VEGFR2 и третий Ig-подобный домен VEGFR1 или VEGFR2; часть, полученная из внеклеточного домена FGFR (такого как FGFR1), содержит: часть, полученную из участка промежуточной функциональной последовательности Ig-подобного домена FGFR, второй Ig-подобный домен FGFR и третий Ig-подобный домен FGFR. Часть, полученная из участка промежуточной функциональной последовательности Ig-подобного домена FGFR, предпочтительно не содержит кислый бокс. В частности, указанный FGFR, пример, представляет собой FGFR1 или FGFR2.

В другом варианте осуществления часть, полученная из внеклеточного домена VEGFR, содержит: второй Ig-подобный домен VEGFR1 и третий Ig-подобный домен VEGFR2; часть, полученная из внеклеточного домена FGFR, содержит: часть, полученную из участка промежуточной функциональной последовательности Ig-подобного домена FGFR, второй Ig-подобный домен FGFR третий Ig-подобный домен FGFR. Часть, полученная из участка промежуточной функциональной последовательности Ig-подобного домена FGFR, предпочтительно не содержит кислый бокс. В частности, указанный FGFR, например, представляет собой FGFR1 или FGFR2.

В другом варианте осуществления часть, полученная из внеклеточного домена VEGFR, содержит последовательно в направлении от N-конца к С-концу второй Ig-подобный домен VEGFR1 и третий Ig-подобный домен VEGFR2; часть, полученная из внеклеточного домена FGFR, содержит последовательно в направлении от N-конца к С-концу, часть, полученную из участка промежуточной функциональной последовательности Ig-подобного домена FGFR, второй Ig-подобный домен FGFR и третий Ig-подобный домен FGFR. Часть, полученная из участка промежуточной функциональной последовательности Ig-подобного домена FGFR, предпочтительно не содержит кислый бокс. В частности, указанный FGFR, например, представляет собой FGFR1 или FGFR2.

В некоторых конкретных вариантах осуществления часть, полученная из внеклеточного домена VEGFR, также содержит первый Ig-подобный домен VEGFR1. Например, за первым Ig-подобным доменом VEGFR1 следует второй Ig-подобный домен VEGFR1. Первый Ig-подобный домен VEGFR1 предпочтительно имеет аминокислотную последовательность, соответствующую положениям 32-123 SEQ ID NO:2, или аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 70% идентичность, предпочтительно по меньшей мере 80%, 90%, 93%, 95%, 97%, 98% или 99% идентичность, с аминокислотной последовательностью, соответствующей положениям 32-123 SEQ ID NO:2.

В некоторых конкретных вариантах осуществления часть, полученная из внеклеточного домена FGFR (такого как FGFR1) дополнительно содержит первый Ig-подобный домен FGFR или его фрагмент. Первый Ig-подобный домен FGFR или его фрагмент предпочтительно имеет аминокислотную последовательность, соответствующую положениям 40-118 SEQ ID NO:1, или аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 70% идентичность, предпочтительно по меньшей мере 80%, 90%, 93%, 95%, 97%, 98% или 99% идентичность, с последовательностью, соответствующей положениям 40-118 SEQ ID NO:1; или

аминокислотную последовательность, соответствующую положениям 77-118 SEQ ID NO:1, или аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 70% идентичность, предпочтительно по меньшей мере 80%, 90%, 93%, 95%, 97%, 98% или 99% идентичность, с аминокислотной последовательностью, соответствующей положениям 77-118 SEQ ID NO:1.

В некоторых предпочтительных вариантах осуществления изобретения второй Ig-подобный домен VEGFR1 имеет аминокислотную последовательность, соответствующую положениям 151-214 SEQ ID NO:2, или аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 70% идентичность, предпочтительно по меньшей мере 80%, 90%, 93%, 95%, 97%, 98% или 99% идентичность, с аминокислотной последовательностью, соответствующей положениям 151-214 SEQ ID NO:2.

В некоторых других предпочтительных вариантах осуществления изобретения третий Ig-подобный домен VEGFR2 имеет аминокислотную последовательность, соответствующую положениям 224-320 SEQ ID NO:3, или аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 70% идентичность, предпочтительно по меньшей мере 80%, 90%, 93%, 95%, 97%, 98% или 99% идентичность, с аминокислотной последовательностью, соответствующей положениям 224-320 SEQ ID NO:3.

В некоторых других предпочтительных вариантах осуществления изобретения второй Ig-подобный домен FGFR1 имеет аминокислотную последовательность, соответствующую положениям 163-247 SEQ ID NO:1, или аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 70% идентичность, предпочтительно по меньшей мере 80%, 90%, 93%, 95%, 97%, 98% или 99% идентичность, с аминокислотной последовательностью, соответствующей положениям 163-247 SEQ ID NO:1.

В других предпочтительных вариантах осуществления изобретения третий Ig-подобный домен FGFR1 имеет аминокислотную последовательность, соответствующую положениям 270-359 SEQ ID NO:1, или аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 70% идентичность, предпочтительно по меньшей мере 80%, 90%, 93%, 95%, 97%, 98% или 99% идентичность, с аминокислотной последовательностью, соответствующей положениям 270-359 SEQ ID NO:1.

Предпочтительно, слитый белок по изобретению содержит дополнительную структурную единицу, например, Fc-область иммуноглобулина, предпочтительно, Fc-область человеческого IgG, более предпочтительно, Fc-область человеческого IgGI, более предпочтительно, слитый белок содержит:

аминокислотную последовательность, соответствующую SEQ NO:7. или аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 70% идентичность, предпочтительно по меньшей мере 80%, 90%, 93%, 95%, 97%, 98% или 99% идентичность, с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:7; или

аминокислотную последовательность, кодируемую нуклеотидной последовательностью, соответствующей SEQ ID NO:8, или аминокислотную последовательность, кодируемую нуклеотидной последовательностью, имеющей по меньшей мере 70% идентичность, предпочтительно по меньшей мере 80%, 90%, 93%, 95%, 97%, 98% или 99% идентичность, с нуклеотидной последовательностью SEQ ID NO:8.

В некоторых других вариантах осуществления слитый белок по изобретению дополнительно содержит область секреторного сигнального пептида, например, область сигнального пептида VEGFR1, и предпочтительно указанная область секреторного сигнального пептида имеет аминокислотную последовательность положений 1-26 SEQ ID NO:2 или аминокислотную последовательность, кодируемую нуклеотидной последовательностью SEQ ID NO:25.

В другом аспекте настоящее изобретение предоставляет Fc-слитый белок, содержащий:

(1) аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 70% идентичность, предпочтительно по меньшей мере 80%, 90%, 93%, 95%, 97%, 98% или 99% идентичность, с любой аминокислотной последовательностью из SEQ ID NO:9-24;

(2) аминокислотную последовательность, кодируемую нуклеотидной последовательностью, имеющей о меньшей мере 70% идентичность, предпочтительно по меньшей мере 80%, 90%, 93%, 95%, 97%, 98% или 99% идентичность, с любой нуклеотидной последовательностью из SEQ ID NO:26-41; или

(3) любую аминокислотную последовательность из SEQ ID NO:9-24, или аминокислотную последовательность, кодируемую любой нуклеотидной последовательностью из SEQ ID NO:26-41.

В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения части и/или домены, содержащиеся в VEGFR-FGFR-Fc слитом белке, могут быть расположены в любом порядке в направлении от N-конца к С-концу, например, как показано на Фиг. 1.

В некоторых вариантах осуществления VEGFR-FGFR-Fc слитый белок по настоящему изобретению дополнительно содержит сигнальный пептид (SP), предпочтительно секреторный сигнальный пептид, например, сигнальный пептид VEGFR1, который имеет аминокислотную последовательность, соответствующей положениям 1-26 SEQ ID NO:2 или аминокислотную последовательность, кодируемую нуклеотидной последовательностью SEQ ID NO:25. Сигнальный пептид предпочтительно локализован на N-конце слитого белка.

Предпочтительно, слитый белок по изобретению содержит последовательно в направлении от N-конца к С-концу часть, полученную из внеклеточного домена VEGFR, и часть, полученную из внеклеточного домена FGFR.

В слитом белке по настоящему изобретению Fc-область иммуноглобулина предпочтительно представляет собой Fc-область человеческого IgG, например, Fc-область человеческого IgG1, более предпочтительно, слитый белок содержит:

аминокислотную последовательность, соответствующую SEQ NO:1, или аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 70% идентичность, предпочтительно по меньшей мере 80%, 90%, 93%, 95%, 97%, 98% или 99% идентичность, с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:7; или

аминокислотную последовательность, кодируемую нуклеотидной последовательностью, соответствующей SEQ ID NO:8, или аминокислотную последовательность, кодируемую нуклеотидной последовательностью, имеющей по меньшей мере 70% идентичность, предпочтительно по меньшей мере 80%, 90%, 93%, 95%, 97%, 98% или 99% идентичность, с нуклеотидной последовательностью SEQ ID NO:8.

В одном из вариантов настоящего изобретения Fc-область иммуноглобулина локализована на С-конце слитого белка.

В некоторых вариантах настоящего изобретения области и/или домены, содержащиеся в VEGFR-FGFR-Fc слитом белке, могут находиться в любом порядке в направлении от N-конца до С-конца слитого белка. В некоторых других вариантах осуществления указанный порядок может быть таким, как показано на Фиг. 1. В некоторых конкретных вариантах осуществления часть VEGFR и часть FGFR могут быть расположены в прямом, в направлении от N-конца к С-концу, или противоположном порядке по отношению друг к другу, соответственно. Более того, Fc-область может находиться выше или ниже ингибирующей ангиогенез структурной единицы; например, Fc-область может находиться на С-конце слитого белка.

В некоторых вариантах VEGFR-FGFR-Fc слитый белок по настоящему изобретению дополнительно содержит одну или более межцепочечных дисульфидных связей, предпочтительно содержит одну или более межцепочечных дисульфидных связей в Ig-подобном домене.

В одном из аспектов настоящего изобретения VEGFR-FGFR-Fc слитый белок может быть получен в результате экспрессии слитого белка по изобретению в прокариотической или эукариотической клетке, например, клеточными линиями бактерий, грибов (таких как дрожжи) и млекопитающих. В частности, клеточная линия млекопитающих может представлять собой клеточную линию СНО. Клетки СНО представляют собой клеточную линию, часто используемую для экспрессии рекомбинантного белка. Помимо этого, исходную клетку СНО модифицируют, руководствуясь различными требованиями для крупномасштабной экспрессии, и, таким образом, для специализированной экспрессии была получена серия производных клеточных линий СНО, используемых для продуцирования рекомбинантных белков, например, для культуры, не содержащей серу, и т.п. Все они известны в области экспрессии рекомбинантных белков.

В другом аспекте домены и/или области, включенные в слитый белок по изобретению, связаны непосредственно друг с другом и/или через линкер, и, например, часть, полученная из внеклеточного домена VEGFR, часть, полученная из внеклеточного домена FGFR, и часть, полученная из Fc-области иммуноглобулина, могут быть связаны через линкер или непосредственно друг с другом. В одном из вариантов осуществления часть, полученная из внеклеточного домена VEGFR, часть, полученная из внеклеточного домена FGFR, и Fc-область иммуноглобулина непосредственно связаны друг с другом. В другом варианте осуществления часть, полученная из внеклеточного домена VEGFR, часть, полученная из внеклеточного домена FGFR, и Fc-область иммуноглобулина связаны посредством линкера, например, связаны посредством (С4S)₃ линкера.

В другом аспекте настоящее изобретение относится к изолированным молекулам нуклеиновой кислоты, кодирующей слитый белок. Молекула нуклеиновой кислоты предпочтительно содержит любую нуклеотидную последовательность из SEQ ID NO:26-41.

В другом аспекте настоящего изобретения предоставляется вектор, содержащий молекулу нуклеиновой кислоты. Также предоставляются клетки, предпочтительно клетки СНО, трансформированные/трансфицированные вектором.

В другом аспекте настоящего изобретения предоставляется фармацевтическая композиция, содержащая слитый белок по изобретению, молекулу нуклеиновой кислоты, вектор или клетку, и фармацевтически приемлемый носитель.

Настоящее изобретение также относится к способу продуцирования слитого белка для ингибирования ангиогенеза, который осуществляется путем экспрессии слитого белка по изобретению в прокариотических клетках или эукариотических клетках, например, клеточных линиях бактерий, грибов (таких как дрожжи) или млекопитающих. Предпочтительно, клеточная линия млекопитающих может представлять собой клеточную линию СНО.

В другом аспекте настоящего изобретения предоставляется способ ингибирования ангиогенеза, где способ содержит введение эффективного для ингибирования ангиогенеза количества слитого белка по изобретению, молекулы нуклеиновой кислоты, вектора, клетки или фармацевтической композиции, нуждающемуся в этом субъекту. Предпочтительно, способ осуществляется у млекопитающих.

В другом аспекте настоящего изобретения предоставляется способ лечения или профилактики опухолей у млекопитающих, где способ содержит ведение терапевтически или превентивно эффективного количества слитого белка по изобретению, молекулы нуклеиновой кислоты, вектора, клетки или фармацевтической композиции нуждающемуся в этом субъекту, предпочтительно, опухоль представляет собой солидную опухоль.

В другом аспекте настоящего изобретения предоставляется способ лечения или профилактики у млекопитающих заболеваний, связанных с офтальмологическим ангиогенезом, где способ содержит введение терапевтически или превентивно эффективного количества слитого белка по изобретению, молекулы нуклеиновой кислоты, вектора, клетки или фармацевтической композиции нуждающемуся в этом субъекту, при этом, заболевания, связанные с офтальмологическим ангиогенезом предпочтительно выбирают из группы, состоящей из возрастной дегенерации желтого пятна, диабетической ретинопатии т.п.

В другом аспекте настоящего изобретения предоставляется способ связывания FGF и/или VEGF in vitro или in vivo, содержащий обеспечение контакта FGF и VEGF со слитым белком по изобретению.

Настоящее изобретение также относится к применению слитого белка, молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей указанный слитый белок, вектора, содержащего указанную молекулу нуклеиновой кислоты, клетки, трансформированной/трансфицированной указанным вектором, или фармацевтической композиции, содержащей его, согласно настоящему изобретению для производства лекарственного средства для ингибирования ангиогенеза. Более того, настоящее изобретение также относится к применению слитого белка по настоящему изобретению, молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей указанный слиты белок, вектора, содержащего указанную молекулу нуклеиновой кислоты, клетки, трансформированной/трансфицированной указанным вектором, или фармацевтической композиции, содержащей его, для производства лекарственного средства для лечения или профилактики связанных с ангиогенезом заболеваний, причем связанные с ангиогенезом заболевания предпочтительно представляют собой опухоль или заболевание, связанное с офтальмологическим ангиогенезом.

Учитывая разные требования в разных странах к объекту, защищаемому в патентных системах, указанное раскрытие также предусматривает фармацевтическое применение, соответствующее указанным выше способам, и лекарственные средства для медицинского применения. Фармацевтическое применение и лекарственные средства также входят в объем защиты настоящего изобретения, как если бы они уже были конкретно описаны в настоящем раскрытии.

В настоящем описании приведены примеры только для нескольких конкретных вариантов осуществления изобретения, в отношении которого испрашивается защита, при этом технические признаки, описанные в одном или более технических предложениях, могут быть объединены с любым одним или более признаками одного и/или более технических предложений, и эти технические предложения, полученные путем комбинации, также входят в объем защиты заявки, как если бы эти технические предложения, полученные путем комбинации, были уже конкретно раскрыты в настоящем описании.

Ниже приводится более подробное описание настоящего изобретения со ссылкой на прилагаемые чертежи и описание в виде примеров, приведенных исключительно с целью иллюстрации. Следует иметь в виду, что приведенное ниже описание проиллюстрировано путем предоставления примеров технических предложений, заявленных в рамках настоящего изобретения, причем указанные примеры не следует рассматривать в качестве ограничения этих технических предложений. Объем защиты настоящего изобретения, определяется исключительно прилагаемой формулой изобретения.

Краткое описание чертежей

На Фиг. 1 представлена структура VEGFR-FGFR-Fc слитого белка, на которой отдельно указаны VEGFR1, VEGFR2 и FGFR1 белки. Fc-слитый белок показан жирной линией, а удаленная аминокислота показана пунктирной линией; антителоподобный домен представлен в виде окружности; разные антителоподобные домены обозначены буквой + номером, где домен VEGFR1 представлен как а1-а7, домен VEGFR2 представлен как b1-b7, домен FGFR1 представлен как с1-с3; дисульфидная связь обозначена s s; человеческий Fc IgG1 представлен в виде серого прямоугольника; сигнальный пептид обозначен SP; (G4S)₃-связывающая последовательность представлена в виде трех ромбов; последовательность кислого бокса представлена в виде прямоугольника, обозначенного АВ.

Фиг. 2 представляет собой сравнительную диаграмму, демонстрирующую связывание VEGF и FGF-2 соответствующими Fc-слитыми белками, на которой связывание между соответствующим Fc-слитым белком (20 нг/мл) и VEGF165 и/или FGF-2 (содержащими 100 нг/мл гепарина), иммобилизованными на планшете, определено методом ELISA.

На Фиг. 3 показано изображение SDS-PAGE геля для слитого белка.

На Фиг. 4 показано связывание VEGF (А) и FGF-2 (В) в зависимости от градиента концентрации слитых белков.

На Фиг. 5 показана аффинность слитого белка к VEGF (А) и FGF-2 (В).

На Фиг. 6 показано влияние слитого белка на деление клеток HUVEC, индуцированное VEGF или FGF-2, и относительные уровни ингибирования. На Фиг. 6А показано влияние слитого белка на пролиферацию клеток HUVEC, индуцированную VEGF, а на Фиг. 6В показаны относительные уровни ингибирования слитым белком пролиферации клеток