Вакцина против высокопатогенного репродуктивно-респираторного синдрома свиней (hp prrs)

Вакцина против высокопатогенного репродуктивно-респираторного синдрома свиней (hp prrs)

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Перечень последовательностей

В настоящую заявку входит перечень последовательностей в бумажной версии и электронной версии, сущность и содержание которых включены в настоящее описание в качестве ссылки.

Предпосылки создания изобретения

Область техники, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение относится в целом к вакцинам против инфекционных болезней. Более конкретно оно относится к вакцинам против высокопатогенного репродуктивно-респираторного синдрома свиней (HP PRRS), вирусного заболевания, поражающего свиней.

Описание известного уровня техники

Репродуктивно-респираторный синдром свиней (PRRS) представляет собой серьезное заболевание свиней, и оно характеризуется либо расстройством органов воспроизводства супоросных свиней, либо нарушением дыхательного пути, прежде всего у поросят-сосунков. Это вирусное заболевание было впервые обнаружено в Соединенных Штатах в 1987 г., затем оно было выявлено в Европе и идентифицировано в Азии в начале 1990-х годов. К настоящему времени PRRS распространился по всему миру, характеризуясь эндемичностью для стран, в которых выращивают свиней, приводя каждый год к значительным экономическим потерям. Возбудителем PRRS является вирус репродуктивно-респираторного синдрома свиней (PRRSV), который наряду с вирусом повышения уровня лактатдегидрогеназы мышей (LDEV), вирусом артериита лошадей (EAV) и обезьяним вирусом геморрагической лихорадки (SHFV) принадлежит к семейству Arteriviridae отряда Nidovirales.

PRRSV, который является представителем небольших покрытых оболочкой вирусов, имеет геном, который представлен одной позитивной цепью (ssPHK) размером примерно 15,1-15,5 т.п.н., содержащий по меньшей мере 8 открытых рамок считывания (ОРС), которые кодируют примерно 20 предполагаемых белков. Геном содержит также две нетранслируемые области (UTR) на 5'- и на 3'-концах. Так, ОРС1 (OPC1a и OPC1b) локализована в прямом направлении относительно 5'-UTR и на ее долю приходится более 2/3 полного генома. OPC1a транслируется непосредственно, в то время как OPC1b транслируется со сдвигом рибосомной рамки считывания, что приводит к образованию крупного полипротеина OPC1ab, из которого в результате протеолитического расщепления образуются продукты, связанные с системой транскрипции и репликации вируса. ОРС 2-7, локализованные в обратном направлении относительно 3'-UTR, кодируют ряд вирусных структурных белков, ассоциированных с вирионом, таких как оболочечный белок (Е) и нуклеокапсидный белок (N). Все эти белки транслируются из 3'-котерминального блока субгеномных мРНК (sgmPHK).

Филогенетический анализ изолятов PRRSV из различных географических регионов в мире четко продемонстрировал наличие двух основных генотипов: тип I представлен европейским прототипом (вирус Лелистада, (LV), а тип II представлен северо-американским штаммом АТСС VR2332 (геномная последовательность VR2332 находится в GenBank, регистрационный № AY150564) в качестве прототипа (Murtaugh и др., Arch Virol. 140, 1995, cc.1451-1460). Кроме того, в некоторых исследованиях установлено, что ОРС5 и ген (nsp2), кодирующий неструктурный белок 2 (NSP2), могут представлять собой наиболее генетически вариабельные области в геноме PRRSV (см. SwissProt, регистрационный № Q9WJB2 или SEQ ID NO:2, в которой представлена последовательность NSP2 VR2332). Известно также, что штаммы PRRSV значительно отличаются по патогенности.

В 2006 г. произошла не имеющая себе равных крупномасштабная вспышка ранее неизвестного, но обозначенного в целом как «как сопровождающаяся сильной лихорадкой (отличающаяся высокой температурой) форма» заболевания с симптомами PRRS, которое распространилось более чем в 10 провинциях и поразило свыше 2000000 свиней, из которых погибло примерно 400000. В отличие от типичной формы PRRS «отличающейся высокой температурой формой» поражалось также много взрослых свиней. Эта пандемия атипичного PRRS первоначально была идентифицирована как напоминающее холеру заболевание свиней, для которого характерны неврологические симптомы (например, дрожь), высокая температура (40-42°С), эриматозная исчезающая сыпь и т.д. Аутопсии в сочетании с иммунологическими анализами четко продемонстрировали поражение высокопатогенными PRRSV многих органов, в которых были обнаружены серьезные патологические изменения (Tian и др., PLoS ONE., 2(6), 2007, е526). Wанализ всего генома выделенных вирусов позволил установить, что эти изоляты PRRSV относятся к типу II и обладают высоким уровнем гомологии с НВ-1, китайским штаммом PRRSV (идентичность на уровне нуклеотидной последовательности 96,5%) и с JX143 (Yuan и др., International PRRS Symposium, Chicago, (Международный симпозиум по PRRS, Чикаго) 2007 г.). Геномная последовательность JX143 представлена в SEQ ID NO:1 или в EMBL/GenBank, регистрационный № EU708726. Установлено также, что эти вирусные изоляты содержат уникальный молекулярный отличительный признак, а именно прерывистую делецию 30 аминокислот в неструктурном белке 2 (NSP2) (Tian и др., PLoS ONE., 2(6), 2007, е526), «Отличающуюся высокой температурой» форму PRRS в настоящее время обозначают также как «высокопатогенный PRRS» или HP PRRS.

Выделение вируса PRRS (PRRSV) и изготовление вакцин против PRRS, которые содержат либо модифицированный живой (ослабленный), либо инактивированный PRRSV, описано в многочисленных публикациях (WO 92/21375, WO 93/06211, WO 93/03760, WO 93/07898, WO 96/36356). В частности, в WO 93/03760 описаны методы выделения, культивирования, ослабления вируса PRRS, а также изготовления соответствующих вакцин и, прежде всего изолята прототипа PRRS типа II АТСС VR-2332. В WO 96/36356 описано, в частности, пригодное для применения ослабленное потомство вышеуказанного изолята, полученное путем серийных пассажей в клетках обезьян, которое депонировано под регистрационным номером АТСС VR-2495. Соответствующий продукт в виде модифицированной живой вакцины (MLV) поступает в продажу от фирмы Boehringer Ingelheim под маркой Ingelvac® PRRS MLV. Другая MLV-вакцина на основе изолята типа II поступает в продажу под маркой Ingelvac® PRRS ATP.

Пригодной стратегией предупреждения PRRS является вакцинация. Однако пока не известно, будет ли обладать эффективностью вакцинация против HP PRRS, и какой тип вакцины можно применять.

Описание изобретения

При создании изобретения неожиданно было установлено, что ослабленные штаммы вируса PRRS типа II можно применять для вакцинации и защиты свиней от форм болезни, отличающихся высокой температурой, которые ассоциированы с репродуктивно-респираторным синдромом свиней. Идентификация профилактических свойств ослабленных штаммов вирусов PRRS типа II может позволить лечить свиней, имеющих высокий риск заражения, например, HP PRRS. Указанная программа вакцинации или лечения может способствовать снижению вероятности возникновения других вспышек HP PRRS, аналогичных той, которая разорила свиноводство Китая в 2006 г. и привела к отбраковке грубо 20 миллионов свиней, или снижению их воздействия.

Одним из объектов настоящего изобретения является способ профилактической защиты свиней от воздействия отличающейся высокой температурой формы болезни, заключающийся в том, что вводят свинье, которая нуждается в этом, иммуногенную композицию, содержащую в эффективном количестве вирус PRRS типа II, предпочтительно ослабленный вирус PRRS типа II. Композиция может содержать также фармацевтически приемлемый носитель. Композиция может содержать также адъювант. Способ можно применять в качестве превентивной или лечебной меры. Кроме того, введение в эффективном количестве такой иммуногенной композиции приводит к снижению коэффициента заболеваемости или серьезности клинических симптомов отличающихся высокой температурой форм заболевания PRRS.

В изобретении предложен также способ вакцинации свиней от отличающейся высокой температурой формы болезни, заключающийся в том, что вводят свинье иммуногенную композицию, содержащую в эффективном количестве вирус PRRS типа II, предпочтительно ослабленный вирус PRRS типа II. Композиция может содержать также фармацевтически приемлемый носитель, Композиция может содержать также адъювант. Кроме того, введение в эффективном количестве такой иммуногенной композиции приводит к снижению коэффициента заболеваемости или серьезности клинических симптомов отличающейся высокой температурой формы заболевания PRRS.

Отличающаяся высокой температурой болезнь может представлять собой форму, ассоциированную с репродуктивно-респираторным синдромом свиней. Репродуктивно-респираторный синдромом свиней может представлять собой высокопатогенный («HP PRRS»). HP PRRS или отличающуюся высокой температурой форму болезни можно выявлять у свиньи по наличию одного или нескольких следующих клинических симптомов: гиперемия кожи, пятна крови, петехиальное кровоизлияние, эриматозная исчезающая сыпь и папулы, часто присутствующие в ушах, ротовой полости, носовой полости, на спине и внутренней поверхности бедер. Другие обычные симптомы могут включать высокую температуру (температура более 40°С), депрессию, анорексию, кашель, астму, хромоту, дрожь, нарушение дыхательного пути и диарею. HP PRRS вызывается вирусом HP PRRS.

Другим объектом изобретения является способ профилактической защиты свиньи от инфекции, которая вызывается вирусом HP PRRS, заключающийся в том, что вводят свинье, которая нуждается в этом, иммуногенную композицию, содержащую в эффективном количестве вирус PRRS типа II, предпочтительно ослабленный вирус PRRS типа II.

Присутствие вируса HP PRRS, открытого в 2002 г. в Китае в качестве представителя генотипа 2 PRRS, коррелирует с так называемой отличающейся высокой температурой формой болезни. После этого было установлено, что вирус HP PRRS стал доминантным в некоторых провинциях Китая, что свидетельствует о его избирательном преимуществе при распространении в пораженных популяциях свиней по сравнению с другими вирусами PRRS.

Понятие «вирус HP PRRS» означает (но, не ограничиваясь только ими) штамм вируса PRRS, который имеет нуклеотидную последовательность, практически идентичную последовательности, представленной в SEQ ID NO:1. Предпочтительно вирус HP PRRS представляет собой штамм вируса PRRS, который имеет нуклеотидную последовательность, практически идентичную последовательности, представленной в SEQ ID NO:1. Практически идентичная последовательности, представленной в SEQ ID NO:1, означает, что нуклеотидная последовательность штамма вируса PRRS предпочтительно содержит последовательность, идентичную на 85-100% последовательности, представленной в SEQ ID NO:1, предпочтительно при условии, что вирус HP PRRS не представляет собой вирус PRRS типа II, указанный в настоящем описании, например, нуклеотидная последовательность ОРС5 менее чем на 91%, предпочтительно менее чем на 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% гомологична последовательности ОРС5 VR2332, референс-изолята вируса. Нуклеотидная последовательность штамма вируса HP PRRS предпочтительно более чем на 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88% или 89% идентична последовательности, представленной в SEQ ID NO:1, также при условии, что вирус HP PRRS не представляет собой вирус PRRS типа II, указанный в настоящем описании, например, нуклеотидная последовательность ОРС5 менее чем на 91%, предпочтительно менее чем на 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% гомологична последовательности ОРС5 VR2332, референс-изолята вируса. Еще более предпочтительно нуклеотидная последовательность штамма вируса PRRS более чем на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или более 99% идентична последовательности, представленной в SEQ ID NO:1, предпочтительно при условии, что вирус HP PRRS не представляет собой вирус PRRS типа II, указанный в настоящем описании, например, нуклеотидная последовательность ОРС5 менее чем на 91%, предпочтительно менее чем на 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% гомологична последовательности ОРС5 VR2332, референс-изолята вируса.

Понятие «вирус HP PRRS» может означать также любые штаммы вируса PRRS, которые имеют определенную модификацию в белке NSP2. Согласно этому определению штамм вируса HP PRRS представляет собой штамм вируса PRRS, который кодирует белок NSP2, в котором аминокислота, соответствующая лейцину в положении 482 аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO:2, удалена в результате делеции, и который вызывает клинический симптом в виде высокой температуры. В качестве альтернативы или в дополнении к делеции лейцина в указанном положении в аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO:2, аминокислоты, соответствующие аминокислотам 534-562 последовательности, представленной в SEQ ID NO:2, могут быть удалены в результате делеции из кодируемого вирусом PRRS белка NSP2. В этом контексте последовательность, представленную в SEQ ID NO:2, следует рассматривать в качестве примера, и понятие белок NSP2 не ограничено белком NSP2, последовательность которого представлена в SEQ ID NO:2. На основе указанных выше сведений специалист в данной области может легко идентифицировать любую соответствующую модификацию в штаммах вируса PRRS, которые имеют последовательность белка NSP2, отличающуюся от последовательности, представленной в SEQ ID NO:2, но имеют такую же модификацию, т.е. делецию лейцина, который соответствует лейцину в положении 482 последовательности, представленной в SEQ ID NO:2, и/или делению аминокислот, соответствующих аминокислотам 534-562 последовательности, представленной в SEQ ID NO:2.

Кроме того, вирус HP PRRS может означать также штамм вируса PRRS, который имеет нуклеотидную последовательность, практически идентичную последовательности, представленной в SEQ ID NO:1 (как она описана выше) и кодирует белок NSP2, в котором аминокислота, соответствующая лейцину в положении 482 аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO:2, и/или аминокислоты, соответствующие аминокислотам последовательности, представленной в 534-562 SEQ ID NO:2, удалены в результате делеции из кодируемого вирусом PRRS белка NSP2.

Кроме того, понятие «вирус HP PRRS» относится к вирусу HP PRRS, который представляет собой штамм вируса PRRS, имеющий нуклеотидную последовательность, которая практически идентична последовательности, представленной в SEQ ID NO:1, при условии, что вирус HP PRRS не представляет собой вирус PRRS типа II, указанный в настоящем описании, например, нуклеотидная последовательность ОРС5 менее чем на 91%, предпочтительно менее чем на 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% гомологична последовательности ОРС5 VR2332, референс-изолята вируса (как описано выше), и кодирует белок NSP2, в котором аминокислота, соответствующая лейцину в положении 482 аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO:2, и/или аминокислоты, соответствующие аминокислотам 534-562 последовательности, представленной в SEQ ID NO:2, удалены в результате делеции из кодируемого вирусом PRRS белка NSP2.

Кроме того, понятие «вирус HP PRRS» относится к вирусу HP PRRS, который представляет собой штамм вируса PRRS, имеющий нуклеотидную последовательность, которая практически идентична последовательности, представленной в SEQ ID NO:1, при условии, что вирус HP PRRS не представляет собой вирус PRRS типа II, указанный в настоящем описании, например, нуклеотидная последовательность ОРС5 менее чем на 91%, предпочтительно менее чем на 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% гомологична последовательности ОРС5 VR2332, реферес-изолята вируса (как описано выше), и кодирует белок NSP2, при этом антитела, обладающие реактивностью к пептидам, соответствующим аминокислотам (ак) в положениях 536-550 или 546-560, или 476-490, не обладают к нему реактивностью.

Кроме того, известно, что указанные ниже изоляты вируса PRRS представляют собой штаммы вируса HP PRRS. Таким образом, понятие «штамм вируса HP PRRS» в контексте настоящего описания должно включать также любые из указанных штаммов вирусов, а также любое их потомство: штамм вируса HP PRRS АН-1; AHCFSH; AHCFZC; BB07; BD-8; BQ07; CL07; СХ07; CZ07; FY060915; FY080108; GC-2; GCH-3; GD1; GD2; GD2007; GD3; GD4; GDSD1; GDY1-2007; GDY2-2007; GDYF1; GS2008; GXHZ12; GXHZ13; GXHZ14; GXHZ16; GXHZ19; GXHZ2; GXHZ21; GXHZ4; GXLZ5; GXLZ7; GY; GZCJ; GZDJ; GZHW1; GZHW2; GZHX; GZJS; GZKB; GZKY; GZLJ1; GZWB; GZWM; GZZB; Hainan-1; Hainan-2; HB1; HB2; HB3; HB-Tsh1; HB-Xt1; HEN46; HeN-KF; HeN-LH; HeN-LY; HLJDF; HLJMZ1; HLJMZ2; HLJMZ3; HLJZY; HM-1; HN2; HN2007; HN3; HN1d; HN1y; HNLY01; HNNX01; HNPJ01; HNsp; HNXT1; HNyy; HNyz; HQ-5; HQ-6; HUB; HuN; HUN1; HUN11; HUN15; HUN16; HUN17; HUN2; HUNS; HUN4; HUNS; HUN6; HUN7; Hunan-1; Hunan-2; Hunan-3; HUNH2; HUNH4; HuNh1; HUNL1; HUNX4; HZ061226; HZ070105; Jiangsu-1; Jiangsu-2; Jiangsu-3; Jiangxi-2; Jiangxi-4; JLYS; JN; JX1; JX143; JX2; JX-2; JX2006; JX3; JX4; JX5; JXA1; KS06; LC07; LJ; LS06; LS-4; LY07; NB070319; SC07; SD; SD14; SDWF2; SH02; ST-7; SX2007; SY0608; TJDMJ; TJZHJ2; TJZHJ3; TQ; TQ07; TW07; WF07; XJ07; XL2008; YN2008; YNBS; YNDL; YNMG; YNWS; YNYS; YNYX1; YNYX3; ZJ06; ZJCJ; ZJWL; ZX07; ZS070921. Понятие «потомство» не должно быть ограничено изолятом вируса, полученным из любого родительского вируса, указанного выше, и имеющего нуклеотидную последовательность, которая идентична более чем на 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% и 99% нуклеотидной последовательности соответствующего родительского штамма вируса.

Понятие «вирус PRRS типа II» означает (но, не ограничиваясь только им) штамм вируса PRRS, практически идентичный изоляту вируса, который депонирован как ATCC-VR2332, или любому потомству изолята вируса, депонированного как ATCC-VR2332. Практически идентичный в контексте настоящего описания означает, что нуклеотидная последовательность, которая кодирует белок ОРС5, идентична на 85-100% нуклеотидной последовательности изолята вируса, депонированного как ATCC-VR2332, и представленной в SEQ ID NO:3. Нуклеотидная последовательность ОРС5 предпочтительно более чем на 86%, 87%, 88% или 89% идентична последовательности, представленной в SEQ ID NO:3. Еще более предпочтительно нуклеотидная последовательность ОРС5 более чем на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или более чем на 99% идентична последовательности, представленной в SEQ ID NO:3. Предпочтительно вирус PRRS типа II в контексте настоящего описания означает штамм вируса PRRS, который практически идентичен изоляту вируса, депонированному как ATCC-VR2332, или любому потомству изолята вируса, депонированного как ATCC-VR2332 (описанному выше), но в котором отсутствует делеция в гене NSP2, который кодирует аминокислоту, соответствующую аминокислотам 534-562 последовательности, представленной в SEQ ID NO:2. Полная последовательность вируса PRRS ATCC-VR2332 находится в GenBank под регистрационным номером U87392.

Понятие «вирус PRRS типа II» должно также включать любой ослабленный вирус, полученный из любого из вышеперечисленных штаммов вируса PRRS типа II. Например, понятие «вирус PRRS типа II» должно также включать ослабленный вирус PRRS типа II, депонированный как ATCC-VR2495. Кроме того, ослабленный вирус PRRS типа II может представлять собой любое ослабленное потомство изолята вируса, депонированного как ATCC-VR2332. В некоторых предпочтительных вариантах вирус PRRS типа II в сочетании с фармацевтически приемлемыми носителями может представлять собой вакцину Ingelvac® PRRS MLV (серийный № JA-A64A-149) фирмы Boehrmger Ingelheim Vetmedica, Inc. (Сент-Джозеф, шт.Миссури). Понятие «вирус PRRS типа II» может включать также изоляты, обозначенные как НВ-1; BJ-4; CH-1a; CH-1R; CH-1R01; HB-2; HN1; HT06; HZ07; LS05; LY03; NH04; PL97-1; S1; SH061130; SX071226; TW07-1; WF03; ХХ03; ZJJ04; ZJJ05; ZJJ07, которые не представляют собой штаммы HP PRRS китайского происхождения.

Другим объектом настоящего изобретения является способ профилактики заражения свиней HP PRRS, заключающийся в том, что вводят свинье, которая нуждается в этом, иммуногенную композицию, содержащую в эффективном количестве вирус PRRS типа II, предпочтительно ослабленный вирус типа PRRS типа II, где вирус PRRS типа II представляет собой штамм вируса PRRS, который практически идентичен изоляту вируса, депонированному как ATCC-VR2332, или любому потомству изолята вируса, депонированного как ATCC-VR2332. Предпочтительно вирус PRRS типа II не несет делецию в кодируемых геном NSP2 аминокислотах, которые соответствуют аминокислотам 534-562 последовательности, представленной в SEQ ID NO:2. Еще более предпочтительно вирус PRRS типа II представляет собой ослабленный вирус PRRS типа II, депонированный как ATCC-VR2495. Кроме того, вирус PRRS типа II представляет собой вакцину Ingelvac® PRRS MLV (серийный № JA-A64A-149).

Эффективное количество вируса PRRS типа II может представлять собой количество вируса, вызывающее или обладающее способностью вызывать иммунный ответ у животного, которому вводят вирус в эффективной дозе. Количество, являющееся эффективным, может зависеть от ингредиентов вакцины и схемы введения. Если применяют препарат инактивированного вируса или модифицированного живого вируса, то можно рекомендовать применять вакцину в количестве, содержащем от 10^2,0 до примерно 10^9,0 TCID₅₀ (средняя цитопатогенная доза (инфицирующая 50% клеток)), более предпочтительно от 10^3,0 до примерно 10^4,0 TCID₅₀ и еще более предпочтительно от примерно 10^4,0 до примерно 10^8,0 TCID₅₀ на дозу.

Согласно настоящему описанию вирус PRRS типа II можно применять в виде инактивированного полностью убитого вируса или в виде ослабленной формы вируса PRRS типа II с целью профилактики свиньи для защиты от отличающейся высокой температурой формы болезни, указанной в настоящем описании. Кроме того, субъединицы, включая иммуногенные фрагменты или фракции вируса PRRS типа II, можно применять также с целью профилактики свиньи для защиты от отличающейся высокой температурой формы болезни.

Согласно настоящему описанию ослабленный вирус PRRS типа II можно применять также в виде модифицированной живой вакцины (MLV), содержащей один или несколько указанных выше живых штаммов в фармацетически приемлемом носителе. В другом или дополнительном варианте инактивированный вирус можно применять для получения убитой вакцины (KV), описанной выше. Можно использовать препаративные формы MLV, которые позволяют вводить от 10¹ до 10⁷ вирусных частиц, предпочтительно от 10³ до 10⁵ частиц на дозу, более предпочтительно от 10⁴ до 10⁵ частиц на дозу. Препаративные формы KV можно создавать на основе титра до инактивации, составляющего от 10³ до 10¹⁰, от 10⁴ до 10⁹, от 10⁵ до 10⁸ или от 10⁶ до 10⁷ вирусных частиц на дозу.

Вирус PRRS типа II, предпочтительно ослабленный вирус PRRS типа II, можно вводить свинье перед обработкой свиньи штаммом вируса PRRS, который вызывает HP PRRS, в виде профилактической меры, одновременно с обработкой свиньи штаммом вируса PRRS, который вызывает HP PRRS, или после обработки изучаемой свиньи штаммом вируса PRRS, который вызывает HP PRRS. Изучаемая свинья может иметь один или несколько клинических признаков или общих симптомов HP PRRS или отличающейся высокой температурой формы болезни, которые описаны выше. Изучаемая свинья может обладать очень высокой чувствительностью к отличающейся высокой температурой форме болезни, ассоциированной с HP PRRS. Изучаемая свинья может обладать очень высокой чувствительностью к HP PRRS. Изучаемая свинья может обладать чувствительностью к HP PRRS из-за иммунодефицита. Изучаемая свинья может обладать чувствительностью к HP PRRS в зависимости от того, на какой ферме она выращивается. Чувствительная свинья может выращиваться на ферме в Китае. Чувствительная свинья может выращиваться в провинции в Китае, такой как провинция Цзянси, провинция Хэбэй или в городе Шанхае (см. Tian и др., PloS ONE, 2(6), 2007, е526, содержание указанной публикации включено в настоящее описание в качестве ссылки). Ослабленный вирус PRRS типа II можно вводить путем инъекции, ингаляции или с помощью имплантата, при этом инъекция является предпочтительной. В зависимости от требуемой продолжительности и эффективности вакцинации или обработки вирус PRRS типа II, предпочтительно ослабленный вирус PRRS типа II, можно вводить один или несколько раз, а также периодически, например, на суточной основе в течение нескольких дней, недель или месяцев и в различных дозах. При этом предпочтительным является введение одной дозы. Инъекцию можно осуществлять в периферическую или центральную вену в требуемом количестве или в другом варианте применяют непрерывную инфузию. Вирус PRRS типа II, предпочтительно ослабленный вирус PRRS типа II можно вводить орально, парентерально, подкожно, внутримышечно, внутрикожно, подъязычно, трансдермально, ректально, через слизистую оболочку, местно или путем ингаляции, с помощью трансбуккального введения или использовать их комбинацию. Вирус PRRS типа II, предпочтительно ослабленный вирус PRRS типа II, можно применять также в форме имплантата, который может обеспечивать медленное высвобождение ослабленного вируса. Для внутримышечного введения можно использовать объем, составляющий от 0,5 до 3 мл, более предпочтительно от 1 до 2,5 мл, еще более предпочтительно от 1,5 до 2 мл. Наиболее предпочтительным является внутримышечное введение 2 мл. Для внутрикожного введения применяют объем, составляющий от 0,05 до 1 мл, более предпочтительно от 0,1 до 0,8 мл, еще более предпочтительно от 0,1 до 0,5 мл, еще более предпочтительно от 0,2 до 0,4 мл. Наиболее предпочтительно для внутрикожной инъекции можно использовать 0,2 мл вируса PRRS типа II можно использовать объемы, составляющие от 0,5 до 5 мл, более предпочтительно от 1 до 4 мл, еще более предпочтительно от 2 до 3 мл. Для внутриносового введения наиболее предпочтительно следует использовать объем, составляющий 3 мл.

Фармацевтически приемлемый носитель может представлять собой любой и все такие агенты, как растворители, диспергирующие среды, материалы для нанесения покрытия, стабилизаторы, разбавители, консерванты, антибактериальные и противогрибковые средства, агенты для придания изотоничности, замедляющие адсорбцию агенты и т.п.

«Адъюванты» в контексте настоящего описания могут представлять собой гидроксид алюминия и фосфат алюминия, сапонины, например, Quil A, QS-21 (фирма Cambridge Biotech Inc., Кембридж, шт.Массачусетс), GPI-0100 (фирма Galenica Pharmaceuticals, Inc., Бирмингем, шт.Алабама), эмульсию типа вода-в-масле, эмульсию типа масло-в-воде, эмульсию типа вода-в-масле-в-воде. Основой эмульсии может быть легкое жидкое парафиновое масло (типа тех масел, которые входят в Европейскую фармакопею); изопреноидное масло, такое как сквалановое или скваленовое масло, полученное в результате олигомеризации алкенов, в частности изобутена или децена; эфиры кислот или спиртов, содержащие линейную алкильную группу, более предпочтительно растительные масла, этилолеат, ди(каприлат/капрат) пропиленгликоля, три(каприлат/капрат) глицерина или диолеат пропиленгликоля; эфиры разветвленных жирных кислот или спиртов, в частности, эфир изостеариновой кислоты. Для получения эмульсии масло применяют в сочетании с эмульгаторами. Эмульгаторы предпочтительно представляют собой неионные поверхностно-активные вещества, в частности, эфиры сорбитана, маннида (например, ангидроманнитолеат), гликоля, полиглицерина, пропиленгликоля и олеиновой, изостеариновой, рициноловой или гидроксистеариновой кислоты, которые необязательно являются этоксилированными, и блок-сополимеры полиоксипропилена-полиоксиэтилена, в частности продукты типа Pluronic, прежде всего L121 (см. Hunter и др., The Theory and Practical Application of Adjuvants, под ред. Stewart-Tull D. E. S., изд-во JohnWiley and Sons, NY, 1995, cc.51-94 и Todd и др., Vaccine 15, 1997, cc.564-570).

Например, можно применять эмульсию фирмы SPT, которая описана на с.147 в «Vaccine Design, The Subunit and Adjuvant Approach», под ред. М. Powell и M. Newman, изд-во Plenum Press, 1995, и эмульсию MF59, описанную на с.183 в этой же книге.

Другим примером адъюванта является соединение, выбранное из полимеров акриловой и метакриловой кислоты и сополимеров малеинового ангидрида и производного алкенила. Предпочтительными адъювантами являются сшитые полимеры акриловой и метакриловой кислоты, прежде всего сшитые с простыми полиалкениловыми эфирами Сахаров или полиспиртов. Эти соединения известны под названием карбомер (Phameuropa, т.8, №. 2, июнь 1996 г.). Специалисты в данной области могут ознакомиться также с US 2909462, в котором описаны такие акриловые полимеры, сшитые с полигидроксилированным соединением, имеющим по меньшей мере 3 гидроксильные группы, предпочтительно не более 8, атомы водорода по меньшей мере трех гидроксилов могут быть замещены ненасыщенными алифатическими радикалами, которые имеют по меньшей мере 2 атома углерода. Предпочтительными являются радикалы, которые содержат от 2 до 4 атомов углерода, например, винилы, аллилы и другие ненасыщенные этиленом группы. Ненасыщенные радикалы могут сами включать заместителей, таких как метил. Наиболее приемлемыми являются продукты, поступающие в продажу по названием Карбопол; (фирма BF Goodrich, шт.Огайо, США). Они сшиты с аллилсахарозой или с аллилпентаэритритолом. Среди них следует упомянуть Карбопол 974Р, 934Р и 971P. Наиболее предпочтительно применяют Карбопол 971P. Из сополимеров малеинового ангидрида и алкенильного производного следует упомянуть сополимеры ЕМА (фирма Monsanto), которые представляют собой сополимеры малеинового ангидрида и этилена. Растворение этих полимеров в воде приводит к получению кислого раствора, который надо нейтрализовать, предпочтительно до физиологического значения рН, для получения раствора адъюванта, в который можно включать иммуногенную, иммунологическую композицию или саму композицию вакцины.

Кроме того, приемлемыми адъювантами среди многих других являются (но, не ограничиваясь только ими), ацетат α-токоферола, система адъювантов RIBI (фирма Ribi Inc.), блок-сополимер (CytRx, Атланта, шт.Джорджия), SAF-M (Хирон, Эмеривилль, шт.Калифорния), монофосфорил липида А, адъювант на основе липида авридина-амина, термолабильный энтеротоксин из Е.coli (рекомбинатный или любой другой), холерный токсин, IMS 1314 или мурамилдипептид.

Предпочтительно адъювант добавляют в количестве от примерно 100 мкг до примерно 10 мг на дозу. Еще более предпочтительно адъювант добавляют в количестве от примерно 100 мкг до примерно 10 мг на дозу. Еще более предпочтительно адъювант добавляют в количестве от примерно 500 мкг до примерно 5 мг на дозу. Еще более предпочтительно адъювант добавляют в количестве от примерно 750 мкг до примерно 2,5 мг на дозу. Наиболее предпочтительно адъювант добавляют в количестве примерно 1 мг на дозу.

Изобретение относится также к способу получения ослабленного вируса PRRS типа II, который можно применять для лечения или иммунизации изучаемой свиньи от HP PRRS. Способ может заключаться в том, что осуществляют одну или несколько следующих стадий: (а) осуществляют пассаж ATCC-VR2332 или любого вируса PRRS типа II, практически идентичного ATCC-VR2332, согласно описанному ниже процессу для модификации вируса и придания ему авирулентности и способности иммунизировать изучаемую свинью против HP PRRS, (б) собирают полученные клетки или клеточную культуру вируса, (в) добавляют стабилизатор в полученную культуру вируса; и/или (г) лиофилизируют полученную культуру вируса. Пассаж вируса может предусматривать применение классических методов размножения и селекции; например, длительное размножение в приемлемых клетках-хозяевах для усиления ослабленного фенотипа. Пассажи могут приводить к получению вирусного штамма, который несет приобретенные мутации, многие из которых могут не изменять существенно свойства родительского штамма. Ослабленный вирус PRRS типа II можно получать на основе ATCC-VR2332 или любого другого вируса PRRS типа II, практически идентичного ATCC-VR2332, пассажи которого в клетки-хозяева осуществляли по меньшей мере 60, 65, 70, 75, 80 или более раз. Ослабленный вирус PRRS типа II можно получать из ATCC-VR2332 или любого вируса PRRS типа II, практически идентичного ATCC-VR2332, после пассажей в клетке-хозяине от 50 до 100 раз, от 60 до 90 раз, от 70 до 80 раз или от 65 до 75 раз. Ослабленный вирус PRRS типа II можно получать из ATCC-VR2332 или любого вируса PRRS типа II, практически идентичного ATCC-VR2332, после пассажей в клетке-хозяине от 70 до 75 раз. Приемлемая клетка-хозяин может представлять собой обезьянью клеточную линию, клетки Vero или альвеолярные свиные макрофаги. Предпочтительной обезьяньей клеточной линией является МА-104. Клетка-хозяин может представлять собой культуру клеток. Клеточная линия может быть заражена вирусом, который подлежит пассированию. При осуществлении каждого пассажа может требоваться инкубация образовавшейся зараженной вирусом клеточной линии или культуры клеток при температуре от 34°С до 40°С, более предпочтительно от 35°С до 39°С, еще более предпочтительно от 36°С до 38°С и еще более предпочтительно от 35°С до 37°С. Наиболее предпочтительно при осуществлении каждого пассажа может требоваться инкубация образовавшейся зараженной вирусом клеточной линии или культуры клеток при температуре 37°С. Стадия сбора может включать замораживание зараженной вирусом клеточной культуры. Лиофилизация может включать сублимацию влаги из замороженного образца зараженной вирусом клеточной культуры.

Для получения ослабленного вируса PRRS типа II можно использовать также модификацию вируса и для этой цели можно применять направленную мутацию нуклеотидной последовательности штамма вируса с помощью пригодных методов генной инженерии. Указанные методы можно применять для создания полноразмерной нуклеотидной копии вирусного генома, который может быть модифицирован с помощью методов рекомбинации нуклеиновых кислот и манипуляции ими. В таких методах можно применять сайтнаправленный мутагенез. Затем можно модифицировать антигенные центры или ферментативные свойства вирусных белков.

Изобретение относится также к набору, предназначенному для осуществления любого из вышеуказанных методов. Набор может включать контейнер, иммуногенную композицию, предпочтительно содержащую ослабленный вирус PRRS типа II, фармацевтически приемлемый носитель, адъювант и инструкции по введению иммуногенной композиции животному, которое нуждается в этом, с целью снижения коэффициента заболеваемости или серьезности клинических симптомов или воздействий заражения PRRS и предпочтительно отличающихся высокой температурой форм PRRS или НР-PRRS. Набор может содержать также средства для осуществления инъекции и/или средства для других форм введения. Набор может содержать также растворитель. Вакцину на основе ослабленного вируса можно сушить вымораживанием и ее можно восстанавливать с помощью растворителя, получая раствор, предназначенный для инъекции и/или ингаляции. Растворитель может представлять собой воду, физиологический раствор, буфер или раствор адъюванта. Набор может включать различные контейнеры для ослабленного вируса, растворителя и/или фармацевтически приемлемого носителя. Инструкции могут представлять собой листовку и/или этикету, прикрепленную к одному или нескольким контейнерам.

Краткое описание чертежей

На чертежах показано:

на фиг.1 - схема, согласно которой осуществляли балльную оценку состояния легких и определяли процент площади легкого, имеющей видимые невооруженным глазом признаки пневмонии;

на фиг.2 - график, на котором представлено сравнение ректальной температуры свиней в вакцинированных и невакцинированных группах;

на фиг.3 - график, на котором представлено сравнение средних значений соотношения S/P для свиней в вакцинированных и невакцинированных группах; среднее значение S/P, определенное методом ELISA, применяли в качестве критерия серологического ответа соответствующей группе на PRRSV;

на фиг.4 - график, на котором продемонстрировано сравнение групповых средних клинических баллов у свиней в вакцинированных и невакцинированных группах при регистрации баллов респираторного заболевания у свиней в вакцинированных и невакцинированных группах;

на фиг.5 - график, на котором продемонстрировано сравнение среднего суточного прироста массы (тела) (ADG) свиней в вакцинированных и невакцинированных группах;

на фиг.6 - график, на котором продемонстрирован суммарный процент PRRSV-позитивной по данным ОТ-ПЦР сыворотки у вакцинированных MLV свиней и невакцинированных/подвергнутых контрольному заражению свиней.

Подробное описание изобретения

Определения

Применяемая в контексте настоящего описания терминология дана только с целью описания конкретных вариантов осуществления изобретения и не направлена на ограничение его объема. В настоящем описании и в прилагаемой формуле изобретения упоминание понятия в единственном числе подразумевает также его употребление во множественном числе, если из контекста ясно не следует иное.

При указании численных диапазонов подразумевается, что каждое находящиеся внутри диапазона численное значение характеризуется той же самой степенью точности. Например, под диапазон значений 6-9 подпадают помимо 6 и 9 численные значения 7 и 8, и очевидно, что под диапазон значений 6,0-7,0 подпадают численные значения 6,0, 6,1, 6,2, 6,3, 6,4, 6,5, 6,6, 6,7, 6,8, 6,9 и 7,0.

В контексте настоящего описания понятие «ослабленный вирус» может означать авирулентный вирус, который не вызывает клинических симптомов заболевания PRRS, но обладает способностью индуцировать иммунный ответ у изучаемого млекопитающего, и оно может означать также, что клинические симптомы снижены по частоте или серьезности у животных, зараженных ослабленным вирусом, по сравнению с «контрольной группой животных», зараженных неослабленным вирусом PRRS и не подвергнутых воздействию ослабленн