Разрушаемые клостридиальные токсины

Разрушаемые клостридиальные токсины

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Разрушаемые клостридиальные токсины

[01] Данная заявка претендует на приоритет предварительной заявки на патент США, серийный номер 61/346,578, поданной 20 мая 2010 года, полное раскрытие которой включено здесь путем данной конкретной ссылки.

[02] Способность клостридиальных токсинов, таких, как, например, ботулинических нейротоксинов (BoNT), BoNT/A, BoNT/B, BoNT/Cl, BoNT/D, BoNT/E, BoNT/F и BoNT/G, и нейротоксина столбняка (TeNT), ингибировать нейрональную трансмиссию использовалась в широком спектре терапевтических и косметических применений, см., например, William J. Lipham, Cosmetic and Clinical Applications of Botulinum Toxin (Slack, Inc., 2004). Клостридиальные токсины, коммерчески доступные как фармацевтические композиции, включают препараты BoNT/A, такие, как, например, ВОТОХ^® (Allergan, Inc., Irvine, CA), DYSPORT^®/RELOXIN^®, (Beaufour Ipsen, Porton Down, Англия), NEURONOX^® (Medy-Tox, Inc., Ochang-myeon, Южная Корея), ВТХ-А (Lanzhou Institute Biological Products, Китай) и XEOMIN^® (Merz Pharmaceuticals, GmbH., Frankfurt, Германия); и препараты BoNT/B, такие, как, например, MYOBLOC™/NEUROBLOC™ (Elan Pharmaceuticals, San Francisco, CA). Как пример, ВОТОХ^® в настоящее время утвержден в одной или более странах для следующих показаний: ахалазия, спастичность у взрослых, анальная трещина, боль в спине, блефароспазм, бруксизм, цервикальная дистония, эссенциальный тремор, межбровные морщины или гиперкинетические, лицевые морщины, головная боль, гемифациальный спазм, гиперактивность мочевого пузыря, гипергидроз, ювенильный церебральный паралич, множественный склероз, миоклонические расстройства, носогубные морщины, спастическая дисфония, косоглазие и нарушение VII нерва.

[03] Лечение клостридиальным токсином ингибирует высвобождение нейротоксина путем нарушения процесса экзоцитоза, который используется для выделения нейромедиатора в синаптическую щель. У фармацевтической индустрии имеется большое желание расширить применение терапий клостридиальным токсином за рамки его текущих миорелаксантных применений для лечения сенсорных неврологических расстройств, таких, как, например, различные виды хронической боли, неврогенное воспаление и урогенитальные расстройства, наряду с другими расстройствами, такими, как, например, панкреатит. Один подход, использующийся в настоящее время для расширения применения терапий, основанных на клостридиальном токсине, включает такую модификацию клостридиального токсина, при которой токсин приобретает измененную способность к клеточному таргетингу клеток-мишеней, отличных от мишеней клостридиального токсина. Данная способность к изменению таргетинга достигается путем замещения природного таргетингового домена клостридиального токсина таргетинговым доменом, демонстрирующим преимущественную связывающую активность с рецептором, отличным от рецептора клостридиального токсина, присутствующим в клетках-мишенях, не являющихся клетками-мишенями клостридиального токсина. Такие модификации домена таргетинга, в результате, приводят к гибриду клостридиального токсина, который называется белок, модулирующий целевой везикулярный экзоцитоз (Targeted Vesicular Exocytosis Modulating Protein - VEMP), способному селективно связывается с рецептором, не являющимся рецептором клостридиального токсина (рецептор - мишень), присутствующим на клетке-мишени, не являющейся клеткой-мишенью клостридиального токсина, который перемещается в цитоплазму и оказывает протеолитическое действие на комплекс SNARE клеток, отличных от клеток-мишеней клостридиального токсина.

[04] Терапия клостридиальным токсином и гибридом клостридиального токсина успешно используются для многих показаний. В общем, введение клостридиального токсина и гибрида клостридиального токсина хорошо переносится. Однако введение при некоторых применениях может оказаться сложным, так как для достижения благоприятного эффекта потребуются большие дозы. Большие дозы могут увеличить вероятность того, что клостиридиальный токсин или гибрид клостридиального токсина смогут двигаться во внутритканевых жидкостях и лимфатической системе организма, приводя в результате к нежелательной дисперсии токсина или гибрида клеостридиального токсина на зоны, не являющиеся мишенями лечения. Такая дисперсия может приводить к нежелательным побочным эффектам, таким, как, например, ингибирование высвобождения нейромедиатора из нейронов, не являющихся мишенями лечения токсином, или паралич мышцы, не являющейся мишенью лечения. Для примера, у пациента, которому вводили терапевтически эффективное количество лечения BoNT/A в мышцу шеи по поводу кривошеи, может развиться дисфагия из-за дисперсии токсина в ротоглотку. Таким образом, остается потребность в улучшенных клостридиальных токсинах и/или гибридах клостридиального токсина, которые эффективны в месте лечения, однако имеют эффекты от незначительных до минимальных в зонах, не являющихся мишенями лечения токсином.

[05] Растущее клиническое, терапевтическое и косметическое использование клостридиальных токсинов и гибридов клостридиальных токсинов в терапиях, требующих больших доз, вынуждает фармацевтическую индустрию разрабатывать модифицированные клостридиальные токсины и гибриды клостридиальных токсинов, эффективные в участках-мишенях применения, однако снижать или предотвращать возможные побочные эффекты, ассоциированные с дисперсией токсинов в нежелательные локализации. Настоящее описание предоставляет новые модифицированные клостридиальные токсины и гибриды клостридиальных токсинов, которые снижают или предотвращают нежелательные побочные эффекты, ассоциированные с дисперсией токсина в нецелевые зоны. Данные и связанные с ними преимущества полезны для различных клинических, терапевтических и косметических применений, таких, как, например, лечение нейромышечных расстройств, глазных расстройств, боли, повреждений мышц, головной боли, сердечнососудистых заболеваний, нейропсихиатрических расстройств, эндокринных расстройств, раков, ушных расстройств и гиперкинетических лицевых морщин, наряду с другими расстройствами, где введение клостридиального токсина или гибрида клостридиального токсина млекопитающим может вызвать благоприятный эффект.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ФИГУР

[06] ФИГ.1 демонстрирует схему текущей парадигмы о высвобождении нейромедиатора и интоксикации клостридиальным токсином в центральном и периферическом нейроне. ФИГ.1А демонстрирует схему механизма высвобождения нейромедиатора центрального и периферического нейрона. Процесс высвобождения может быть описан как процесс, состоящий из двух этапов: 1) докинг везикулы, белок SNARE, связанный с везикулой, содержащей молекулы нейромедиатора, связывается с мембрано-связанными белками SNARE, расположенными на плазматической мембране; и 2) высвобождение нейромедиатора, где везикула сливается с плазматической мембраной и молекулы нейромедиатора подвергаются экзоцитозу. ФИГ.1В демонстрирует схему механизма интоксикации для активности столбняка и ботулинического токсина в центральном и периферическом нейроне. Этот процесс интоксикации может быть описан как процесс, состоящий из четырех этапов: 1) связывание рецептора, где клостридиальный токсин связывается с системой клостридиального рецептора и инициирует процесс интоксикации; 2) интернализация комплекса, где после связывания токсина везикула, содержащая комплекс токсин/система рецептора, подвергается эндоцитозу внутрь клетки; 3) транслокация легкой цепи, где, как предполагается, происходят многие события, включая, например, изменения внутреннего рН везикулы, образование перового канала, включающего домен UN тяжелой цепи клостридиального токсина, отделение легкой цепи клостридиального токсина от тяжелой цепи и высвобождение активной легкой цепи и 4) энзиматическая модификация мишени, где активированная легкая цепь клостридиального токсина протеолитически расщепляет свой целевый субстрат SNARE, такой, как, например, SNAP-25, VAMP или Syntaxin, тем самым предотвращая докинг везикулы и высвобождение нейромедиатора..

[07] ФИГ.2 демонстрирует организацию доменов природных клостридиальных токсинов. Одноцепочечная форма описывает линейную организацию от амино- до карбоксильных групп, включающую энзиматический домен, транслокационный домен и домен связывания. Двухцепочечный участок петли, расположенный между транслокационным и энзиматическим доменами, описывается двойной SS вилкой. Этот участок включает двухцепочечный петлевой сайт расщепления эндогенной протеазой, который в результате протеолитического расщепления под действием природной протеазы, такой, как, например, эндогенная протеаза клостридиального токсина или природная протеаза, вырабатываемая в окружении, конвертирует одноцепочечную форму токсина в двухцепочечную форму. Над одноцепочечной формой изображен участок Нес связывающего домена клостридиального токсина. Этот участок содержит домен в форме β-трилистника, который включает линейную организацию от амино- до карбоксильных групп α-складку, β4/β5 «шпильку», β-складку, β8/β9 «шпильку» и γ-складку.

[08] ФИГ.3 демонстрирует клостридиальные токсины или гибриды клостридиальных токсинов со связывающим доменом, расположенным на амино- конце токсина. ФИГ.3А изображает одноцепочечную полипептидную форму токсина или гибрида с линейной организацией от амино- до карбоксильных групп, включающую связывающий элемент, транслокационный элемент, энзиматический домен, транслокационный домен и домен связывания, двухцепочечный участок петли, включающий сайт расщепления экзогенной протеазой (Р) и терапевтический элемент. После протеолитического расщепления протеазой Р одноцепочечная форма токсина или гибрида конвертируется в двухцепочечную форму. ФИГ.3В изображает форму токсина или гибрида из одного полипептида с линейной организацией от амино- до карбоксильных групп, включающую связывающий элемент, терапевтический элемент, двухцепочечный участок петли, содержащий сайт расщепления экзогенной протеазой (Р), и транслокационный элемент.После протеолитического расщепления протеазой Р одноцепочечная форма токсина или гибрида конвертируется в двухцепочечную форму.

[09] ФИГ.4 демонстрирует клостридиальные токсины или гибриды клостридиального токсина со связывающим доменом, расположенным на амино- конце токсина. ФИГ.4А изображает токсин или гибрид в форме единичного полинуклеотида с линейной организацией от амино- до карбоксильных групп, включающего терапевтический компонент, двухцепочечный участок петли, состоящий из сайта расщепления экзогенной протеазой (Р), связывающий элемент и транслокационный элемент. Под действием протеолитического расщепления протеазой Р одноцепочечная форма токсина или гибрида конвертируется в двухцепочечную форму. ФИГ.4 В изображает токсин или гибрид в форме единичного полинуклеотида с линейной организацией от амино- до карбоксильных групп, включающую транслокационный элемент, двухцепочечный участок петли, состоящий из сайта расщепления экзогенной протеазой (Р), связывающий элемент и терапевтический элемент. Под действием протеолитического расщепления протеазой Р одноцепочечная форма токсина или гибрида конвертируется в двухцепочечную форму. ФИГ.4С изображает токсин или гибрид в форме единичного полинуклеотида с линейной организацией от амино- до карбоксильных групп, включающего терапевтический элемент, связывающий элемент, двухцепочечный участок петли, состоящий из сайта расщепления экзогенной протеазой (Р), и транслокационный элемент. Под действием протеолитического расщепления протеазой Р одноцепочечная форма токсина или гибрида конвертируется в двухцепочечную форму. ФИГ.4D изображает токсин или гибрид в форме единичного полинуклеотида с линейной организацией от амино- до карбоксильных групп, включающего транслокационный элемент, связывающий элемент, двухцепочечный участок петли, состоящий из сайта расщепления экзогенной протеазой (Р), и терапевтический элемент. Под действием протеолитического расщепления протеазой Р одноцепочечная форма токсина или гибрида конвертируется в двухцепочечную форму.

[010] ФИГ.5 демонстрирует клостридиальные токсины или гибриды клостридиального токсина со связывающим доменом, расположенным на амино- конце токсина. ФИГ.5А изображает токсин или гибрид в форме единичного полинуклеотида с линейной организацией от амино- до карбоксильных групп, включающего терапевтический элемент, двухцепочечный участок петли, состоящий из сайта расщепления экзогенной протеазой (Р), транслокационный элемент и связывающий элемент.Под действием протеолитического расщепления протеазой Р одноцепочечная форма токсина или гибрида конвертируется в двухцепочечную форму. ФИГ.5 В изображает токсин или гибрид в форме единичного полинуклеотида с линейной организацией от амино- до карбоксильных групп, включающего транслокационный элемент, двухцепочечный участок петли, состоящий из сайта расщепления экзогенной протеазой (Р), терапевтический элемент и связывающий элемент.Под действием протеолитического расщепления протеазой Р одноцепочечная форма токсина или гибрида конвертируется в двухцепочечную форму.

ДЕТАЛЬНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

[011] Настоящее описание раскрывает модифицированные клостридиальные токсины и модифицированные гибриды клостридиального токсина, которые могут быть быстро инактивированы из нежелательной локализации или локализаций путем использования наличия протеаз, присутствующих в межтканевой жидкости и в циркуляторных системах, таких как, например, сердечнососудистая система и лимфатическая система. Это происходит потому, то клостридиальные токсины и гибриды клостридиального токсина, раскрываемые в настоящем описании, содержат сайт расщепления протеазой для протеазы, присутствующей в межтканевой жидкости и/или циркуляторной системе. Наличие такого сайта расщепления протеазой делает модифицированный клостридиальный токсин или модифицированный гибрид клостридиального токсина чувствительным к протеолитическому расщеплению распознающей его протеазой, которая делает такие модифицированные токсины неактивными. Например, в ситуации, где клостридиальный токсин или гибрид клостридиального токсина, модифицированный с тем, чтобы содержать сайт расщепления для протеазы внеклеточного матрикса, проник благодаря диффузии в межтканевую жидкость, это модифицированный токсин или модифицированный гибрид клостридиального токсина может быть эффективно расщеплен распознающей его протеазой внеклеточного матрикса. Приведем другой пример, в ситуациях, где клостридиальный токсин или гибрид клостридиального токсина модифицирован с тем, чтобы включить сайт расщеплении для протеазы крови, проник благодаря диффузии в сердечнососудистую систему, этот модифицированный токсин или модифицированный гибрид клостридиального токсина может быть эффективно расщеплен распознающей его протеазой крови. Приведем еще один пример, в ситуации, где клостридиальный токсин или гибрид клостридиального токсина, модифицированный с тем, чтобы содержать сайт расщепления для лимфатической протеазы, проникает благодаря диффузии в лимфатическую систему, этот модифицированный токсин или модифицированный гибрид клостридиального токсина может быть эффективно расщеплен распознающими его лимфатическими протеазами. Таким образом, использование клостридиального токсина или гибрида клостридиального токсина, включающего сайт(ы) расщепления для протеаз, присутствующих в межтканевой жидкости и/или циркуляторной системе, уменьшит или удалит такой клостридиальный токсин или гибрид клостридиального токсина из нежелательной локализации, тем самым снижая или предотвращая нежелательные побочные эффекты, ассоциированные с диффузией клостридиального токсина или гибрида клостридиального токсина в нежелательную локализацию.

[012] Таким образом, аспекты настоящего описания предоставляют клостридиальный токсин, включающий инактивационный сайт расщепления, расположенный на участке инактивационного расщепления, где участок инактивационного расщепления расположен в транслокационном домене или связывающем H_CN субдомене. Такие раскрываемые токсины могут включать энзиматический домен клостридиального токсина, транслокационный домен клостридиального токсина, связывающий домен клостридиального токсина, двухцепочечный петлевой участок, включающий сайт расщепления экзогенной протеазой и инактивационный сайт расщепления, расположенный в участке инактивационного сайта расщепления. Не имеющие ограничительного характера примеры инактивационных сайтов расщепления включают сайты расщепления тромбином, сайты расщепления плазмином, сайты расщепления фактором коагуляции VIIa, сайты расщепления фактором коагуляции IXa, сайты расщепления фактором коагуляции Ха, сайты расщепления фактором коагуляции XIa, сайты расщепления фактором коагуляции XIIa, сайты расщепления калликреином плазмы, сайты расщепления активируемым протеазой рецептором 1, сопряженным с G протеином (PAR1), сайты расщепления PAR 2, сайты расщепления PAR3, сайты расщепления PAR4, сайты расщепления матричной металлопротеиназой-2 (ММР-2), сайты расщепления матричной металлопротеиназой-9 (ММР-9), сайты расщепления фурином, сайты расщепления активатором плазминогена типа урокиназы (uPA), сайты расщепления активатором плазминогена тканевого типа (tPA), сайты расщепления триптазой-е, сайты расщепления протеазой мышиных тучных клеток-7 (mMCP-7), сайты расщепления эндотелин-конвертирующим ферментом-1 (ЕСЕ-1), сайты расщепления группой крови Келла, сайты расщепления ингибитором дипептидазы-IV (DPPIV), сайты расщепления металлопептидазой ADAM с мотивом 13 тромбоспондина типа 1 (ADAMTS13) и сайты расщепления катепсином L. Добавление инактивационного сайта расщепления увеличивает профиль безопасности клостридиального токсина или гибрида клостридиального токсина по сравнению с тем же или подобным клостридиальным токсином или гибридом клостридиального токсина, однако, без дополнительного инактивационного сайта расщепления.

[013] Другие аспекты настоящего описания предоставляют гибрид клостридиального токсина, включающий энзиматический домен клостридиального токсина, транслокационный домен клостридиального токсина, связывающий домен, не относящийся в клостридиальному токсину, и инактивационный сайт расщепления, расположенный в участке инактивационного сайта расщепления, где участок инактивационного участка расщепления расположен в транслокационном домене или в H_CN связывающем субдомене. Такие раскрываемые токсины могут включать энзиматический домен клостридиального токсина, транслокационный домен клостридиального токсина, связывающий домен, не относящийся в клостридиальному токсину, двухцепочечный петлевой участок, включающий сайт расщепления экзогенной протеазой, и инактивационный сайт расщепления, расположенный в участке инактивационного сайта расщепления. Не имеющие ограничительного характера примеры инактивационных сайтов расщепления включают сайты расщепления тромбином, сайты расщепления плазмином, сайты расщепления фактором коагуляции Вила, сайты расщепления фактором коагуляции IXa, сайты расщепления фактором коагуляции Ха, сайты расщепления фактором коагуляции XIa, сайты расщепления фактором коагуляции XIIa, сайты расщепления калликреином плазмы, сайты расщепления активируемым протеазой рецептором 1, сопряженным с G протеином (PAR1), сайты расщепления PAR 2, сайты расщепления PAR3, сайты расщепления PAR4, сайты расщепления матричной металлопротеиназой-2 (ММР-2), сайты расщепления матричной металлопротеиназой-9 (ММР-9), сайты расщепления фурином, сайты расщепления активатором плазминогена типа урокиназы (иРА), сайты расщепления активатором плазминогена тканевого типа (tPA), сайты расщепления триптазой-е, сайты расщепления протеазой мышиных тучных клеток-7 (mMCP-7), сайты расщепления эндотелин-конвертирующим ферментом-1 (ЕСЕ-1), сайты расщепления группой крови Келла, сайты расщепления DPPIV, сайты расщепления металлопептидазой ADAM с мотивом-13 тромбоспондина типа 1 (ADAMTS13) и сайты расщепления катепсином L. Добавление инактивационного сайта расщепления увеличивает профиль безопасности клостридиального токсина или гибрида клостридиального токсина по сравнению с тем же или подобным клостридиальным токсином или гибридом клостридиального токсина, однако, без дополнительного инактивационного сайта расщепления.

[014] Другие аспекты настоящего описания предоставляют полипептидные молекулы, кодирующие клостридиальный токсин или гибрид клостридиального токсина, раскрываемый в настоящем описании. Полинуклеотидная молекула, кодирующая такой клостридиальный токсин или гибрид клостридиального токсина, может далее включать экспрессирующий вектор.

[015] Другие аспекты настоящего описания предоставляют композицию, включающую клостридиальный токсин или гибрид клостридиального токсина, раскрываемый в настоящем описании. Композиция, включающая такой клостридиальный токсин или гибрид клостридиального токсина, может быть фармацевтической композицией. Такая фармацевтическая композиция, в добавление к модифицированному клостридиальному токсину, раскрываемому в настоящем описании, может включать фармацевтический носитель, фармацевтический компонент или оба.

[016] Другие аспекты настоящего описания предоставляют способ получения клостридиального токсина или гибрида клостридиального токсина, раскрываемого в настоящем описании, способ, включающий этап экспрессии в клетке полинуклеотидной молекулы, кодирующей клостридиальный токсин или гибрид клостридиального токсина, раскрываемый в настоящем описании, где экспрессии полинуклеотидной молекулы производит кодируемый клостридиальный токсин или гибрид клостридиального токсина. В других аспектах способ включает этапы внедрения в клетку полинуклеотидной молекулы, кодирующей клостридиальный токсин или гибрид клостридиального токсина в настоящем описании, и экспрессию полинуклеотидной молекулы, где экспрессия от полинуклеотидной молекулы производит кодируемый клостридиальный токсин или гибрид клостридиального токсина.

[017] Клостридиальные токсины, вырабатываемые Clostridium botuiimim, Clostridium tetani, Clostridium baratiiand Clostridium butyricum, являются наиболее широко используемыми в терапевтических и косметических лечениях людей и других млекопитающих. Штаммы С.botulinum вырабатывают семь антигенно различающихся типов ботулинических токсинов (BoNT), которые были идентифицированы путем исследования вспышек ботулизма у людей (BoNT/A, /В, /Е и/F), животных (BoNT/Cl и 7D), или выделены из почвы (BoNT/G). BoNT имеют, приблизительно, 35% аминокислотную идентичность друг с другом, и имеют одну и ту же функциональную доменную организацию и общее структурное построение. Специалистами в области техники признается, что среди каждого типа клостридиальных токсинов могут быть подтипы, несколько различающиеся по своей аминокислотной последовательности и также нуклеиновым кислотам, кодирующим эти белки. Например, в настоящее время существуют пять подтипов BoNT/A, BoNT/A1, BoNT/A2, BoNT/А3, BoNT/A4 и BoNT/A5, отдельные подтипы демонстрируют, приблизительно, от 84% до 93% идентичности аминокислот по сравнению с подтипом BoNT/A с SEQ ID NO:1. Как другой пример, в настоящее время существует пять подтипов BoNT/B, BoNT/B1, BoNT/B2, BoNT/В3, BoNT/Bnp и BoNT/Bbv, отдельные подтипы демонстрируют, приблизительно, от 93% до 96% идентичности аминокислот по сравнению с подтипом BoNT/B с SEQ ID NO:6. Как еще другой пример, в настоящее время существует три подтипа BoNT/E, BoNT/E1, BoNT/E2, и BoNT/ЕЗ, отдельные подтипы демонстрируют, приблизительно, от 95% до 99% идентичности аминокислот по сравнению с подтипом BoNT/E с SEQ ID NO:15. В то время, как все семь серотипов BoNT имеют одинаковую структуру и фармакологические свойства, каждый также проявляет гетерологические бактериологические характеристики. В отличие от этого, токсин столбняка (TeNT) вырабатывается однородной группой С.tetani. Два других вида клостридии, С.baratii и С.butyricum, вырабатывают токсины BaNT и BuNT, которые подобны, соответственно, BoNT/F и BoNT/E.

[018] Каждый из клостридиальных токсинов транслируется в виде одноцепочечного полипептида, весом, приблизительно, 150 кДа, который в дальнейшем расщепляется путем протеолитического разрезания природной протеазой в дисульфидной петле (ФИГ.1). Это расщепление происходит в определенном двухцепочечном участке петли, созданном между двумя цистеиновыми остатками, формирующими дисульфидный мостик. Этот посттрансляционный процессинг приводит к двухцепочечной молекуле, включающий, приблизительно, 50 кДа легкую цепь (LC) и, приблизительно, 100 кДа тяжелую цепь (НС), удерживаемыми вместе единичной дисульфидной связью и не-ковалентным взаимодействием между двумя цепями. Природные протеазы, используемые для конвертирования одноцепочечной молекулы в двухцепочечную, в настоящее время неизвестны. В некоторых серотипах, таких, как, например, BoNT/A, природные протеазы вырабатываются эндогенно серотипом бактерии, и расщепление происходит в клетке перед тем, как токсин высвобождается в окружающую среду. Однако в других серотипах, таких, как, например, BoNT/E, бактериальный штамм, как оказывается, не продуцирует эндогенную протеазу, способную конвертировать одноцепочечную форму токсина в двухцепочечную форму. В этих ситуациях токсин высвобождается из клетки в виде одноцепочечного токсина, который в дальнейшем конвертируется в двухцепочечную форму природными протеазами, находящимися в окружении.

[019] Каждая зрелая двухцепочечная молекула включает три функционально различных домена: 1) энзиматический домен, расположенный на LC, который включает участок металлопротеиназы, имеющий цинк-зависимую эндопептидазную активность, которая специфически направлена в отношении ключевых компонентов аппарата высвобождения нейромедиатора; 2) транслокационный домен, находящийся в амино-терминальной половине НС (H_N), которые способствует высвобождению LC из внутриклеточных везикул в цитоплазму клетки-мишени; и 3) связывающий домен, находящийся в карбокси-терминальной половине НС (H_c), который определяет связывающую активность и связывающую специфичность токсина по отношению к рецепторному комплексу, расположенному на поверхности клетки-мишени. D. В. Lacy and R. С.Stevens, Sequence Homology and Structural Analysis of the Clostridial Neurotoxins, J. Mol. Biol. 291: 1091-1104 (1999). Домен Не включает два различных структурных компонента приблизительно равного размера, разделенные α-спиралью, носящие названия субдомены H_CN и H_CC. В Таблице 1 даны приблизительные пограничные участки для каждого домена и субдомена, обнаруживаемых в примерных клостридиальных токсинах.

Таблица 1.
Референтные последовательности и участки клостридиального токсина
Токсин	SEQ ID NO:	LC	Цвухцепо чечная	HN	Hc
HCN	α-линкер	Hcc
BoNT/A	1	M1/P2-L429	С430-С454	I455-I873	I874-N1080	E1081-Q1091	S1092-L1296
BoNT/B	6	M1/P2-M436	С437-С446	I447-I860	L861-S1067	Q1068-Q1078	S1079-E1291
BoNT/C 1	11	M1/P2-F436	С437-С453	R454-I868	N869-D1081	G1082-L1092	Q1093-E1291
BoNT/D	13	M1/T2-V436	С437-С450	1451-1864	N865-S1069	N1069-Q1079	11080-Е1276
BoNT/E	15	M1/P2-F411	С412-С426	1427-1847	K848-D1055	Е1056-Е1066	Р1067-К1252
BoNT/F	18	M1/P2-F428	С429-С445	1446-1865	K866-D1075	K1076-Е1086	Р1087-Е1274
BoNT/G	21	M1/P2-M435	С436-С450	1451-1865	S866-N1075	A1076-Q1086	S1087-E1297
TeNT	22	M1/P2-L438	С439-С467	I468-L881	K882-N1097	P1098-Y1108	L1109-D1315
BaNT	23	M1/P2-L420	С421-С435	I436-I857	I858-D1064	K1065-Е 1075	Р1076-Е1268
BuNT	24	M1/P2-F411	С412-С426	I427-I847	K848-D1055	Е1056-Е1066	Р1067-K1251

[020] Связывание, транслокация и энзиматическая активность этих трех функциональных доменов - все они необходимы для токсичности. В то время, как точные детали данного процесса еще точно не известны, общий механизм клеточной интоксикации, посредством которой клостридиальные токсины входят в нейрон и ингибируют высвобождение нейромедиатора, подобны, вне зависимости от серотипа или подтипа. Хотя заявители не имеют желания быть ограниченными следующим описанием, механизм интоксикации может быть описан как состоящий, по меньшей мере, из четырех следующих этапов: 1) связывание рецептора, 2) интернализация комплекса, 3) транслокация легкой цепи и 4) энзиматическая модификация мишени (ФИГ.3). Процесс инициируется, когда домен Не клостридиального токсина связывается с рецепторной системой, специфичной к токсину, которая расположена на поверхности плазматической мембраны клетки-мишени. Специфичность связывания рецепторного комплекса, как считается, частично достигается специфической комбинацией ганглиозидов и белковых рецепторов, которые, по-видимому, определенно включают каждый комплекс клостридиального токсина и рецептора. Будучи связанными, комплексы токсин/рецептор интернализуются путем эндоцитоза и интернализированные везикулы распределятся по специфическим внутриклеточным путям. Этап транслокации, по-видимому, запускается подкислением компартмента везикулы. Этот процесс, как представляется, инициирует две важные рН-зависимые структурные перестройки, которые повышают гидрофобность и способствуют образованию двухцепочечной формы токсина. Будучи активированной, эндопептидаза легкой цепи эндотоксина высвобождается из внутриклеточной везикулы в цитозоль, где, по-видимому, она специфически направлена против одного из трех известных ключевых компонентов аппарата высвобождения нейромедиатора. Эти ключевые белки, мембранный белок, ассоциированный с везикулой (VAMP)/синаптобревин, белок 25 кДа, ассоциированный с синаптосомой (SNAP-25) и синтаксин, необходимы для докинга синаптической везикулы и слияния на нервном окончании, и они представляют собой членов семейства растворимого N-этилмалеимид чувствительного фактора - рецептора присоединения белка (SNARE). BoNT/A и BoNT/E расщепляют SNAP-25 на терминальном карбоксильном участке, высвобождая, соответственно, сегмент в девять или двадцать шесть аминокислот, и BoNT/Cl также расщепляет SNAP-25 вблизи карбоксильного конца. Ботулинические серотипы BoNT/B, BoNT/D, BoNT/F и BoNT/G, и токсин столбняка действуют на консервативную центральную часть VAMP и высвобождают амино-концевую часть VAMP в цитозоль. BoNT/Cl расщепляет синтаксин в единичном месте вблизи цитозольной поверхности мембраны. Селективный протеолиз синаптических SNARE ответственен за блокирование высвобождения нейромедиатора, вызываемое клостридиальными токсинами in vivo. Мишень клостридиальных токсинов - белок SNARE является характерным белком для экзоцитоза в разнообразных клетках, не относящихся к нейрональным; в этих клетках, как и в нейронах, пептидазная активность легкой цепи ингибирует экзоцитоз, см, например, Yann Humeau et al., How Botulinum and Tetanus Neurotoxins Block Neurotransmitter Release, 82(5) Biochimie. 427-446 (2000); Kathryn Turton et al., Botulinum and Tetanus Neurotoxins: Structure, Function and Therapeutic Utility, 27(11) Trends Biochem. Sci. 552-558. (2002); Giovanna Lalli et al., The Journey of Tetanus and Botulinum Neurotoxins in Neurons, 11(9) Trends Microbiol. 431-437, (2003).

[021] Трехмерные кристаллические структуры BoNT/A, BoNT/B и домена Не TeNT указывают на то, что эти три функциональных домена клостридиальных нейротоксинов являются структурно различными доменами, что является общим для всех клостридиальных токсинов. Консенсусный мотив НЕХХН легкой цепи образует тетраэдральный карман, связывающий цинк, расположенный в глубокой щели на поверхности белка, которая доступна посредством канала. Структура доменов H_N и H_C состоит, в основном, из структур β-складчатости, связанных единичной α-спиралью. Домен H_N цилиндрической формы содержит две длинные алифатические α-спирали, которые напоминают мотив суперспирали, обнаруживаемый в некоторых вирусных белках. Домен H_N также образует длинную неструктурированную петлю, называемую «транслокационный пояс», которая оборачивается вокруг большой отрицательно заряженной щели легкой цепи, которая блокирует доступ к атому цинка к каталитическому связывающему карману активного сайта. Домен H_c содержит два различных структурных компонента приблизительно равного размера, которые определяют функцию. Первый, названный H_CN домен, расположен на амино- половине домена H_C. Домен H_CN образует β-бочковую складчатость в форме «рулета с вареньем». Домен H_CC является вторым доменом, который содержит домен H_C. Этот домен с карбокси концом включает модифицированный β-складчатый домен в форме трилистника, который формирует три различные карбогидрат-связывающие участки, которые напоминают карбогидрат-связывающие функциональные группы, обнаруживаемые во многих сахаро-связывающих белках, таких, как, например, сывороточный амилоид Р, сиалидаза, cryIA, инсектицидный 9-эндотоксин, и пектины. Биохимические исследования указывают на то, что β-складчатая, в форме трилистника структура домена H_CC, по-видимому, опосредует связывание со специфическими карбогидрат-содержащими компонентами рецептора клостридиального токсина на клеточной поверхности, см., например, Krzysztof Ginalski et al., Structure-based Sequence Alignment for the Beta-Trefoil Subdomain of the Clostridial Neurotoxin Family Provides Residue Level Information About the Putative Ganglioside Binding Site,4S2(l-2) FEBS Lett. 119-124 (2000). Домен Не отклоняется от домена hn, экспонируя поверхностные петли и делая их доступными для связывания. Между легкой цепью и доменом Не не происходит никаких контактов.

[022] Аспекты настоящего описания предоставляют, частично, клостридиальный токсин. В данном контексте термин «клостридиальный токсин» относится к любому токсину, вырабатываемому штаммом клостридиального токсина, который может осуществлять полный клеточный механизм, посредством которого клостридиальный токсин вызывает интоксикацию клетки и направляет связывание клостридиального токсина с рецепторным комплексом низкой или высокой афинности, интернализацию комплекса токсин/рецептор, транслокацию легкой цепи клостридиального токсина в цитоплазму, и энзиматическую модификацию субстрата клостридиального токсина. Клостридиальный токсин включает энзиматический домен клостридиального токсина, транслокационный домен клостридиального токсина и связывающий домен клостридиального токсина. Примерные клостридиальные токсины включают токсины, вырабатываемые Clostridium botulinum, Clostridinm tetani, Clostridium baratii и Clostridium butyricum.

[023] Клостридиальные токсины включают, без ограничения, природные варианты клостридиального токсина, такие, как, например, изоформы клостридиального токсина и подтипы клостридиального токсина, не встречающиеся в природе варианты клостридиального токсина, такие, как, например, консервативные варианты клостридиального токсина, не-консервативные варианты клостридиального токсина и активные фрагменты этих вариантов клостридиального токсина, или любые их комбинации. В данном контексте термин «вариант клостридиального токсина», является ли это природный вариант, или вариант, не встречающийся в природе, относится к клостридиальному токсину, который имеет, по меньшей мере, одно изменение аминокислоты из соответствующего участка раскрываемых референтных последовательностей (Таблица 1), и может быть описан в процентной идентичности, по отношению к соответствующему участку референтной последовательности. В качестве примеров, не имеющих ограничительного характера, вариант BoNT/A с SEQ ID NO:1 будет иметь, по меньшей мере, различие по одной аминокислоте, такое, как, например, замена, делеция или добавление аминокислоты по сравнению с соответствующим положением(ями) SEQ ID NO:1; вариант BoNT/B с SEQ ID NO:6 будет иметь, по меньшей мере, различие по одной аминокислоте, такое, как, например, замена, делеция или добавление аминокислоты по сравнению с соответствующим положением(ями) SEQ ID NO:6; вариант BoNT/Cl с SEQ ID NO:11 будет иметь, по меньшей мере, различие по одной аминокислоте, такое, как, например, замена, делеция или добавление аминокислоты по сравнению с соответствующим положением(ями) SEQ ID NO:11; вариант BoNT/D с SEQ ID NO:13 будет иметь, по меньшей мере, различие по одной аминокислоте, такое, как, например, замена, делеция или добавление аминокислоты по сравнению с соответствующим положением(ями) SEQ ID NO:13; вариант BoNT/E с SEQ ID NO:15 будет иметь, по меньшей мере, различие по одной аминокислоте, такое, как, например, замена, делеция или добавление аминоки