Плазмида для экспрессии в клетках сно рекомбинантного фолликулостимулирующего гормона (фсг) человека, плазмида для экспрессии в клетках сно бета-субъединицы рекомбинантного фсг человека, клетка сно - продуцент рекомбинантного фсг человека и способ получения указанного гормона

Плазмида для экспрессии в клетках сно рекомбинантного фолликулостимулирующего гормона (фсг) человека, плазмида для экспрессии в клетках сно бета-субъединицы рекомбинантного фсг человека, клетка сно - продуцент рекомбинантного фсг человека и способ получения указанного гормона

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Область техники

Изобретение относится к биотехнологии, конкретно к способу получения рекомбинантного фолликулостимулирующего гормона человека, который может быть использован в медицине, методом рекомбинантных ДНК.

Предшествующий уровень техники

Фолликулостимулирующий гормон (ФСГ) является незаменимым для нормального роста и созревания фолликулов и для образования половых стероидов у человека. У женщин уровень ФСГ является критичным для начала и протекания развития фолликулов и, следовательно, для установления определенного ритма созревания и количества достигающих зрелости фолликулов, у мужчин - для индукции и поддержания сперматогенеза. Вследствие этого рекомбинантные и нативные варианты фолликулостимулирующего гормона могут применяться для стимуляции развития фолликулов и образования стероидов во многих случаях нарушения половой функции. Существенная часть производимых лекарственных средств ФСГ используется при применении вспомогательных репродуктивных технологий, проводимых под медицинским контролем, таких как экстракорпоральное оплодотворение и перенос эмбрионов (ЭКО/ПЭ), перенос гамет в маточную трубу (ГИФТ) и интрацитоплазматическая инъекция сперматозоида (ИКСИ) (van Wely M. et al. (2011), "Recombinant versus urinary gonadotrophin for ovarian stimulation in assisted reproductive technology cycles". Cochrane Database of Syst. Rev., 2: CD005354).

В клинической практике препараты, содержащие ФСГ, обычно используют при ановуляторном бесплодии у женщин, а также при применении вспомогательных репродуктивных технологий у пациенток с: (1) первым классом ановуляторного бесплодия (гипоталамо-гипофизарная недостаточность), для которого характерны очень низкие содержания эндогенных ФСГ, лютеинизирующего гормона (ЛГ) и эстрадиола; (2) второго класса ановуляторного бесплодия (гипоталамо-гипофизарная дисфункция), для которого характерны низкий или нормальный уровень эндогенного ФСГ, высокое или нормальное содержание эндогенного ЛГ, высокий или нормальный уровень тестостерона, а также при наличии мужского фактора бесплодия (Dhont M. (2005), "WHO-classification of anovulation: background, evidence, problems. International congress series. 1279:3-9).

На сегодняшний день существует два класса фармацевтических препаратов, содержащих ФСГ: полученные из мочи женщин в постменопаузе и полученные с использованием рекомбинантных ДНК. Препараты ФСГ мочевого происхождения появились на рынке много лет назад (1958 г.) и на сегодняшний день представлены: высокоочищенными мочевыми гонадотропинами с биохимической чистотой ФСГ до 77-95% и содержащими около 2% активности ЛГ; мочевыми гонадотропинами с биохимической чистотой ФСГ до 70%, а также содержащими ЛГ, хорионический гонадотропин (ХГ) и существенные количества посторонних белков, не относящихся к гонадотропинам. Применение технологии рекомбинантной ДНК позволило получить фармацевтические препараты ФСГ, содержащие рекомбинантный ФСГ человека с чистотой более 99% и не содержащих других гонадотропинов. Разработка новых методов и подходов, позволяющих получать большие количества рекомбинантного ФСГ в культивируемых клетках млекопитающих, представляет большой интерес для фармацевтической промышленности вследствие постоянного роста потребления лекарственных препаратов ФСГ и низкой продуктивности разработанных в конце 80-х годов прошлого века систем экспрессии ФСГ, использованных для производства оригинальных препаратов рекомбинантного ФСГ. Оптимизация эукариотической системы экспрессии рекомбинантного ФСГ, проведенная путем многократного увеличения удельной продуктивности получаемой моноклональной клеточной линии лежат в основе настоящего изобретениия.

ФСГ - гетеродимерный гликопротеиновый гормон (34 кДа), продуцирующийся аденогипофизом. Он состоит из двух нековалентно связанных друг с другом субъединиц, кодирующихся разными генами (Pierce J.G., Parsons T.F. (1981), "Glycoproteinhormones: structureandfunction". Annu.Rev. Biochem., 50:465-495). Альфа-субъединица ФСГ человека содержит 92 а.к. и также представлена в лютеинезирующем гормоне, хорионическом гонадотропине и тиреотропном гормоне (ТТГ). Все данные гормоны являются гетеродимерами одинаковой альфа-цепи и различных специфических бета-цепей (или субъединиц). Бета-субъединица ФСГ состоит из 111 а.к. Альфа- и бета-субъединицы ФСГ человека подвергаются N-гликозилированию по остаткам аспарагина альфа-52, альфа-78 и бета-7, бета-24 соответственно, что определяет высокую степень гликозилирования ФСГ до 35% в весовом соотношении, тем самым создавая микрогетерогенность гормона (Mulders J.W. et al. (1997). "Prediction of the in vivo Biological Activity of Human Recombinant Follicle Stimulating Hormone Using Quantitative Isoelectric Focusing". Biologicals, 25(3):269-81). Вторичные модификации карбогидратных цепей включают образование разветвленных структур на основе сиаловых кислот, количественный и качественный состав которых определяет время полужизни ФСГ в кровотоке, биологическую активность гормона in vivo и способность к активации рецепторов ФСГ in vitro (Ulloa-Aguirre A. et al. (1995). "Follicle-stimulating isohormones: characterization and physiological relevance". EndocrRev.; 16(6):765-87). Изогормоны ФСГ с изоэлектрической точкой (pI) 5.5 в 2-3 раза превышают способность к активации рецепторов ФСГ в тестах in vitro изогормонами с pI 4.3, в то же время наиболее кислые формы изогормонов ФСГ (pI 3.5) имеют в 100-200 раз большую биологическую активность в тестах in vivo, по сравнению с изогормонами, имеющими pI 5.5 (Mulders J.W. et al. (1999). "Prediction of the in-vivo biological activity of human recombinant follicle-stimulating hormone using quantitative isoelectric focusing. Optimization of the model". Pharm. Pharmacol. Commun., 5:51-55).

Известен самый первый способ создания векторов, кодирующих альфа- и бета-субъединицы ФСГ человека, и генетическая модификация этими векторами культивируемых клеток мыши линии С127 в целях получения рекомбинантного ФСГ (патенты США 4923805, 5156957). Для экспрессии генов альфа- и бета-субъединиц ФСГ, содержащих все экзоны и интроны, используются две независимые плазмидные конструкции pRF375 и CL28FSH2.8BPV соответственно. Недостатком описанного способа является использование для экспрессии целевых генов металлотеонеинового промотора (МТ) мыши, который не является наиболее сильным для экспрессии белков в эукариотических клетках. Также полученные плазмиды не были использованы для создания стабильной линии клеток-продуцентов полноразмерного ФСГ человека, поэтому неизвестен уровень секреции рекомбинантного ФСГ в культуральную среду при использовании полученных плазмид.

Известен способ получения векторов, кодирующих альфа- и бета-субъединицы ФСГ человека, и генетическая модификация этими векторами культивируемых клеток китайского хомяка линии СНО (Keene J.L. et al. (1989). "Expression of biologically active human follitropin in Chinese hamster ovary cells". J. Biol. Chem., 264:4769-4775). Гены альфа- и бета-субъединицы ФСГ, содержащие интроны и экзоны, клонируют в векторы рМ²/α и рМ² соответственно, экспрессия субъединиц находится под контролем промотора вируса саркомы мышей Харви (LTR). К недостаткам этого способа относится использование генов субъединиц ФСГ человека, содержащих интроны, которые могут содержать как энхенсерные, так и сайленсерные регуляторные элементы, положительно и отрицательно влияющие на экспрессию кодируемого белка. Обе созданные плазмиды содержат последовательность, обеспечивающую устойчивость трансфицированных клеток к селективному антибиотику - генетицину (G418), тогда как использование двух селективных антибиотиков и последовательности дигидрофолатредуктазы мыши (DHFR) для селективного отбора и амплификации являются более перспективными при создании генетической модификации клеточных культур. При описании данного способа не указывается продуктивность по целевому белку полученной клеточной линии, а также на протяжении скольких пассажей сохраняется продукция ФСГ.

Известен другой способ создания эукариотических продуцентов рекомбинантных гетеродимерных гормонов человека, в том числе ФСГ (патент США 5240832). Способ основан на получении двух независимых плазмидных конструкций. Первая плазмида создана на основе вектора CLH3AXSC2DHFR и содержит полноразмерный ген альфа-субъединицы ФСГ человека, а также открытую рамку считывания DHFR для селективного отбора и амплификации в эукариотических клетках. Вторая плазмида создана на основе вектора CLH3AXSC20DOC и содержит кДНК бета-субъединицы ФСГ человека, ген орнитин декарбоксилазы (ODC) мыши для селективного отбора трансформантов. Экспрессия генов обеих субъединиц ФСГ находится под контролем МТ промотора. С помощью котрансфекции линии клеток DUKX СНО двумя вышеописанными плазмидами с последующей их амплификацией в среде с добавлением 200 мМ метотрексата (МТХ) получают несколько линий клеток-продуцентов ФСГ. Уровень секреции полноразмерного ФСГ в культуральную среду по 9 полученным линиям составляет в среднем 1,25 мкг/10⁶ клеток/день. К недостаткам этого метода относится использование полноразмерного гена альфа-субъединицы ФСГ человека, так как интроны могут содержать сайленсерные регуляторные элементы, отрицательно влияющие на экспрессию кодируемого белка в процессе культивирования. При описании данного способа не указывается конечная концентрация секретируемого ФСГ (т.н. вольюметрическая продуктивность) и число пассажей культуры до падения уровня секреции.

Известен способ создания продуцентов рекомбинантного человеческого ФСГ на основе линии клеток СНО-K1 (Olijve W. et al. (1996). "Molecular biology and biochemistry of human recombinant folliclestimulating hormone" Mol. Hum. Rep., 2(5):371-382). Ген альфа-субъединицы ФСГ, содержащий интроны, и открытую рамку считывания бета-субъединицы ФСГ клонируют в вектор pKMS, созданный на основе вектора pBR327, с получением вектора pKMS.FSHαgβg, в котором экспрессия гена альфа-субъединицы находится под контролем раннего вирусного промотора SV40, с содержанием энхенсерных последовательностей SV40, а бета-субъединицы - под контролем металлотеонеинового промотора (MT-II), с содержанием энхенсерных последовательностей вируса лейкемии мышей (MuLV). Амплификацию плазмиды в геноме эукариотических клеток СНО-K1 обеспечивает открытая рамка считывания дигидрофолатредуктазы мыши, присутствующая в векторе pKMS.FSHαgβg. Клетки СНО-K1 котрансфицируют плазмидами pKMS.FSHαgβg и вспомогательной плазмидой pAG60/MT2, содержащей ген металлотеонеина и ген устойчивости к неомицину, которые обеспечивают резистентность культуры клеток к тяжелым металлам (Cd²⁺) и селективному антибиотику генетицину (G418) соответственно. Продуктивность линии-продуцента сохраняется при культивировании в биореакторе на микроносителях на протяжении 3-х месяцев и составляет 5-8 МЕ/10⁶ клеток/день, что приблизительно соответствует 0,5-0,8 мкг/10⁶ клеток/день. Данный способ обладает недостатками, а именно: для экспрессии гетерологического белка в эукариотической системе используются неоптимальные промоторы - металлотеонеиновый (МТ-II) и вирусный (SV40), активность последнего может подавляться клетками в процессе культивирования. Также наличие интронов в клонированной последовательности альфа-субъединицы ФСГ может индуцировать отрицательную регуляцию экспрессии этой субъединицы в клетках.

Известен способ получения плазмиды pXM17ss#6 для экспрессии альфа- и бета-субъединиц ФСГ человека в клетках эукариот, которая способна экспрессировать оптимизированные кодирующие синтетические последовательности альфа- и бета-субъединиц ФСГ (патентная заявка США 20120034655 А1). К недостаткам данного метода относится выбор неоптимальных вирусных промоторов (SV40 и CMV), проведение только временной трансфекции полученной плазмидой без проведения амплификации экспрессионной кассеты метотрексатом и дальнейшей селекции антибиотиком, так как известно, что свойства поликлональной культуры клеток после проведения временной трансфекции и стабильно-трансфицированной клеточной культуры могут значительно различаться как по стабильности, так и по продуктивности целевого белка.

Известен способ создания клеток-продуцентов ФСГ с использованием синтетических генов альфа- и бета-субъединиц ФСГ человека (патентная заявка РФ №2012106207). Синтетический ген альфа-субъединицы ФСГ человека клонируют в вектор pcDNA-TOPO (Invitrogen, США) с получением плазмиды pcDNA/FSHальфа, для получения плазмиды pOptiVEC/FSHбета синтетический ген бета-субъединицы клонируют в вектор pOptiVEC-TOPO (Invitrogen, США). В обеих полученных плазмидах экспрессия альфа- и бета-субъединиц ФСГ находится под контролем конститутивного промотора цитомегаловируса (CMV), плазмида pcDNA/FSHальфа содержит ген устойчивости к антибиотику неомицин для селекции стабильных клеточных линий генетицином, плазмида pOptiVEC/FSHбета содержит последовательность дигидрофолатредуктазы. После проведения котрансфекции клеток линии СНО K1 DXB11 полученными плазмидами, получают линию клеток huFSHIK, которая способна секретировать в культуральную среду полноразмерный гормон ФСГ в количестве 1,5 мкг/10⁶ клеток/день в течение 30 пассажей при культивировании с МТХ (в селективных условиях) и, по крайней мере, в течение 15 пассажей без МТХ (в неселективных условиях). Данный метод обладает следующими недостатками. Для экспрессии генов обеих субъединиц ФСГ используется промотор цитомегаловируса (CMV), эффективность которого для экспрессии генов-интереса может изменяться как в течение культивирования модифицированной культуры клеток, так и при криоконсервации клеточной культуры, что может приводить к снижению продуктивности экспрессии каждого из генов двух субъединиц и впоследствии к значительному стехиометрическому дисбалансу в продукции альфа- и бета-субъединиц ФСГ. Также при получении клеток-продуцентов ФСГ клетки культивировали в присутствии 50-100 нМ метотрексата, что недостаточно для получения максимальной амплификации экспрессионных кассет в геноме. Синтетические последовательности открытых рамок считывания альфа- и бета-субъединиц ФСГ были получены путем оптимизации кодонов для экспрессии в млекопитающих, в то же время известно, что оптимизация кодонов и другие манипуляции с кодирующей последовательностью могут приводить к снижению уровней экспрессии целевых генов. Культивирование генетически модифицированных плазмидами клеток проводили в среде с добавлением 10% сыворотки крупного рогатого скота (FBS), что также является недостатком описанного метода ввиду неэкономичности использования FBS при промышленном культивировании клеток, а также наличии риска потери продуктивности клеточной культуры при адаптации к росту в бессывороточной среде культивирования и постоянному риску контаминации промышленной культуры вирусами крупного рогатого скота и прионами.

Известны способ получения вектора, содержащего гены альфа- и бета-субъединицы ФСГ человека, и линия-продуцент рекомбинантного ФСГ, полученная после трансфекции созданным вектором линии клеток DUKX-B11 СНО (Yoon S.K. et al. (2007). "Effect of culture temperature on follicle-stimulating hormone production by Chinese hamster ovary cells in a perfusion bioreactor". Appl. Microbiol. Biotechnol., 76:83-89). Из описания способа неизвестно, какой вектор и структурные элементы были использованы для создания экспрессионной плазмиды. С помощью данного способа получают стабильную клеточную линию, способную при культивировании в биореакторе с перфузией при 28°С продуцировать ФСГ в количестве более 10 мкг/10⁶ клеток/день. К недостаткам данного способа относится возможность получения продуцируемого ФСГ на высоком уровне лишь в течение 8 дней их культивирования (с 15 по 23 день культивирования).

Известен способ получения двух плазмид, кодирующих альфа- и бета-субъединицы ФСГ на основе вектора pLCED, созданного с использованием модифицированного вектора pCDM8 (Invitrogen, США) (Kim D.J. et al. (2010). "Highly expressed recombinant human follicle-stimulating hormone from Chinese hamster ovary cells grown in serum-free medium and its effect on induction of folliculogenesis and ovulation". Fertil. Steril., 93:2652-60). Открытую рамку считывания обеих субъединиц получают с помощью последовательно проведенных полимеразных цепных реакций (ПЦР) и клонируют в отдельный вектор pLCED. Экспрессия субъединиц в клетках СНО начинается независимо по контролем вирусного промотора (CMV), причем обе плазмиды способны экспрессировать также ген DHFR, связанный с генами субъединиц участком, содержащим сайт внутреннего связывания рибосом (IRES). Продуктивность получаемой клональной линии составляет 0,0085 мМЕ/клетку/48 часов, что составляет приблизительно 0,425 мкг/10⁶ клеток/день. К недостаткам данного способа относится использование неоптимальных вирусных промоторов и невысокий уровень продукции ФСГ. Информация о стабильности полученной культуры к продукции ФСГ также отсутствует.

Известен способ создания продуцента ФСГ, в котором последовательность, кодирующую альфа-субъединицу ФСГ, клонируют в вектор рЕ-neo, а последовательность, кодирующую бета-субъединицу, - в вектор pE-hygr (патентная заявка США 2009/0291473 А1). кДНК альфа-субъединицы получают путем ПЦР из библиотеки кДНК человеческой плаценты, а кДНК бета-субъединицы из библиотеки кДНК человеческого гипофиза. Клетки линии СНО котрансфицируют полученными плазмидами и производят селекцию клонов с использованием антибиотиков - гигромицина и генетицина (G418), получают клеточную линию, адаптированную к росту в суспензии в бессывороточной среде, продуктивность которой не превышает 1 мкг ФСГ/10⁶ клеток/день. При данном способе для индукции экспрессии обеих субъединиц используется промотор EF-1 (коровая область промотора фактора элонгации трансляции 1 человека), который является относительно слабым промотором для экспрессии белков в клетках грызунов. Стабильность продукции ФСГ линией-продуцентом в данной заявке не упоминается.

Известны способы повышения биологической активности рекомбинантного ФСГ за счет увеличения его гликозилирования (патентные заявки США 2009/0018070 А1, 2005/0100989 А1) и добавления C-концевого пептида (СТР, carboxyterminalpeptide) бета-субъединицы человеческого хорионического гонадотропина к бета-субъединице ФСГ (патенты США 5338835 и 5585345).

Краткое описание настоящего изобретения

Технической задачей, решаемой авторами, являлось создание высокопродуктивной технологии получения рекомбинантного фолликулостимулирующего гормона человека для биофармацевтического производства.

Технический результат достигался путем создания пары новых совместимых экспрессионный плазмидных ДНК p1.1-FSH-AIB и p1.2-Hygro-B-chain, кодирующих открытые рамки считывания альфа- и бета-цепей гетеродимерного белка фолликулостимулирующего гормона человека и создание на их основе клональной клеточной линии-продуцента.

В основе данной технологии лежит разработанная пара совместимых плазмидных ДНК p1.1-FSH-AIB (длина 13222 пар оснований, SEQ ID NO:1, Фиг.1) и p1.2-Hygro-B-chain (длина 12811 пар оснований, SEQ ID NO:4, Фиг.2).

Плазмида p1.1-FSH-AIB состоит из:

- фрагмента ДНК длиной 1324 п.о., в следующей последовательности содержащего:

- последовательность 363 п.о. (SEQ ID NO:1 4079-4441), содержащую синтетическую последовательность Козак (сайт кэп-зависимой инициации трансляции), SEQ ID NO:1 4079-4087), обеспечивающую инициацию трансляции мРНК, и ОРС альфа-субъединицы фолликулостимулирующего гормона человека (SEQ ID NO:1 4088-4438) с блоком стоп-кодонов (SEQ ID NO:1 4436-4441),

- последовательность 955 п.о. (SEQ ID NO:1 4448-5402), содержащую последовательность IRES вируса энцефаломиокардита (EMCV) дикого типа (SEQ ID NO:1 4448-5012), обеспечивающую бицистронную экспрессию в животных клетках, и ОРС бета-субъединицы фолликулостимулирующего гормона человека (SEQ ID NO:1 5010-5399) с блоком стоп-кодонов (SEQ ID NO:1 5397-5402); и

- фрагмента ДНК длиной 11898 п.о. плазмиды p1.1 (SEQ ID NO:1 5403-13222, 1-4074, Фиг.3), в следующей последовательности содержащего регуляторные элементы, обеспечивающие экспрессию целевого белка:

- последовательность IRES вируса энцефаломиокардита (EMCV), обеспечивающая бицистронную экспрессию в животных клетках, (SEQ ID NO:1 5423-6010) и последовательность фактора устойчивости трансфицированных клеток к воздействию метотрексата - дигидрофолатредуктазы (DHFR) (SEQ ID NO:1 6023-6586),

- 3′ нетранслируемую область (3′НТО) гена фактора элонгации 1 альфа китайского хомячка, включающую терминатор и сигнал полиаденилирования этого гена, а также фланкирующие нетранскрибируемые области этого гена, обеспечивающие эухроматинизацию сайтов инсерции и транскрипционную активность генетической кассеты в геноме СНО (SEQ ID NO:1 6588-10846);

- область начала репликации плазмиды pUC, открытую рамку считывания бета-лактамазы (bla) и прокариотический промотор гена bla, обеспечивающей устойчивость бактерий к антибиотику ампициллину, позволяющие проводить препаративную наработку плазмиды в Е.coli (SEQ ID NO:1 11000-10846), и участок терминального повтора вируса Эпштейн-Барр человека (EBVTR) (SEQ ID NO:1 12810-13211);

- 5′ нетранслируемую область (5′НТО) гена фактора элонгации 1 альфа китайского хомячка, включающие фланкирующие нетранскрибируемые области этого гена, обеспечивающие эухроматинизацию сайтов инсерции и транскрипционную активность генетической кассеты в геноме СНО, и его функциональный промотор (SEQ ID NO:1 11-4074).

Плазмида p1.2-Hygro-B-chain состоит из:

- фрагмента ДНК, длиной 402 п.о., в следующей последовательности содержащего, последовательность 363 п.о. (SEQ ID NO:4 12409-12810), содержащую синтетическую последовательность Козак (сайт кэп-зависимой инициации трансляции, SEQ ID NO:1 12409-12417), обеспечивающую инициацию трансляции мРНК, и ОРС цепи бета-субъединицы фолликулостимулирующего гормона человека (SEQ ID NO:1 12418-12804) с блоком стоп-кодонов (SEQ ID NO:1 12805-12810),

- фрагмента 12409 п.о. плазмиды р1.2 (SEQ ID NO:4 1-12408, Фиг.4), в следующей последовательности содержащего регуляторные элементы, обеспечивающие экспрессию целевого белка:

- 3′ нетранслируемую область (3′НТО) гена фактора элонгации 1 альфа китайского хомячка, включающую терминатор и сигнал полиаденилирования этого гена, а также фланкирующие нетранскрибируемые области этого гена, обеспечивающие эухроматинизацию сайтов инсерции и транскрипционную активность генетической кассеты в геноме СНО (SEQ ID NO:4 1-4257);

- промотор вируса SV40, последовательность фактора устойчивости трансфицированных клеток к селекционному маркеру - антибиотику гигромицину, сигнал полиаденилирования и терминатор вируса SV40 (SEQ ID NO:4 4292-5946),

- область начала репликации плазмиды pUC, открытую рамку считывания бета-лактамазы (bla) и прокариотический промотор гена bla, обеспечивающей устойчивость бактерий к антибиотику ампициллину, позволяющие проводить препаративную наработку плазмиды в Е.coli (SEQ ID NO:4 6108-6781),

- участок терминального повтора вируса Эпштейн-Барр человека (EBVTR) (SEQ ID NO:4 7918-8319),

- 5′ нетранслируемую область (5′НТО) гена фактора элонгации 1 альфа китайского хомячка, включающую фланкирующие нетранскрибируемые области этого гена, обеспечивающие эухроматинизацию сайтов инсерции и транскрипционную активность генетической кассеты в геноме СНО функциональный промотор этого гена, а также его функциональный промотор (SEQ ID NO:4 8331-12401).

Плазмида p1.1-FSH-AIB имеет размер 13222 п.о. и содержит уникальные сайты узнавания эндонуклеазами рестрикции NheI (1), AgeI (2396), AscI (5464), PvuI (6857), BstBI (11863), AbsI (11894), XbaI (12080).

Плазмида p1.2-Hygro-B-chain имеет размер 12811 п.о. и содержит уникальные сайты узнавания эндонуклеазами рестрикции AgeI (1209), KpnI (4143), NdeI (5120), PsiI (5844), SalI (5962), SwaI (10487), FseI (11171), AbsI (12404).

Плазмиды были последовательно введены методом электротрансфекции (Straus S.E. et al., J. Virol., 1981, Jul; 39(1):290-4) в клетки линии CHO-S (Invitrogen, США; кат. № R800-07), адаптированной к бессывороточной ростовой среде и выделенной в виде отдельного субклона из клеточной линии CHOK1. После введения в клетки линеаризованной плазмиды p1.1-FSH-AIB вели культивацию в безбелковой среде, не содержащей гипоксантин и тимидин, и дополнительно содержащей 1 мкМ ингибитора DHFR метотрексата (МТХ) до восстановления жизнеспособности клеток более 85%. После этого была проведена амплификация целевых генов цепей ФСГ в геноме путем последовательных культивировании в присутствии возрастающих концентраций метотрексата до концентрации МТХ 8 мкМ. Была получена поликлональная популяция клеток, устойчивых к высокой концентрации МТХ и продуцирующих увеличенные количества ФСГ и значительные количества свободной альфа-цепи ФСГ. Клетки данной популяции трансфицировали плазмидой p1.2-Hygro-B-chain, после чего культивировали в присутствии 8 мкМ МТХ и 750 мкг/мл гигромицина до восстановления жизнеспособности клеток более 85%. Была получена популяция клеток, секретирующих большее количество гетеродимера ФСГ. Клетки данной популяции подвергли клонированию методом предельных разведений. Полученные клоны клеток-продуцентов были проанализированы методом иммуноферментного анализа, и были отобраны клоны, дающие максимальный уровень экспрессии гетеродимера ФСГ. Среди них был выбран клон C-P1.3-FSH-G4, при культивировании которого в суспензионной культуре в бессывороточной среде конечная концентрация фолликулостимулирующего гормона человека составляла 36,5 мкг/мл при конечной концентрации клеток 1,55 млн/мл, удельная продуктивность не менее 10 пг/клетка/день. Полученная клеточная линия C-P1.3-FSH-G4 депонирована во Всероссийской Коллекции Промышленных Микроорганизмов (ВКПМ) под регистрационным номером ВКПМ Н-140.

Целью настоящего изобретения является предоставление плазмид для экспрессии рекомбинантного фолликулостимулирующего гормона человека, в частности плазмид p1.1-FSH-AIB и p1.2-Hygro-B-chain. Также целью настоящего изобретения является предоставление моноклональной линии клеток млекопитающего, в частности клеток яичника китайского хомячка, - продуцентов рекомбинантного фолликулостимулирующего гормона человека, содержащей в геноме множественные копии экспрессионных кассет, соответствующих линеаризованным экспрессионным плазмидам, в частности плазмидам p1.1-FSH-AIB и p1.2-Hygro-B-chain. Иллюстративным примером указанной моноклональной линии клеток являются клетки яичника китайского хомячка клона С-P1.3-FSH-G4.

Также целью настоящего изобретения является предоставление способа получения рекомбинантного фолликулостимулирующего гормона человека с использованием указанных клеток.

Подробное описание настоящего изобретения

Для реализации настоящего изобретения главной технической задачей явилось создание технологии высокопродуктивного получения рекомбинантного фолликулостимулирующего гормона человека для биофармацевтического производства с использованием культивируемых клеток яичника китайского хомячка, адаптированных к суспензионному культивированию в безбелковой среде, содержащих в геноме множественные копии генетических кассет, представляющих собой линеаризованные экспрессионные плазмиды, содержащих фрагмент ДНК, кодирующих альфа- и бета-цепи фолликулостимулирующего гормона человека под контролем промотора и регуляторных элементов, функционирующих в эукариотической клетке.

Термин «экспрессионная плазмида» («экспрессионная плазмидная ДНК») означает плазмидную ДНК, содержащую все необходимые генетические элементы для экспрессии внедренного в него гена, например, такие как промотор, терминатор, сигнал полиаденилирования. Конкретным примером генетических элементов, необходимых для экспрессии рекомбинантного фолликулостимулирующего гормона в составе экспрессионной кассеты согласно настоящему изобретению, является, но не ограничивается им, промотор гена фактора элонгации 1 альфа китайского хомячка.

Фрагментами ДНК, кодирующими рекомбинантный фолликулостимулирующий гормон человека согласно настоящему изобретению, являются гены, кодирующие ОРС полипептидов альфа- и бета-цепей ФСГ, которые могут быть получены, например, как указано в Примере 1. Также указанные фрагменты ДНК могут быть получены, например, с использованием технологии клонирования фирмы SloningBioTechnology, описанной в заявке РСТ WO2005071077.

Последовательность искусственного гена, кодирующего ОРС обеих субъединиц рекомбинантного фолликулостимулирующего гормона человека согласно настоящему изобретению, представлена в Перечне последовательностей под номером SEQ ID NO:1 (цепь альфа-субъединицы - нуклеотиды 4088-4438, цепь бета-субъединицы - нуклеотиды 5010-5399). Аминокислотная последовательность секретируемого фолликулостимулирующего гормона человека согласно настоящему изобретению представлена в Перечне последовательностей под номерами SEQ ID NO:2 и 3, и представляет собой продукт трансляции нуклеотидов 4088-4438 и 5010-5399 последовательности ОРС SEQ ID NO:1, включая 24 аминокислоты N-концевого сигнального пептида альфа-цепи и 18 аминокислот N-концевого сигнального пептида бета-цепи, отделяющихся при посттрансляционном процессинге цепей ФСГ и отсутствующих в зрелом секретированном гетеродимерном белке. Часть молекул цепей ФСГ может быть секретирована в свободной форме, для целей настоящего изобретения важно накопление только двуцепочечной формы гетеродимера цепей ФСГ в культуральной среде.

Чтобы обеспечить эффективную трансляцию гена в клетках китайского хомячка, предпочтительно, чтобы ОРС предварялась последовательностью для кэп-зависимой инициации трансляции (последовательность Козак), например, синтетической. Для кэп-независимой инициации трансляции предпочтительно использование вирусных регуляторных элементов класса сайтов внутреннего связывания рибосом (IRES).

Фрагменты ДНК, которые кодируют по существу тот же белок, могут быть получены, например, путем модификации нуклеотидной последовательности фрагмента ДНК SEQ ID NO:1 (цепь альфа-нуклеотиды 4088-4438, цепь бета-нуклеотиды 5010-5399), например, посредством метода сайт-направленного мутагенеза, так, что один или несколько аминокислотных остатков в определенном сайте будут делегированы, заменены, вставлены или добавлены. Фрагменты ДНК, модифицированные, как описано выше, могут быть получены с помощью традиционных методов обработки с целью получения мутации. Фрагменты ДНК, которые кодируют по существу такой же функциональный белок, могут быть выявлены путем экспрессии фрагментов ДНК, имеющих мутацию, описанную выше, в соответствующей клетке и установления активности экспрессируемого продукта.

ФСГ - гетеродимерный гликопротеиновый гормон (34 кДа), продуцирующийся аденогипофизом, и состоит из двух нековалентно связанных друг с другом субъединиц, кодирующихся разными генами (Pierce J.G., Parsons T.F. (1981), "Glycoproteinhormones: structureandfunction". Annu. Rev. Biochem., 50:465-495).

Показатели функциональной активности, при которой считается, что полученный белок обладает свойствами рекомбинантного фолликулостимулирующего гормона человека, определяются по его способности стимулировать рост фолликулов. Так, например, биологическую активность рекомбинантного фолликулостимулирующего гормона человека можно определить с помощью теста Steelman-Pohley, по линейному увеличению веса яичников крыс в зависимости от вводимой дозы препарата ФСГ (Steelman S.L., Pohley F.M. (1953) "Assay of the follicle stimulating hormone based on the augmentation with human chorionic gonadotropin". Endocrinology, 53:604-16). Концентрацию гетеродимерного фолликулостимулирующего гормона человека определяют при помощи иммуноферментного анализа в сравнении со стандартом, в качестве которого можно использовать образцы плазмы крови женщин, калиброванные против первичного международного стандарта ФСГ, изготовляемого Всемирной Организацией Здравоохранения, например стандарта NIBSC code: 08/282. Удельную активность фолликулостимулирующего гормона человека определяют как отношение активности и концентрации ФСГ и выражают в МЕ/мг. Считается, что вариант белка обладает свойствами рекомбинантного фолликулостимулирующего гормона человека при условии, что удельная активность указанного варианта составляет не ниже 1% от удельной активности природного фолликулостимулирующего гормона человека, выделяемого из мочи, то есть не менее 60 МЕ/мг.

Экспрессионная плазмида согласно настоящему изобретению содержит фрагмент ДНК, кодирующий цепи альфа- и бета-субъединиц фолликулостимулирующего гормона человека или индивидуальную цепь бета-субъединицы ФСГ человека под контролем промотора и регуляторных элементов, функционирующих в эукариотической клетке. В качестве рекомбинантной плазмиды согласно настоящему изобретению могут использоваться различные плазмиды, обладающие способностью к экспрессии в клетке-реципиенте, такие как плазмиды pcDNA3.1, pCMV-Myc, pDEF38 и подобные им, но список плазмид не ограничивается ими.

Пара совместимых плазмид согласно настоящему изобретению означает две такие экспрессионные плазмиды, которые могут быть использованы для одновременной или последовательной трансфекции культивируемых клеток млекопитающих и последующей селекции стабильно трансфицированных клеток. Необходимым условием совместимости векторов является наличие в их составе различных генов устойчивости к действию селекционных агентов, сообщающих трансфицированным клеткам устойчивость к действию только одного из нескольких используемых селекционных агентов. Экспрессионые плазмиды из пары совместимых плазмид могут кодировать ген, содержащий ОРС одной или обеих цепей ФСГ.

Конкретным вариантом реализации настоящего изобретения является пара совместимых плазмид p1.1-FSH-AIB (длина 13222 пар оснований, SEQ ID NO:1, Фиг.1) и p1.2-Hygro-B-chain (длина 12811 пар оснований, SEQ ID NO:4, Фиг.2), которые содержат следующие функциональные элементы, перечисленные в порядке их расположения:

Для плазмиды p1.1-FSH-AIB

1. область начала репликации плазмиды pUC (11000-11673), открытую рамку считывания бета-лактамазы (bla) (11815-122675) и прокариотический промотор гена bla (12670-12774), позволяющие проводить препаративную наработку плазмиды в Е.coli;

2. участок терминального повтора вируса Эпштейн-Барр человека (EBVTR), представляющий собой фрагмент конкатемера терминальных повторов вируса Эпштейна-Барр (12810-13211), обеспечивающей увеличение частоты интеграции генетической кассеты в геном клеток СНО и увеличение скорости амплификации кассеты в геноме;

3. фрагмент последовательности, фланкирующей ген фактора элонгации 1 альфа китайского хомячка «выше по течению» (1-4071), включающий нетранскрибируемые области этого гена, промотор этого гена, первый интрон этого гена, обеспечивающий конститутивную экспрессию гена фолликулостимулирующего гормона человека в геноме клеток СНО;

4. синтетическую последовательность Козак (сайт связывания рибосом) (4079-4087), обеспечивающую кэп-зависимую инициацию трансляции мРНК в животных клетках;

5. последовательность, кодирующую открытую рамку считывания альфа-субъединицы фолликулостимулирующего гормона человека (4088-4438) с блоком стоп-кодонов (4436-4441);

6. последовательность внутреннего сайта связывания рибосом вируса энцефаломиокардита EMCV дикого типа (4448-5012), обеспечивающая кэп-независимую инициацию трансляции полицистронных РНК в животных клетках;

7. последовательность, кодирующую открытую рамку считывания бета-субъединицы фолликулостимулирующего гормона человека (5010-5399) с блоком стоп-кодонов (5397-5402);

8. последовательность аттенюированного внутреннего сайта связывания рибосом вируса энцефаломиокардита EMCV (5423-6010), обеспечивающую кэп-независимую инициацию трансляции полицистронных РНК в животных клетках;

9. последовательность, кодирующую открытую рамку считывания дигидрофолатредуктазы (6023-6586) - фактора устойчивости трансфицированных клеток к воздействию метотрексата;

10. фрагмент последовательности, фланкирующей ген фактора элонгации 1 альфа китайского хомячка «ниже по течению» (6588-10846), включающий терминатор и сигнал полиаденилирования, а также нетранскрибируемые области этого гена, обеспечивающий конститутивную экспрессию гена фолликулостимулирующего гормона человека в геноме клеток СНО.

Для плазмиды p1.2-Hygro-B-chain:

1. область начала репликации плазмиды pUC (6108-6781), открытую рамку считывания бета-лактамазы (bla) (6923-7783) и прокариотический промотор гена bla (7778 7882), позволяющие проводить препаративную наработку плазмиды в Е.coli;

2. участок терминального повтора вируса Эпштейн-Барр человека (EBVTR), представляющий собой фрагмент конкатемера терминальных повторов вируса Эпштейна-Барр (7918-8319), обеспечивающей увеличение частоты интеграции генетической кассеты в геном клеток СНО и увеличение скорости амплификации кассеты в геноме;

3. фрагмент последовательности, фланкирующей ген фактора элонгации 1 альфа китайского хомячка «выше по течению» (8331-12401), включающий нетранскрибируемые области этого гена, промотор этого гена, первый интрон этого гена, обеспечивающий конститутивную экспрессию гена бета-цепи фолликулостимулирующего гормона человека в геноме клеток СНО;

4. синтетическую последовательность Козак (сайт связывания рибосом) (12409-12417), обеспечивающую кэп-зависимую инициацию трансляции мРНК в животных клетках;

5. последовательность, кодирующую открытую рамку считывания бета цепи фолликулостимулирующего гормона человека (12418