Новые цитокины птиц и кодирующие их генетические последовательности

Новые цитокины птиц и кодирующие их генетические последовательности

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Область техники, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение, в общем, касается новых рекомбинантных полипептидов, обладающих свойствами цитокинов птиц, и кодирующих их генетические последовательности. В частности, настоящее изобретение касается рекомбинантных полипептидов интерферона III типа птиц и кодирующих их генетических последовательностей, вместе с клеточными системами для их экспрессии и применения. Более конкретно, настоящее изобретение касается λ-интерферона (IFN-λ) птиц и его функциональных производных, гомологов и фрагментов, а также способов их применения. Молекулы и клетки настоящего изобретения полезны в широком круге применений, в том числе в обеспечении средства для лечения и профилактики заболеваний, в частности заболеваний птиц, или в качестве модулятора иммунитета. Также предусмотрены диагностические средства для скрининга иммунного ответа и средства скрининга для идентификации модуляторов функциональности белка или нуклеиновой кислоты IFN-λ.

Уровень техники

Библиографические детали публикаций, ссылки на которые приводятся по авторам в настоящем описании, собраны в алфавитном порядке в конце описания.

Ссылка в настоящем описании на любую предшествующую публикацию (либо полученную из нее информацию) или на то, что уже известно, не является и не должна восприниматься как признание или подтверждение или иное предположение того, что предшествующая публикация (либо полученная из нее информация) или известный факт составляет часть общеизвестных сведений в той области техники, к которой относится настоящее описание.

Все возрастающее совершенствование технологии рекомбинантной ДНК сильно облегчает исследования в области медицины и ветеринарии. Особое значение имеет исследование цитокинов, в особенности потому, что эти молекулы регулируют пролиферацию, дифференцировку и функционирование широкого круга клеток, как-то клеток, участвующих в реализации иммунитета. Введение рекомбинантных цитокинов или регулирование функции и/или синтеза цитокинов все больше становится темой медицинских исследований при лечении ряда заболеваний у человека и животных.

Интерфероны (IFNs) составляют группу цитокинов, вызывающих разнообразные клеточные эффекты у позвоночных путем регулирования сотен генов, известных как IFN-стимулируемые гены (ISG). Интерфероны проявляют множественные функции, включая модулирование клеточного цикла роста и запуск и регуляцию воспалительных реакций, которые в большой степени определяют общий иммунный ответ. Одним из наиболее признанных свойств IFNs является их способность вызывать устойчивость клеток к вирусам (Hwang et al., 1995, PNAS).

Интерфероны позвоночных состоят из трех типов, которые классифицируют по их молекулярной структуре, специфичности к рецепторам и тем путям, которые они индуцируют (Smith et al., 2005; Theophilopoulos et al., 2005).

Интерфероны I типа включают IFN-α, у которого есть множественные представители в геномах позвоночных (Meager, 2002), и IFN-β, который обычно представлен одним единственным геном (Schultz et al., 2004). Интерфероны I типа активируются при появлении многих вирусов (Jacobs and Langland 1996; Majde 2000), а после активации взаимодействуют со своим рецептором - рецептором IFN-α/β (IFNα/βR) и индуцируют одну подгруппу ISG, что вызывает IFN-специфичную антивирусную защиту (de Veer et al., 2001; Takaoka and Yanai 2006). Терапевтическое применение IFN I типа оказалось успешным при защите млекопитающих от вирусов, включая вирусы гриппа (Beilharz et al., 2007; Koemer et al., 2007), гепатита С (Marcello et al., 2006) и несколько других вирусов (Kotenko et al., 2003; Sheppard et al., 2003; Meager et al., 2005).

Интерфероны II типа состоят из единственного представителя - IFN-y (Schroder et al., 2004). IFN-γ активирует антивирусную активность и клеточный иммунитет через рецептор IFN-γ (IFNγR) (Kamijo et al., 1994; Schroder et al., 2004). Этот IFN также проявляет антивирусную активность, включая защиту от вируса ящура (PMD) (Moraes et al., 2007), вируса полиомы (Abend et al., 2007) и других вирусов (Chesler et al., 2003), а также он применялся как лечебное средство против ряда патогенов (Schroder et al., 2004).

Недавно у млекопитающих было описано третье семейство IFN - Интерфероны III типа, из которых сейчас известно три подтипа, а именно IFN-λ1 (также известен как IL29), IFN-λ2 (также известен как IL28A) и IFN-λ3 (также известен как IL28B) (Sheppard et al., 2003). Представители IFN-λ у млекопитающих взаимодействуют с особым рецепторным комплексом, состоящим из рецептора-1 IFN-λ (IFNλR1) и β-рецептора IL10 (IL10Rβ) (Donnely et al., 2004). Эти субъединичные рецепторы подвергаются димеризации при связывании лиганда, вызывая фосфорилирование передатчика сигналов и активатора факторов трансрипции (STAT) (Kotenko et al., 2003; Donnely et al., 2004), что приводит к активации специфичного к IFN-λ набора генов (Ank et al., 2006; Marcello et al., 2006). Несмотря на его IL10-подобный сигнальный комплекс (Sheppard et al., 2003; Donnely et al., 2004), IFN-λ млекопитающих проявляет антивирусные свойства, близкие к IFN I типа (Meager et al., 2005). Поэтому возможно, что IFN-λ, индуцирует подгруппу близких к IFN I типа генов через альтернативный рецепторный комплекс (Marcello et al., 2006).

Некоторые исследования IFN-λ человека (huIFN-λ) показали, что IFN-λ способен ингибировать вирусы. Так, было показано, что huIFN-λII ингибирует вирус гепатита С в культуре клеток млекопитающих (Robek et al., 2005; Marcello et al., 2006). Эта защита была сравнима с IFN I типа, но каждый IFN индуцировал отдельную подгруппу генов (Marcello et al., 2006). Таким образом, защита от вирусов может запускаться из различных наборов стимулируемых генов (Rio et al., 1998; Stohr and Esveld, 2004; Meager et al., 2005; Annibali et al., 2007). Кроме того, сравнение антивирусных свойств IFN-λ и IFN I типа показало, что оба типа IFN способны ингибировать EMCV. Однако эти эффекты сильно отличались по величине (Meager et al., 2005). Аналогичные результаты наблюдались в исследованиях на VSV (Kotenko et al., 2003). Это означает, что реагирующий на IFN-λ путь может быть нужен для специфической функциональной роли при некоторых вирусных инфекциях.

Недавно высказывалась большая озабоченность по поводу вирусов домашних птиц при наблюдавшихся вспышках птичьего гриппа, которые могут быстро распространяться и вызывать большую смертность, как у домашних птиц, так и у людей (Stohr and Esveld, 2004). Трудная задача укрощения вызывающих проблемы вирусов у домашних птиц в сочетании с тем, что при терапии с помощью IFN I типа и II типа могут наблюдаться иммунотоксические эффекты (Kotenko et al., 2003; Stohr and Esveld, 2004; Meager et al., 2005), требует проведения исследований для новых и альтернативных антивирусных стратегий. Соответственно, существует потребность в улучшении контроля за вирусами домашних птиц, что могло бы оказать пользу птицеводству, а также уменьшить риск переноса этих вирусов на человека (Chen et al., 2007). Более того, в свете большого значения птицеводства для экономики и поставок продуктов по всему миру решающее значение имеет разработка новых средств регулирования и улучшения иммуномодуляции.

В работе, приведшей к настоящему изобретению, был выделен и просеквенирован IFN-λ курицы (в дальнейшем именуется "chIFNλ"). Были получены и экспрессированы в трансформированных клетках рекомбинантные генетические конструкции, включающие выделенную молекулу нуклеиновой кислоты по настоящему изобретению, тем самым, позволяя выделение и секвенирование chIFNλ. Эти результаты теперь дают возможность альтернативной терапии с помощью IFN.

Раскрытие изобретения

По всему описанию и последующей формуле изобретения, если по контексту не требуется иначе, подразумевается, что слово "включать" или такие варианты, как "включает" или "включающий", означает включение указанного элемента или числа либо группы элементов или чисел, но не исключение какого-либо иного элемента или числа либо группы элементов или чисел.

По всему описанию и последующей формуле изобретения, если по контексту не требуется иначе, подразумевается, что слово "включать" и такие варианты, как "включает" и "включающий", означает включение указанного числа или стадии либо группы чисел или стадий, но не исключение какого-либо иного числа или стадии либо группы чисел или стадий.

В настоящем изобретении термин "происходит из" служит для обозначения того, что определенное число или группа чисел происходит из указанного вида, но необязательно была получена непосредственно из указанного источника. Более того, в настоящем изобретении формы единственного числа охватывают и множественное число, если по контексту явно не требуется иное.

Если не указано иначе, все технические и научные термины, используемые в настоящем изобретении, имеют такое же значение, как это обычно понимается рядовыми специалистами в той области, к которой относится изобретение.

Настоящая заявка содержит информацию об аминокислотных и нуклеотидных последовательностях, полученную с помощью программы Patentin версии 3.1, которая приведена после библиографии. Каждая аминокислотная и нуклеотидная последовательность в перечне последовательностей идентифицирована с помощью цифрового идентификатора <210>, после которого идет идентификатор последовательности (напр., <210>1, <210>2 и т.д.). Для каждой последовательности указаны длина, тип последовательности (аминокислотная, ДНК и т.п.) и исходный организм с помощью информации, приведенной в полях цифровых идентификаторов <211>, <212> и <213>, соответственно. Приведенные в описании аминокислотные и нуклеотидные последовательности идентифицированы с помощью указателя SEQ ID NO:с последующим идентификатором последовательности (напр., SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2 и т.д.). Приведенный в описании идентификатор последовательности соотносится с информацией, представленной в поле цифрового идентификатора<400>в перечне последовательностей, после которого идет идентификатор последовательности (напр., <400>1, <400>2 и т.д.). Таким образом, приведенная в описании SEQ ID NO:1 соответствует последовательности, указанной как <400>1 в перечне последовательностей.

Однобуквенные и трехбуквенные сокращения, используемые по всему описанию, приведены в табл.1.

Один из аспектов настоящего изобретения касается молекулы нуклеиновой кислоты, которая кодирует или комплементарна молекуле нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид цитокина птиц либо его функциональный фрагмент или производное, причем данный полипептид представляет собой интерферон III типа.

В другом аспекте настоящего изобретения предусмотрена молекула нуклеиновой кислоты либо ее функциональный фрагмент или производное, которые кодируют или комплементарны молекуле нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид цитокина птиц либо его функциональный фрагмент или производное, причем данный полипептид представляет собой интерферон III типа, а вид птицы выбирается из списка, включающего кур, уток, гусей, индеек, бентамок, перепелов и цесарок.

В следующем аспекте данный полипептид интерферона III типа представляет собой полипептид IFN-λ курицы (chIFNλ) или слитую молекулу, включающую его самого либо его функциональный фрагмент, производное или птичий гомолог.

В следующем аспекте предусмотрена молекула нуклеиновой кислоты либо ее функциональный фрагмент или производное, которые кодируют или комплементарны молекуле нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид IFN-λ курицы либо его функциональный фрагмент или производное.

Следующий аспект настоящего изобретения касается выделенной нуклеиновой кислоты, выбранной из списка, состоящего из:

(i) выделенной молекулы нуклеиновой кислоты либо ее функционального фрагмента, производного или птичьего гомолога, включающих нуклеотидную последовательность, кодирующую или комплементарную последовательности, кодирующей аминокислотную последовательность, практически такую же, как приведенная в SEQ ID NO:2 или 4, либо ее функциональное производное, фрагмент или птичий гомолог, либо аминокислотную последовательность, по меньшей мере, на 50%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или больше идентичную SEQ ID NO:2 или 4 по всей длине последовательности, либо последовательность нуклеиновой кислоты, способной гибридизироваться с данной молекулой нуклеиновой кислоты в условиях низкой строгости;

(ii) выделенной молекулы нуклеиновой кислоты либо ее функционального фрагмента, производного или птичьего гомолога, включающих нуклеотидную последовательность или комплементарную данной последовательности, причем данная нуклеотидная последовательность практически такая же, как приведенная в SEQ ID NO:1 или 3, либо нуклеотидную последовательность, по меньшей мере, на 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или больше идентичную SEQ ID NO:1 или 3 по всей длине последовательности, либо нуклеотидную последовательность, способную гибридизироваться с SEQ ID NO:1 или 3 или с комплементарной ей в условиях низкой строгости;

(iii) выделенной молекулы нуклеиновой кислоты либо ее функционального фрагмента, производного или птичьего гомолога, включающих нуклеотидную последовательность, приведенную в SEQ ID NO:1 или 3.

В следующем аспекте настоящего изобретения предусмотрен полипептид интерферона III типа птиц либо его функциональный фрагмент или производное.

Следующий аспект настоящего изобретения касается выделенного белка, приведенного в SEQ ID NO:2 или 4 либо, по меньшей мере, на 60%, 65%, 75%, 80% или больше идентичного SEQ ID NO:2 или 4 по всей длине последовательности, либо его функционального производного, фрагмента или птичьего гомолога.

Следующий аспект настоящего изобретения касается выделенного белка, кодируемого нуклеотидной последовательностью, приведенной в SEQ ID NO:1 или 3, или последовательностью, комплементарной последовательности, способной гибридизироваться с SEQ ID NO:1 или 3 в условиях низкой строгости и кодирующей аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO:2 или 4 либо, по меньшей мере, на 60%, 65%, 70%, 75%, 80% или больше идентичную SEQ ID NO:2 или 4 по всей длине последовательности.

В следующем аспекте изобретения предусмотрен способ получения рекомбинантных молекул интерферона III типа птиц в клетках, который включает экспрессирование в данных клетках молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей или комплементарной молекуле нуклеиновой кислоты, кодирующей данный интерферон III типа птиц.

В следующем аспекте изобретения предусмотрены выделенные клетки, которые экспрессируют эндогенный или рекомбинантный интерферон III типа птиц либо его функциональный фрагмент, производное или гомолог.

В связанном с этим аспекте настоящего изобретения предусмотрен способ получения рекомбинантного интерферона III типа птиц в клетках, который включает стадии:

(i) введения в данные клетки генетической конструкции, включающей молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующей или комплементарной молекуле нуклеиновой кислоты, кодирующей данный интерферон III типа птиц, которая поставлена под контроль соответствующей последовательности промотора;

(ii) культивирования данных клеток в течение времени и в условиях, достаточных для экспрессирования данной молекулы нуклеиновой кислоты; и

(iii) выделения данного продукта экспрессии.

В следующем аспекте настоящего изобретения предусмотрен и способ получения слитой молекулы интерферона III типа птиц в клетках, который включает введение в данные клетки генетической конструкции, включающей молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующей или комплементарной молекуле нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид интерферона III типа птиц либо его функциональный фрагмент, производное или птичий гомолог, причем данный полипептид представляет собой слитый полипептид между первым интерфероном III типа и вторым интерфероном III типа либо первым интерфероном III типа и вторым интерфероном I типа или II типа, выбранным из списка, включающего, среди прочего, IFN-α, IFN-β, IFN-γ, chIFN-α, chIFN-β, chIFN-γ.

В следующем аспекте настоящего изобретения предусмотрен и рекомбинантный слитый полипептид между первым интерфероном III типа и вторым интерфероном III типа либо первым интерфероном III типа и вторым интерфероном I типа или II типа, выбранным из списка, включающего, среди прочего, IFN-α, IFN-β, IFN-γ, chIFN-α, chIFN-β, chIFN-γ.

В следующем аспекте настоящего изобретения предусмотрена генетическая конструкция, включающая молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую или комплементарную молекуле нуклеиновой кислоты, кодирующей слитый полипептид интерферона III типа птиц либо его функциональный фрагмент или производное, причем данный полипептид представляет собой слитый полипептид между интерфероном III типа и вторым интерфероном III типа либо первым интерфероном III типа и вторым интерфероном I типа или II типа, выбранным из списка, включающего, среди прочего, IFN-α, IFN-β, IFN-γ, chIFN-α, chIFN-β, chIFN-γ.

В следующем аспекте настоящего изобретения предусмотрен способ идентификации генетической последовательности интерферона III типа птиц либо его функционального фрагмента или производного.

В следующем аспекте настоящего изобретения предусмотрен способ детектирования присутствия полипептида интерферона III типа птиц либо его функционального фрагмента, производного или гомолога.

В следующем аспекте настоящего изобретения предусмотрен способ лечения или профилактики птиц, который включает введение данным птицам эффективного количества полипептида интерферона III типа птиц либо его функционального фрагмента, производного или гомолога в течение времени и в условиях, достаточных для поддержания, стимуляции или усиления иммунореактивности данных птиц.

В следующем аспекте настоящего изобретения предусмотрен способ лечения или профилактики птиц, подвергавшихся воздействию или зараженных патогенным организмом, который включает введение данным птицам эффективного количества полипептида интерферона III типа птиц либо его функционального фрагмента, производного или гомолога.

Следующий аспект настоящего изобретения касается полипептида интерферона III типа птиц для применения при лечении или профилактике птиц.

Следующий аспект настоящего изобретения касается применения полипептида интерферона III типа птиц при производстве медикамента для модулирования иммунного ответа у птиц и/или для лечения или профилактики птиц.

В следующем аспекте настоящего изобретения предусмотрен адъювант, включающий молекулу цитокина птиц, причем данный цитокин представляет собой интерферон III типа либо слитую молекулу между молекулой интерферона III типа и второй молекулой цитокина, а также, необязательно, фармацевтически приемлемый носитель, наполнитель или разбавитель.

Следующий аспект настоящего изобретения касается ветеринарной фармацевтической композиции, включающей эффективное иммуномодулирующее количество интерферона III типа птиц либо слитой молекулы между интерфероном III типа птиц и вторым цитокином либо генетической последовательности, способной экспрессировать его же, а также один или несколько носителей и/или разбавителей, пригодных для ветеринарного применения.

Таблица 1.
Однобуквенные и трехбуквенные обозначения аминокислот
Аминокислота	Трехбуквенное сокращение	Однобуквенное обозначение
Аланин	Ala	A
Аргинин	Arg	R
Аспарагин	Asn	N
Аспарагиновая кислота	Asp	D
Цистеин	Cys	С
Глутамин	Gln	Q
Глутаминовая кислота	Glu	E
Глицин	Gly	G
Гистидин	His	H
Изолейцин	Ile	I
Лейцин	Leu	L
Лизин	Lys	К
Метионин	Met	M
Фенилаланин	Phe	F
Пролин	Pro	P
Серии	Ser	S
Треонин	The	Т
Триптофан	Trp	w
Тирозин	Tyr	Y
Валин	Val	v
Любой остаток	Хаа	x

Краткое описание фигур

На фиг.1 представлен анализ экспрессии транскриптов chIFN методом ОТ-ПЦР в спленоцитах курицы, обработанных поли(I:С) (50 мкг/мл) в течение 2 ч. ChIFN-α, -β или -γ подвергали амплификации с помощью IFN-специфичных праймеров для секвенирования и разгоняли в 1% агарозном геле. В качестве отрицательного контроля использовали воду. В качестве внутреннего контроля использовали экспрессию GAPDH.

На фиг.2 схематически представлено совмещение выведенных аминокислотных последовательностей chIFN-λ и IFN-λII из различных видов позвоночных, созданное с помощью программы ClustalW (BioManage). Предполагаемую последовательность белка chIFN-λ совмещали с hulFN-λII (номер доступа NM_172138), mIFN-XII (номер доступа AY869695) и IFN-λ рыб (номер доступа АВ093588). Идентичные аминокислотные остатки отмечены звездочкой (*), а консервативные и полуконсервативные остатки - значками (:) и (.), соответственно. Черточкой обозначены пробелы, введенные в последовательность для оптимизации совмещения. Были идентифицированы сигнальные пептиды, которые представлены в рамках, однако для IFN-λ. рыб не было предсказано сигнального пептида.

На фиг.3 схематически представлена нуклеотидная последовательность chIFN-λ, и ожидаемая трансляция аминокислот. Подвергали анализу последовательность ORF chIFN-λ и представили ожидаемую трансляцию аминокислот. Предполагаемый сигнальный пептид подчеркнут, а сайты сплайсинга интронов указаны стрелками.

На фиг.4 схематически представлено бескорневое филогенетическое древо, показывающее взаимные отношения аминокислотных последовательностей chIFN-λ, некоторых IFN-λ других позвоночных и отдельных других цитокинов курицы с использованием полной кодирующей последовательности. Номер доступа Genebank для каждого гена приведен в табл.4.

На фиг.5 представлен анализ экспрессированных в Е.coli рекомбинантных IFN методом SDS-PAGE. Экспрессированные в Е.coli рекомбинантные белки chIFN-α, chIFN-β и chIFN-λ очищали методом металлоаффинной хроматографии Ni-NTA после индукции с помощью IPTG. Затем эти рекомбинантные белки разгоняли в 12% SDS-PAGE и анализировали по окрашиванию Coomassie Brilliant Blue. Для сравнения включали маркеры широкого диапазона молекулярных весов (Markers).

На фиг.6 представлен график стимулируемой IFN курицы продукции нитрита. Макрофагоподобные клетки HD11 курицы культивировали в присутствии chIFN-λ и chIFN-β в течение 24 ч, а затем тестировали супернатант на наличие индуцированной продукции нитрита. Представлены средние значения из каждого опыта, проводившегося в трех повторах. Приведены результаты из 2 независимых опытов.

На фиг.7 представлен график, показывающий защиту от SFV в клетках СЕР после обработки IFN. Клетки CEF культивировали с различными chIFN в течение 18 ч, а затем инфицировали SFV. Затем измеряли цитолиз по окрашиванию нейтральным красным и измерению поглощения (OD₅₄₀) через 24 ч после инфицирования. Представлены средние значения из каждого опыта, проводившегося в трех повторах. Приведены результаты из 2 независимых опытов.

На фиг.8 представлен график, показывающий снижение вируса гриппа в куриных макрофагах HD11 после предварительной обработки IFN. Клетки HD11 обрабатывали chIFN-α, chIFN-β, chIFN-λ, или только средой в течение 6 ч, а затем инфицировали гриппом (PR8). Через различные промежутки времени после инфицирования измеряли титр вируса методом НА. Представлены средние значения из каждого опыта, проводившегося в четырех повторах. Приведены результаты из 2 независимых опытов.

На фиг.9 представлен график, показывающий индуцирование поли(1:С) экспрессии мРНК IFN. Клетки мононуклеаров селезенки курицы культивировали в присутствии 30 мкг/мл поли(I:С) в течение 2 и 4 ч. После этого клетки собирали и измеряли уровень мРНК chIFN-α, chIFN-β и chIFN-λ методом кОТ-ПЦР. Данные представляют экспрессию различных IFN относительно нестимулированных контролей. Представлены средние значения, а планки погрешностей означают SE. Опыты проводились в трех повторах, приведены результаты из 2 независимых опытов.

На фиг.10 представлен график, показывающий индуцирование IFN экспрессии мРНК TLR3. Клетки мононуклеаров селезенки курицы культивировали в присутствии chIFN-α, chIFN-β и chIFN-λ в различных концентрациях в течение 3 ч, а затем измеряли уровень мРНК TLR3 методом кОТ-ПЦР. В качестве "бытового" гена для стандартизации результатов использовали GAPDH. Представлена экспрессия относительно нестимулированных контролей. Представлены средние значения, а планки погрешностей означают SE. Опыты проводились в трех повторах, приведены результаты из 2 независимых опытов.

На фиг.11 представлен график, показывающий, что IFN-λ индуцируется при заражении H5N1 (птичьим гриппом). Цитокин IFN-λ измеряли методом кОТ-ПЦР в легких, селезенке и мозге курицы до и после инфицирования H5N1 (V1203). Данные представляют изменения по сравнению с неинфицированными контрольными птицами. Данные представлены средними значениями (n=7), а планки погрешностей означают SE.

На фиг.12 представлен график, показывающий, что IFN-X защищает от заражения гриппом и до, и после инфицирования. Клетки HD11 обрабатывали chIFN-α, -β и -λ, в трех концентрациях либо до (В), либо после (А) заражения вирусом гриппа (PR8). Столбиками показан относительный уровень вируса при измерении методом НА через 24, 40, 48, 60 и 72 часа. Вирус не обнаруживался через 24 и 40 часов. В каждой точке брали по несколько образцов.

На фиг.13 представлен график, показывающий ингибирование активности IFN-λ антителами против IFN-λ. Антитела против chIFN-λ при введении in ovo вместе с вирусом гриппа повышали титр вируса гриппа при определении методом НА. Данные представлены средними значениями из вплоть до 7 опытов ±SE. Статистическая значимость представлена звездочками: одна звездочка (*): р 0,05, две звездочки (**): р 0,005, три звездочки (***): р=0,001.

На фиг.14 представлен график, показывающий, что IFN-λ повышает выработку антител после иммунизации. Свободных от специфических патогенов (SPF) цыплят (n=7) вакцинировали внутрибрюшинно с помощью 0,2 мл осажденных эритроцитов овцы (SRBC) в присутствии или в отсутствие цитокинов. Птиц повторно иммунизировали с помощью одних лишь SRBC на 15-й день после иммунизации. У всех птиц брали кровь каждую неделю и измеряли титры НА. Титры антител в сыворотке, которые определяли методом полной агглютинации, выражали в виде среднего значения для каждой группы.

На фиг.15 представлен график, показывающий, что rchIFN-λ ингибирует вызванную Con А пролиферацию спленоцитов. Спленоциты культивировали в присутствии серийных разведении экспрессированных в Е.coli rchIFN-α, -β и -λ и субоптимальной концентрации Con A (5 мкг/мл) в течение 48 ч. Затем добавляли [³H]-тимидин и культивировали клетки еще 24 ч. Для определения пролиферации клеток измеряли радиоактивность, которую выражали в виде среднего значения ±SE из четырех повторов. Клетки, обработанные одним лишь Con А, представлены средним значением из четырех повторов.

Осуществление изобретения

Настоящее изобретение основывается, отчасти, на выделении и секвенировании молекул нуклеиновой кислоты, соответствующей гену нового интерферона III типа птиц, более точно гена IFN-X, курицы. Этот факт обеспечивает новые молекулы белков и нуклеиновых кислот для применения, среди прочего, в иммуномодуляции. В обработанных вирусом клетках наблюдается защита от вызванного вирусом цитолиза при культивировании клеток в присутствии продукта экспрессии гена IFN-λ курицы. Соответственно, идентификация этого нового гена цитокина птиц особенно способствовала разработке препаратов и способов для применения при лечении, профилактике и диагностике/мониторинге, среди прочего, заболеваний птиц, связанных с воздействием или заражением патогенным организмом.

Соответственно, один из аспектов настоящего изобретения касается молекулы нуклеиновой кислоты, которая кодирует или комплементарна молекуле нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид цитокина птиц либо его функциональный фрагмент или производное, причем данный полипептид представляет собой интерферон III типа.

Термин "птичий" служит для обозначения представителей класса позвоночных, которых обычно именуют птицами. Следует иметь в виду, что в настоящем изобретении термин "птичий" охватывает оба пола и все онтогенетические стадии домашних птиц, комнатных птиц и охотничье-промысловых птиц, выбранных из списка, включающего кур, индеек, бентамок, перепелов, цесарок, уток, гусей, страусов, эму, голубей, канареек, волнистых попугайчиков, попугаев и зябликов, среди прочего.

В настоящем изобретении термин "полипептид цитокина" служит для обозначения молекулы полипептида, составляющего, по меньшей мере, одну субъединицу биологически активного белка, который обладает одним или несколькими характерными биологическими признаками интерферона III типа, в частности способностью к модулированию функциональных возможностей иммунных клеток птиц, как-то лимфоцитов (В- или Т-клеток), гранулоцитов (эозинофилов, базофилов или нейтрофилов) либо других неспецифических иммунных клеток (напр., макрофагов, моноцитов, NK-клеток и др.).

Не ограничивая настоящее изобретение какой-либо одной теорией или механизмом действия, было установлено, что интерфероны III типа проявляют биологические свойства, похожие на свойства интерферона I типа. Соответственно, ссылки на биологическую активность интерферона III типа следует понимать как включающие и антивирусное, и иммуномодулирующее действие, такое, к примеру, как индуцированная вирусом экспрессия, ведущая к передаче сигналов через путь киназы Janus (Jak)-STAT и активации IFN-стимулируемой регулируемой экспрессии (ISRE) генов, усилению экспрессии антигенов класса I главного комплекса гистосовместимости (МНС) и защите от цитопатических эффектов, вызванных вирусной инфекцией.

Соответственно, другой аспект настоящего изобретения предусматривает молекулу нуклеиновой кислоты либо ее функциональный фрагмент или производное, которые кодируют или комплементарны молекуле нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид цитокина птиц либо его функциональный фрагмент или производное, причем данный полипептид представляет собой интерферон III типа, а вид птицы - курица, индейка, бентамка, перепел, цесарка, утка, гусь, страус, эму, голубь, канарейка, волнистый попугайчик, попугай или зяблик.

Наиболее предпочтительно молекула нуклеиновой кислоты по настоящему изобретению происходит из курицы.

Не ограничивая настоящее изобретение какой-либо одной теорией или механизмом действия, а также как изложено в настоящем изобретении, интерфероны относятся к трем семействам, исходя из молекулярной структуры, типа рецепторов и тех функциональных путей, которые они индуцируют. Это семейства IFN I, IFN II и IFN III. Интерфероны III типа охватывают группу лямбда-IFN (IFN-λ), в которой у млекопитающих имеется три подтипа: IFN-λ1 (IL29), IFN-λ2 (IL28A) и IFN-λ3 (IL28B). Хотя группа IFN-λ у курицы как будто содержит лишь одного представителя, следует иметь в виду, что ссылки на IFN-λ птиц охватывают ссылки на все формы этих молекул и на их функциональные фрагменты, производные и птичьи гомологи, включая изомерные формы, которые могут возникать при альтернативном сплайсинге мРНК IFN-λ, полиморфные формы, аллельные формы и на формы, существующие в виде димеров, мультимеров и слитых белков.

Не ограничивая настоящее изобретение какой-либо одной теорией или механизмом действия, ген IFN-λ предпочтительно содержит 5 экзонных участков на хромосоме 7, которые кодируют полипептид из 186 аминокислот с молекулярным весом 21 кДа, который только на 36% идентичен huIFN-λII на уровне нуклеотидов. Продукт экспрессии гена IFN-λ, предпочтительно проявляет антивирусное и иммуномодулирующее действие, как описано выше.

В предпочтительном воплощении данный полипептид интерферона III типа представляет собой полипептид IFN-λ курицы (chIFN-λ) или слитую молекулу, содержащую его самого или его функциональный фрагмент, производное или птичий гомолог.

В соответствии с этим предпочтительным воплощением предусмотрена молекула нуклеиновой кислоты либо ее функциональный фрагмент или производное, которые кодируют или комплементарны молекуле нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид IFN-λ курицы либо его функциональный фрагмент, птичий гомолог или производное.

Следующий аспект настоящего изобретения касается выделенной нуклеиновой кислоты, выбранной из списка, состоящего из:

(i) выделенной молекулы нуклеиновой кислоты либо ее функционального фрагмента, производного или птичьего гомолога, включающих нуклеотидную последовательность, кодирующую или комплементарную последовательности, кодирующей аминокислотную последовательность, практически такую же, как приведенная в SEQ ID NO:2 или 4, либо ее функциональное производное, фрагмент или птичий гомолог, либо аминокислотную последовательность, по меньшей мере, на 50%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или больше идентичную SEQ ID NO:2 или 4 по всей длине последовательности, либо последовательность нуклеиновой кислоты, способной гибридизироваться с данной молекулой нуклеиновой кислоты в условиях низкой строгости;

(ii) выделенной молекулы нуклеиновой кислоты либо ее функционального фрагмента, производного или птичьего гомолога, включающих нуклеотидную последовательность или комплементарную данной последовательности, причем данная нуклеотидная последовательность практически такая же, как приведенная в SEQ ID NO:1 или 3, либо нуклеотидную последовательность, по меньшей мере, на 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или больше идентичную по всей длине последовательности, либо нуклеотидную последовательность, способную гибридизироваться с SEQ ID NO:1 или 3 или с комплементарной ей в условиях низкой строгости;

(iii) выделенной молекулы нуклеиновой кислоты либо ее функционального производного, фрагмента или птичьего гомолога, включающих нуклеотидную последовательность, приведенную в SEQ ID NO:1 или 3, либо функциональный фрагмент данной молекулы.

Предусматривается, что настоящее изобретение распространяется и на геномную форму ДНК нуклеотидных последовательностей кДНК, приведенных выше. При этом SEQ ID NO:1 соответствует кДНК chIFN-λ, включая последовательность, кодирующую сигнальный пептид. SEQ ID NO:3 соответствует последовательности кДНК, кодирующей открытую рамку считывания зрелого белка chIFN-λ, т.е. белка без сигнального пептида. SEQ ID NO:2 соответствует белку chIFN-λ, содержащему сигнальный пептид, a SEQ ID NO:4 соответствует белку chIFN-λ, не содержащему сигнального пептида.

Ссылки на геномные формы и кДНК chIFN-λ, следует понимать в самом широком смысле, включающем:

(i) классический геномный ген, состоящий из регулирующих транскрипцию и/или трансляцию последовательностей и/или кодирующей области и/или не подлежащих трансляции последовательностей (т.е. интронов, 5'- и 3'-нетранслируемых последовательностей);

(ii) мРНК или кДНК, соответствующую кодирующим участкам (т.е. экзонам), необязательно содержащую 5'- или 3'-нетранслируемые последовательности гена; и/или

(iii) мРНК или кДНК, соответствующую кодирующей области без или вместе с последовательностями, связанными с такими формами предшественников белка, как сигнальные последовательности, и необязательно 5'- или 3'-нетранслируемыми последовательностями.

Как описано выше, chIFN-λ соответствует молекуле прежде неизвестного интерферона птиц. Предусматривается, что настоящее изобретение распространяется и на продукты экспрессии молекулы нуклеиновой кислоты, приведенной выше.

Соответственно, следующий аспект настоящего изобретения касается полипептида цитокина птиц либо его функционального фрагмента или производного, причем данный полипептид является интерфероном III типа.

Предпочтительно данный полипептид интерферона III типа представляет собой полипептид IFN-X, птиц либо его функциональный фрагмент или производное.

Более предпочтительно данный полипептид IFN-λ представляет собой chIFN-λ.

Следующий аспект настоящего изобретения касается выделенного белка, приведенного в SEQ ID NO:2 или 4 либо, по меньшей мере, на 60%, 65%, 75%, 80% или больше идентичного SEQ ID NO:2 или 4 по всей длине последовательности, либо его функционального производного, фрагмента или птичьего гомолога.

Предусматривается, что термин "белок" охватывает пептиды, полипептиды и белки. Нужно иметь в виду, что эти термины применяются взаимозаменяемым образом. Белок может быть гликозилирован или не гликозилирован и/или может содержать ряд других молекул, слитых, присоединенных, связанных или иным образом соединенных с белком, как-то аминокислоты, липиды, углеводы либо другие пептиды, полипептиды или белки. В дальнейшем ссылки на "белок" включают и белки, содержащие последовательность аминокислот, и белки, связанные