Способ продуцирования и очистки ортопоксвируса

Способ продуцирования и очистки ортопоксвируса

Иллюстрации

Показать все

Реферат

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ

Настоящее изобретение относится к области получения и очистки вирусов. В частности, настоящее изобретение относится к способу получения и очистки ортопоксвируса дикого типа, а также аттенюированного и/или рекомбинантного ортопоксвируса.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Ортопоксвирусы являются сложными упакованными вирусами диаметром от 200 до 300 нм, что принципиально отличает их по морфологии, их большому ДНК-геному и их цитоплазматическому сайту репликации. Геном нескольких членов рода Ортопоксвирусов, включая штамм Копенгаген вируса осповакцины (W) (GOEBEL et al., 1990, Virol. 179, 247-266 и 517-563; JOHNSON et al., 1993, Virol. 196, 381-401) и штамм Анкара модифицированного вируса осповакцины (MVA) (ANTOINE et al., 1998, Virol. 244, 365-396), был картирован и секвенирован. W содержит геном из двухцепочечной ДНК размером 192 т.п.о., кодирующий около 200 белков, из которых примерно 100 вовлечены в процесс сборки вируса. MVA является штаммом сильно аттеньюированного вируса осповакцины, полученный в ходе более 500 последовательных пассажей вируса осповакцины Анкара на фибробластах эмбрионов цыпленка (MAYR et al., 1975, Infection 3, 6-16). Вирус MVA депонирован в Национальной коллекции культур микроорганизмов (Collection Nationale de Cultures de Microorganismes, CNCM) под номером N602 1-721. Определение полной последовательности генома MVA и сравнение с геномом вируса Копенгаген W позволяет точно идентифицировать изменения, которые произошли в геноме вируса, и определить семь делеций (с I по VII) и множественные мутации, приводящие к получению фрагментированных ОРС (открытых рамок считывания) (ANTOINE etal., 1998, Virology 244, 365-396).

На использование Ортопоксвирусов в качестве векторов для разработки живых рекомбинантных вакцин оказали воздействие факторы безопасности и нормативные инструкции. Перед использованием Ортопоксвирусов для вакцинации необходимо провести очистку указанных вирусов. Доступные в настоящее время способы получения Ортопоксвирусов включают репликацию указанных вирусов в клеточных линиях (например, HelaS3), в яйцеклетках с зародышем или в фибробластах эмбриона цыпленка (CEF). После репликации вируса удаляют культуральную жидкость, клетки лизируют, а ортопоксвирусы, высвобожденные из клеток, очищают путем центрифугирования с использованием слоя сахарозы (KOTWAL and ABRAHAM; Poxvirus growth, Purification and tittering in Vaccinia Virus and Poxvirology, 2004,101-108, Humana Press Inc., Totowa; NJ; USA).

В международной патентной заявке WO 07/147528 описан способ получения MVA дикого типа, а также аттеньюированного и/или рекомбинантного MVA с нецелевой инфекционной специфичностью, включающий получение культуры пакующих клеток (например, CEF; линии клеток), инфицирования указанной культуры клеток, выращивания указанных инфицированных клеток, выделение вирусов MVA, полученных из супернатанта культуры и/или пакующих клеток, и дальнейшую очистку вирусов путем глубокой фильтрации, микрофильтрации и диафильтрации. В заявке WO 07/147528 отмечено, что при осуществлении глубокой фильтрации, микрофильтрации и диафильтрации использование нуклеаз, и, более конкретно, использование Benzonase® в качестве нуклеазы не является необходимым.

В международной патентной заявке WO 08/138533 описан способ очистки биологически активного вируса осповакцины, включающий загрузку твердофазного матрикса с присоединенным к нему лигандом вируса осповакцины, содержащимся в жидкой фазе культуры, отмывку матрикса и элюирование указанного вируса.

Несмотря на то, что описано несколько способов получения и очистки ортопоксвирусов, существует необходимость в альтернативных способах. Настоящее изобретение обеспечивает такие способы.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Во всем тексте настоящей заявки "ортопоксвирус" относится к вирусу оспы человека, вирусу осповакцины (W), такому как, например, штаммы: Элстри (Elstree), Вестерн Резерв (Western Reserve), Вайет (Wyeth), NWAC, NYCBOH, Париж, Копенгаген и производным производные, такие как, например, модифицированный вирус осповакцины Анкара (MVA), в частности, MVA 575 (ЕСАСС V00120707) и MVA-BN (ECACC V00083008). Согласно настоящему изобретению, ортопоксвирус может быть равнозначно незрелым вирусом (IV), зрелым внутриклеточным вирусом (IMV), внутриклеточным вирусом в оболочке (IEV), связанным с клеткой вирусом в оболочке (CEV) или внеклеточым вирусом в оболочке (EEV) (SMITH et al. (2002), J.Gen. Virol., 83, 2915-2931).

По всему тексту заявки формы единственного числа означают «по меньшей мере один», «по меньшей мере первый», «один или более» или «множество» описываемых компонентов или этапов, если контекст явно не указывает на другое.

По всему тексту заявки «и/или» в каждом случае употребления включает значения «и», «или» и "все или любая другая комбинация элементов, связанную указанным термином".

Во всем тексте заявки "содержащий" и "содержать" по замыслу авторов обозначает, что продукты, композиции и способы включают указанные компоненты или этапы, но не исключает присутствия других. "Состоящий по существу из" применительно к определенным продуктам, композициям и способам обозначает исключение других компонентов или этапов, имеющих какое-либо существенное значение. Таким образом, указание, что композиция состоит по существу из перечисленных компонентов, не исключает того, что указанная композиция может содержать следовые примеси и фармацевтически приемлемые носители. "Состоящий из" означает, что более чем следовые элементы или другие компоненты и этапы исключены.

Во всем тексте заявки "примерно" или "приблизительно" означает в пределах 20%, предпочтительно в пределах 10%, и более предпочтительно в пределах 5% данного значения или диапазона.

Настоящее изобретение относится к способу (т.е. Способ А) получения и очистки ортопоксвируса дикого типа, аттеньюированного и/или рекомбинантного ортопоксвируса, включающий следующие этапы:

a) приготовление культуры пакующих клеток;

b) инфицирование культуры пакующих клеток ортопоксвирусом;

c) культивирование инфицированных пакующих клеток до получения потомства ортопоксвируса;

d) инкубация в присутствии одной или более нуклеаз;

e) выделение ортопоксвирусов из супернатанта культуры и/или пакующих клеток;

f) добавление моновалентных солей к ортопоксвирусам, выделенным на этапе е), в условиях, подходящих для ингибирования активности нуклеазы (нукпеаз) и для предотвращения адсорбции указанных ортопоксвирусов к анионообменному адсорбенту на этапе д);

g) осуществление контакта смеси, полученной на этапе f), с анионообменным адсорбентом в условиях, подходящих для захвата нуклеиновых кислот;

h) осветление смеси, полученной на этапе g), в условиях, подходящих для удаления клеточного дебриса;

i) промывка анионообменного адсорбента в условиях, подходящих для выделения оставшихся ортопоксвирусов в фильтрате;

j) концентрирование фильтрата, полученного на этапе h) и фильтрата, полученного на этапе i);

k) диафильтрация содержащей ортопоксвирус фракции, полученной на этапе j).

В соответствии с предпочтительным вариантом осуществления настоящего изобретения, в способе согласно настоящему изобретению не используются продукты животного происхождения (за исключением пакующих клеток). Применительно ко всей заявке, к «продуктам животного происхождения» относится любой продукт или набор продуктов, производимых в клетке или клеткой животного в живом организме.

В соответствии с предпочтительным вариантом осуществления настоящего изобретения, способ согласно настоящему изобретению является приемлемым для асептического процесса производства промышленного масштаба, полностью удовлетворяющего нормативным требованиям относительно стерильности вакцин.

Применительно ко всей заявке, "аттеньюированный ортопоксвирус" относится к любому ортопоксвирусу, который был модифицирован таким образом, что его патогенность в целевом субъекте значительно снижена. Предпочтительно, чтобы указанный ортопоксвирус был ослаблен до такой степени, что он является непатогенным с клинической точки зрения, то есть у субъекта, подверженного воздействию указанного ортопоксвируса, не обнаруживается статистически значимого увеличения патологии по отношению к контрольным субъектам. В соответствии с предпочтительным вариантом осуществления настоящего изобретения, указанным аттеньюированным ортопоксвирусом являются аттеньюированный W или аттеньюированный MVA.

Применительно ко всей заявке, "рекомбинантный ортопоксвирус" относится к ортопоксвирусу, содержащему экзогенную последовательность, внедренную в его геном. Использованная здесь экзогенная последовательность относится к нуклеиновой кислоте, которая не присутствует в природном исходном вирусе.

Применительно ко всей заявке, "пакующие клетки" относится к клеткам, которые могут быть инфицированы ортопоксвирусом, который планируется получить. Пакующей клеткой может быть первичная клетка, рекомбинантная клетка и/или линия клеток. Например, может быть использована рекомбинантная клетка, которая содержит элементы, необходимые для получения рекомбинантного вируса и отсутствующие в используемом рекомбинантном вирусном векторе.

В соответствии с предпочтительным вариантом осуществления настоящего изобретения, указанные пакующие клетки являются иммортализованными линиями клеток. Применительно ко всей заявке, " иммортализованные линии клеток" относятся к линиям клеток, которые размножаются в культуре со скоростью, большей предела Хейфлика.

В соответствии с настоящим изобретением указанные иммортализованные линии клеток предпочтительно получены из клеток птиц, принадлежащих к семействам Anatidae или Phasianidae. В частности, среди клеток из Anatidae, клетки, принадлежащие к родам Cairina или Anas являются предпочтительными. Еще более предпочтительными являются иммортализованные линии клеток птиц, принадлежащих к видам Cairina moschata или Anas platyrhynchos.

В соответствии с более предпочтительным вариантом осуществления настоящего изобретения, указанные пакующие клетки являются иммортализованные линиями клеток птиц, полученных из клеток птиц, принадлежащих семейству, а предпочтительно из вида Cairina moschata.

Предпочтительными иммортализованными линиями клеток птиц Cairina moschata в соответствии с настоящим изобретением являются иммортализованные линии клеток птиц Cairina moschata, содержащие последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую обратную транскриптазу теломеразу (TERT), описанную в патентной заявке WO 2007/077256. Следующие иммортализованные линии клеток птиц являются особенно предпочтительными:

- Т3-17490, депонированная в Европейской коллекции культур клеток (European Collection of Cell Cultures, ЕСАСС) под инвентарным номером 08060502 (см. Фигуры 2, 3 и 4), или ее производная;

- Т6-17490, депонированная в Европейской коллекции культур клеток (European Collection of Cell Cultures, ЕСАСС) под инвентарным номером 08060501 (см. Фигуры 5, 6 и 7), или ее производная.

Другими предпочтительными иммортализованными линиями клеток птиц Cairina moschata в соответствии с настоящим изобретением являются иммортализованные линии клеток птиц Cairina moschata, содержащие последовательность нуклеиновой кислоты Е1А, кодирующую обратную транскриптазу теломеразу (TERT), описанную в патентной заявке WO 2009/004016.

Применительно ко всей заявке, "производные" депонированных иммортализованных линий клеток птиц относятся к иммортализованным линиям клеток птиц, которые содержат последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую "соединение, представляющее интерес". Используемое здесь "соединение, представляющее интерес" может включать фармацевтически активный белок, например факторы роста, регуляторы роста, антитела, антигены, их производные, пригодные для иммунизации или вакцинации и подобные им, интерлейкины, инсулин, эритропоэтин, G-CSF, GM-CSF, hPG-CSF, M-CSF, интерфероны (интерферон-альфа, интерфенон-бета, интерферон-гамма, факторы свертываемости крови (например, фактор VIII; фактор IX; tPA) или их комбинации, но не ограничивается ими.

Другими иммортализованными линиями клеток, которые могут быть использованы в способе согласно настоящему изобретению, являются:

- линия клеток DF1, защищенная патентом США 5,879,924, которая является спонтанно иммортализованной линией клеток цыпленка, полученная из яйцеклеток в возрасте 10 дней линии East Lansing (ELL-0);

- линия клеток Ebx цыпленка, описанная в патентной заявке WO 2005/007840, которая получена из эмбриональных стволовых клеток путем прогрессирующего отделения от факторов роста и подпитывающего слоя;

- линия клеток DEC 99 (Ivanov et al. Experimental Pathology and Parasitology, 4/2000 Bulgarian Academy of Sciences), которая является устойчивой линией клеток эмбриона утки. В соответствии с другим предпочтительным вариантом осуществления настоящего изобретения, указанными пакующими клетками являются первичные клетки.

Применительно ко всей заявке, "первичные клетки" относятся к клеткам, которые были недавно выделены из ткани животного или человека, органа или организма, при этом указанные клетки не способны к продолжительному и неограниченному удвоению и делению. Обычно первичные клетки делятся в клеточной культуре менее 100 раз, часто менее 50 раз, часто менее 25 раз. Поэтому первичные клетки не подвергаются иммортализации. Первичные клетки включают фибробласты животных или лимфоциты пуповинной крови, но не ограничиваются ими.

В соответствии с другим предпочтительным вариантом осуществления настоящего изобретения, указанными пакующими клетками являются первичные или вторичные клетки птиц, предпочтительно фибробласты эмбрионов цыплят (CEF).

В соответствии с настоящим изобретением, питательная среда, используемая для получения культуры пакующих клеток (то есть в ходе стадии а)), среда для культивирования, используемая для инфицирования указанной клее точной культуры с ортопоксвирусом (то ест в ходе стадии b)), а также среда для культивирования, используемая для выращивания указанных инфицированных пакующих клеток (то есть в ходе стадии с)) могут быть одинаковыми или различными.

В соответствии с предпочтительным вариантом осуществления настоящего изобретения, указанная среда для культуры клеток, используемая в соответствии с настоящим изобретением является свободной от продуктов животного происхождения. Множество сред, свободных от продуктов животного происхождения, уже описаны, некоторые из них являются коммерчески доступными. Например, 293 SFM II; адаптированная среда без сыворотки для клеток 293-F; адаптированная среда без сыворотки для клеток 293-Н; реагент для трансфекции 293fectin™; CD 293 AGT™; среда CD 293; система экспрессии FreeStyle™ 293; среда FreeStyle™ 293; адаптированная среда FreeStyle™ без сыворотки для клеток 293-F; среда для экспрессии аденовирусов (АЕМ); среда для выращивания клеток PER.C6®; CD 293 AGT™; среда CD 293 Medium; адаптированная среда без сыворотки для клеток COS-7L; среды EPISERF®; OptiPro™ SFM; VP-SFM; VP-SFM AGT™ (все доступны у Invitrogen) могут быть использованы в качестве среды для выращивания клеток в способе согласно настоящему изобретению. Среда для выращивания клеток, не содержащая продукты животного происхождения, использующаяся в соответствии с настоящим изобретением также может быть средой, приготовленной самостоятельно.

Этап а) приготовления культуры пакующих клеток хорошо известен специалистам в данной области.

В случае когда пакующие клетки представляют собой иммортализованные линии клеток, указанные иммортализованные линии клеток культивируют в соответствующей культуральной среде. Способы могут включать выращивание клеток, адгезированных на поверхности, выращивание в суспензии в присутствии или или без (микро)носителей или их комбинацию. Культивирование моно осуществлять, например, в чашках, роллерных флаконах или в биореакторах, с использованием периодических, периодических с подпиткой, непрерывных систем, мембранной фильтрации и т.п.. Для обеспечения крупномасштабной продукции вируса путем культивирования клеток в данной области предпочтительно иметь клетки, способные расти в суспензии в присутствии (микро)носителей или без них, и также предпочтительно иметь клетки, которые можно культивировать в среде, не содержащей продуктов животного происхождения. Среда для культивирования клеток, используемая в настоящем изобретении, предпочтительно не содержит продуктов животного происхождения. К настоящему времени уже описано множество сред, не содержащих продуктов животного происхождения, и некоторые из них, как было описано ранее, доступны для приобретения.

Если пакующие клетки представляют собой CEF, указанные СЕР предпочтительно извлечены из яиц, свободных от определенных патогенов (SPF-яиц). SPF-яйца можно приобрести, например, в Charles River Laboratories (Wilmington, MA, США). Возраст указанных яиц предпочтительно больше 9 дней, более предпочтительно между 10 и 14 днями, и еще более предпочтительно, составляет 12 дней. Перед извлечением эмбриона яйца предпочтительно дезинфицируют. Из уровня техники известно много способов и продуктов для дезинфекции яиц. Особенно предпочтительно инкубация в растворе формалина (например, 2% формалина, 1 мин.) с последующей промывкой в 70% этанола. Затем клетки эмбрионов разделяют и очищают. В предпочтительном варианте осуществления изобретения клетки эмбрионов подвергают этапу ферментативного расщепления, что обеспечивает разрушение межклеточного матрикса. Для этой цели особенно полезно использование ферментов, способных расщеплять межклеточный матрикс. Предпочтительные ферменты согласно настоящему изобретению включают перечисленные, но не ограничиваются ими: трипсин, коллегеназа, проназа, диспаза, гиалуронидаза и нейраминидаза. Ферменты, используемые для приготовления CEF согласно настоящему изобретению, предпочтительно имеют рекомбинантное происхождение. Ферменты можно использовать по отдельности или в комбинации. В предпочтительном варианте изобретения используют комбинацию диспазы и трипсина (например, TrypLE select от Gibco™). Специалист в данной области смоет определить концентрацию фермента, температуру и продолжительность инкубации, обеспечивающие эффективное разделение клеток. Приготовление культуры CEF может дополнительно включать этап фильтрации и/или этап центрифугирования, обеспечивающие удаление примесей. Согласно настоящему изобретению, первичные полученные CEF могут также использоваться либо сразу либо после одного дополнительного пассажа в качестве вторичных CEF. Указанные CEF (Т.е. первичные или вторичные) затем культивируют в соответствующей среде для культивирования клеток. Среды для культивирования клеток, используемые согласно настоящему изобретению, предпочтительно не содержат продуктов животного происхождения. К настоящему времени уже описано множество сред, не содержащих продуктов животного происхождения, и некоторые из них, как было описано ранее, доступны для приобретения. В настоящем изобретении СЕР предпочтительно культивируют в среде для культивирования клеток VP-SFM (Invitrogen). CEF предпочтительно культивируют в течение от 1 до 5 дней, более предпочтительно между 1 и 2 днями и еще более предпочтительно 2 дня до инфицирования. CEF предпочтительно культивируют при температуре, лежащей в диапазоне между 30ºС и 36,5ºС.

Этап b) инфицирования культуры пакующих клеток (приготовленной на этапе a)) ортопоксвирусом хорошо известен специалистам в данной области. Во всем тексте настоящей заявки "инфицирование" относится к переносу вирусной нуклеиновой кислоты в клетку, где происходит репликация вирусной нуклеиновой кислоты, синтез вирусных белков или сборка вирусных частиц. Специалист в данной области сможет выбрать наиболее подходящую пакующую клетку для продукции конкретного вируса. В предпочтительном варианте осуществления способ согласно настоящему изобретению включает использование CEF или иммортализованной линии клеток птиц, предусмотренной в патентной заявке WO 2007/077256 или WO 2009/004016 для продукции ортопоксвируса, и предпочтительно MVA или W. Этап b) инфицирования культуры пакующих клеток (приготовленной на этапе а)) ортопоксвирусом осуществляют в соответствующей среде для культивирования клеток, которая может быть такой же среда для культивирования клеток, использованная для приготовления указанной культуры пакующих клеток (т.е в ходе этапа а)), или отличаться от нее. Среды для культивирования клеток, используемая согласно настоящему изобретению предпочтительно не содержат продуктов животного происхождения. К настоящему времени уже описано множество сред, не содержащих продуктов животного происхождения, и некоторые из них, как было описано ранее, доступны для приобретения. В случае, если пакующие клетки представляют собой CEF, этап Ь) инфицирования культуры CEF осуществляют в Basal Medium Eagle (среда для культивирования клеток, Invitrogen). В среду для культивирования клеток предпочтительно высевают от 0,5 до 1,5, более предпочтительно между 1,1 и 1,3 и еще более предпочтительно примерно 1,2 эмбриона/л среды для культивирования клеток. В конкретном варианте осуществления, в котором, продуцируемым ортопоксвирусом является MVA, MVA высевают в сосуд для культивирования клеток при MOI (множественность инфекции), которая предпочтительно находится в диапазоне между 0,001 и 0,1, более предпочтительно между 0,03 и 0,07, и еще более предпочтительно примерно 0,05. В другом конкретном варианте осуществления, в котором продуцируемый ортопоксвирус представляет собой W, высевают в сосуд для культивирования клеток при М01 (множественность инфекции), которая предпочтительно находится в диапазоне между 0,0001 и 0,1, и более предпочтительно примерно 0,0001.

Этап с) культивирования инфицированных пакующих клеток (из этапа b)) до получения потомства ортопоксвируса, хорошо известен специалистам в данной области.

В случае, если пакующие клетки представляют собой CEF, этап с) культивирования инфицированных CEF осуществляют в соответствующей среде для культивирования клеток, которая может быть такой же или отличаться от среды для культивирования клеток, использованной для приготовления культуры CEF (т.е., в ходе этапа а), и от среды для культивирования клеток, использованной для инфицирования указанной культуры CEF ортопоксвирусом (т.е., в ходе этапа b)). Среды для культивирования клеток, используемая согласно настоящему изобретению предпочтительно не содержат продуктов животного происхождения. К настоящему времени уже описано множество сред, не содержащих продуктов животного происхождения, и некоторые из них, как было описано ранее, доступны для приобретения. Согласно настоящему изобретению культивирование инфицированных CEF осуществляют среда для культивирования клеток Basal Medium Eagle (Invitrogen). Инфицированные CEF предпочтительно культивируют в течение от 1 до 6 дней, более предпочтительно от 2 до 4 дней и еще более предпочтительно в течение 3 дней. Инфицированные CEF предпочтительно культивируют при температуре ниже чем 37ºС, предпочтительно между 30ºС и 36,5ºС.

Этап d) инкубации в присутствии одной или более нуклеаз (а именно, эндонуклеаз или экзонулеаз) проводят для того чтобы разрушить нуклеиновые кислоты (например, ДНК; РНК), присутствующие в растворе. Нуклеазы, предпочтительно используемые в соответствии с настоящим изобретение, представляют собой эндонуклеазы. Эндонуклеазы могут быть классифицированы по их субстратам следующим образом: дезоксирибонуклеазы (ДНКазы), которые разрушают ДНК; рибонуклеазы (РНКазы) которые разрушают РНК; и эндонуклеазы, которые разрушают ДНК и РНК. Эндонулкеазы ДНКазы включают, но не ограничиваются, перечисленными: ДНКазу I, ДНКазу II и эндодезоксинуклеазу IV. Эндонуклеазы РНКазы включают, но не ограничиваются, перечисленными: PHKse I, РНКазу III, РНКазу Е, РНКазу F и РНКазу Р. Эндонуклеазы, которые разрушают ДНК и РНК, включают, но не ограничиваются, перечисленными: Benzonase®. В предпочтительном варианте изобретения этап а) инкубирования ортопоксвирусов, полученных на этапе с), осуществляют в присутствии Benzonase®. Benzonase® разрушает нуклеиновую кислоту (например, ДНК; РНК) путем гидролиза внутренних фосфодиэфирных связей между некоторыми нуклеотидами. После полного расщепления все свободные нуклеиновые кислоты (например, ДНК; РНК), присутствующие в растворе, восстанавливаются до олигонуклеотидов с 5'-монофосфатом на конце, имеющих от 3 до 8 оснований в длину. Benzonaze® не обладает протеолитической активностью. Benzonaze®, используемая согласно настоящему изобретению, предпочтительно является фармацевтически приемлемой. Фармацевтически приемлемая Benzonaze® доступна для приобретения (например, продукт Eurogentec под номером МЕ-0280-10; Merck под номером, например, 1.01653.0001).

Предпочтительными условиями для воздействия нуклеазы (нуклеаз) согласно настоящему изобретению являются (как описано в Примере 1):

- рН находится в диапазоне между 7,0 и 9,0, предпочтительно между 7,5 и 8,5, и более предпочтительно, рН равен 8,0;

- концентрация кофакторов, выбранных из Mg²⁺ и Mn²⁺, предпочтительно Mg²⁺, лежит в диапазоне от 1 до 2 мМ, и предпочтительно составляет 2 мМ.

В предпочтительном варианте осуществления изобретения нуклеазу (нуклеазы) инкубируют при температуре в диапазоне между 22ºС и 28ºС, предпочтительно при температуре в диапазоне между 23ºС и 27ºС, более предпочтительно при температуре в диапазоне между 24ºС и 26ºС, и еще более предпочтительно при температуре 25ºС (как описано в Примере 1). В настоящем варианте осуществления продолжительность этапа d) предпочтительно находится в диапазоне между 1 и 5 часами, и более предпочтительно, составляет 2 часа (как описано в Примере 1).

Согласно другому предпочтительному варианту осуществления изобретения нуклеазу (нукпеазы) инкубируют при температуре в диапазоне между 2ºС и 8ºС, предпочтительно при температуре в диапазоне между 3ºС и 7ºС, более предпочтительно при температуре в диапазоне между 4ºС и 6ºС, и еще более предпочтительно при температуре 5ºС. В этом другом варианте осуществления продолжительность этапа d) предпочтительно находится в диапазоне между 10 и 20 часами, и, более предпочтительно, составляет 18 часов.

Согласно настоящему изобретению, концентрация нуклеазы (нуклеаз), используемых на этапе d), находится в диапазоне от 5 до 100 мкл/мин, предпочтительно в диапазоне от 5 до 50 мкл/мин, и более предпочтительно, составляет 10 мкл/мин. Как показано на Фиг.1, применение в тех же условиях 10 мкл/мин Benzonase® неожиданно приводит к снижению концентрации ДНК после 2 часов обработки (температура 25ºС; 2 мМ Mg²⁺; рН 8), эквивалентному достигаемому при использовании 50 мкл/мин Benzonase®.

В предпочтительном варианте осуществления изобретения этап а) дополнительно включает добавление одного или более детергентов. Детергенты включают, но не ограничиваются перечисленными: Tween, Triton X-100 (нонаэтилен гликоль октил феноловый эфир), сапонин, додецилсульфат натрия, Brij 96, Polidocanol, N-октил β-D-глюкопиранозид и карбонат натрия. Предпочтительным детергентом, используемом на этапе d), является Tween. Tween включает, но не ограничен перечисленными видами: Tween 20 (полиоксиэтилен сорбитан монолаурат), Tween 80 (полиоксиэтилен сорбитан моноолеат) и Tween 85 (полиоксиэтилен сорбитан триолеат). Предпочтительным видом Tween, используемым на этапе d), является Tween 80, Согласно настоящему изобретению, концентрация детергента (детергентов), используемого на этапе d), находится в диапазоне от 10 до 100 мкг/л, предпочтительно в диапазоне от 10 до 55 мкг/л.

Ортопосквирусы, полученные и предварительно обработанные нуклеазу (нуклеазами), затем выделяют из культутрального супернатанта и/или пакующих клеток.

Если ортопоксвирусы выделяют из пакующих клеток (т.е. только из пакующих клеток, или из пакующих клеток и из супернатанта), перед этапом е) можно осуществить этап, обеспечивающий разрушение мембраны пакующих клеток. Этот этап приводит к высвобождению ортопоксвирусов из пакующих клеток. Разрушение мембраны пакующих клеток можно вызвать при помощи различных методик, хорошо известных специалистам. Эти методики включают, но не ограничиваются перечисленными: замораживание/оттаивание, лизис в гипотонической среду, обработку ультразвуком (с использованием соникатора) и микрофлюидизацию (с использованием микрофлюидизатора). Соникаторы доступны для приобретения, например, в Heraeus PSP, Biologies, Misonix или GlenMills. Предпочтительными соникаторами для использования согласно настоящему изобретению являются SONITUBE 20 КГц тип SM 20-120-3, SONITUBE 36 КГц тип SM 35/3WU и SONITUBE 35 КГц тип SM 35-400-3 (Heraeus PSP). Микрофлюидизатоы доступны для приобретения, например, в Microfluidics Corporation. Мембрана пакующих клеток также может быть разрушена с использованием пресса SLM Aminco French. Мембрана пакующих клеток также может быть разрушена с использованием высокоскоростного гомогенизатора. Высокоскоростные гомогенизаторы доступны для приобретения в, например, Silverson Machines или Ika-Labotechnik. Предпочтительным высокоскоротным гомогенизатором для использования согласно настоящему изобретению является SILVERSON L4R (Silverson Machines). Смесь, полученную после разрушения мембраны пакующих клеток, можно затем инкубировать в течение по меньшей мере 1 часа при перемешивании, что обеспечит разрушение ранее добавленной нуклеазой (нуклеазами) (на этапе а)) нуклеиновых кислот (например, ДНК), высвобожденных из пакующих клеток. Соответственно, в конкретном варианте осуществления изобретения перед этапом е) осуществляют:

1) этап, обеспечивающий разрушение мембраны пакующих клеток, предпочтительно с использованием высокоскоростного гомогенизатора или путем обработки ультразвуком; и

2) этап инкубирования смеси, полученной на этапе 1) в течение по меньшей мере 1 часа, что обеспечивает разрушение добавленной на этапе d) нуклеазой (нуклеазами) нуклеиновых кислот (например, ДНК), высвобожденных из пакующих клеток.

Согласно настоящему изобретению, продолжительность этапа 2) предпочтительно находится в диапазоне между 1 и 5 часами, и более предпочтительно, составляют 2 часа (как описано в Примере 1).

Согласно настоящему изобретению, нуклеазу (нуклеазы) (предварительно добавленную (на этапе d) инкубируют) в ходе этапа 2) при температуре в диапазоне между 22ºС и 28ºС, предпочтительно при температуре в диапазоне между 23ºС и 27ºС, более предпочтительно при температуре в диапазоне между 24ºС и 26ºС, и еще более предпочтительно при температуре 25ºС (как описано в Примере 1).

Этап f) добавления моновалентных солей к ортопоксвирусам, выделенным на этапе е), в подходящих условиях позволяет:

- ингибировать активность нуклеазы (нуклеаз); и

- избежать адсорбции ортопоксвирусов на анионообменном адсорбенте на этапе g), т.е. избежать адсорбции более 10% ортопоксвирусов на анионообменном адсорбенте. Соответственно, на этапе g) на анионообменном адсобренте будут адсорбированы только нуклеиновые кислоты (например, ДНК).

Моновалентные соли включают, но не ограничиваются перечисленными: NaCl и KCl. Предпочтительной моновалентной солью для использования на этапе f) является NaCl. Согласно настоящему изобретению, концентрация моновалентных солей на этапе f) находится в диапазоне от 200 до 300 мМ, и предпочтительно составляет 250 мМ или 300 мМ. Согласно настоящему изобретению, этап f) осуществляют при рН, находящемся в диапазоне между 7,0 и 9,0, предпочтительно между 7,5 и 8,5, и, более предпочтительно, при рН 8,0, Согласно настоящему изобретению, этап f) добавления моновалентных солей к ортопоксвирусам, выделенным на этапе е) предпочтительно осуществляют в условия, описанных в Примере 1, с использованием NaCl в количестве 250 мМ, или, более предпочтительно, 300 мМ, при рН 8,0.

Этап g) осуществления контакта смеси, полученной на этапе f), с анионообменным адсорбентом в подходящих условиях обеспечивает захват нуклеиновых кислот (например, ДНК), содержащихся в указанной смеси. Анионообменный сорбент не захватывает отропоксвирусы благодаря обработке, осуществленной на этапе f).

Согласно настоящему изобретению, этап g) осуществляют при рН, находящемся в диапазоне между 7,0 и 9,0, предпочтительно, между 7,5 и 8,5, и, более предпочтительно при рН 8,0 (как описано в Примере 1).

Согласно настоящему изобретению, продолжительность этапа g) предпочтительно находится в диапазоне между 1 и 3 часами, и, более предпочтительно, составляет 1 (как описано в Примере 1).

Согласно настоящему изобретению, функциональные группы анионообменного адсорбента на этапе g) представляют собой первичные, вторичные, третичные и четвертичные аминогруппы, такие как, например, диметиламиноэтил(ОМАЕ), диэтиламиноэтил (DEAE), триметиламиноэтил (ТМАЕ), триэтиламиноэтил (ТЕАЕ), группа -R-СН(ОН)-СН₂-N+-(СН₃)₃ (также называемая Q-группой; см., смолы Streamline®, Pharmacia) и и другие группы, такие как, например, полиэтиленимин (PEI), которая уже имеет или приобретает формально положительный заряд в диапазоне рН от 7,0 до 9,0, Предпочтительными функциональными группами анионообменного адсорбента на этапе д) являются группы, выбранные из группы, состоящей из диметиламиноэтила (DMAE), диэтиламиноэтила (DEAE), триметиламиноэтила (ТМАЕ) и триэтиламиноэтила (ТЕАЕ), и, в более предпочтительном случае, представляют собой триметиламиноэтил (ТМАЕ).

Анионообменный адсорбент на этапе g) может представлять собой например матрикс, состоящий из гранул, или мембрану.

В предпочтительном варианте осуществления изобретения анионообменный адсорбент на этапе g) представляет собой матрикс, состоящий из гранул. Матрикс может быть, например, агарозой, гидрофильным полимером, целлюлозой, декстраном или кремниевым. Цепи (например, цепи декстрана) связаны с матриксом. Функциональные группы, описанные ранее, присоединены к указанным цепям химически стабильными связями (например, эфирными связями). Предпочтительными функциональными группами матрикса, состоящего из гранул, являются триметиламиноэтильные группы (ТМАЕ). Согласно настоящему изобретению, диаметр гранул матрикса, состоящего из гранул, превышает размер пор фильтров, используемых на этапе осветления h). Соответственно, гранулы в матриксе, состоящем из гранул, предпочтительно, имеют диаметр более 8 мкм, более предпочтительно, диаметр, лежащий в диапазоне между 50 мкм и 150 мкм, более предпочтительно, диаметр, лежащий в диапазоне между 90 мкм и 120 мкм, и еще более предпочтительно диаметр, равный 120 мкм. В соответствии с признаками настоящего изобретения ортопоксвирусы (имеющие диаметр, равный 200-300 нм) проходят через фильтры с таким размером пор в ходе этапа осветления h) (т.е., ортопксвирусы перейдут в фильтрат h). Анионообменные адсорбенты, представляющие собой матрикс, состоящий из гранул, используемые согласно настоящему изобретению предпочтительно являются автоклавируемыми. Автоклавируемые анионообменные адсорбенты, представляющие собой матрикс, состоящий из гранул, уже описаны и некоторые из них доступны для приобретения, такие как, например, UNOsphere® Q (BioRad), UNOsphere® S (BioRad), STREAMLINE™ Q Sepharose® XL (Amersham Biosciences), STREAMLINE™ SP Sepharose® XL (Amersham Biosciences) или BioSepra® Q hyperZ (Pall Corporation). Предпочтительным автоклавируемым анионообменным адсорбентом, представляющим собой матрикс, состоящий из гранул, в соответствии с настоящим изобретением является UNOsphere® Q (BioRad). UNOsphere® Q (BioRad) состоит из гидрофильных полимерных сферических гранул, имеющих диаметр, равный 120 мкм и несущих триметиламиноэтильные (ТМАЕ) функциональные группы. Этап g) осуществления контакта смеси, полученной на этапе f), с анионообменным адсорбентом, где указанный обменный сорбент представляет собой матрикс, состоящий из гранул, предпочтительно осуществляют в соответствии с условиями, описанными в Примере 1, где используют UNOsphere® Q (BioRad).

Согласно другому предпочтительному варианту осуществления изобретения анионообменный адсорбент на этапе g) состоит из мембраны. Функциональные группы мембраны могут быть такими, как описано ранее. Предпочтительными функциональными группами мембраны являются группы триметиламиноэтила (ТМАЕ). Согласно настоящему изобретению размер пор мембраны превышает диаметр ортопосквирусов (т.е. 200 нм). Соответственно, ортопоксвирусы переходят в фильтрат. В этом отношении размер пор мембраны согласно настоящему изобретению находится в диапазоне между 1 и 5 мкм, и предпочтительно составляет 3 мкм. Анионообменные адсорбенты, состоящие из мембран, используемые согласно настоящему изобретению предпочтительно являются автоклавируемыми. Автоклавируемые анионообменные адсорбенты, состоящие мембран уже описаны и некоторые из них доступны для приобретения, такие как, например Sartobind® 75 Q (Sartorius), CUNO PolyNet™ Filters (например, PolyNet™ PB РОЮ, Р020, Р030, Р050) или CUNO Betapure™ Filters (например, Betapure™ Z13-020, Z13-030, Z13-050). Предпочтительным автоклавируемым анионообменным адсорбентом, состоящим из мембран, испо