Способ получения ботулинического нейротоксина (варианты)

Способ получения ботулинического нейротоксина (варианты)

Иллюстрации

Показать все

Реферат

ПЕРЕКРЕСТНАЯ ССЫЛКА

Данная заявка истребует приоритет заявки на патент США 12/502181 от 13 июля 2009 г., полное описание которой включено сюда во всей своей полноте посредством отдельной ссылки.

ИЗВЕСТНЫЙ УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Данное изобретение описывает системы и способы для получения нейротоксина клостридий, способы получения фармацевтической композиции из такого нейротоксина, а также терапевтическое и косметическое применение полученной таким образом композиции. В частности, данное изобретение описывает быстрый, не содержащий белка животных способ и систему хроматографии для получения высокоактивного, с высокой степенью очистки и большим выходом биологически активного ботулинического нейротоксина.

Фармацевтическая композиция, подходящая для введения человеку или животному в лечебных, диагностических, исследовательских или косметических целях, включает активное действующее вещество и одно или несколько вспомогательных веществ, буферы, носители, стабилизаторы, средства для корректировки тоничности, консерванты и/или объемообразующие агенты. Активное действующее вещество в фармацевтической композиции может иметь биологическое происхождение и быть представлено, например, ботулиническим нейротоксином. Известные способы (такой как способ Шанца) для получения ботулинического нейротоксина, используемого в качестве активного действующего вещества в фармацевтической композиции, представлены многонедельным культивированием, ферментацией и способами очистки с применением белков животного происхождения, таких как мясной бульон и казеин (в питательной среде и среде для ферментации), а также ферментов для очистки животного происхождения. Введение пациенту фармацевтической композиции при использовании продукции животного происхождения может повлечь за собой риск введения патогенов или инфекционного агента, такого как прион. Кроме того, известные способы получения ботулинического токсина, не предполагающие применения животных белков, также требуют временных затрат (т.е. для завершения необходимо более одной недели), включая многочисленные подготовительные (культивирование и ферментация) и заключительные (очистка) стадии, и кроме того, приводят к получению ботулинического нейротоксина с определяемыми примесями.

Ботулинический токсин

Род Clostridium насчитывает более ста двадцати семи видов, группированных по морфологическим и функциональным признакам. Анаэробные, грамположительные бактерии Clostridium botulinum вырабатывают сильный полипептидный нейротоксин, ботулинический токсин (синонимически «токсин»), который приводит к нейропаралитическому заболеванию у человека и животных, известному как ботулизм. Симптомы интоксикации ботулиническим нейротоксином могут прогрессировать от трудностей при ходьбе, глотании и речи до паралича дыхательных мышц и смерти.

Одна единица ботулинического токсина определяется как LD₅₀ при интраперитонеальной инъекции самкам мышей линии Swiss Webster весом примерно 18-20 грамм каждая. Одна единица ботулинического токсина представляет собой количество ботулинического токсина, которое приводит к гибели 50% группы самок мышей линии Swiss Webster. Было охарактеризовано семь иммунологически различных ботулинических нейротоксинов, и их соответствующие серотипы А, В, C₁, D, Е, F и G отличаются по нейтрализации типоспецифических антител. Различные серотипы ботулинического токсина различаются у видов животных, которых они поражают, а также степени тяжести и продолжительности вызываемого ими паралича. Ботулинические токсины связываются с высокой аффинностью с холинэргическими двигательными нейронами, перемещаются в нейроне и блокируют пресинаптическое высвобождение ацетилхолина.

Ботулинические токсины использовали в клинической практике для лечения, например, нейромышечных расстройств, характеризующихся гиперактивностью скелетных мышц. Ботулинический токсин типа А был утвержден Управлением США по контролю за качеством продуктов питания и лекарственных препаратов (FDA) для лечения эссенциального блефароспазма, косоглазия и гемифациального спазма у пациентов старше 13 лет, цервикальной дистонии, межбровных (лицевых) морщин, а также для лечения гипергидроза. FDA также утвердило ботулинический токсин типа В для лечения цервикальной дистонии.

Несмотря на то, что все серотипы ботулинического токсина ингибируют высвобождение нейропередатчика ацетилхолина в нервно-мышечном синапсе, такая функция возможна при воздействии на различные нейросекреторные белки и/или расщепление таких белков в различных участках. Ботулинический токсин типа А представлен эндопептидазой цинка, которая может специфическим образом гидрозилировать пептидную связь внутриклеточного, везикуло-ассоциированного белка (VAMP, также называется синаптобревин) 25 кДа синаптосомально-ассоциированного белка (SNAP-25). Ботулинический токсин типа Е также расщепляет SNAP-25, но направлен на другие аминокислотные последовательности данного белка в сравнении с ботулиническим токсином типа А. Ботулинические токсины типов В, D, F и G воздействуют на VAMP, причем каждый серотип расщепляет белок в различном месте. Наконец, было показано, что ботулинический токсин типа С₁ расщепляет синтаксин и SNAP-25. Такие различия в механизме действия могут влиять на относительную активность и/или длительность действия различных серотипов ботулинического токсина.

Молекулярный вес белковой молекулы активного ботулинического токсина (также известного как «чистого токсина» или «нейротоксического компонента») из комплекса ботулинического токсина для всех семи известных серотипов ботулинического токсина составляет примерно 150 кДа. Интересно, что ботулинические токсины высвобождаются бактерией-клостридией в виде комплексов, включающих нейротоксический компонент 150 кДа вместе с одним или несколькими связанными нетоксичными белками. Таким образом, комплекс ботулинического токсина типа А может вырабатываться бактерией-клостридией в виде форм 900 кДа, 500 кДа и 300 кДа (примерный молекулярный вес). Типы ботулинического токсина В и С₁ вырабатываются только в виде комплекса 500 кДа. Ботулинический токсин типа D вырабатывается в виде комплексов 300 кДа и 500 кДа. Наконец, ботулинический токсин типов Е и F вырабатывается только в виде комплексов примерно 300 кДа. Комплексы (т.е. с молекулярным весом более чем примерно 150 кДа) содержат белки гемагглютинин (НА) и нетоксический белок, не являющийся гемагглютинином (NTNH). Таким образом, комплекс ботулинического токсина может включать молекулу ботулинического токсина (нейротоксический компонент) и один или несколько белков НА и/или белок NTNH. Такие два типа нетоксичных белков (которые вместе с молекулой ботулинического токсина могут составлять соответствующий комплекс нейротоксина) могут обеспечивать молекуле ботулинического токсина стабильность относительно денатурации и защиту от кислот пищеварительного сока при проглатывании токсина. Кроме того, возможно, что большие (молекулярный вес более чем примерно 150 кДа) комплексы ботулинического токсина могут приводить к более медленной скорости диффузии ботулинического токсина из места внутримышечной инъекции комплекса ботулинического токсина. Успех ботулинического токсина типа А в лечении целого ряда клинических состояний породил интерес к другим серотипам ботулинического токсина. Таким образом, в клинической практике для лечения человека использовали, по меньшей мере, такие типы ботулинического токсина, как А, В, Е и F. Кроме того, в Европе на рынке представлена лекарственная форма нейротоксического компонента (т.е. без связанных нетоксичных белков) под торговой маркой КСЕОМИН (Merz Pharmaceuticals, Frankfurt, Germany).

Ботулинический токсин типа А растворим в водных растворах при pH 4-6,8. При pH выше примерно 7, стабилизирующие нетоксичные белки диссоциируют из нейротоксина, что приводит к постепенной потере токсичности, в частности, при повышении значения pH и температуры (Schantz E.J., et al Preparation and characterization of botulinum toxin type A for human treatment (in particular pages 44-45), being chapter 3 of Jankovic, J., et al, Therapy with Botulinum Toxin, Marcel Dekker, Inc, 1994).

Как и для всех других ферментов, биологическая активность ботулинических токсинов, являющихся внутриклеточными пептидазами, зависит, по меньшей мере, частично, от их трехмерной конформации. Разведение токсина от количества в миллиграммах до раствора, содержащего нанограммы на миллилитр, представляет собой значительные трудности, такие как, например, тенденция токсина осаждаться на поверхности, что приводит к снижению количества доступного токсина. Поскольку токсин может использоваться спустя месяцы или годы после разработки фармацевтической композиции, включающей токсин, токсин стабилизируют с использованием стабилизирующего агента, такого как белок, сахароза, трегалоза и/или желатин.

Представленная на рынке фармацевтическая композиция, содержащая ботулинический токсин, продается под торговой маркой БОТОКС® (комплекс нейротоксина, включающий очищенный ботулинический токсин типа А) от компании Allergan, Inc., Irvine, California. Каждая ампула со 100 единицами препарата БОТОКС® состоит из примерно 5 нг комплекса очищенного ботулинического токсина типа А, 0,5 мг сывороточного альбумина человека и 0,9 мг натрия хлорида; содержимое представлено в виде высушенного в вакууме порошка и предназначено для восстановления стерильным физиологическим раствором без консерванта (инъекция 0,9% натрия хлорида). Другие представленные на рынке и содержащие ботулинический токсин фармацевтические композиции включают Диспорт® (комплекс токсина Clostridium botulinum типа А и гемагглютинина с сывороточным альбумином человека и лактозой в фармацевтической композиции с ботулиническим токсином), представленный Ipsen Limited, Berkshire, U.K. в виде порошка для восстановления 0,9% натрия хлоридом перед использованием, а также MyoBloc™ (раствор для инъекций, включающий ботулинический токсин типа В, сывороточный альбумин человека, натрия сукцинат и натрия хлорид при pH примерно 5,6, представлен Solstice Neurosciences of San Diego, California). Комплексы нейротоксического компонента (молекула токсина 150 кДа) и ботулинического токсина (от 300 кДа до 900 кДа) могут быть получены, например, у List Biological Laboratories, Inc., Campbell, California; Centre for Applied Microbiology and Research, Porton Down, U.K.; Wako (Osaka, Japan), a также у Sigma Chemicals (St Louis, Missouri).

Способы получения ботулинического нейротоксина, не содержащие животных белков, и/или способы хроматографии описаны в патентах США 7445914; 7452697; 7354740; 7160699; 7148041 и 7189541. Кроме того, интерес представляют заявки на патент США 11/609449 под названием «Среда для бактерий рода Clostridium» от 12 декабря 2006 г.; 12/098896 под названием «Среда, не содержащая животный продукт, и способы для получения ботулинического токсина» от 7 апреля 2008 г.; 11/932689 под названием «Способ и система хроматографии для очистки ботулинического токсина» от 31 октября 2007 г.; 11/932789 под названием «Способ и система хроматографии для очистки ботулинического токсина» от 31 октября 2007 г.; и 12/234537 под названием «Среда, не содержащая животный продукт, и способы для получения ботулинического токсина» от 19 сентября 2008 г.

Ботулинический токсин для использования в фармацевтической композиции может быть получен путем анаэробной ферментации Clostridium botulinum и известного способа Шанца (см., например, Schantz E.J., et al., Properties and use of botulinum toxin and other microbial neurotoxins in medicine, Microbiol Rev 1992 Mar; 56(1): 80-99; Schantz E.J., et al., Preparation and characterization of botulinum toxin type A for human treatment, chapter 3 in Jankovic J, ed. Neurological Disease and Therapy. Therapy with botulinum toxin (1994), New York, Marcel Dekker; 1994, pages 41-49, и; Schantz E.J., et al., Use of crystalline type A botulinum toxin in medical research, in: Lewis GE Jr, ed. Biomedical Aspects of Botulism (1981) New York, Academic Press, pages 143-50). Способ Шанца для получения ботулинического токсина предполагает использование продуктов животного происхождения, например, в виде реагентов и части питательной и ферментативной среды.

Для получения фармацевтической композиции клостридиального токсина, подходящей для введения человеку или животному для терапевтических, диагностических, исследовательских или косметических целей, необходим ряд этапов. Такие этапы могут включать получение очищенного токсина клостридий с последующим приготовлением очищенного клостридиального токсина. Первый этап может заключаться в высевании и выращивании колоний бактерий-клостридий, обычно на чашках с кровяным агаром, в среде, способствующей росту анаэробных бактерий, такой как, например, теплая анаэробная атмосфера. Этот этап позволяет получить колонии клостридий с необходимой морфологией и другими характеристиками. На втором этапе выбранные колонии клостридий могут быть ферментированы в первой подходящей среде и, при необходимости, во второй ферментативной среде. После определенного периода ферментации, бактерии-клостридии обычно лизируют и высвобождают токсин клостридий в среду. На третьем этапе среда может быть очищена с получением общего количества токсина. Обычно очистка среды для получения общего количества токсина проводится с использованием, кроме других реагентов, ферментов животного происхождения, таких как ДНКаза и РНКаза, которые используют для деградации и облегчения высвобождения нуклеиновых кислот. Получаемое общее количество токсина может быть представлено токсином высокой очистки, обладающим отдельной специфической активностью. После стабилизации в подходящем буфере, токсин может быть соединен с одним или несколькими вспомогательными веществами для получения фармацевтической композиции токсина клостридий, подходящей для введения человеку. Фармацевтическая композиция клостридиального токсина может включать клостридиальный токсин в виде активного фармацевтического ингредиента (АФИ). Фармацевтическая композиция также может включать одно или несколько вспомогательных веществ, буферы, носители, стабилизаторы, консерванты и/или объемообразующие агенты.

Этап ферментации клостридиального токсина может привести к получению раствора среды ферментации, содержащего целые бактерии р. Clostridium, лизированные бактерии, питательные вещества среды и побочные продукты ферментации. Фильтрация такого раствора среды, а также удаление основных элементов, таких как целые и лизированные бактерии, приводит к образованию подготовленной/очищенной среды. Очищенная среда включает клостридиальный токсин и целый ряд примесей и служит для получения концентрированного клостридиального токсина, называемого нерасфасованным токсином.

Способы ферментации и очистки для получения нерасфасованного клостридиального токсина с использованием одного или нескольких продуктов животного происхождения (таких как, например, казеин, получаемый в результате расщепления молока, ДНКаза и РНКаза) известны. Примером известного способа, не предусматривающего использование продуктов неживотного происхождения («NAPF») для получения комплекса ботулинического токсина, является способ Шанца и его модификации. Способ Шанца (от исходного высевания, культивирования клеток до ферментации и очистки токсина) предполагает использование целого ряда продуктов, полученных из животных источников, таких как, например, среда с отварным мясом в пробирке с культурой, чашки с колумбийским кровяным агаром для роста и селекции колоний, а также казеин в среде для ферментации. Кроме того, способ Шанца для очистки нерасфасованного токсина предполагает использование ДНКазы и РНКазы, полученных из крупного рогатого скота, для гидролиза нуклеиновых кислот, присутствующих в содержащей токсин ферментативной среде. Были выражены определенные опасения относительно потенциала развития вирусной и трансмиссивной губчатой энцефалопатии (ТГЭ), такой как губчатая энцефалопатия крупного рогатого скота (ГЭКРС), заражения при использовании продуктов животного происхождения в способе получения АФИ и/или способе получения (составления) фармацевтической композиции с использованием такого АФИ.

Способ ферментации для получения столбнячного анатоксина, предполагающий использование пониженных количеств продуктов животного происхождения (указаны как способы ферментации, не содержащие продуктов животного происхождения, или ферментационные «APF»-способы; «APF» обозначает отсутствие животного белка) известен (см., например, патент США 6558926). Ферментативный APF-способ для получения клостридиального токсина обладает потенциальным преимуществом в снижении (и так очень низкой) возможности контаминации получаемого общего количества токсина вирусами, прионами или другими нежелательными элементами, которые затем сопровождают активный фармацевтический ингредиент, клостридиальный токсин, в составе фармацевтической композиции для введения человеку.

Хроматография, такая как, например, колоночная хроматография, может использоваться для выделения отдельного белка (такого как ботулинический нейротоксин) из смеси белков, нуклеиновых кислот, остатков клеток и т.д., в ходе способа, известного как фракционирование или очистка. Смесь белков обычно пропускают через стеклянную или пластиковую колонку, содержащую, например, твердую, часто пористую среду (часто указываемую как гранулы или смола). Различные белки и другие соединения проходят через среду с различной скоростью, основываясь на их специфических химических свойствах и способа, с помощью которого такие характерные свойства позволяют им взаимодействовать с отдельной используемой хроматографической средой.

Выбор среды определяет тип химической характеристики, на котором основано фракционирование белков. Существует четыре основных типа колоночной хроматографии: ионообменная, гель-фильтрация, аффинная и гидрофобное взаимодействие. Ионообменная хроматография сопровождается фракционированием, основанным на поверхностном электростатическом заряде с использованием колонки, наполненной небольшими гранулами, несущими положительный или отрицательный заряд. При гель-фильтрации белки фракционируют на основе их размера. В ходе аффинной хроматографии белки разделяют на основе их способности связываться со специфическими химическими группами (лигандом), присоединенными к гранулам в среде колонки. Лиганды могут быть биологически специфическими относительно белка-мишени. Хроматография с гидрофобным взаимодействием сопровождается фракционированием на основе поверхностной гидрофобности.

Широко известна колоночная хроматография для очистки (фракционирования) клостридиального токсина. См., например, следующие публикации:

1. Ozutsumi К., et al, Rapid, simplified method for production and purification of tetanus toxin, App & Environ Micro, Apr. 1985, p 939-943, vol 49, no. 4. (1985) раскрывает использование гель фильтрации высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) для очистки столбнячного токсина.

2. Schmidt J.J., et al., Purification of type E botulinum neurotoxin by high-performance ion exchange chromatography, Anal Biochem 1986 Jul; 156(1): 213-219 раскрывает использование гель-проникающей хроматографии или ионообменной хроматографии для очистки ботулинического токсина типа Е. Также раскрыто использование протамина сульфата вместо рибонуклеазы (РНКазы).

3. Simpson L.L., et al., Isolation and characterization of the botulinum neurotoxins

Simpson LL; Schmidt JJ; Middlebrook JL, In: Harsman S, ed. Methods in Enzymology. Vol. 165, Microbial Toxins: Tools in Enzymology San Diego, CA: Academic Press; vol 165: pages 76-85 (1988) раскрывает очистку ботулинического нейротоксина с использованием жидкостной хроматографии с колонками "gravity flow", высокоэффективной жидкостной хроматографии, этапов улавливания с использованием аффинности смолы, гель-хроматографии, ионообменной (катион и анион) хроматографии, включающей применение двух разных ионнообменных колонок. Раскрыты различные колонки Sephadex, Sephacel, Trisacryl, S и Q.

4. Zhou L, et al., Expression and purification of the light chain of botulinum neurotoxin A: A single mutation abolishes its cleavage of SNAP-25 and neurotoxicity after reconstitution with the heavy chain, Biochemistry 1995; 34(46): 15175-81 (1995) раскрывает использование колонки с амилозой при аффинной хромотографии для очистки легкой цепи рекомбинантных белков ботулинического нейротоксина.

5. Kannan К., et al., Methods development for the biochemical assessment of Neurobloc (botulinum toxin type B), Mov Disord 2000; 15 (Suppl 2): 20 (2000) раскрывает использование гель-проникающей хроматографии для анализа ботулинического токсина типа В.

6. Wang Y-c, The preparation and quality of botulinum toxin type A for injection (BTXA) and its clinical use, Dermatol Las Faci Cosm Surg 2002;58 (2002) раскрывает применение ионообменной хроматографии для очистки ботулинического токсина типа А. Также в документе раскрыта комбинация осадительных и хроматографических способов.

7. Johnson S.K., et al., Scale-up of the fermentation and purification of the recombination heavy chain fragment С of botulinum neurotoxin serotype F, expressed in Pichia pastoris, Protein Expr and Purif 2003; 32: 1-9 (2003) раскрывает использование ионообменных колонок и колонок гидрофобного взаимодействия для очистки рекомбинантного фрагмента тяжелой цепи ботулинического токсина типа F.

8. Опубликованная заявка на патент США 2003 0008367 А1 (Oguma) описывает применение ионообменных колонок и колонок с лактозой для очистки ботулинического токсина.

Обобщенные выше способы очистки относятся к мелкомасштабной очистке нейротоксического компонента комплекса ботулинического токсина (т.е. молекулы нейротоксина примерно 150 кДа) или специфического компонента нейротоксического компонента, в отличие от очистки всего комплекса ботулинического токсина 900 кДа.

Кроме того, существующие способы, включая способы производственного масштаба, для получения ботулинического токсина, подходящего для приготовления фармацевтической композиции ботулинического токсина, обычно включают серию этапов преципитации для разделения комплекса токсина и примесей, сопровождающих ботулинический токсин с момента способа ферментации. Примечательно, что способы преципитации широко используются в биофармацевтической промышленности для очистки ботулинического токсина. Например, для удаления белков плазмы используют фракционирование холодным спиртом (способ Коэна) или преципитацию. К несчастью, используемые ранее способы преципитации для очистки ботулинического токсина обладают недостатками: низкое разрешение, низкая продуктивность, сложность работы, трудности в контроле и/или валидации, и/или затруднения в уменьшении/повышении масштабности. Опубликованная ранее заявка на патент США No. 11/452570 от 12 октября 2006 г. описывает этапы, такие как центрифугирование, осаждение кислотой, осаждение этанолом, этапы ацидификации и осаждения в сульфате аммония, используемые в ходе различных не содержащих животных белков и NAPF-способов (подробное описание представлено в опубликованной заявке на патент США 2006/0228780 (включено сюда во всей своей полноте посредством ссылки)). В тексте данной заявки представлены некоторые различия между способами, не содержащими белки неживотного происхождения, и способами, не содержащими белки животного происхождения, для получения ботулинического нейротоксина.

Следовательно, необходимо наличие быстрых, относительно мелкомасштабных, но высокопроизводительных систем и способов для получения ботулинического нейротоксина высокой активности и высокой степени очистки, который может использоваться в исследовательских целях и/или для получения фармацевтической композиции.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Данное изобретение удовлетворяет таковой потребности и описывает ботулинический нейротоксин высокой активности и высокой степени очистки, полученный с использованием быстрых, мелкомасштабных, используемых в промышленности, высокопроизводительных и не содержащих животных белков систем и способов хроматографии. Получаемый ботулинический нейротоксин используют для приготовления фармацевтической композиции. Клостридиальный токсин, полученный по изобретению, является преимущественно ботулиническим нейротоксином и, более преимущественно, комплексом ботулинического нейротоксина А (примерно 900 кДа) или нейротоксическим компонентом 150 кДа. Наше изобретение не требует использование реагентов NAPF, таких как ДНКаза и РНКаза.

Определения

Представленные ниже слова и термины, используемые в изобретении, обладают следующими значениями.

Термин «примерно» обозначает, что единица, параметр или термин, квалифицированные таким образом, охватывают диапазон плюс/минус десять процентов от указанной единицы, параметра или термина.

Термины «введение» или «ввести» обозначает этап принятия (т.е. введения) фармацевтической композиции или активного ингредиента субъекту. Описанные здесь фармацевтические композиции вводят «локально», например, с использованием таких путей введения, как внутримышечное (в/м), интрадермальное, подкожное введение, интратекальное введение, интракраниальное, интраперитонеальное введение (и/п), топическое (трансдермальное) введение и имплантация (т.е. использование устройства с замедленным высвобождением, такого как полимерный имплант или миниосмотический насос).

Термины «не содержащий продуктов животного происхождения (APF)» или «по существу не содержащий продуктов животного происхождения», соответственно, и термины «не содержащий белков животного происхождения» или «по существу не содержащий белков животного происхождения» обозначают отсутствие или практическое отсутствие продуктов или соединений, полученных из крови, смешанной крови и других продуктов или соединений животного происхождения. Термин «животное» обозначает млекопитающее (такое как человек), птицу, рептилию, рыбу, насекомое, паука или другие виды животных. Термин «животное» исключает микроорганизмы, такие как бактерии. Таким образом, в контексте данного изобретения среда APF или способ, или по существу среда APF или способ могут включать ботулинический токсин или бактерию Clostridial botulinum. Например, способ APF или по существу способ APF обозначает способ, который по существу не содержит или по существу не содержит или полностью не содержит белков животного происхождения, таких как иммуноглобулины, мясной бульон, мясные субпродукты, а также продукты молока или молочные продукты, или продукты расщепления.

Термин «ботулинический токсин» или «ботулинический нейротоксин» обозначает нейротоксин, выработанный Clostridium botulinum, а также модифицированные, рекомбинантные, гибридные и химерные ботулинические токсины. Рекомбинантный ботулинический токсин может иметь легкую цепь и/или тяжелую цепь, полученные рекомбинантным образом с использованием других видов, кроме клостридий. В контексте данного изобретения термин «ботулинический токсин» охватывает серотипы ботулинического токсина А, В, С, D, Е, F и G. В контексте данного изобретения термин «ботулинический токсин» также охватывает комплекс ботулинического токсина (т.е. комплексы 300, 600 и 900 кДа), а также чистый ботулинический токсин (т.е. нейротоксическую молекулу примерно 150 кДа), которые могут использоваться при применении данного изобретения на практике. Термин «очищенный ботулинический токсин» обозначает чистый ботулинический токсин или комплекс ботулинического токсина, который изолирован или по существу изолирован от других белков и примесей, которые могут сопровождать ботулинический токсин в ходе его получения способом культивирования или ферментации. Таким образом, очищенный ботулинический токсин может содержать, по меньшей мере, 90%, преимущественно более 95%, и более преимущественно более 99% ботулинического токсина при удалении белков, не являющихся белками ботулинического токсина, и примесей. Не будучи нейротоксинами, ботулинические цитотоксины С₂ и С₃, исключены из области данного изобретения.

Термин «клостридиальный нейротоксин» обозначает нейротоксин, полученный или присущий бактерии-клостридии, такой как Clostridium botulinum, Clostridium butyricum или Clostridium beratti, и, кроме того, клостридиальный нейротоксин получают рекомбинантным образом у видов, не являющихся клостридиями.

Термин «практически не содержащий» (в терминологии «состоящий из») обозначает, что вещество не может быть определено или его присутствие не может быть подтверждено в диапазоне определения используемого инструмента или способа.

Термин «по существу не содержащий» (в терминологии «в основном состоящий из») обозначает, что могут быть определены только следовые количества вещества.

Термин «модифицированный ботулинический токсин» обозначает, что ботулинический токсин характеризуется удалением, модификацией или заменой, по меньшей мере, одной из своих аминокислот в сравнении с нативным ботулиническим токсином. Кроме того, модифицированный ботулинический токсин может быть представлен полученным рекомбинантным образом нейротоксином, или производным или фрагментом полученного рекомбинантным образом нейротоксина. Модифицированный ботулинический токсин сохраняет, по меньшей мере, одну биологическую активность нативного ботулинического токсина, такую как способность связываться с рецептором ботулинического токсина или способность ингибировать высвобождение нейропередатчика из нейрона. Один пример модифицированного ботулинического токсина представлен ботулиническим токсином, в которой легкая цепь получена из одного серотипа (такого как серотип А) ботулинического токсина, а тяжелая цепь получена из другого серотипа ботулинического токсина (такого как серотип В). Другой пример модифицированного ботулинического токсина представлен ботулиническим токсином, соединенным с нейропередатчиком, таким как вещество Р.

Термин «фармацевтическая композиция» обозначает композицию, в которой активное действующее вещество может быть представлено ботулиническим токсином. Термин «композиция» обозначает, что существует, по меньшей мере, один дополнительный ингредиент (такой как, например (не ограничиваясь), альбумин [такой как сывороточный альбумин человека или рекомбинантный человеческий альбумин] и/или натрия хлорид) в фармацевтической композиции в добавление к активному действующему веществу ботулиновому нейротоксину. Таким образом, фармацевтическая композиция представляет собой композицию, подходящую для диагностического, терапевтического или косметического введения (например, путем внутримышечной или подкожной инъекции или путем введения депо или имплантата) субъекту, такому как пациент-человек. Фармацевтическая композиция может быть представлена в виде лиофилизированного или высушенного в вакууме порошка, раствора, образованного после восстановления фармацевтической композиции в виде лиофилизированного или высушенного в вакууме порошка физиологическим раствором или водой, или в виде раствора, не требующего восстановления. Активное действующее вещество может быть представлено серотипами ботулинического токсина А, В, C₁, D, Е, F или G или ботулиническим токсином, при этом такие виды токсина получают естественным образом с использованием бактерий-клостридий. Как уже указано, фармацевтическая композиция может быть жидкой или твердой, например, высушенным в вакууме порошком. Типичные способы приготовления фармацевтической композиции с активным действующим веществом ботулиническим токсином описаны в опубликованной заявке на патент США 20030118598 от 5 ноября 2002 г. (включено в данный документ во всей своей полноте посредством ссылки).

Термин «по существу не содержащий» обозначает присутствие на уровне или менее одного процента по весу питательной среды, среды ферментации, фармацевтической композиции или другого материала, в котором оценивают процент весового содержания вещества (такого как продукт животного происхождения, белок животного происхождения или продукт или белок животного происхождения).

Термин «терапевтическая композиция» обозначает композицию, которая может использоваться для лечения и, следовательно, снижения степени тяжести нарушения или заболевания и/или связанного симптома, такого как нарушение или заболевание, характеризующееся гиперактивностью (например, спастичностью) периферической мышцы или железы (например, потовой железы).

Термин «терапевтически эффективное количество» обозначает уровень, количество или концентрацию агента (например, такого как ботулинический токсин или фармацевтическая композиция, включающая ботулинический токсин), необходимый для лечения заболевания, нарушения или состояния без вызова значительных отрицательных или нежелательных побочных явлений.

Термины «лечить» или «лечение» обозначают снижение степени тяжести или уменьшение (что включает незначительное снижение, существенное снижение, по существу полное снижение и полное снижение), разрешение или предотвращение (постоянное или временное) заболевания, нарушения или состояния, такого как деформация ягодиц, в результате чего достигается необходимый терапевтический или косметический результат, такой как заживление поврежденной или пораженной ткани, или изменение, усиление, улучшение, снижение степени тяжести и/или улучшение существующего или выявленного заболевания, нарушения или состояния. Эффект лечения, такой как снижение степени тяжести при введении ботулинического нейротоксина, может не отмечаться клиническим образом в течением 1-7 дней после введения ботулинического нейротоксина пациенту, и может иметь продолжительность от примерно 1 месяца до примерно 1 года или любой другой диапазон времени, например, в зависимости от состояния и отдельного случая, подвергнутого лечению.

Процентные показатели основываются на весе в единицу объема, если иное не указано отдельным образом.

APF обозначает не содержащий продукта/белка животного происхождения.

КО обозначает объем колонки.

ДФ обозначает диафильтрацию.

ИФА обозначает иммуноферментный анализ.

IAPF в контексте «система IAPF» или «способ IAPF» обозначает «улучшенную и не содержащую белка животного происхождения» систему или способ. Система или способ IAPF включает использование двух хроматографических сред или трех хроматографических сред для очистки ботулинического токсина или компонента нейротоксина, как это подробно описано в тексте данной заявки. Хроматографическая среда включает хроматографические смолы, что хорошо известно в науке. Партии ботулинического нейротоксина, полученные путем использования двух хроматографических сред, указаны в тексте данной заявки как IAPF.

FAPF в контексте «система FAPF» или «способ FAPF» обозначает «дополнительно улучшенную и не содержащую белка животного происхождения» систему или способ. В соответствии с этим, FAPF является способом IAPF, и система или способ FAPF обозначает использование трех хроматографических сред для очистки ботулинического токсина или компонента нейротоксина. Партии ботулинического нейротоксина, полученные путем использования трех хроматографических сред, указаны в тексте данной заявки как FAPF.

NAPF обозначает не содержащий белка неживотного происхождения.

Гель-электрофорез обозначает гель-электрофорез в присутствии полиакриламида натрия додецилсульфата.

ЭХ обозначает эксклюзионную высокоэффективную жидкостную хроматографию.

УФ обозначает ультрафильтрацию.

В одном варианте воплощения изобретения описан по существу APF-способ хроматографии для получения биологически активного ботулинического нейротоксина, и такой способ включает следующие этапы: (а) предоставление среды ферментации (по существу APF); (б) ферментация бактерий Clostridium botulinum в среде ферментации; и (в) восстановление биологически активного ботулинического нейротоксина из среды ферментации путем контакта среды ферментации с анионообменной хроматографической средой с последующим контактом элюента, полученного в ходе анионообменной хроматографии, с катионообменной хроматографической средой, в результате чего получают биологически активный ботулинический нейротоксин в ходе способа хроматографии (по существу APF). В отдельных вариантах воплощения изобретения способ может приводить к образованию ботулинического нейротоксина, который включает менее чем одну часть на миллион (м.д.) остаточной нуклеиновой кислоты, составляющей один нанограмм или менее остаточной нуклеиновой кислоты на каждый миллиграмм полученного ботулинического нейротоксина. В еще одном варианте воплощения изобретения способ проводят в течение одной недели или менее.

В одном примере среда с соотношением 3:1:1 обозначает культуру ботулинического токсина/среды ферментации, содержащей 3% HySoy, 1% HyYeast и 1% глюкозы. HySoy (номер по каталогу Quest 5X59022) является источником пептида, полученным путем ферментативного гидролиза сои. HyYeast (HyYest, номер по каталогу Quest 5Z10102 или 5Z10313) является экстрактом пекарских дрожжей. В другом примере сред