Мультиплексный анализ стопочного трансгенного белка

Мультиплексный анализ стопочного трансгенного белка

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Эта заявка испрашивает приоритет, основанный на предварительной патентной заявке 61/183777, которая была зарегистрирована в Бюро США по патентам и торговым знакам 3 июня 2009 г., и полное раскрытие которой включено в этот документ путем ссылки.

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ, К КОТОРОЙ ОТНОСИТСЯ ИЗОБРЕТЕНИЕ

Изобретение, в целом, относится к высокопроизводительному анализу признаков растений. В некоторых вариантах осуществления изобретение относится к способам высокопроизводительного анализа и количественной оценки растительных белков, определенных посредством масс-спектрометрии с разовым впрыскиванием образцов смешанного белка, извлеченного из растений и растительной ткани. Далее, некоторые варианты осуществления изобретения относятся к способам анализа генотипов трансгенных растений и поддержки экспрессии в этих растениях желательных растительных признаков.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Расширяющееся применение технологии рекомбинантных ДНК для получения трансгенных растений в коммерческих и индустриальных целях требует развития высокопроизводительных способов анализа линий трансгенных растений. Такие способы нужны для сохранения сортов трансгенных растений в последовательной череде поколений, для предупреждения утечки трансгенов в окружающую среду, а также для помощи в быстром получении трансгенных растений с желательными или оптимальными фенотипами. Кроме того, современные руководства по безопасной оценке ГМ (генетически модифицированных) растений, предназначенных для употребления человеком, требуют их характеристики на уровне ДНК и белка при сравнении между родительской и модифицированной культурой. См. Sesikeran and Vasanthi (2008) Asia Pac. J. Clin. Nutr. 17 Suppl. 1:241-44. Новые экспериментальные сорта ГМ-растений, состоят из все более сложных генетических модификаций, включая, среди прочего, стопочные гены и признаки.

Современные способы анализа трансгенных растений, предпочитаемые в данной области техники, включают: методики, основанные на ДНК (например, ПЦР), ОТ-ПЦР, применение генов-репортеров, саузерн-блоттинг и иммунохимию. Всем перечисленным методологиям присущи различные недостатки, вследствие чего весьма желательно найти более совершенный способ, который определенно способен быстро и недорого идентифицировать, а также количественно оценить множественные продукты трансгенов высокопроизводительным образом посредством анализа ограниченного образца из трансгенного растения.

Методики анализа трансгенных растений, основанные на ДНК, страдают несколькими заметными недостатками. Несмотря на тот факт, что трансформация, опосредованная Agrobacterium, считается наиболее предпочтительным способом генетической трансформации растений, генотипы растений, трансформированных Agrobacterium, трудно анализировать, применяя методики, основанные на ПЦР. См. Nain et al. (2005) Plant Mol. Biol. Rep. 23:59-65. Присутствие в трансформированных тканях даже следовых количеств Agrobacterium приводит к обманчивым результатам ПЦР. Форматы Id. амплификации ДНК также требуют эмпирического тестирования ген-специфических праймеров и условий термоциклирования. Наиболее важно, что подходы к скринингу трансгенных растений, основанные на ДНК, фактически не определяют экспрессию белкового продукта гена. Сходным образом, ОТ-ПЦР или нозерн-блоттинг можно использовать для подтверждения присутствия трансгенных транскриптов в трансгенном растительном материале. См. Alwine et al. (1977) Proc. Nat. Acad. Sci. 74:5350-54; Toplak et al. (2004) Plant Mol. Biol. Rep. 22:237-50. Ни один из этих способов не подтверждает наличия фактической экспрессии белка в исходном растительном материале. Эти методики также требуют применения радиоактивных материалов и/или большего количества тканей и большого времени обработки.

Гены-репортеры, такие как гены, кодирующие флуоресцентные белки, также могут быть котрансформированы в геномы трансгенных растений, то есть, обеспечить инструмент для идентификации трансформантов. Однако гены-репортеры являются лишь косвенными индикаторами генетической рекомбинации. Экспрессия конструкции гена-репортера не подтверждает экспрессию сопутствующего трансгена. Далее, либо ген-репортер, либо трансген могут быть утрачены в последующих поколениях растения-хозяина, тем самым разрывая связь между наличием репортера и представляющего интерес трансгена. Сходным образом, трансгены могут уходить из растения-хозяина в соседние растения, например, в результате перекрестного опыления, без одновременного ухода гена-репортера. Когда в трансгенном растении сложены стопкой множественные гены, необходимо ввести в его геном равное количество генов-репортеров для анализа трансгенного протеома, поскольку функция гена-репортера является только косвенным индикатором функции трансгена, то есть, изменения экспрессии одного трансгена в ответ на присутствие добавочного трансгена могут оказаться не выявленными.

В отличие от способов, описанных выше, для идентификации продуктов экспрессии трансгенов в трансгенном растении можно использовать иммунохимию. Хотя иммунохимия полезна в этих целях, данный способ требует высокой степени очистки белковых образцов для выработки антител. Полученные в результате антитела должны быть протестированы на специфичность, и для этого необходимо создать условия анализа, специфичные в отношении реагентов. Ограничениями полезности этого способа являются высокий уровень экспрессии и очистки, необходимый для проведения иммунохимического анализа, а также связанные с этим проблемы удаления загрязнений из растительной ткани.

Для анализа протеома трансгенного растения также можно использовать масс-спектрометрию. Однако признанные в данной области техники спектрометрические методики требуют, чтобы сложные смеси растительных белков, прежде всего, были разделены двумерным гель-электрофорезом. Rajagopal and Ahern (2001) Science 294(5551):2571-73. См. также Domon and Aebersold (2006) Science 312(5771):212-17, 214. Единичные полосы из разделенного в геле образца белка впоследствии можно расщеплять протеазой и подвергать масс-спектрометрии для идентификации уникального белка, первоначально представленного в нерасщепленной полосе. См., например, Chang et al. (2000) Plant Physiol. 122(2):295-317. Стадия разделения в геле при использовании этого способа является длительным процессом, который затрудняет применение масс-спектрометрии в высокопроизводительных приложениях.

В данной области техники существует потребность в высоко-производительном способе выявления и количественного определения продуктов экспрессии трансгенов в растениях, который не требовал бы очищенного или высокоэкспрессируемого белка, а также использования специфических по отношению к методике реактивов. Такой способ будет полезным подспорьем для растениеводов, занимающихся трансгенными растениями, в сохранении сорта целевого трансгенного растения в ряду последовательных поколений при половом или бесполом размножении. Такой способ также будет полезен для быстрого анализа растений, полученных в результате процедуры трансформации, с целью идентификации таких полученных растений, которые являются трансгенными растениями, экспрессирующими встроенный белок в нужных тканях. Далее, такой способ можно применять для быстрого скрининга растений, подверженных риску контаминации трансгенами из трансгенного растения, для достижения биологической изоляции трансгенного растения.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Специфический вариант осуществления изобретения включает высокопроизводительный способ выявления и количественной оценки присутствия двух или более представляющих интерес белков с известными аминокислотными последовательностями в образце растительного происхождения. Способ включает обеспечение первого впрыскивания смешанного образца растительного происхождения, содержащего белки, и расщепление белков из смешанного образца растительного происхождения на пептиды. В альтернативном варианте способ включает предварительную стадию расщепления белков из смешанного образца растительного происхождения на пептиды с последующим первым впрыскиванием пептидов. Затем пептиды разделяют и ионизируют. Для пептидов получают синхронные масс-спектральные данные и определяют присутствие или отсутствие двух или более представляющих интерес белков.

Еще один вариант осуществления изобретения включает высокопроизводительный способ выявления присутствия двух или более представляющих интерес белков с известными аминокислотными последовательностями в образце растительного происхождения. Способ включает получение масс-спектральных данных для двух или более представляющих интерес белков и осуществление первого впрыскивания смешанного образца растительного происхождения, содержащего белки.

Белки смешанного образца растительного происхождения расщепляют на пептиды, а затем эти пептиды разделяют и ионизируют. Для пептидов получают синхронные масс-спектральные данные. Синхронные масс-спектральные данные сравнивают с масс-спектральными данными, полученными для двух или более представляющих интерес белков, тем самым, определяя наличие или отсутствие двух или более представляющих интерес белков.

Еще один вариант осуществления изобретения включает способ сохранения генотипа ассортимента трансгенных растений. Способ включает: (i) получение масс-спектральных данных для одного или более ожидаемых продуктов трансгенной экспрессии в ряду трансгенных растений, (ii) проведение первого впрыскивания смешанного образца, содержащего белки, из первого поколения ассортимента трансгенных растений, (iii) расщепление белков из смешанного образца растительного происхождения на пептиды, (iv) разделение пептидов, (v) ионизацию пептидов, (vi) получение синхронных масс-спектральных данных для пептидов и сравнение синхронных масс-спектральных данных с масс-спектральными данными, предоставленными для ожидаемых продуктов трансгенной экспрессии, тем самым, определяя наличие или отсутствие ожидаемых продуктов трансгенной экспрессии в первом поколении ассортимента трансгенных растений, (vii) проведение первого впрыскивания смешанного образца, содержащего белки, из второго поколения ассортимента трансгенных растений, (viii) повторение стадий (iii)-(vi) со смешанным образцом, содержащим белки, из второго поколения ассортимента трансгенных растений, и (ix) отказ от размножения второго поколения ассортимента трансгенных растений в том случае, если наличие ожидаемого продукта (продуктов) трансгенной экспрессии не было подтверждено по масс-спектральным данным для пептидов из смешанного белкового образца второго поколения ассортимента трансгенных растений, тем самым, сохраняя генотип ассортимента трансгенных растений.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ФИГУР

Фиг. 1 показывает ЖХ\МС\МС мультиплексное выявление AAD-1.

Фиг. 2 показывает ЖХ\МС\МС мультиплексное выявление AAD-12.

Фиг. 3 показывает ЖХ\МС\МС мультиплексное выявление Cry1F.

Фиг. 4 показывает ЖХ\МС\МС мультиплексное выявление Cry34.

Фиг. 5 показывает ЖХ\МС\МС мультиплексное выявление Cry35.

Фиг. 6 показывает ЖХ\МС\МС мультиплексное выявление ФАТ.

Фиг. 7 показывает ЖХ\МС\МС мультиплексное выявление Cry1F, экспрессированного в ткани инбредной кукурузы.

Фиг. 8 показывает ЖХ\МС\МС мультиплексное выявление Cry34, экспрессированного в ткани инбредной кукурузы.

Фиг. 9 показывает ЖХ\МС\МС мультиплексное выявление Cry35, экспрессированного в ткани инбредной кукурузы.

Фиг. 10 показывает ЖХ\МС\МС мультиплексное выявление ФАТ, экспрессированного в ткани инбредной кукурузы.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Специфичность, присущая масс-спектрометрическому подходу при идентификации единичного белка в смешанном образце, уникальна в том, что для идентификации представляющего интерес белка нужна только последовательность представляющего интерес белка. По сравнению с другими форматами мультиплексирования масс-спектрометрия уникальна, будучи способной использовать всю длину первичной аминокислотной последовательности белка, чтобы нацелиться на уникальные идентифицирующие участки первичной аминокислотной последовательности и, практически, исключить неспецифическое выявление. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения протеолитический фрагмент или набор протеолитических фрагментов, который уникальным образом идентифицирует представляющий интерес белок (белки), применяют для выявления представляющего интерес белка (белков) в смешанном белковом образце.

В общих чертах, специфические способы, предложенные изобретением, позволяют осуществить прямой мониторинг и количественное определение любого белка (белков) из представляющей интерес ткани, для чего требуется только предварительное знание аминокислотной последовательности белка (белков). Способ может быть реализован высокопроизводительным образом без необходимости разрабатывать/тестировать реактив, специфический по отношению к реакции. Наличие очищенного белка в качестве реактива для разработки способа неизменно приносит успех, хотя для разработки способа этого анализа вполне достаточно иметь белок, степень очистки которого составляет, например, 60%. Способы, описанные в представленном раскрытии изобретения, могут исключить для компетентного специалиста необходимость разрабатывать требующие напряжения сил способы приготовления высокоочищенных образцов белка с целью их применения для выработки антител. Таким образом, способы, предложенные настоящим изобретением, помогут сэкономить время и ресурсы. Кроме того, эти способы обеспечивают большее разнообразие белковых реактивов, пригодных для мультиплексного анализа, поскольку усилия для удаления, например, последних 30-40% загрязнений могут стать ненужными. Раскрытые в этом документе способы также представляют необходимое улучшение по сравнению с мультиплексными подходами, основанными на амплификации ДНК, которые требуют эмпирического тестирования геноспецифических праймеров, соблюдения условий термоциклирования и, кроме того, создают ситуации, в которых любая утрата целевой специфичности может значительно снизить точность способа вследствие экспоненциальной амплификации, необходимой для выявления ДНК.

В отдельных вариантах осуществления способы, предлагаемые настоящим изобретением, позволяют осуществить обратную инженерию белка, чтобы определить, почему специфический белок обладает уникальными свойствами, причем реальный белок для начала исследования не требуется. Например, модификации последовательности и/или посттрансляционные модификации целевых белков, которые ассоциированы с желательными или нежелательными призраками растения, могут быть идентифицированы по масс-спектральным данным смешанного белкового образца из растения, экспрессирующего желательный или нежелательный признак.

В некоторых вариантах осуществления изобретения раскрытые в этом документе способы позволяют провести количественное определение или оценку соотношения различных белков в смешанном белковом образце посредством одноразового масс-спектрометрического анализа в противоположность индивидуальному многоразовому измерению каждого представляющего интерес белка и компиляции индивидуальных результатов в общий результат для одного образца.

В других вариантах осуществления настоящее изобретение также предлагает способы, полезные для развития и использования технологии трансгенных растений. Более конкретно, раскрытые в этом документе способы могут быть использованы для сохранения генотипов трансгенных растений в ряду поколений. Кроме того, некоторые варианты осуществления раскрытых в этом документе способов могут быть использованы для обеспечения высокопроизводительного анализа нетрансгенных растений, которые подвержены риску контаминации трансгенами от соседних растений, например, посредством перекрестного опыления. Благодаря этим вариантам осуществления изобретения может быть облегчено и/или достигнуто биологическое предотвращение распространения трансгенов. В других вариантах осуществления раскрытые в этом документе способы могут быть использованы для скрининга результатов процедуры трансформации растений высоко-производительным образом с целью идентификации трансформантов, которые проявляют желательные свойства экспрессии.

I. Сокращения

Настоящее изобретение будет описано с употреблением следующих сокращений:

AAD-1: (R)-2,4-дихлорфеноксипропионат диоксигеназа

AAD-12: (S)-2,4-дихлорфеноксипропионат/альфа-кетоглутарат диоксигеназа

ИСД: Индуцированная столкновениями диссоциация

Cry1F: Пестицидный кристаллический белок Cry1Fa (инсектицидный дельта-эндотоксин Cry1F(a)

Cry34: Кристаллический белок ET79 (Bacillus thuringiensis)

Cry35: Cry35Ab-подобный (Bacillus thuringiensis)

КЭ: Капиллярный электрофорез

ДНК: Дезоксирибонуклеиновая кислота

ELISA: Ферментный иммуносорбентный анализ

УИП: Усиленный ион-продукт

ГМ: Генетически модифицированный

ЗЗИ: Захват, зависящий от информации

ЖХ\МС\МС: Жидкостная хроматография - тандемная масс-спектрометрия

ММР: Мониторинг множественных реакций

МС: Масс-спектрометрия

МСМС: Тандемная масс-спектрометрия

ФАТ: Фосфинотрицин N-ацетилтрансфераза (PPT N-ацетилтрансфераза)

ПЦР: Полимеразная цепная реакция

ОТ-ПЦР: Полимеразная цепная реакция с обратной транскриптазой

II. Термины

Для того чтобы облегчить просмотр различных вариантов осуществления изобретения, описанных в этом документе, дается следующее разъяснение специфических терминов:

Биологическое сдерживание: При использовании в этом документе термин "биологическое сдерживание" относится к ограничению перемещения генетически модифицированных растений или их генетического материала в нежелательные ареалы. Этот термин включает физическое, физико-химическое, биологическое сдерживание, а также другие формы сдерживания, которые предотвращают выживание, распространение или репродукцию генетически модифицированных растений в природную окружающую среду или в искусственные условия выращивания.

Смешанный белковый образец: При использовании в этом документе термин "смешанный белковый образец" употребляется для дифференциации с очищенным белковым образцом. Сложный белковый образец содержит множественные белки и дополнительно может содержать другие загрязнения.

Масс-спектрометрия: При использовании в этом документе общий термин "масс-спектрометрия" относится к любому подходящему способу, устройству или конфигурации масс-спектрометрии, включая, например, ионизацию электрораспылением (ИЭР), МС с ионизацией способом лазерной десорбции в присутствии матрицы (ИЛДПМ), времяпролетную МС с ИЛДПМ, МС с ИЛДПМ при атмосферном давлении, МС с ИЛДПМ в вакууме, тандемную МС или любую комбинацию этих способов. Устройства для масс-спектрометрии измеряют молекулярную массу молекулы (как функцию соотношения между массой и зарядом молекулы), определяя траекторию полета молекулы через множество магнитных и электрических полей. Соотношение между массой и зарядом является физической величиной, широко используемой в электродинамике заряженных частиц. Соотношение между массой и зарядом определенного пептида априорно может рассчитать компетентный специалист в данной области. Две частицы с разным соотношением между массой и зарядом, подвергаясь воздействию одинаковых электрических и магнитных полей, не будут двигаться в вакууме по одной и той же траектории. Настоящее изобретение включает, среди всего прочего, применение жидкостной хроматографии высокого разрешения (ЖХВР) с последующим анализом пептидов способом тандемной МС.

Инструменты для масс-спектрометрии состоят из трех модулей: Источника ионов, который разбивает молекулы образца на ионы, масс-анализатора, который сортирует ионы по их массе, прикладывая электромагнитные поля, и детектора, который измеряет величину индикаторного количества и, тем самым, поставляет данные для расчета относительного содержания каждого представленного иона. Такая методика имеет как качественные, так и количественные варианты применения. К их числу относятся идентификация неизвестных соединений, определение изотопного состава элементов в молекуле, определение структуры соединения посредством наблюдения его фрагментации и количественное определение соединения в образце.

Подробный обзорный анализ методологий и устройств масс-спектрометрии можно найти в следующих источниках, которые включены в тот документ путем ссылки: Carr and Annan (1997) Overview of peptide and protein analysis by mass spectrometry. В: Current Protocols in Molecular Biology, под редакцией Ausubel, et al. New York: Wiley, p. 10.21.1-10.21.27; Paterson and Aebersold (1995) Electrophoresis 16: 1791-1814; Patterson (1998) Protein identification and characterization by mass spectrometry. В: Current Protocols in Molecular Biology, под редакцией Ausubel, et al. New York: Wiley, p. 10.22.1-10.22.24; and Domon and Aebersold (2006) Science 312(5771):212-17.

Мультиплексный: Применительно к термину, употребляемому в этом документе, белки и/или пептиды "мультиплексированы", когда в одном и том же образце представлены два или более представляющих интерес белка и/или пептида.

Признак растения: При использовании в этом документе термин "признак растения" может относиться к любому единичному качественному или количественному признаку растения.

Пептид: Пептиды представляют собой короткие полимеры, образующиеся в результате соединения друг с другом α-аминокислот в определенном порядке. Пептиды также можно получить в результате расщепления полипептидов, например, белков, протеазой.

Белок: Белки представляют собой органические соединения аминокислот, выстроенных линейной цепочкой и соединенных друг с другом пептидными связями между карбоксильными группами и аминогруппами остатков смежных аминокислот. Последовательность аминокислот в белке определяется последовательностью гена, которая закодирована в генетическом коде. В общем, генетический код точно определяет 20 стандартных аминокислот, однако в некоторых организмах генетический код может включать селеноцистеин, а в некоторых археях пирролизин. Аминокислотные остатки в белке часто бывают химически модифицированы посредством посттрансляционной модификации, которая может происходить или до использования белка в клетке, или в качестве составной части механизмов управления. Аминокислотные остатки в белке также можно модифицировать преднамеренно, применяя методики, известные компетентному специалисту. При использовании в этом документе термин "белок" охватывает линейные цепочки, содержащие природные аминокислоты, синтетические аминокислоты, модифицированные аминокислоты или комбинации любых перечисленных типов аминокислот.

Одноразовое впрыскивание: При использовании в этом документе термин "одноразовое впрыскивание" относится к начальной стадии операции в устройстве для МС или ЖХ-МС. Когда белковый образец вводят в устройство одним впрыскиванием, весь образец вводится в один прием.

Стопочный/стэкинг: При использовании в этом документе термин "стопочный" относится к наличию множественных гетерологичных полинуклеотидов, встроенных в геном растения.

Тандемная масс-спектрометрия: При тандемной масс-спектрометрии родительский ион, полученный из представляющей интерес молекулы, может быть отфильтрован в инструменте для МС, а затем фрагментирован с выходом одного или более дочерних ионов, которые анализируют (выявляют и/или количественно определяют) во второй процедуре МС.

Трансгенное растение: При использовании в этом документе термин "трансгенное растение" включает ссылку на растение, которое содержит в своем геноме гетерологичный полинуклеотид. Обычно гетерологичный полинуклеотид стабильно интегрирован в геном, то есть, этот полинуклеотид передается в последующие поколения потомства. Гетерологичный полинуклеотид может быть интегрирован в геном самостоятельно или как часть рекомбинантной экспрессирующей кассеты. Термин "трансгенный" при употреблении в этом документе включает любую клетку, клеточную линию, каллюс, ткань, часть растения или целое растение, генотип которых был изменен присутствием гетерологичной нуклеиновой кислоты, включая как растения с первоначально измененным генотипом, так и растения, полученные при перекрестном опылении или бесполом размножении из исходного трансгенного растения.

III. Выбор трансгенного белка для мультиплексного анализа

Способами, предлагаемыми настоящим изобретением, можно проанализировать любой белок, введенный в растение посредством технологии трансгенной экспрессии. Белки, пригодные для мультиплексного анализа, в соответствии с изобретением могут придавать трансгенному растению такой фенотипический признак, который делает его более совершенным по сравнению с нетрансгенным аналогом. Неограничивающими примерами желательных признаков, которые могут быть приданы трансгенным растениям, являются устойчивость к гербицидам, устойчивость к стрессу, связанному с воздействием окружающей среды, повышенная урожайность, улучшенная пищевая ценность, улучшенный срок хранения, измененное содержание масла, измененный состав масла, измененное содержание сахара, измененное содержание крахмала, выработка растительного фармацевтического средства, выработка продуктов промышленного назначения (например, полигидроксил-алканоатов: макромолекулярных полиэфиров, считающихся идеальными для замещения пластиков, полученных из нефти) и потенциал для биоремедиации. Кроме того, с применением способов, описанных в этом раскрытии изобретения, может быть проанализирована экспрессия одного или более трансгенных белков в одном растительном виде. Добавление двух и более генов или желательных признаков в один представляющий интерес биологический вид или их модуляция известны как стэкинг генов (эффект образования стопки). Кроме того, экспрессия одного или более трансгенных белков может быть одновременно проанализирована на основе раскрытого в этом документе мультиплексного анализа с одним или более эндогенных белков растения.

Предпочтение конкретным белкам, выбранным для анализа, определяется по усмотрению специалиста. Такими белками могут быть, но, не ограничиваясь ими, белки растений, животных, дрожжей и т.п., кроме того, это могут быть белки, не обнаруживаемые в нетрансформированной клетке или обнаруживаемые в трансформированной клетке. Особенно удобными белками, экспрессирующимися в трансгенных растениях, являются такие белки, которые придают этим растениям устойчивость к гербицидам, насекомым или вирусам, а также гены, которые обеспечивают повышенную пищевую ценность, более высокую урожайность, засухоустойчивость, утилизацию азота, выработку полезных в промышленном отношении соединений, лучшие характеристики переработки растения или потенциал для биоремедиации. Примеры полезных белков включают белки, кодируемые инсектицидным геном Bacillus thuringiensis, которые придают устойчивость к насекомым, а также ген 5'-энолпирувил-3'-фосфошикимат-синтазы (EPSPS) и его любые варианты, придающие устойчивость к глифосатным гербицидам. Как будет легко понятно компетентному специалисту, любой белок, придающий растению желательный признак, может экспрессироваться в растительной клетке с применением технологии рекомбинантных ДНК.

IV. Отбор пептидных фрагментов

В соответствии с представленным раскрытием изобретения целевые белки можно идентифицировать, определяя наличие протеолитических пептидных фрагментов целевых белков в спектрах МС из сложной смеси растительных белков. Протеазные ферменты расщепляют белки в специфических аминокислотных последовательностях, которые могут быть легко определены в пределах всей последовательности целевого белка. Следовательно, набор пептидных фрагментов, полученных при расщеплении одной или более протеаз, можно логически вывести априорно. Затем, исходя из первичной аминокислотной последовательности пептида, можно определить логически выведенное уникальное соотношение между его массой и зарядом.

Пептидные фрагменты также можно определить эмпирически по спектрам МС расщепленных целевых белков. Специфический вариант осуществления изобретения может быть связан с отбором пептида, последовательность которого является внутренней по отношению к предсказанным сайтам протеолитического расщепления. Для эмпирического отбора пептидных фрагментов с целью идентификации целевого белка образцы расщепленного белка можно подвергнуть масс-спектрометрии, чтобы определить пептидные фрагменты, которые обеспечивают необходимую чувствительность и специфичность выявления для мультиплексной идентификации белка. Обычно предпочтительными для отбора являются самые обильные ионизированные пептиды. Обильное содержание специфического ионизированного пептида является функцией массы пептида и эффективности ионизации пептида.

Представляющие интерес белки в стопочном продукте будут экспрессироваться на разном уровне по отношению друг к другу. Выявленные пептиды будут получены из индивидуальных белков, экспрессированных в разных и иногда неизвестных концентрациях. Выявление пептидов и белков будет варьироваться в диапазоне от аттомолярных до микромолярных концентраций. Чистота тестируемых образцов будет варьироваться от очищенных стандартных белков в буферных растворах до неочищенного матрикса растения, экстрагированного из различных представляющих интерес тканей. Если целевое выявление потребует уменьшения сложности образца матрикса перед выявлением, то пептидные фрагменты будут идентифицированы в неочищенном матриксе растения так же, как и частично очищенный образец матрикса ткани.

V. Целенаправленный анализ ММР

При идентификации одного или более пептидных фрагментов целевого белка, подлежащих определению в мультиплексном анализе, разрабатывают целенаправленный анализ ММР для целевого белка. Предпочтительно, чтобы целенаправленный анализ ММР для данного целевого белка мог идентифицировать те предварительно выбранные пептиды, которые представляют собой наиболее обильные ионные фрагменты. Таким образом, каждый целевой пептид, подлежащий определению в мультиплексном анализе, может иметь специфический анализ ММР, который разработан для идентификации уникальных ионных фрагментов этого целевого пептида. Мультиплексный анализ осуществляется через одновременный анализ ММР, который включает уникальные фрагменты пептида по типу идентификаторов, специфичные для двух или более целевых белков в образце растительной ткани. Предпочтительно, чтобы мультиплексный анализ мог одновременно идентифицировать те специфические пептиды целевого белка, которые демонстрируют эффективную ионизацию и фрагментацию при анализе, как в присутствии, так и в отсутствие сложного матрикса. Целевой белок, включенный в мультиплексный анализ, может быть идентифицирован с одной или более специфических родительских/дочерних пар ионного перехода.

Затем можно провести одноразовый мультиплексный анализ МС/МС для множественных целевых белков в сложной белковой смеси. Благодаря чувствительности и специфичности масс-спектрометрии, сложный белковый образец, подлежащий мультиплексному анализу МС/МС, не должен быть столь же чистым или обильным, как образец, анализируемый с применением традиционных методик, таких как иммунохимия или ПЦР. Однако сложный белковый образец, подлежащий мультиплексному анализу МС/МС, можно приготовить в соответствии с условиями экстракции, оптимизированными для робастного аналитического выполнения мультиплексного способа. Белковые образцы можно приготовить в соответствии с такими методиками, как, среди всего прочего, солевая экстракция (например, бикарбонатом аммония), солевая экстракция в присутствии мочевины и экстракция детергентом (например, CHAPS) или другие методики по типу обогащения.

Растительный материал, из которого можно приготовить мультиплексированный белковый образец, выбирается по усмотрению компетентного специалиста. Подходящий материал может включать, например, ткань или клетки трансгенного растения, ткань растения или клетки, полученные в результате процедуры генетической трансформации, ткань или клетки нетрансгенных растений, анализируемые на присутствие контаминирующего трансгена, или растительные материалы, подозрительные на трансгенное происхождение растения.

Мультиплексный анализ МС проводят на сложном белковом образце. Сложный белковый образец впрыскивают в ионизационную камеру для МС, в которой вырабатывается первый (родительский) ион. Родительский ион может быть выявлен прямым образом в первой МС или он может быть выделен посредством первой МС, фрагментирован на характерные дочерние ионы, а один или более дочерних ионов могут быть выявлены во второй МС (МС/МС).

Ионы можно выявлять с применением нескольких режимов выявления. Например, отобранные ионы можно выявить, применяя режим селективного мониторинга ионов (СМИ), который включает мониторинг множественных реакций (ММР) или мониторинг избранной реакции (МИР). В альтернативном варианте ионы можно выявлять, применяя режим сканирования.

Соотношение между массой и зарядом можно определить, применяя квадрупольный масс-анализатор. Например, в таком инструменте как "квадруполь" или "квадрупольная ионная ловушка" ионы в осциллирующем радиочастотном поле испытывают силовое воздействие, пропорциональное потенциалу DC (постоянного тока) между электродами, амплитуде RF (радиочастотного) сигнала и m/z (отношения массы к заряду). Напряжение и амплитуду можно подобрать таким образом, чтобы только ионы, имеющие особое соотношение m/z, проходили всю длину квадруполя, а все другие ионы отклонялись от прямого направления. Таким образом, инструменты квадруполя могут действовать как "масс-фильтр" и "масс-детектор" для ионов, впрыснутых в инструмент.

Индуцированную столкновениями диссоциацию ("ИСД") часто применяют, чтобы генерировать дочерние ионы для дальнейшего выявления. При ИСД родительские ионы получают энергию через столкновения с инертным газом, таким как аргон, и впоследствии фрагментируются в ходе процесса, известного как "мономолекулярный распад". В родительском ионе должна быть накоплена достаточная энергия для того, чтобы определенные связи внутри иона могли разорваться вследствие накопленной вибрационной энергии.

При выполнении МС/МС родительские ионы отбирают в первом анализе МС. Затем эти отобранные родительские ионы переправляют в камеру для столкновений, чтобы генерировать специфические дочерние ионы пептида для идентификации и количественного определения. При определенных условиях ионизации/фрагментации родительские и дочерние ионы вырабатываются воспроизводимым образом, что придает методике МС/МС исключительно мощные аналитические возможности.

В типичном случае масс-спектрометр обеспечивает пользователя сканированием ионов, то есть, относительной распространенностью каждого соотношения m/z в данном диапазоне (например, от 10 до 1200 атомных единиц массы). Результаты исследования анализируемого вещества, то есть, масс-спектр, могут быть связаны с количеством анализируемого вещества в исходном образце многими способами, известными в данной области техники. Например, при том условии, что параметры отбора образцов и анализа тщательно контролируются, относительную распространенность данного иона можно сравнить с таблицей, которая преобразует эту относительную распространенность в абсолютное количество исходной молекулы. В альтернативном варианте может быть осуществлен прогон с образцами молекулярных стандартов (например, внутренних стандартов и внешних стандартов), и в результате получена стандартная кривая, основанная на ионах, генерированных из этих стандартов. При использовании такой стандартной кривой относительную распространенность данного иона можно преобразовать в абсолютное количество исходной молекулы. Среднему специалисту в данной области техники должны быть хорошо известны многие другие способы, позволяющие соотнести определенное количество иона с определенным количеством исходной молекулы.

Выбор способа ионизации мож