Штамм вируса болезни ньюкасла для изучения онколитических свойств и механизмов онколизиса для создания прототипного противоопухолевого препарата

Штамм вируса болезни ньюкасла для изучения онколитических свойств и механизмов онколизиса для создания прототипного противоопухолевого препарата

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Область техники

Настоящее изобретение относится к онколитическим штаммам вируса болезни Ньюкасла и может быть использовано в вирусологии, микробиологии, ветеринарии и онкологии для изучения биологических, вирусологических и онколитических свойств с целью создания прототипного противоракового препарата.

Уровень техники

Согласно данным Всемирной Организации Здравоохранения ежегодно в мире от злокачественных новообразований умирает более пяти миллионов человек и регистрируется около трех миллионов случаев новых заболеваний. По прогнозам ежегодное число смертей от рака будет только расти и к 2030 году достигнет 13 миллионов случаев в год (WHO (World Health Organization) (World Health Statictics, 2012 - 2012. - p. 176. http://www.who.int/gho/publications/world_health_statistics/EN_WHS2012_Part2.pdf) [1].

На сегодняшний день излечиваемость онкологических заболеваний составляет всего 26%. Показатели смертности от онкологии в Новосибирской области одни из самых высоких в Сибири и превышают средний по России уровень. В динамике выявляемости и смертности населения от онкологических болезней по Новосибирску наблюдается неуклонный рост.

Разработка высокоэффективных методов лечения злокачественных новообразований остается актуальной задачей современной медицины. Несмотря на значительные достижения современных методов терапии в этой области возможности по выявлению опухолей на ранних стадиях и избирательному воздействию на них остаются крайне ограниченными.

Основным недостатком используемых в настоящее время методов химио- и радиотерапии является их низкий терапевтический индекс (ТИ). Данный показатель характеризует различие в степени воздействия соответствующего терапевтического агента на опухолевые и нормальные клетки организма (в упрощенном виде, соотношение количества убитых раковых клеток к количеству убитых нормальных клеток). Терапевтический индекс современных химиотерапевтических средств не превышает 6:1.

По принятому в международном научном сообществе мнению ТИ медикаментозных средств, направленно доставляемых бактериальными векторами, и онколитических вирусов может достигать 100000:1, что обусловлено их высокой специфичностью к опухолевым клеткам.

Идея о возможности использования вирусов для терапии опухолей возникла в первой половине 20 века. Однако датой рождения современной «виротерапии» считается 1991 г., когда в журнале "Science" были опубликованы результаты исследования онколитического потенциала генетически модифицированного вируса простого герпеса 1 типа (Martuza R.L. et al. Experimental therapy of human glioma by means of a geneticaly engineered virus mutant // Science. - 1991. - Vol. 252 (5007). - Pages. 854-856) [2]. К настоящему времени в мире, в результате проведения масштабных исследований, получен целый ряд перспективных препаратов на основе различных онколитических вирусов. Тем не менее на сегодняшний день получение таких препаратов связано со сложными манипуляциями на генетическом уровне. Не следует также забывать, что для создания имеющихся противораковых препаратов на вирусной основе были использованы вирусы млекопитающих, которые являются условно патогенными для человека и могут существенно увеличить свою патогенность в ходе эволюции или за счет спонтанного мутагенеза.

Описание аналогов

В настоящее время известно о наличии онколитической активности у вируса болезни Ньюкасла (далее - ВБН). Он способен селективно лизировать раковые клетки, оставаясь при этом безопасным для нормальных клеток тканей млекопитающих. В нескольких исследованиях была продемонстрирована способность данного вируса к специфическому онколизису. Выявлено существенное отличие в скорости репликации вируса в опухолевых и нормальных клетках млекопитающих (Zhan X. et al. Sendai virus recombinant vaccine expressing hPIV-3 HN or F elicits protective immunity and combines with a second recombinant to prevent hPIV-1, hPIV-3 and RSV infections // Vaccine. - 2008. - Vol. 26 (27-28). - Pages. 3480-3488. doi: 10.1016/j.vaccine.2008.04.022.) [3].

Существует предположение, что высокая тропность ВБН к опухолевым клеткам обусловлена нарушением синтеза белков, отвечающих за элиминацию ВБН (Elankumaran S. et al. Newcastle disease virus exerts oncolysis by both intrinsic and extrinsic caspase-dependent pathways of cell death // J Virol. - 2006. - Vol. 80 (15). - P. 7522-7534. doi: 10.1128/JVI.00241-06.) [4].

Существуют аналоги в Америке, однако информация о данных штаммах, их свойствах и возможности применения на настоящий момент не находится в открытом доступе. Тем не менее противоопухолевые препараты на основе ВБН линии PV1703 и Cassell73 проходят первую стадию клинических испытаний (Ravindra P.V. et al. Newcastle disease virus as an oncolytic agent // Indian J Med Res. - 2009. - Vol. 130(5). - Pages. 507-513) [5].

Механизм онколитического действия этого вируса остается до конца не изученным, хотя в последние годы появляются новые работы, описывающие механизмы попадания вируса в клетку (Cantin С, Holguera J., Ferreira L., Villar Ε., Munoz-Barroso I. J. Gen. Virol. 2007. Vol. 88. Pt. 2. P. 559-569) [6], индукции гибели опухолевых клеток в ответ на заражение вирусом (Fabian Ζ., Csatary СМ., Szeberenyi J., Csatary L.K. p53-independent endoplasmic reticulum stress-mediated cytotoxicity of a Newcastle disease virus strain in tumor cell lines // J. Virol. 2007. Vol. 81. N. 6. P. 2817-2830) [7], репликации ВБН (Puhlmann J., Puehler F., Mumberg D., Boukamp P., Beier R. Racl is required for oncolytic NDV replication in human cancer cells and establishes a link between tumorigenesis and sensitivity to oncolytic virus // Oncogene. 2010. Vol. 29. N. 15. P. 2205-2216) [8].

На данный момент некоторые вакцинные аттенуированные селекцией штаммы ВБН прошли несколько фаз клинических испытаний в США, Канаде, Китае и странах Европы (Германия, Венгрия). (Bai F.L., Yu Y.H., Tian Η., Ren G.P., Wang Η., Zhou В., Han X.H., Yu Q.Z., Li D.S. Genetically engineered Newcastle disease virus expressing interleukin-2 and TNF-related apoptosis-inducing ligand for cancer therapy // Cancer Biol. Ther. 2014. Vol. 15. N. 9. P. 1226-1238) [9]; (Zamarin D., Palese P. Oncolytic Newcastle disease virus for cancer therapy: old challenges and new directions // Future Microbiol. 2012. Vol. 7. N. 3. P. 347-367) [10].

Они продемонстрировали безопасность исследуемых штаммов для человека и способность подавлять развитие опухолей и продлевать жизнь опухолевых больных. С другой стороны, основываясь на высокой доклинической эффективности онколитических вирусов в отношении культур опухолевых клеток в системах in vitro и in vivo, ученые ожидают от клинических испытаний намного больше результатов.

Таким образом, получение отечественного штамма-продуцента ВБН для создания на его основе препарата, обладающего онколитической активностью, является перспективным. Актуальность этого подтверждает отсутствие в России коммерческих аналогов подобных штаммов.

Задачей изобретения является получение нового штамма вируса болезни Ньюкасла, способного избирательно лизировать раковые клетки млекопитающих, не вызывая при этом инфекционного заболевания и гибели млекопитающих для изучения онколитических свойств и механизмов онколизиса для создания прототипного противоопухолевого препарата.

Решение поставленной задачи достигается путем получения штамма вируса болезни Ньюкасла NDV/Altai/770/2011.

Техническим результатом предлагаемого изобретения является установление онколитических свойств и механизмов онколизиса полученного нового штамма NDV/Altai/pigeon/770/2011 вируса болезни Ньюкасла в условиях отказа от излишней аттенуации и использование природного типа штамма ВБН с перспективой создания прототипного противоракового препарата, применяемого в вирусологии, микробиологии, ветеринарии и онкологии.

Раскрытие изобретения

Характеристика заявляемого штамма.

Штамм NDV/Altai/pigeon/770/2011 является представителем вируса болезни Ньюкасла, род Avulavirus, семейство Paromyxoviridae. Он относится к группе штаммов голубиного парамиксовируса типа 1 (ГПМВ-1), связанных с инфицированием голубей. Штамм депонирован в Государственную коллекцию вирусов НИИ вирусологии им. Д.И.Ивановского Минздрава России под регистрационным номером 2778 (7 июля 2014 г.).

Источник получения. Изолят вируса болезни Ньюкасла изначально был выделен из клоакального смыва клинически здорового сизого голубя (Columba livid). Материал был собран осенью 2011 года в Алтайском крае, Российская Федерация. Изолят вируса болезни Ньюкасла получил название NDV/Altai/pigeon/770/2011.

Выделенный штамм прошел 3 пассажа на развивающихся куриных эмбрионах (РКЭ). Индикация вируса была проведена в реакции гемагглютинации (РГА) с эритроцитами петуха: показатель гемагглютинирующей активности составил 128 ГАЕ/50 мкл.

Идентификация вируса. Первичная идентификация изолированного вируса болезни Ньюкасла осуществлялась методом ОТ-ПЦР с детекцией результатов в закрытой пробирке в режиме реального времени с использованием праймеров и зонда, специфичных к консервативным участкам М-гена вируса болезни Ньюкасла, согласно (Miller P.J. et al. Newcastle disease: evolution of genotypes and the related diagnostic challenges // Infect. Genet. Evol. 2010. Vol. 10. N. LP. 26-35) [11].

Полногеномное секвенирование и филогенетический анализ позволили отнести штамм ВБН к II классу VIb генотипу (GenBank: KJ920204). Приложение I.

Культуральные свойства. Штамм NDV/Altai/pigeon/770/2011 при культивировании на монослое первичной культуры клеток фибробластов эмбрионов кур (ФЭК) вызывает цитопатическое действие (ЦПД) на 2-3 сутки (температура культивирования 37°C, в атмосфере 5% СО₂).

Патогенность для человека. Штаммы вируса болезни Ньюкасла не являются патогенными для человека (Cassel W.A., Garrett R.E. Newcastle disease virus as an antineoplastic agent // Cancer. - 1965. - Vol. 18. - P. 863-868) [12], Laurie S.A. et al. A phase 1 clinical study of intravenous administration of PV701, anoncolytic virus, using two-step desensitization // Clin Cancer Res. - 2006. - Vol. 12(8). - P. 2555-2562) [13].

Патогенность для птицы. Штаммы вируса болезни Ньюкасла классифицируют на лентогенные (слабопатогенные), мезогенные и велогенные (высокопатогенные) (ΟΙΕ, World Organisation for Animal Health, Manual of Diagnostic Tests and Vaccines for Terrestrial Animals, Paris, France, 7th edition, 2012, Vol. 1-2, Ch. 2.03.14. available at http://ww.oie.int/fileadmin/Home/eng/Health_standards/tahm/2.03.14_NEWCASTLE_DIS.pdf) [14]. Штамм NDV/Altai/pigeon/770/2011 относится к среднепатогенному (мезогенному) варианту вируса болезни Ньюкасла. Инфекционная активность выделенного вируса составила 7,2±0,09 lg ЭИД₅₀/мл.

Патогенность штамма устанавливали согласно стандартным методикам в тестах на определение среднего времени жизни (MDT) SPF-развивающихся куриных эмбрионов и интрацеребрального индекса патогенности суточных цыплят [14].

Среднее время жизни MDT=76 часов. Показатель индекса интрацеребральной патогенности IСРI=0,675.

Патогенность для млекопитающих. Штамм не проявляет патогенности для млекопитающих (Alexander D.J. Newcastle disease virus and other avian paramyxoviruses // Rev Sci Tech. - 2000. - Vol. 19 (2). - P. 443-462) [15].

Для длительного хранения штамм необходимо лиофилизировать с использованием в качестве защитной среды раствора желатина и сахарозы (САЖ). Лиофилизация с добавлением САЖ в соотношении 1:4 позволяет сохранить стабильную инфекционную активность вируса в течение не менее 2 лет при хранении на -70°C.

Для культивирования штамма в культуре клеток используют следующие питательные среды: Игла МЭМ, ДМЭМ, содержащие 2 мкг/мл трипсина, 2 ммоль/л глютамина, 100 мкг/мл пенициллина и 100 МЕ/мл стрептомицина.

Перечень фигур, чертежей и иных материалов

Рис. 1. Магнитно-резонансная томография. Серии фронтальных срезов на 28 сутки с начала эксперимента in vivo на мышах линии BALB/C. Стрелками указано расположение опухоли. 1. Экспериментальные мыши, получавшие интратуморально инъекции вируса NDV/Altai/pigeon/770/2011 максимальной концентрации в течение 5 дней: 1а - полная регрессия опухоли по сравнению с контрольными животными; 16 - значительная редукция опухоли по сравнению с контрольными животными. 2. Контрольные мыши, получавшие инъекции физиологического раствора: 1а, 2б.

Рис. 2. Фрагмент центральной части опухоли KREBS-2 на 20 сутки после серий интратуморальных инъекций штаммом NDV/Altai/770/2011. Видны обширные поля некрозов опухолевой ткани (стрелки). Окраска гематоксилином и эозином.

Рис. 3. Сегментоядерные нейтрофилы рядом с кровеносным сосудом в небольшом очаге опухолевой ткани KREBS-2.

Рис. 4. Отдельными стрелками указаны активированные макрофаг и лимфоцит. Выделены сегментоядерные нейтрофилы, лимфоцит. Окраска гематоксилином и эозином.

Рис. 5. Островок опухоли KREBS-2 в мышечной ткани. Окраска гематоксилином и эозином.

Рис. 6. Онколитический эффект штамма ВБН NDV/Altai/pigeon/770/2011 на линиях опухолевых клеток человека и нетрансформированных мононуклеарных клетках периферической крови человека в системе in vitro на третьи сутки после инфицирования.

Рис. 7. А. Иммуноокрашивание контрольных не инфицированных вирусом клеток опухолевой линии колоректального рака человека НСТ116. Конфокальная микроскопия, 100х увеличение. Ядра окрашены DAPI. Б. Иммуноокрашивание клеток опухолевой линии колоректального рака человека НСТ116, зараженных штаммом NDV/Altai/pigeon/770/2011 (разведение 8 ГАЕ/10000 клеток). Вторые сутки после инфицирования вирусом. Конфокальная микроскопия, 100х увеличение. Ядра окрашены DAPI, вторичные антитела - Аlеха546.

Примеры использования вируса для изучения возможности создания на его основе прототипного онколитического препарата.

Для выявления онколитических свойств штамма NDV/Altai/pigeon/770/2011 были проведены эксперименты по заражению мышей опухолевыми клетками с последующими интратуморальными инъекциями штамма вируса NDV NDV/Altai/pigeon/770/2011. Результаты данного эксперимента выявили наличие у предлагаемого штамма ВБН способность нейтрализовать опухолевые клетки, препятствуя формированию опухоли. Это может происходить под воздействием иммунной системы, индуцированной наличием вируса, или, что более вероятно, по механизму прямого лизиса предлагаемым авторами штаммом NDV/Altai/pigeon/770/2011 опухолевых клеток. В пользу второй гипотезы говорит то, что при введении штамма NDV/Altai/pigeon/770/2011 в уже сформировавшуюся опухоль, наблюдалось снижение динамики роста опухоли. При морфологическом исследовании было выявлено разрушение опухолевой ткани исследуемым штаммом.

Полученные данные выявляют наличие у штамма NDV/Altai/pigeon/770/2011 способности специфически разрушать новообразования млекопитающих в системе in vivo без предварительной адаптации на культуре опухолевых клеток. Это делает данный штамм перспективным агентом для создания на его основе путем предварительной адаптации противораковых препаратов с широким спектром взаимодействия и высоким терапевтическим индексом.

Пример 1. Изучение онколитических свойств штамма NDV/Altai/pigeon/770/2011 на модели солидной опухоли мышей KREBS-2 при введении вируса в сформировавшуюся опухоль в системе in vivo.

Для оценки влияния ВБН на уже сформировавшуюся опухоль был поставлен следующий пилотный эксперимент. Двум группам иммунокомпетентных мышей линии BALB/C (♂) были привиты внутримышечно в бедро клетки асцитной карциномы KREBS-2 в концентрации 500000 клеток в 100 мкл фосфатного буфера. На третьи сутки после внутримышечной прививки опухолевых клеток в бедрах всех мышей появилось уплотнение, характерное для начала формирования солидного узла опухоли. Через 3 суток после заражения с началом формирования опухоли контрольной группе начали вводить внутримышечно в область локализации опухоли по 100 мкл физиологического раствора, а второй экспериментальной группе - интратуморально вводили по 100 мкл живого вируса NDV/Altai/pigeon/770/2011 в концентрации 256 ГАЕ в 100 мкл. Инъекции физиологического раствора и вируса продолжали ежедневно на протяжении 5-ти суток. В течение этого периода эксперимента трудно говорить об изменениях размеров опухоли, ее развитии или начале регрессии, так как на первых этапах введения вируса в районе опухоли развивается воспалительный процесс, характеризующийся отечностью, что препятствует визуальной оценке возможных изменений. Однако на более поздних этапах опухоли экспериментальных мышей сравнивали с опухолями контрольных мышей. Так на 8-9 день эксперимента визуально стало заметно, что бедро с опухолью контрольных мышей имеет более выраженную шарообразную форму, нежели у экспериментальных. На протяжении эксперимента мыши обеих групп активно потребляли корм и воду. Однако уже на 14-16 день контрольные животные стали менее подвижны. На 28 сутки с начала эксперимента оценивали распространенность внутримышечного опухолевого процесса с помощью метода магнитно-резонансной томографии (МРТ) и проводили забор материала опухолевой ткани от всех мышей.

На рисунке 1 представлены серии фронтальных срезов, полученные при помощи МРТ, на которых опухоль четко визуализируется на фоне здоровых тканей. По полученным изображениям срезов опухолевых участков удалось выявить значительные различия в развитии опухолевого процесса между контрольными и экспериментальными животными. Серии фронтальных срезов опухолевого узла контрольных животных представлены в блоках 1А и 1Б рисунка 1. В случае одной экспериментальной мыши, которая получала интратуморально инъекции вируса NDV/Altai/pigeon/770/2011, наблюдалась практически полная регрессия опухоли по сравнению с размерами опухоли контрольных животных. На блоке срезов 2А видно, что бедро, в которое были привиты опухолевые ткани, не отличается от здорового по размерам и наличие опухолевого узла на серии изображений МРТ не обнаруживаются. Опухоль другой экспериментальной мыши, получавшей инъекции вируса, претерпела значительную редукцию по сравнению с опухолями контрольных животных, получавшими инъекции физиологического раствора. Изображения опухолевого узла в бедре второй экспериментальной мыши представлен на блоке срезов 2Б.

На 28 сутки после заражения был проведен забор биоматериала опухолевой ткани от мышей из каждой группы. Структурный анализ на светооптическом уровне показал наличие многочисленных некрозов в опухолевом узле у мышей, получавших инъекции вируса NDV/Altai/Pigeon/770/2011. На рисунке 2 изображен фрагмент препарата опухолевого узла от экспериментальной мыши. С целью выявления гистологических структур срезы окрашивали по общепринятой методике обзорной окраски гематоксилином-эозином. На 20 сутки после завершения курса инъекций вируса в центральной части опухолевого узла KREBS-2 видны обширные поля некрозов опухолевой ткани, обозначенные стрелками.

В области кровеносных сосудов наблюдаются гранулоциты - сегментоядерные нейтрофилы. Между мышечными волокнами также встречаются лимфоциты и активированные макрофаги (см. рис. 3 и рис. 4). На рисунке 3 представлены сегментоядерные нейтрофилы рядом с кровеносным сосудом в небольшом очаге опухолевой ткани KREBS-2. На рисунке 4 отдельными стрелками указаны активированный макрофаг и лимфоцит. Выделены сегментоядерные нейтрофилы, лимфоцит.

Соединительная капсула плохо выражена, видны малочисленные опухолевые инвазии в подлежащую ткань. Часто встречаются апоптотические тельца.

При морфологическом исследовании опухолевого материала от мыши, у которой наблюдалась почти полная регрессия опухоли по результатам изображения МРТ, было выявлено почти полное разрушение опухоли. Сохранились отдельные опухолевые островки в мышечной ткани, который показан на рисунке 5 (см. рис. 5).

Результаты данного эксперимента показывают наличие у среднепатогенного для птиц штамма ВБН способности нейтрализовать опухолевые клетки млекопитающих и предотвращать формирование опухоли. Этот процесс может происходить под воздействием иммунной системы, индуцированной наличием вируса, или по механизму прямого лизиса вирусными частицами опухолевых клеток. Если считать второе предположение верным, то наличие онколитической активности у патогенного для птиц штамма и отсутствие ее у непатогенного объясняется тем, что апатогенные штаммы ВБН не способны лизировать клетки, в то время как исследуемый штамм, напротив, обладает этой способностью, которая позволяет ему лизировать раковые клетки млекопитающих, предотвращая формирование опухоли.

Пример 2. Оценка жизнеспособности линий опухолевых клеток человека после инфицирования штаммом NDV/Altai/pigeon/770/2011 в системе in vitro.

Для оценки цитопатического эффекта штамма вируса использовали четыре опухолевые линии человека - НСТ116+/+ (линия клеток колоректального рака), MCF7 (линия клеток аденокарциномы молочной железы с отсутствием экспрессии каспазы-3), Η1299 (линия клеток немелкоклеточной карциномы легкого), U87 (линия клеток глиобластомы). Контролем служили мононуклеарные клетки периферической крови человека. Клетки инкубировали с разным разведением вируса от 2 до 16 ГАЕ/10000 клеток. Концентрацию вируса повышали с шагом в 2 раза. Клетки с вирусом инкубировали в течение 1 часа при 37°C. Контрольные опухолевые клетки инкубировали в ростовой среде без вируса в течение 1 часа.

Через 3 суток после заражения клеточных линий штаммами ВБН был проведен анализ жизнеспособности клеток колометрическим методом с помощью коммерчески доступного набора CellTiter 96®AQueous One Solution Cell Proliferation Assay (Promega, USA). Оптическую плотность измеряли при длине волны 490 нм.

Результаты оценки жизнеспособности клеток опухолевых линий представлены в виде гистограммы на рисунке 6 как средние относительные значения доли живых клеток на третьи сутки после обработки штаммами вируса к доли контрольных не обработанных вирусом клеток с учетом стандартного отклонения (среднее относительное значение ± стандартное отклонение).

Природный штамм - NDV/Altai/pigeon/770/2011 показал высокий онколитический потенциал относительно всех опухолевых клеточных линий человека. Жизнеспособность клеточных линий - колоректального рака НСТ116, глиобластомы U87 и рака легкого Н1299, - варьируется в пределах от 40% до 60%. На третьи сутки инфицирования данным штаммом в культуре колоректального рака остаются жизнеспособны 45% опухолевых клеток, а в культуре клеток глиобластомы - около 40%. Для линии немелкоклеточной карциномы легкого Η1299 это значение составляет 60%. Онколитический эффект штамма относительно клеток аденокарциномы молочной железы MCF7 оказался менее выраженным, так как жизнеспособность данной клеточной линии составила порядка 80%. При этом мононуклеарные клетки периферической крови человека (МНПК) оказались практически не восприимчивы к действию данного штамма. Их жизнеспособность составляет около 100% (см. рис. 6).

Раннее было отмечено, что штаммы голубиного парамиксовируса типа-1, к которым относится NDV/Altai/pigeon/770/2011, обладают хорошо выраженными онколитическими свойствами за счет строения их репликативного комплекса (Dortmans J.C. et al. The viral replication complex is associated with the virulence of Newcastle disease virus // J Virol. - 2010. - Vol. 84 (19). - P. 10113-10120) [16], что подтверждается нашим экспериментом. Безопасности вируса в отношении здоровых клеток млекопитающих были проверены на мононуклеарных клетках периферической крови человека. Результаты оценки жизнеспособности клеток после заражения выбранными нами штаммами ВБН подтвердили литературные данные о том, что ВБН является не патогенным для клеток человека (Schirrmacher V., Fournier P. Newcastle disease virus: a promising vector for viral therapy, immune therapy, and gene therapy of cancer // Gene Therapy of Cancer. - 2009. - Vol. 542. - P. 565-605) [17]; (Zemp F.J. et al. Oncolytic viruses as experimental treatments for malignant gliomas: using a scourge to treat a devil // Cytokine Growth Factor Rev. - 2010. - Vol. 21 (2-3). - P. 103-117) [18].

Наличие вируса в клетках опухолевых линий человека было подтверждено с помощью техники иммуноцитохимического окрашивания флуоресцентными антителами на вторые сутки после инфицирования вирусом с помощью конфокальной микроскопии (увеличение 100х). Иммуноокрашивание не зараженных вирусом контрольных клеток колоректального рака НСТ116 дало отрицательный результат. На полученных изображениях, которые представлены на рисунке 7, хорошо видны ядра клеток, окрашенные DAPI.

На рисунке 7А изображен препарат иммуноцитохимически окрашенных контрольных не инфицированных вирусом клеток опухолевой линии колоректального рака человека НСТ116. Никаких других окрашенных флуоресцентных аккумуляций и агрегаций в цитоплазме и ядрах кроме окрашенных DAPI ядер на препарате контрольных опухолевых клеток не обнаружено. На рисунке 7Б в клетках колоректального рака НСТ116, зараженных штаммом NDV/Altai/pigeon/770/2011 (разведение 8 ГАЕ/10000 клеток), после иммуноцитохимического окрашивания помимо ядер выявляется яркое флуоресцентное окрашивание нитчатых структур, располагающихся в цитоплазме клеток. Эти структуры соответствуют положению вирусных частиц штамма NDV/Altai/pigeon/770/2011 в опухолевых клетках. В клетках колоректального рака НСТ 116, проявляющих чувствительность к онколитическому действию штамма NDV/Altai/pigeon/770/2011, окрашенные вирусные нитчатые структуры выявлены в цитоплазме всех клеток и расположены в основном равномерно по всех цитоплазме.

При заражении штаммом NDV/Altai/pigeon/770/2011 опухолевой клеточной линии НСТ116 наблюдается активная репликация вируса во всех инфицированных клетках. Вероятно, этим объясняется высокая чувствительность данной линии клеток к воздействию вируса. И, как следствие, чем эффективнее происходит инфицирование вирусом опухолевых клеток, тем, соответственно, больше из их числа подвергаются онколизису и гибнут.

Показана уникальная способность штамма NDV/Altai/pigeon/770/2011 проявлять избирательную литическую активность в отношении опухолевых клеток млекопитающих, а также активно реплицироваться и сохраняться в этих клетках на протяжении длительного времени без предварительной адаптации, разрушая новообразование.

Таким образом, уникальные свойства предлагаемого штамма позволяют использовать его для исследования механизмов разрушения раковых клеток млекопитающих на ультраструктурном уровне с помощью методов светооптической и электронной микроскопии. Данные свойства перспективны для фундаментальных и прикладных медицинских исследований.

Данные свойства делают штамм NDV/Altai/pigeon/770/2011 перспективным для дальнейшего исследования онколитической активности и разработки кандидатных противоопухолевых препаратов.

Использованные источники информации

1. World Health Statictics, 2012. 2012. Р. 176. http://www.who.int/gho/publications/world health statistics/EN WHS2012 Part2.pdf

2. Martuza R.L. et al. Experimental therapy of human glioma by means of a geneticaly engineered virus mutant // Science. 1991. Vol. 252. N. 5007. P. 854-856.

3. Zhan X. et al. Sendai virus recombinant vaccine expressing hPIV-3 HN or F elicits protective immunity and combines with a second recombinant to prevent hPIV-1, hPIV-3 and RSV infections // Vaccine. 2008. Vol. 26. N. 27-28. P. 3480-3488.

4. Elankumaran S. et al. Newcastle disease virus exerts oncolysis by both intrinsic and extrinsic caspase-dependent pathways of cell death // J. Virol. 2006. Vol. 80. N. 15. P. 7522-7534.

5. Ravindra P.V. et al. Newcastle disease virus as an oncolytic agent // Indian J Med Res. 2009. Vol. 130. N. 5. P. 507-513.

6. Cantin C, Holguera J., Ferreira L., Villar E., Muñoz-Barroso I. http://www.ncbi.nlm.nih.gOv/pubmed/17251575// J. Gen. Virol. 2007. Vol. 88. Pt. 2. P. 559-569.

7. Fabian Z., Csatary С.М., Szeberenyi J., Csatary L.K. p53-independent endoplasmic reticulum stress-mediated cytotoxicity of a Newcastle disease virus strain in tumor cell lines // J. Virol. 2007. Vol. 81. N. 6. P. 2817-2830.

8. Puhlmann J., Puehler F., Mumberg D., Boukamp P., Beier R. Racl is required for oncolytic NDV replication in human cancer cells and establishes a link between tumorigenesis and sensitivity to oncolytic virus // Oncogene. 2010. Vol. 29. N.15. P. 2205-2216.

9. Bai F.L., Yu Y.H., Tian H., Ren G.P., Wang H., Zhou В., Han X.H., Yu Q.Z., Li D.S. Genetically engineered Newcastle disease virus expressing interleukin-2 and TNF-related apoptosis-inducing ligand for cancer therapy // Cancer Biol. Ther. 2014. Vol. 15. N. 9. P. 1226-1238.

10. Zamarin D., Palese P. Oncolytic Newcastle disease virus for cancer therapy: old challenges and new directions // Future Microbiol. 2012. Vol. 7. N. 3. P. 347-367.

11. Miller P.J. et al. Newcastle disease: evolution of genotypes and the related diagnostic challenges // Infect. Genet. Evol. 2010. Vol. 10. N. 1. P. 26-35.

12. Cassel W.A., Garrett R.E. Newcastle disease virus as an antineoplastic agent // Cancer. 1965. Vol. 18. P. 863-868.

13. Laurie S.A. et al. A phase 1 clinical study of intravenous administration of PV701, anoncolytic virus, using two-step desensitization // Clin. Cancer Res. 2006. Vol. 12. N. 8. P. 2555-2562.

14. ΟΙΕ, World Organisation for Animal Health, Manual of Diagnostic Tests and Vaccines for Terrestrial Animals, Paris, France, 7th edition. 2012. Vol. 1-2. Ch.2.03.14. http://www.oie.int/fileadmin/Home/eng/Health_standards/tahm/2.03.14_NEWCASTLE_DIS.pdf.

15. Alexander D.J. Newcastle disease virus and other avian paramyxoviruses // Rev. Sci. Tech. 2000. Vol. 19. N. 2. P. 443-462.

16. Dortmans J.C. et al. The viral replication complex is associated with the virulence of Newcastle disease virus // J. Virol. 2010. Vol. 84. N. 19. P. 10113-10120.

17. Schirrmacher V., Fournier P. Newcastle disease virus: a promising vector for viral therapy, immune therapy, and gene therapy of cancer // Gene Therapy of Cancer. 2009. Vol. 542. P. 565-605.

18. Zemp F.J. et al. Oncolytic viruses as experimental treatments for malignant gliomas: using a scourge to treat a devil // Cytokine Growth Factor Rev. 2010. Vol. 21. N. 2-3. P. 103-117.

Штамм вируса болезни Ньюкасла NDV/Altai/pigeon/770/2011

для изучения онколитических свойств и механизмов онколизиса

для создания прототипного противоопухолевого препарата

Нуклеотидная последовательность

1 accaaacaga gaatctgtga gttacgataa agggcgaaga agcaatcgaa atcgtacggg

61 tagaaggtgt gaacctcgag tgcgaggccg aagctcaaac tcgagggagc cttctgccgg

121 tatgtcatcc gtctttgacg agtacgagca actccttgct gctcaaaccc gccccaacgg

181 agcccacgga ggaggagaaa aagggagcac cttaaaagtt gaggtcccag tattcactct

241 taacagcgat gatccagaag atagatggaa ttttgcggta ttttgtcttc ggattgctgt

301 tagcgaggac gccaacaaac cactcagaca aggtgctctc atatctctct tatgctccca

361 ttctcaagtg atgagaaatc atgttgccct tgcaggaagg cagaacgagg ccacactggc

421 tgttcttgag atcgatggtt ttaccgacaa tgtgccccag ttcaacaaca ggagcggagt

481 gtctgaagag agggcacaga gattcatggt gatagcaggg tctcttcccc gggcatgcag

541 taacagtact ccattcatta cggctggagt tgaagatgat gcgccagaag atatcactga

601 cactctggaa agaatcctat ctatccaggc tcaggtatgg gtcacggtag caaaggccat

661 gactgcatat gagacagcag atgagtcaga aacaaggagg attaataaat atatgcagca

721 aggtagagtc caaaagaagt atatcctcca ccccgtatgc aggagtgcaa ttcaactcac

781 aatcagacat tccctggcag tccgcatttt cttagttagt gagcttaaga ggggccgcaa

841 tacggcaggt gggagctcta catattacaa cttagttggg gatgtggact catacataag

901 gaacaccggg ctgactgcgt tcttcctgac actcaagtat ggaatcaata ccaagacgtc

961 agcccttgca ctcagcagcc tcacaggtga tatccaaaaa atgaaacagc tcatgcgtct

1021 atatcggatg aaaggagaaa atgcaccgta catgacattg ttaggcgaca gtgaccagat

1081 gagcttcgca ccagctgaat atgcacaact ctattctttt gccatgggca tggcatcggt

1141 attagataag ggaactagta aataccaatt cgccagagac tttatgagca cgtcattttg

1201 gagactcgga gtggagtatg cccaggcgca gggaagtagc atcaatgagg atatggctgc

1261 tgaactgaag ctaactccag cagcaaggag gggcttggca gctgctgccc aacgcgtatc

1321 cgaggaaatt ggcagtgtgg acattcccac tcaacaggct ggggtcctca ctgggctcag

1381 tgacgaaggc ccccgaggct cacagggtgg attaagcaag tcgcagggac aatcggatgc

1441 cggggatgga gaggcccaat tcctggacct gatgagagca gtggcaaaca gcatgcgaga

1501 atcaccaaac tccacacaga gcaccactca ccaggagccc cccccgactc ctgggccaac

1561 ccaagacaac gacatcgact gggggtactg atcaacaaca cccagcctgc ccccgccgag

1621 ccgccccaaa ccctccgccc aaacctcccc caaactcccc aacctaccgc cccacacggc

1681 caaaccggca ggagcacccc cnnnnnnnnn nnnnnncccc cnnnnnnncg atcccgcccg

1741 tccaaggcaa cacaggcgca actcggtcca ccggcaatca gcgcagagcc caaagtatta

1801 gaaaaaaata cgggtagaag agagacacgt agaggtcagg acaattcacc ggggtctcta

1861 ctcttctctc tactcagtgg actagggtga agatggccac ctttacagat gctgagatag

1921 aggatatatt agagaccagt ggaaccgtca ttgacagcat aattacggcc cagggcaaat

1981 cagcagagaa tgtcgggagg agcataaccc cacaaggcaa gaccaaggct ccgaacacgg

2041 cacgagataa acatgggaac acccagccac cagctggcca ggacacctcc gaacaacaag

2101 acaggccaga caaacagcca tccatacctg aacaggcgac ccaatacgac aacctgccga

2161 ccgcatccaa cgaaccgctt cccactcagg ccgcaggtga ggctggcgac acacagctca

2221 agacaggagc aagcaattct cttctgtcta tgcttgacaa gctgagcagt aaatcgtcta

2281 atgctaaaaa ggggccacgg tcaaaccctc aggaaggcca tcatcaacct ctggcccaac

2341 aacacgggag tcagccaagc cgtggaaaca accaggagag accacagcac caggccaaag

2401 ccacccctgg aagccagggc acagacgcga acacagcata tcatggacaa cggaaggagt

2461 cacaaccatc agctggtgca acccctcatg tgccccagtc agggcaaagc caagacagta

2521 ctcctgcatc tgcggatcat gtccaaccac ctgtcgactt tgtgcaagcg atgatgtcta

2581 tgatggaggc attatcacag aaggtaagta aagttgacta tcagttagac ctagtcttaa

2641 agcagacatc ctccatcccc atgatgcgat ctgaaatcca acagcttaaa acatctgtag

2701 cgatcatgga agctaattta ggtatgatga agattctgga ccctggttgt gctaacgttt

2761 catctttgag tgacctacga gcagttgccc gatcccaccc agttttaatt tcgggccccg

2821 gagatccatc tccttatgtg acgcaagggg gtgaaatgat actcaataaa ctctcgcaac

2881 cggtcaagaa cccttctgag tcaatcaaat ctgctatgac gagcggatcc gatatcggag

2941 tggagaagga cacagtccgt gcattaatta cctcacgccc gatgcatcca aactcctcaa

3001 ccaagctcct gaataagctg gatgcagcca agtcgatcga agagatcaga aagatcaaac

3061 gccttgcgct gaatggctga ttaccgtcac aactcacaac aggctcctgc cccattagtg

3121 tcacaaggaa tctttcttga gccttccctc acaaacccat gcttcagcac ctcaagcaac

3181 aattccctcc cttccctccc acttccctga atgacagcac aactgcaatt aatccaacag

3241 cattagagat taagaaaaaa tacgggtaga atcaaagtac cctgactgtg ccaaaatgga

3301 ctcatccaga acaatcgggc tgtactttga ttctgccctc ccctctagca gcctgttagc

3361 attcccgatc gtcttacaag acacaggaga tgggaagaag aaaatcaccc cacaatacag

3421 aatccagcgt cttgactcat ggacagacag taaggaagac tcggtattca tcaccaccta

3481 cggatttatc ttccaaatag ggaatgaaga ggtcactgtc ggtatgatta atgacaatcc

3541 cagacatgag ttactttcct ctgcaatgct ctgcctagga agtgttccaa atgacggaga

3601 tcttgttaaa ttggcgaggg cctgcctcac tatggtaata acttgcaaga agagtgcaac

3661 taatactgag agaatagtct tctcagtaat gcaggcacct caggtgctgc aaagctgtat

3721 ggttgtggca aataagtact cgtcagtgaa tgcagtgaag catgttaaag cacccgagaa

3781 gatccctgga agcggaaccc tagagtataa agtgaacttt gtctctttga ctgtggtgcc

3841 gaggaaggat gtctacaaga tcccaactgc agcattgaaa atatctggct caagcctata

3901 taatctcgca ctcaatgtca ctattgatgt ggaggtagat ccgaagagcc cgctagtcaa

3961 atctctttct aagtctgaca gtggatacta tgctaatctt tttttgcata tcgggcttat

4021 gtccactgta gacaagaagg gaaagaaagt gacatttgac aagatagagg aaaagataag

4081 aagactcaat ctatctgtcg ggctcagtga tgtgctcgga ccttctgtgc ttgtgaaggc

4141 gagaggtgca cggactaagc tactggcacc ttttttctcc agcagcggga cggcctgcta

4201 tcctatagca aatgcctccc ctcaggttgc taagatactc tggagtcaaa ccgcgcacct

4261 gcggagtgta aaggtcatca ttcaagctgg cacccaacgt gctgttgcag tgactgccga

4321 tcatgaagtc acctctacta agatagagaa gaggcacacc attgccaaat acaatccttt

4381 caagaagtaa gctgcatccc tgaaactgcg acccacccac ctctctcaat caccgtgaca

4441 ctagatgatg atctatcttg attgcttatg gttagttcac ctgtctatct aattaagaaa

4501 aacacgggta gaagagtctg gatctcggct agcacattca aggcgcaaca tgagctccaa

4561 atcttccacc aggatcccag cacccttgat gttgatcgcc cgaatcatgc tgatactgag

4621 ctgcattcgt ctgacaagct ctcttgatgg caggcccctc gcagctgcgg ggattgtggt

4681 aacaggagat aaagcagtca acatatacac ctcatctcag acagggtcaa tcataatcaa

4741 gttgctcccg aatatgccca aggataaaga ggcgtgtgca aaagccccgt tagaagcata

4801 caacagaaca ctgactgctt tactcaaccc ccttggtgat tccatccgca agatacaagg

4861 atctgtatcc acaccaggag gaaagagaca gaagcgcttt ataggtgcca ttattggcag

4921 tatagctcta ggggttgcga catcggcaca gataacagca gctgcggccc tgatacaagc

4981 caaccagaat gccgccaaca tcctccggct taaggagagc attgctgcaa ccaatgaagc

5041 tgtgcatgag gtcaccgatg gattatcgca actagcagtg gcagttggga agatgcagca

5101 gttcgttaat gaccaattta ataatacggc acgagaattg gactgtataa aagttacaca

5161 acaagtcggt atagaactca acctatacct aactgaattg actacggtgt tcgggccaca

5221 aatcacttcc cctgccctaa ctcagctgac catccaggcg ctttataatt tagctggtgg

5281 caatatggat tacttattga ccaagttagg tatagggaac aatcagctca gctcattaat

5341 tggtagtggc ttgatcacag gccaccctat attgtatgac tcacagactc aactcctggg

5401 catacaggta aatttacctt cagtcgggaa ccttaataat atgcgtgcca cctatttggg

5461 gactttatct gtaagcacaa ccaaagggtt tgcctcagca cttgtcccga aggtagtgac

5521 acaagtcggc tccgtgatag aagaacttga cacctcacac tgtatagagt ctgatcttga

5581 tttatattgc acaagaatag tgacattccc catgtctcca ggcatttatt cctgtctgag

5641 cggcaacacg tcagcttgca tgtattcaaa gactgcaggt gcactcacca cgccatatat

5701 ggccctcaaa ggctcagtta ttgccaattg caaaataaca acatgtaggt gtgtagaccc

5761 cccgggtatc atatcacaaa actatggaga agctgtatct ctgatagata gacattcatg

5821 caatgtctta tcattagatg ggataactct gaggctcagt ggagagtttg atgtaactta

5881 ccaaaagaat atctcaatac tagattctca agtcatcgtg acaggcaacc ttgatatatc

5941 aaccgagctt ggaaatgtca acaattcaat aagcagtgcc ctggacaggt tagcggaaag

6001 caacaacaag ttagacaaag taaatgtcaa ccttaccagc acacctgctc tcattaccta

6061 tatcgttcta actgtcatat ctcttgtttt cggtgcactt agcctggttt tagcatgcta

6121 cctgatgtat aaacaaaagg cacaacaaaa gactttgata tggcttggga ataataccct

6181 tgatcagatg agagccacta caagaacatg aatgcaggcg agatgcggat gtgtctccag

6241 cggtgacctg tgtgtcaact ttgacaatct gttcaataga agacttaaga aaaaattact

6301 ggatatacgc aacccaaaag caatacacgg gtagaacggt tgaagaagct gtctttcaat

6361 caggaactag gcttcacaac atccgctcta ccacatcacc tacagcagac ctcacccatg

6421 gacagagtag ttcgcagggt tgcgctagag aatgaagaaa gggaagcaaa gaacacatgg

6481 cgtttggttt tccggattgc agttttactt ctagtagtaa tgaccttagc tatctctgcg

6541 gctgtcctgg tgcatagcat gagggccagt acgccgcgcg atattgtaag catatcgacc

6601 gtgatctcaa agacggagga gaagattact tccttactca gttcaaatca agatgtagta

6661 gataggatat ataagcaggt ggctcttgaa tctccgctgg cactgctaaa tactgaatct

6721 ataattatga atgcaataac gtctctatct catcaaatta acggggctgc gaataatagc

6781 ggttgtgggg cacctgttca tgacccagat tatatcgggg ggataggcaa agaactcata

6841 atagacgaca ccagtgatgt cacatcattc tatccatctg catatcaaga acacctgaat

6901 tttatcccgg cgcctactac aggatcaggt tgcactcgga taccctcatt tgacatgagt

6961 gctacccact actgttatac tcacaatgtg atattgtctg gttgcagaga tcactcccac

7021 tcacatcaat acttagcact cggtgtgctt cggatatctg caacaggaag ggtcttcttc

7081 tcgactctgc gttccatcaa tttggatgat acccaaaatc gaaagtcttg cagtgtgagt

7141 gcaactccta tgggttgtga tatactgtgc tccaaagtca cagagactga agaagaggac

7201 tacaagtcaa ttacccccac atcaatggtg cacggaaggt taggttttga cggtcaatat

7261 catgagaagg acttagacgt cacagtctta tttaaggatt gggtggcaaa ttacccggga

7321 gtgggaagtg gatcttttat tgatgaccgt gtatggttcc caatttacgg agggctcaaa

7381 cctaattcgc ctagcgacac cgcacaagaa gggaattatg taatatacaa gcgttataat

7441 aacacatgcc ctgatgaaca aagttatcaa atccggatgg ctaaagcttc gtacaagcct

7501 gggcggttcg gtggaaagcg cgtgcagcag gccatcttat cgatcaaagt gtcaacatct

7561 ttaggtgagg acccggtgtt gaccgttccg cctaatacaa ttacgctcat gggggccgaa

7621 ggcagaattc ttacaatagg gacatctcat ttcttgtatc aacgtggatc ttcatatttc

7681 tctcccgcct tattatatcc tatgacagtc tataataaaa cagctactct tcatagtcct

7741 tatacattta acgctttcac ccggccaggt agtgttcctt gtcaggcatc agcaagatgt

7801 cccaactcat gtatcactgg agtctatact gatccgtacc ccttaatctt ccatagaaac

7861 cacaccttga gaggggtctt cgggacaatg cttgatgata tacaagcaag actcaaccct

7921 gtgtctgcag tattcgacaa tatatcccgc agtcgtgtaa cccgagtaag ttcaagcagc

7981 accaaggcgg catacacgac atcgacatgt tttaaagttg tcaagactaa taaaacttat

8041 tgtcttagca ttgcagaaat atccaatact ctttttggag aattcaggat cgttccttta

8101 ctagttgaga ttcttaaggg tgataaggtt taagaagcca gatctgacca gctgagtcga

8161 acataggatt actcggaaaa tggtgctgtg ccacctatct ctcacaacac caaggatcaa

8221 actagatatc actgcaagcc caactctcat actaccgggc agccacaatc tgacaatgct

8281 aatgtgatca gtctgaattt ttcctatagt agattcattt agaaaaaaca tgaatggtag

8341 caagatataa ggggaaacaa cgtacaggag atagcacggg taggaaatgg cgggctccgg

8401 tcctgaaagg gcagagcatc aaattatcct accagagtca catctatcct cgccattagt

8461 caagcacaaa ttgctctatt actggaaatt aactgggcta ccgctccctg acgaatgcga

8521 ctttgatcac ctcattatca gcaggcaatg gaagaaaata cttgaatctg ccactcctga

8581 cattgagagg atgataaaac ttgggcgggc ggtgcatcag actctcaacc acaattccaa

8641 gataaccgga gtactccatc ccaggtgttt ggaagaacta tctagtattg agatctctga

8701 ttcaactaac aaattccgga agattgaaaa gaagatccag attcacaaca caaggtatgg

8761 agacctgttc gcaaagctgt gtacgcacgt tgaaaagaaa ttgctgggat catccaggtc

8821 taacaatgtc tcacgatcag aggagttcag cagcatccgt acagatccgg cattctggtt

8881 ccactcaaaa tggtccaaag ccaaatttgc atggctccat ataaaacagg cccagaggca

8941 tctgattgta gcagcaagaa caaggtccgc agtcaacaag ttagtgacat tgacccataa

9001 gacaggacaa gtctttgtta ctcctgagct tgtcattgtg acacatacag atgagaacaa

9061 gttcacatgc ctcactcaag aacttgtatt aatgtatgca gatatgatgg agggcagaga

9121 catggtcaac ataatatcat ctacggcgac acatctcaga agtctatcag agaaaattga

9181 tgatattctg cggttaatag atgctctgtc aaaggatttg ggcaatcaag tctatgacgt

9241 tgtatcattg atggagggat ttgcgtacag tgctgttcag ctgcttgaac catcaggtac

9301 atttgcagga gatttctttg cattcaactt acaagaacta aaaaacactc taactgagct

9361 cctcccaaat gatatagccg aatcagtaac tcacgcaatc gcctccatat tctctggttt

9421 agaacagaat caagcagctg agatgttgtg cttactgcgt ttgtggggtc acccattgct

9481 tgagtctcgt agtgcagcaa gggcagtcag gagccagatg tgcgcaccta aaatggtaga

9541 tttcgatatg atcctccaag tattatcttt ctttaaggga acaatcatca atggatacag

9601 gaagaagaac tcaggtgtgt ggccacgagt taaggtagat acgatatacg ggaaagtcat

9661 tgggcagcta cacgctgatt cagcggagat ttcgcatgat atcatgctga gggagtacaa

9721 gagtttatct gcccttgaat tcgagccatg tatagaatat gaccctgtca ccaatctaag

9781 tatgttctta aaggacaagg caattgcaca tccgagagat aactggcttg cttcttttag

9841 gcggaacctt ctctctgagg accagaggaa acaggtaaag gaggcaacct ctactaaccg

9901 cctcttgata gagttcttag aatcaaatga ttttgatccg tataaggaga tggaatattt

9961 gacaaccctt gagtacctaa gagacgacag cgtggcagta tcgtactcac tcaaagagaa

10021 ggaggtgaag gttaatgggc ggatttttgc taagttgaca aagaaattaa ggaactgcca

10081 ggtaatggca gaagggattc tagctgacca gattgcgcct tttttccagg ggaatggggt

10141 cattcaagat agcatatcct tgaccaagag tatgttagcg atgagtcaac tgtcttttaa

10201 cagcaacaag aaacgtatca ctgactgcaa agagagggtt tcctcaaaac gcaatcatga

10261 cttgaagagc aagaatcgtc gaagagttgc tactttcatc acaacggacc tgcaaaagta

10321 ttgtcttaac tggagatacc agacagttaa actcttcgca catgccatca atcagctgat

10381 gggcctacct cacttcttcg aatggattca tcttagactg atggatacta cgatgtttgt

10441 aggagaccct tttaatcctc caagtgaccc gactgactgc gatctatcca gagtcccaaa

10501 tgatgatata tatattgtca gtgctagagg gggcattgag ggattatgcc agaaactatg

10561 gacaatgatc tcaattgctg caattcaact cgctgcagca aggtcgcatt gtcgggttgc

10621 ctgcatggta caaggtgaca atcaagtaat agccgtaaca aaagaagtaa gatcagatga

10681 ctccccagat atggttttga cacaactgca tcaagctagt gataatttct tcaaagaact

10741 gattcacgtt aatcatctga ttggccacaa cctgaaagat cgtgaaacca tcaggtcaga

10801 cacattcttc atatacagca agcggatatt caaagacgga gcaatactca gtcaggtcct

10861 caaaaattca tcaaaattgg tgctaatatc aggcgatctt ggtgaaaata ctgtaatgtc

10921 ctgtgccaac attgcatcca ctgtagcacg gctatgcgag aacgggcttc ctaaagattt

10981 ctgttattat ttaaattacc taatgagctg tgtgcagaca tactttgatt ctgagttttc

11041 tattactcat agctcacaac cagattcaaa ccagccctgg atcgaggaca tttcttttgt

11101 acactcatat gttttgactc ctgctcagct gggaggactg agtaaccttc aatactcaag

11161 gctctacaca aggaatattg gtgacccggg gaccactgct tttgcggagg taaagcgatt

11221 agaaacagtt gggttgctga atcctagcat tatgaccaac atcttgactc ggccacctgg

11281 caatggagac tgggctagcc tatgcaacga tccttattct tttaattttg agactgtcgc

11341 aagcccaaat attgtcctta agaaacatac ccaaaaagtc ttatttgaga cttgttcaaa

11401 ccctctacta tccggagtac atacagagga caatgaggca gaggagaagg cattggctga

11461 attcctactc aatcaagaag cagttcaccc acgtgtcgca catgctatca tggaagcaag

11521 ctctgtaggt aggagaaagc aaattcaagg gcttgttgac actacaaaca ctgtgatcaa

11581 gattgcgctg accaggaggc ccctcggtat caagaggctg acacggataa tcaattactc

11641 gagcatgcat gcaatgctat tcagagatga tgttttcttg tctagtcgat ccaaccaccc

1