Растения кукурузы, отличающиеся локусам количественных признаков qtl

Растения кукурузы, отличающиеся локусам количественных признаков qtl

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Область техники, к которой относится изобретение

Тематика настоящего изобретения касается растений, в частности растений кукурузы с геномом, содержащим уникальный набор аллелей, связанных с соответствующими локусами количественных признаков (QTL), участвующими в экспрессии целого ряда фенотипических признаков, представляющих экономический интерес, выбранных из группы урожайности по зерну, влажности зерна при сборе, раннего и позднего прикорневого полегания, стеблевого полегания, частоты головни обыкновенной, частоты вызванного Fusarium загнивания початков (фузариоза початков), устойчивости к Sulcotrione и строения метелки.

Изобретение также касается способа получения таких растений, а также способов анализа и скрининга для идентификации растений с требуемым профилем.

Уровень техники

Селекционное разведение столетиями применялось для улучшения или в попытке улучшения фенотипических признаков, представляющих агрономический и экономический интерес у растений, как-то: урожайность, содержание масла в зерне и др. Вообще говоря, селекционное разведение включает отбор особей для того, чтобы они служили в качестве родителей нового поколения на основе одного или нескольких представляющих интерес фенотипических признаков. Однако такая селекция по фенотипу зачастую осложняется негенетическими факторами, способными повлиять на искомый фенотип. Негенетические факторы, способные давать такие эффекты, включают такие экологические воздействия, как тип и качество почвы, количество осадков, диапазон температур и др.

Большинство фенотипических признаков контролируются более чем одним генетическим локусом, каждый из которых обычно влияет на данный признак в большей или меньшей степени. Например, U.S. Patent No.6399855 на Beavis свидетельствует, что подавляющее большинство имеющих экономическое значение фенотипических признаков у домашних растений представляют собой так называемые количественные признаки. Обычно термин "количественный признак" применяется для описания такого фенотипа, который проявляет непрерывную изменчивость при экспрессии и является конечным результатом взаимодействия нескольких генетических локусов предположительно друг с другом и/или со средой. Также широко применялся термин "сложный признак" для описания признаков, не проявляющих классического менделевского наследования, которое обычно относится к одному генетическому локусу (Lander & Schork (1994) 265 Science 2037-2048).

Одним из последствий многофакторного профиля наследования является то, что может оказаться затруднительным картирование локусов, способствующих экспрессии таких признаков. Однако разработка множества полиморфных генетических маркеров (напр., RFLP, SNP, SSR и др.), охватывающих весь геном, дает возможность изучать то, что Edwards et al. (1987) 115 Genetics 113-125 назвали "локусами количественных признаков" (QTL), а также их количество, величину и распределение. Локусы QTL содержат гены, в той или иной степени контролирующие качественные и количественные фенотипические признаки, которые могут быть дискретными или иметь непрерывное распределение в семействе особей, а также в популяции семейств особей.

Были разработаны различные экспериментальные подходы для идентификации и анализа QTL (напр., см. U.S. Patent Nos.5,385,835, 5,492,547 и 5,981,831). Один из таким подходов заключается в скрещивании двух инбредных линий с получением простого гибридного потомства F₁, самоопылении гибридного потомства F₁ с получением расходящегося потомства F₂, генотипировании множественных маркерных локусов и оценки одного или нескольких количественных фенотипических признаков среди расходящегося потомства. Затем проводится идентификация QTL на основе значимых статистических связей между генотипическими величинами и фенотипической изменчивостью среди расходящегося потомства. Такой экспериментальный принцип является идеальным в том смысле, что родительские линии поколения F₁ имеют известные фазы сцепления, все расщепляющиеся локусы у потомства являются информативными, а неравновесность сцепления между маркерными локусами и генетическими локусами, затрагивающими фенотипические признаки, достигает максимума.

В настоящем изобретении применяли распространенную методику продвижения поколений для создания растений кукурузы, проявляющих уникальный профиль аллелей по специфическим локусам QTL.

Определения

В настоящем описании и формуле изобретения формы единственного числа включают значения множественного числа, если только контекст четко не предписывает иначе. Так, например, просто растение включает одно или несколько растений, а просто клетка включает смеси клеток, тканей и т.п.

"Аллель" в рамках изобретения служит для обозначения альтернативных форм различных генетических единиц, связанных с различными формами гена или любого иного отдельного генетического элемента, которые при наследовании являются альтернативными потому, что они располагаются в одном и том же локусе гомологичных хромосом. В диплоидных клетках или организмах две аллели данного гена (или маркера) обычно занимают соответствующие локусы на паре гомологичных хромосом.

Аллель, связанная с количественным признаком, может составлять один ген либо несколько генов или же ген, кодирующий генетический фактор, вносящий вклад в фенотип, представленный данным QTL.

В настоящем изобретении термин "разведение" и его грамматические варианты относятся к любым процессам, создающим особей потомства. Разведение может быть половым или бесполым либо комбинированным. Неограничивающие примеры типов разведения включают скрещивание, самоопыление, получение двойных гаплоидов и их комбинации.

В настоящем изобретении выражение "устойчивая селекционная популяция" относится к совокупности потенциальных партнеров для скрещивания, полученных от или используемых в качестве родителей в селекционной программе, напр., коммерческой селекционной программе. Представители устойчивой селекционной популяции, как правило, хорошо изучены в отношении генетики и/или фенотипа. Например, могли быть изучены несколько представляющих интерес фенотипических признаков, напр., при различных экологических условиях, в различных местностях и/или в разное время. С другой стороны, могли быть идентифицированы один или несколько генетических локусов, связанных с экспрессией фенотипических признаков, и один или несколько представителей популяции могли быть генотипированы в отношении одного или нескольких генетических локусов, а также в отношении одного или нескольких генетических маркеров, связанных с одним или несколькими генетическими локусами.

В настоящем изобретении выражение "диплоидная особь" относится к особям, имеющим два набора хромосом, обычно по одному от каждого из родителей. Однако следует иметь в виду, что в некоторых воплощениях диплоидная особь может получить свои "материнские" и "отцовские" наборы хромосом из одного и того же организма, как-то при самоопылении растений для получения следующего поколения растений.

"Гомозиготные" в рамках изобретения служит для обозначения одинаковых аллелей в одном или нескольких соответствующих локусах на гомологичных хромосомах.

"Гетерозиготные" в рамках изобретения служит для обозначения неодинаковых аллелей в одном или нескольких соответствующих локусах на гомологичных хромосомах.

"Возвратное скрещивание" в рамках изобретения служит для обозначения процесса, в котором гибридное потомство неоднократно подвергается скрещиванию обратно с одним из родителей.

"Генетическое сцепление" в рамках изобретения служит для обозначения связи между признаками при наследовании из-за того, что гены располагаются рядом на одной и той же хромосоме, которое измеряется как процент рекомбинации между локусами (сантиморган, сМ).

В настоящем изобретении выражение "количественный признак" относится к таким фенотипическим признакам, которые могут быть описаны в числовом выражении (т.е. количественно). Количественный признак, как правило, проявляет непрерывную изменчивость между особями популяции; то есть различия в численном значении фенотипического признака являются небольшими и переходят друг в друга. Зачастую распределение по частоте количественного фенотипического признака в популяции выражается колоколообразной кривой (т.е. проявляет нормальное распределение между двумя крайними значениями). Количественный признак, как правило, является результатом взаимодействия генетического локуса с окружающей средой или взаимодействия нескольких генетических локусов (QTL) друг с другом и/или с окружающей средой. Примеры количественных признаков включают высоту и урожайность растений.

В настоящем изобретении термины "локус количественного признака" (QTL) и "связь с маркерным признаком" относятся к связи между генетическим маркером и участком хромосомы и/или геном, затрагивающим фенотип данного признака. Как правило, это определяется статистически, напр., на основе одного или нескольких методов, опубликованных в литературе. Локус QTL может представлять собой участок хромосомы и/или генетический локус как минимум с двумя аллелями, по-разному влияющими на экспрессию фенотипического признака (количественного либо качественного признака).

В настоящем изобретении выражения "скрещивание половым путем" и "половое размножение" в контексте тематики настоящего изобретения относятся к слиянию гамет для получения потомства (напр., при оплодотворении, как-то при опылении растений для получения семян). "Половое скрещивание" или "перекрестное оплодотворение" в некоторых воплощениях означает оплодотворение одной особи другой особью (напр., перекрестное опыление у растений). Термин "самоопыление" в некоторых воплощениях означает получение семян при самооплодотворении или самоопылении, т.е. пыльца и семяпочка происходят из одного и того же растения.

В настоящем изобретении выражение "генетический маркер" относится к какой-то особенности генома особи (напр., последовательности нуклеотидов или полинуклеотидов, находящейся в геноме особи), которая связана с одним или несколькими нужными локусами. В некоторых воплощениях генетический маркер может быть полиморфным в данной популяции или же локус занят полиморфными формами, в зависимости от контекста. Генетические маркеры включают, к примеру, полиморфизмы по одному нуклеотиду (SNP), индели (т.е. вставки/делеции), простые повторы последовательности (SSR), полиморфизмы по длине рестрикционных фрагментов (RFLP), амплифицированные случайным образом полиморфные участки ДНК (RAPD), маркеры типа расщепленных амплифицированных полиморфных последовательностей (CAPS), маркеры по технологии матриц разнообразия (DArT) и полиморфизмы по длине амплифицированных фрагментов (AFLP), среди многих других примеров. Генетические маркеры, к примеру, могут использоваться для локализации генетических локусов, содержащих аллели, способствующие вариабельности при экспрессии фенотипических признаков на хромосоме. Выражение "генетический маркер" также может относиться к последовательности полинуклеотида, комплементарного геномной последовательности, как-то последовательности нуклеиновой кислоты, используемой в качестве зонда.

Генетический маркер может физически располагаться в таком положении на хромосоме, которое находится внутри или вне того генетического локуса, с которым он связан (т.е. внутри гена или вне гена, соответственно). Иными словами, в то время как генетические маркеры обычно используются тогда, когда не установлена локализация на хромосоме гена, соответствующего искомому локусу, и при этом степень рекомбинации между генетическим маркером и данным локусом не равна нулю, в тематике настоящего изобретения могут использоваться и такие генетические маркеры, которые физически находятся в пределах генетического локуса (напр., внутри геномной последовательности, соответствующей гену, как-то при полиморфизме внутри интрона или экзона гена). В некоторых воплощениях тематики настоящего изобретения один или несколько генетических маркеров составляют от одного до десяти генетических маркеров, а в некоторых воплощениях один или несколько генетических маркеров составляют более десяти генетических маркеров.

В настоящем изобретении термин "генотип" относится к генетическому составу клетки или организма. "Генотип по набору генетических маркеров" особи включает специфические аллели для одного или нескольких локусов генетических маркеров у этой особи. Как известно, генотип может относиться к одному локусу или к нескольким локусам, связанным или не связанным и/или сцепленным или не сцепленным друг с другом. В некоторых воплощениях генотип особи относится к одному или нескольким генам, связанным в том смысле, что они участвуют в экспрессии искомого фенотипа (напр., определенного количественного признака). Так, в некоторых воплощениях генотип слагается из одной или нескольких аллелей, представленных у особи в одном или нескольких генетических локусах количественного признака. В некоторых воплощениях генотип выражается в переводе на гаплотип (который определен ниже).

В настоящем изобретении термин "идиоплазма" относится к совокупности генотипов у популяции или иной группы особей (напр., вида). Термин "идиоплазма" может относиться и к растительному материалу, напр., группе растений, служащих хранилищем различных аллелей. Выражение "адаптированная идиоплазма" относится к растительному материалу с доказанным генетическим преимуществом, напр., для данной среды или географической зоны, тогда как выражения "неадаптированная идиоплазма", "сырая идиоплазма" и "экзотическая идиоплазма" относятся к растительному материалу с неизвестной или недоказанной генетической ценностью, напр., для данной среды или географической зоны; при этом в некоторых воплощениях выражение "неадаптированная идиоплазма" относится к такому растительному материалу, который не входит в состав устойчивой селекционной популяции и не имеет известного родства с представителями устойчивой селекционной популяции.

В настоящем изобретении термин "гаплотип" относится к тому набору аллелей, который особь унаследовала от одного из родителей. При этом диплоидная особь имеет два гаплотипа. Термин "гаплотип" может применяться в более узком смысле для обозначения физически сцепленных и/или не сцепленных генетических маркеров (напр., полиморфизмов последовательности), связанных с фенотипическим признаком. Выражение "гаплотипный блок" (что иногда в литературе также именуется просто гаплотипом) относится к группе из двух или нескольких генетических маркеров, физически сцепленных на одной хромосоме (или ее части). Как правило, каждый блок содержит несколько общих гаплотипов, причем можно выбрать подгруппу генетических маркеров (т.е. "метку гаплотипа"), которая однозначно идентифицирует каждый из этих гаплотипов.

В настоящем изобретении термины "гибрид", "гибридное растение" и "гибридное потомство" относятся к особям, полученным от генетически разных родителей (напр., генетически гетерозиготным или почти гетерозиготным особям).

Если две особи обладают одинаковыми аллелями в определенном локусе, то эти аллели называются "идентичными по происхождению", если они унаследованы от одного общего предка (т.е. являются копиями одной и той же родительской аллели). Альтернатива состоит в том, что аллели являются "идентичными по состоянию" (т.е. они кажутся одинаковыми, но происходят из двух разных копий этой аллели). Информация об идентичности по происхождению полезна для опытов по сцеплению, а информация об идентичности по происхождению и идентичности по состоянию может использоваться в опытах по ассоциации типа тех, что описаны в настоящем изобретении, хотя особенно полезной может оказаться информация об идентичности по происхождению.

В настоящем изобретении выражение "F₁-гибрид от однократного скрещивания" относится к F₁-гибридам, полученным от скрещивания между двумя инбредными линиями.

В настоящем изобретении выражение "инбредная линия" относится к генетически гомозиготной или почти гомозиготной популяции. Инбредная линия, к примеру, может быть получена посредством нескольких циклов скрещивания между братьями/сестрами или самоопыления. В некоторых воплощениях инбредные линии разводят по одному или нескольким заданным фенотипическим признакам. "Инбредный", "инбредная особь" или "инбредное потомство" представляют собой особи, отобранные из инбредной линии.

В настоящем изобретении термин "сцепление" и его грамматические варианты относятся к тенденции аллелей в различных локусах на одной и той же хромосоме к совместному расщеплению более часто, чем это было бы случайным образом, если бы они передавались независимо, а в некоторых воплощениях вследствие их физического соседства.

В настоящем изобретении выражение "неравновесное сцепление" (а также "аллельная ассоциация") относится к явлению, при котором определенные аллели в двух или нескольких локусах стремятся остаться вместе в группах сцепления при расщеплении от родителей к потомкам с большей частотой, чем это можно ожидать из их индивидуальных частот в данной популяции. Например, аллель генетического маркера и аллель QTL могут проявлять неравновесное сцепление, если они встречаются вместе с большей частотой, чем это можно предсказать из частот индивидуальных аллелей. Неравновесное сцепление может происходить по нескольким причинам, в том числе вследствие их физического соседства на хромосоме.

В настоящем изобретении термин "локус" относится к положению на хромосоме, в котором содержится ген, вносящий вклад в признак, генетический маркер и т.п.

В настоящем изобретении выражение "нуклеиновая кислота" относится к любой физической цепочке звеньев мономера, которая может соответствовать цепочке нуклеотидов, включая полимеры нуклеотидов (напр., типичные полимеры ДНК или РНК), модифицированные олигонуклеотиды (напр., олигонуклеотиды, содержащие необычные для биологической РНК или ДНК основания, как-то 2'-O-метилированные олигонуклеотиды) и др. В некоторых воплощениях нуклеиновая кислота может быть одноцепочечной, двухцепочечной, многоцепочечной или комбинированной. Если не указано иначе, последовательность определенной нуклеиновой кислоты по настоящему изобретению необязательно включает или охватывает комплементарные последовательности, наряду с последовательностями, указанными в явном виде.

В настоящем изобретении выражение "фенотип" или "фенотипический признак" относится к внешнему виду или иной отличительной и заметной характеристике особи, вытекающей из взаимодействия генома с окружающей средой.

В настоящем изобретении термин "большинство" означает больше, чем один. Так, "большинство особей" означает по меньшей мере две особи. В некоторых воплощениях термин "большинство" означает больше, чем половину целого. Например, в некоторых воплощениях "большинство популяции" означает больше, чем половину представителей этой популяции.

В настоящем изобретении термин "потомство" относится к потомкам от определенного скрещивания. Как правило, потомство образуется от скрещивания двух особей, хотя некоторые виды (в частности, некоторые растения и гермафродитные животные) могут скрещиваться сами с собою (т.е. одно и то же растение служит донором как мужских, так и женских гамет). Потомки могут принадлежать, например, к поколению F₁, F₂ или любому последующему поколению.

В настоящем изобретении выражение "количественный признак" относится к такому фенотипическому признаку, который контролируется одним или несколькими генами, проявляющими большие фенотипические эффекты. Вследствие этого количественные признаки, как правило, имеют простое наследование. Примеры у растений включают окраску цветков, окраску стержня початка и устойчивость к заболеваниям, как-то устойчивость к увяданию листьев кукурузы типа Northern.

"Селекция по маркерам" в рамках изобретения означает применение генетических маркеров для выявления одной или нескольких нуклеиновых кислот у растения, причем нуклеиновая кислота связана с требуемым признаком для идентификации растений, несущих гены желательных (или нежелательных) признаков с тем, чтобы использовать (или отбросить) эти растения в программе селекционного разведения.

"Микросателлитный маркер или простые повторы последовательности (SSR)" в рамках изобретения означает такой тип генетического маркера, который состоит из многочисленных повторов коротких последовательностей оснований ДНК, которые встречаются повсеместно в ДНК растения и могут быть сильно полиморфными.

"ПЦР (полимеразная цепная реакция)" в рамках изобретения означает способ получения сравнительно большого количества определенных участков ДНК, что делает возможным различные анализы на основе этих участков.

"Праймер для ПЦР" в рамках изобретения означает сравнительно короткий фрагмент одноцепочечной ДНК, используемый при амплификации методом ПЦР определенных участков ДНК.

"Полиморфизм" в рамках изобретения означает наличие в популяции двух или нескольких различных форм гена, генетического маркера или наследуемого признака.

"Селекционное разведение" в рамках изобретения означает программу разведения, в которой в качестве родителей используются растения, обладающие или проявляющие желательные признаки.

"Растение-анализатор" в рамках изобретения означает растение, используемое для генетической характеристики признака у подлежащего анализу растения. Как правило, подлежащее анализу растение скрещивают с растением-анализатором и определяют коэффициент расщепления признака в потомстве от этого скрещивания.

В настоящем изобретении термин "анализатор" относится к линии или особи со стандартным генотипом, известными характеристиками и установленной продуктивностью. "Родитель-анализатор" - это особь из линии-анализатора, которая используется в качестве родителя при половом скрещивании. Как правило, родитель-анализатор не связан родством и генетически отличается от той особи, с которой его скрещивают. Анализатор обычно используется для получения потомства F₁ при скрещивании с особями или инбредными линиями для фенотипической оценки.

В настоящем изобретении выражение "комплексное скрещивание" относится к процессу скрещивания одной линии-анализатора с множественными линиями. Целью такого скрещивания является определение фенотипической продуктивности гибридного потомства, то есть оценка способности каждой из множественных линий к выработке желательного фенотипа у гибридного потомства, полученного от этой линии при аналитическом скрещивании.

"Гомологичность последовательностей или идентичность последовательностей" в настоящем изобретении применяются взаимозаменяемым образом. Термины "идентичные" или "идентичность" на столько-то процентов в контексте двух или нескольких последовательностей нуклеиновых кислот или белков означают, что две или несколько последовательностей одинаковы или имеют определенный процент одинаковых аминокислотных остатков или нуклеотидов при сравнении и совмещении их по максимальному соответствию, что измеряется при помощи одного из следующих алгоритмов сравнения последовательностей или при визуальном осмотре. Если две последовательности, которые нужно сравнить друг с другом, отличаются по длине, то идентичность последовательностей предпочтительно относится к проценту нуклеотидных остатков более короткой последовательности, идентичных нуклеотидным остаткам более длинной последовательности. Идентичность последовательностей можно определить стандартным образом с помощью таких компьютерных программ, как программа Bestfit (Wisconsin Sequence Analysis Package, Version 8 for Unix, Genetics Computer Group, University Research Park, 575 Science Drive Madison, WI 53711). В программе Bestfit используется алгоритм локальной гомологии по Smith and Waterman, Advances in Applied Mathematics 2 (1981), 482-489, чтобы найти отрезок с наибольшей идентичностью между двумя последовательностями. При использовании Bestfit или другой программы совмещения последовательностей для определения того, что определенная последовательность, к примеру, на 95% идентична сравниваемой последовательности настоящего изобретения, параметры предпочтительно выставляются таким образом, чтобы процент идентичности вычислялся по всей длине контрольной последовательности, и были разрешены разрывы гомологии вплоть до 5% от общего числа нуклеотидов в контрольной последовательности. При использовании Bestfit так называемые произвольные параметры лучше оставить на предварительно заданном уровне ("по умолчанию"). Отклонения, возникающие при сравнении между данной последовательностью и вышеописанными последовательностями изобретения, могут быть вызваны, к примеру, добавлением, делецией, заменой, вставкой или рекомбинацией. Такое сравнение последовательностей предпочтительно также можно проводить и с помощью программы "Fasta20u66" (version 2.0u66, September 1998 by William R. Pearson and the University of Virginia; также см. W.R.Pearson (1990), Methods in Enzymology 183, 63-98, приведенные примеры и http://workbench.sdsc.edu/). Для этой цели можно использовать настройки параметров "по умолчанию".

Другим признаком того, что две последовательности нуклеиновых кислот по существу идентичны, является то, что эти две молекулы гибридизуются друг с другом в строгих условиях. Выражение "гибридизуется специфически с" относится к связыванию, образованию двойного комплекса (дуплекса) или гибридизации молекулы только с определенной последовательностью нуклеотидов в строгих условиях, если такая последовательность присутствует в сложной смеси (напр., тотальном препарате) ДНК или РНК клеток. "Связывается существенно" относится к комплементарной гибридизации между нуклеиновой кислотой зонда и нуклеиновой кислотой мишени и охватывает небольшие несоответствия, которые можно устранить снижением строгости среды гибридизации для достижения нужного выявления последовательности нуклеиновой кислоты мишени.

Термин "гибридизуется" в настоящем изобретении относится к стандартным условиям гибридизации, предпочтительно таким условиям гибридизации, при которых в качестве раствора используется раствор 5xSSPE, 1% SDS, 1храствор Денхардта, а температура гибридизации составляет от 35°С до 70°С, предпочтительно 65°С.После гибридизации проводится отмывка, предпочтительно сначала с помощью 2×SSC, 1% SDS, а затем 0,2×SSC при температуре от 35°С до 75°С, в частности от 45°С до 65°С, но особенно предпочтительно при 59°С (касательно определения SSPE, SSC и раствора Денхардта см. Sambrook et al., loc. cit). Особенно предпочтительны строгие условия гибридизации, например, как описано в Sambrook et al., supra. Строгие условия гибридизации особенно предпочтительны тогда, когда гибридизация и отмывка проводятся при 65°С, как указано выше. Менее предпочтительны нестрогие условия гибридизации, например, проведение гибридизации и отмывки при 45°С, еще менее - при 35°С.

"Строгие условия гибридизации" и "строгие условия отмывки при гибридизации" в контексте таких экспериментов по гибридизации нуклеиновых кислот, как southern- и northern-гибридизация, зависят от последовательности и отличаются при различных параметрах среды. Более длинные последовательности специфически гибридизуются при более высоких температурах. Исчерпывающее руководство по гибридизации нуклеиновых кислот представлено в Tijssen (1993) Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology - Hybridization with Nucleic Acid Probes part I chapter 2 "Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid probe assays" Elsevier, New York. В общем, условия высокой строгости при гибридизации и отмывке выбирают на 5°С меньше, чем температура плавления (T_m) для конкретной последовательности при определенной ионной силе и рН. Как правило, в "строгих условиях" зонд будет гибридизоваться со своей мишенью, но не с другими последовательностями.

T_m - это температура (при определенной ионной силе и рН), при которой 50% последовательностей мишени гибридизуются с идеально соответствующим зондом. Очень строгие условия выбирают равными значению Тщ для данного зонда. Примером строгих условий при гибридизации комплементарных нуклеиновых кислот, имеющих более 100 комплементарных остатков, на фильтре методом southern- или northern-гибридизации является 50% формамида с 1 мг гепарина при 42°С, с проведением гибридизации в течение ночи. Примером очень строгих условий отмывки является 0,15 М NaCl при 72°С в течение 15 минут. Примером строгих условий отмывки является раствор 0,2×SSC при 65°С в течение 15 минут (см. описание буфера SSC в Sambrook, infra). Часто перед отмывкой при высокой строгости проводится отмывка при низкой строгости для устранения фонового сигнала зонда. Примером отмывки при средней строгости для двойного комплекса, напр., из более чем 100 нуклеотидов, является 1×SSC при 45°С в течение 15 минут. Примером отмывки при низкой строгости для двойного комплекса, напр., из более чем 100 нуклеотидов, является 4-6×SSC при 40°С в течение 15 минут. Для коротких зондов (напр., от 10 до 50 нуклеотидов) строгие условия обычно включают концентрацию соли менее чем 1,0 М иона Na, обычно от 0,01 до 1,0 М иона Na (или другой соли) при рН от 7,0 до 8,3, а температура обычно составляет как минимум 30°С. Строгие условия также достигаются добавлением дестабилизирующих веществ, как-то формамида. В общем случае отношение сигнал-шум в 2 раза (или больше), чем это наблюдается для постороннего зонда в данном опыте по гибридизации, означает выявление специфической гибридизации. Нуклеиновые кислоты, не гибридизующиеся друг с другом в строгих условиях, все равно считаются существенно идентичными, если кодируемые ими белки являются существенно идентичными. Это происходит, напр., при создании копии нуклеиновой кислоты с использованием максимальной вырожденности кодонов, допускаемой генетическим кодом.

"Растение" означает любое растение на любой стадии развития, в частности семенное растение.

"Растительная клетка" - это структурная и физиологическая единица растения, включающая протопласт и клеточную стенку. Растительная клетка может иметь вид изолированной одиночной клетки или культуры клеток, либо входить в состав более высокоорганизованной единицы, такой, к примеру, как растительная ткань, растительный орган или целое растение. Термин растительная клетка также охватывает растительные протопласты, у которых удалена только часть или вся клеточная стенка.

"Культура растительных клеток" означает культуру составных частей растений, таких, к примеру, как протопласты, клетки клеточной культуры, клетки растительных тканей, пыльцы, пыльцевых трубок, семяпочек, зародышевых мешков, зигот и зародышей на различных стадиях развития.

"Растительный материал" относится к листьям, стеблям, корням, цветкам или частям цветков, плодам, пыльце, яйцеклеткам, зиготам, семенам, черенкам, клеточным или тканевым культурам или любым иным частям или продуктам растений.

"Растительный орган" - это отдельная, имеющая видимую структуру и дифференцированная часть растения, как-то корень, стебель, лист, цветочная почка или зародыш.

"Растительная ткань" в настоящем изобретении означает группу растительных клеток, образующих структурную и функциональную единицу, включая любые ткани растений в самих растениях или в культуре. Этот термин охватывает целые растения, органы растений, семена растений, культуры тканей и любые группы растительных клеток, образующих структурные и/или функциональные единицы. Применение этого термина в сочетании с или без указания конкретного типа растительной ткани, приведенного выше или иным образом охваченного этим определением, не должно исключать любого иного типа растительных тканей.

Раскрытие изобретения

В одном воплощении изобретение касается растений кукурузы, у которых геном содержит набор аллелей, связанных с соответствующим набором локусов количественных признаков (QTL), имеющих экономическое значение и генетически сцепленных с соответствующими маркерами, представленными в табл.A-G, причем данный набор локусов QTL включает по меньшей мере два QTL, предпочтительно по меньшей мере 5, более предпочтительно по меньшей мере 10, еще более предпочтительно по меньшей мере 20 и вплоть до 37 QTL, вносящих вклад в фенотипический признак, выбранный из группы урожайности по зерну, влажности зерна при сборе, раннего и позднего прикорневого полегания, стеблевого полегания, частоты головни обыкновенной, частоты вызванного Fusarium загнивания початков (фузариоза початков), устойчивости к Sulcotrione и строения метелки.

В частности, изобретение касается растений кукурузы, содержащих ядерный геном, включающий набор аллелей по соответствующему набору локусов QTL, каждый из которых вносит вклад в фенотипический признак, имеющий экономическое значение, при этом:

a) каждый локус QTL генетически сцеплен по меньшей мере с одним маркерным локусом, который можно идентифицировать при помощи пары олигонуклеотидных праймеров для ПЦР, состоящей из прямого праймера и обратного праймера, проявляющих нуклеотидные последовательности, приведенные в SEQ ID NO:1-82, представленных в табл.A-G;

b) каждая аллель в соответствующем локусе QTL определяется по меньшей мере одной маркерной аллелью в данном по меньшей мере одном маркерном локусе, сцепленном с этим QTL, причем маркерная аллель характеризуется продуктом ПЦР-амплификации, полученным при реакции ПЦР с помощью соответствующей пары олигонуклеотидных праймеров, приведенных в табл.A-G, а продукт амплификации по существу идентичен соответствующему продукту амплификации благоприятной аллели, указанной в табл.A-G, полученной из инбредных линий М3047/1 (NCIMB 41459) и М3047/2 (NCIMB 41460) при реакции ПЦР с помощью идентичной пары праймеров;

причем данный набор локусов QTL включает по меньшей мере 10, предпочтительно по меньшей мере 15, более предпочтительно по меньшей мере 20, еще более предпочтительно по меньшей мере 25, но особенно предпочтительно по меньшей мере 30 и вплоть до 37 различных QTL.

Пары праймеров, указанные выше в пунктах а) и b), состоят из прямого праймера с нечетным номером SEQ ID и обратного праймера со следующим за ним четным номером SEQ ID. Например, прямой праймер с SEQ ID NO:1 и обратный праймер с SEQ ID NO:2 составляют пару праймеров, равно как SEQ ID NO:3 и SEQ ID NO:4; SEQ ID NO:5 и SEQ ID NO:6 и т.д.

Продукт ПЦР-амплификации, указанный выше в пункте Ь), полученный при реакции ПЦР с помощью пары олигонуклеотидных праймеров, приведенных в табл.A-G, может быть идентифицирован по молекулярному весу или по нуклеотидной последовательности, которые по существу идентичны молекулярному весу или нуклеотидной последовательности соответствующего продукта ПЦР-амплификации благоприятной аллели, указанной в табл.A-G, полученной из инбредных линий М3047/1 (NCIMB 41459) и М3047/2 (NCIMB 41460) при реакции ПЦР с помощью идентичной пары праймеров.

В одном конкретном воплощении растения кукурузы по изобретению, описанные выше, характеризуются набором аллелей по соответствующему набору локусов QTL, причем каждый локус QTL генетически сцеплен по меньшей мере с одним маркерным локусом, который можно идентифицировать при помощи пары олигонуклеотидных праймеров для ПЦР, состоящей из прямого праймера и обратного праймера, проявляющих нуклеотидные последовательности, приведенные в SEQ ID NO:9/10, 13/14, 17/18, 19/20, 25/26, 27/28, 29/30, 35/36, 41/42, 47/48, 49/50, 51/52, 59/60, 61/62, 63/64, 65/66, 69/70, 73/74, 75/76 и 77/78, представленных в табл.А, причем данный набор локусов QTL включает по меньшей мере 5, предпочтительно по меньшей мере 8, более предпочтительно по меньшей мере 10, еще более предпочтительно по меньшей мере 14 различных QTL, вносящих вклад в фенотипический признак урожайности по зерну, а сами QTL локализуются на хромосомах 1, 2, 4, 5 и 7, при этом каждая аллель в соответствующем QTL определяется по меньшей мере одной маркерной аллелью в данном по меньшей мере одном маркерном локусе, сцепленном с этим QTL, причем маркерная аллель характеризуется продуктом ПЦР-амплификации от соответствующей пары олигонуклеотидных праймеров, приведенных в табл. А, а продукт амплификации по существу идентичен соответствующему продукту амплификации благоприятной аллели, указанной в табл.A-G, полученной из инбредных линий М3047/1 (NCIMB 41459) и М3047/2 (NCIMB 41460) при реакции ПЦР с помощью идентичной пары праймеров.

В одном аспекте изобретения растения кукурузы по изобретению, опи