Пептиды cdc45l и вакцины, включающие таковые

Пептиды cdc45l и вакцины, включающие таковые

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Область техники

Приоритет

Настоящая заявка утверждает преимущество предварительной заявки США № 61/217133, поданной 26 мая 2009 года, которая включена в данное описание в полном объеме посредством ссылки.

Настоящее изобретение относится к области биологической науки, в частности, к области терапии онкологических заболеваний. В частности, изобретение относится к новым пептидам, которые чрезвычайно эффективны в качестве противораковых вакцин и лекарственных средств для лечения и предупреждения опухолей.

Предпосылки изобретения

Рак легких представляет собой самую распространенную форму рака, составляющую 1,35 млн. из 10,9 млн. новых случаев рака в год. Он также является основной причиной смерти от связанного с раком заболевания, что составляет 1,18 млн. из 6,7 млн. смертей, связанных с раком, во всем мире (непатентная литература, NPL 1). Несмотря на недавние улучшения в системной терапии, как например, химиотерапия и молекулярно-адресная терапия, прогноз для пациентов с раком легких в поздней стадии остается весьма неутешительным (NPL 2). Рак легких рецидирует у 50% пациентов после операции, и менее 25% пациентов реагирует на системную химиотерапию. В связи с этим, крайне необходимы более эффективные способы лечения, и иммунотерапия представляет один из перспективных подходов для лечений рака легких в будущем (NPL 3-5).

Успех терапевтических противораковых вакцин может основываться, в конечном счете, на идентификации иммуногенных антигенов, которые сверхэкспрессируются в опухолях по сравнению с нормальными тканями. Эффективная индукция цитотоксических Т-лимфоцитов (ЦТЛ) опухолеспецифическими антигенами (ОСА) продемонстрировала многообещающие результаты (NPL 6-7). В последнее время развитие технологии кДНК-микрочипов, наряду с геномной информацией, предоставило исчерпывающие профили экспрессии генов в злокачественных клетках, которые затем можно сравнивать с таковыми в нормальных клетках (NPL 8). Получение профилей экспрессии генов при помощи технологий кДНК-микрочипов представляет собой эффективный подход для выявления новых ОСА, полезных для диагностики рака и иммунотерапии (NPL 9-12).

Несмотря на то, что официально сообщалось о некоторых кандидатах в ОСА, экспрессируемых при раке легких (NPL 13-14), важно идентифицировать разнообразные ОСА, сверхэкспрессирующиеся при данном раке, для разработки более эффективной противораковой иммунотерапии, опосредованной Т-клетками (NPL 15).

CDC45L (cell division cycle 45-like) представляет собой жизненно важный клеточный белок, который функционирует как в инициации, так и в элонгации при репликации ДНК для обеспечения репликации хромосомной ДНК только один раз за клеточный цикл (NPL 16-19). CDC45L является высоко консервативным среди всех эукариотов, и направленное разрушение этого гена приводит к эмбриональной летальности у мышей (NPL 20). У взрослых людей подавляющее большинство клеток является дифференцированными и прекратило клеточное деление, и только небольшая популяция клеток пролиферируется в некоторых самообновляющийся тканях (NPL 21). Таким образом, в то время как CDC45L отсутствует в покоящихся в течение длительного времени, окончательно дифференцированных и стареющих клетках человека, он присутствует в пролиферирующих раковых клетках на протяжении всего клеточного цикла (NPL 18). Соответственно, экспрессия CDC45L тесно связана с пролиферирующими популяциями клеток, и, таким образом, CDC45L считается перспективным кандидатом в качестве нового маркера пролиферации в клеточной биологии рака (NPL 18, 22). Однако пригодность CDC45L в качестве мишени для иммунотерапии рака еще не была полностью исследована.

Список ссылок

Непатентная литература

Краткое описание изобретения

Настоящее изобретение основывается, по крайней мере частично, на открытии пептидов, которые могут служить в качестве мишеней иммунотерапии. Открытие соответствующих мишеней является чрезвычайно важным, поскольку ОСА иногда воспринимаются иммунной системой как «свои» и, вследствие этого, часто не обладают иммуногенностью. Как отмечалось выше, CDC45L (типичные аминокислотная последовательность и генная последовательность приведены в SEQ ID NO: 18 и SEQ ID NO: 17, соответственно, и последовательности также доступны из GenBank под номером NM_003504) был идентифицирован как активированный при раках, неограничивающие примеры которых включают опухоль яичка, рак поджелудочной железы, рак мочевого пузыря, немелкоклеточный рак легкого, мелкоклеточный рак легкого, рак молочной железы, рак пищевода, рак предстательной железы, хронический миелоидный лейкоз (ХМЛ), опухоль мягких тканей, рак желудка, гепатобилиарный рак и рак прямой кишки. Таким образом, CDC45L является кандидатом в качестве мишени иммунотерапии рака/опухолей.

Настоящее изобретение также относится к идентификации специфических эпитопных пептидов генного продукта CDC45L, которые обладают способностью индуцировать ЦТЛ, специфичные для CDC45L. Как подробно обсуждается ниже, мононуклеарные клетки периферической крови (PBMC), полученные от здоровых доноров, стимулировали при помощи связывающихся с HLA-A*2402 или HLA-A*0201 пептидов-кандидатов, полученных из CDC45L. Затем были образованы линии ЦТЛ со специфической цитотоксичностью в отношении HLA-А24- или HLA-A2-положительных клеток-мишеней, подвергнутых импульсному воздействию каждым из пептидов-кандидатов. Данные результаты показывают, что эти пептиды представляют собой HLA-А24- или HLA-A2-рестриктированные эпитопные пептиды, которые могут индуцировать сильные и специфические иммунные ответы в отношении клеток, экспрессирующих CDC45L. Кроме того, полученные результаты показывают, что CDC45L является сильным иммуногеном и его эпитопы представляют собой эффективные мишени для иммунотерапии рака/опухолей.

Соответственно, предметом по настоящему изобретению является предоставление выделенных пептидов, связывающихся с HLA-антигеном, в особенности таких, которые получены из CDC45L (SEQ ID NO: 18), или их иммунологически активных фрагментов. Предполагается, что эти пептиды обладают способностью индуцировать ЦТЛ и поэтому могут быть использованы для индуцирования ЦТЛ ex vivo, или их можно вводить субъекту для индукции иммунного ответа против раков, таких как опухоль яичка, рак поджелудочной железы, рак мочевого пузыря, немелкоклеточный рак легкого, мелкоклеточный рак легкого, рак молочной железы, рак пищевода, рак предстательной железы, хронический миелоидный лейкоз (ХМЛ), опухоль мягких тканей, рак желудка, гепатобилиарный рак, рак прямой кишки и т.д. Предпочтительно, пептиды представляют собой нонапептиды или декапептиды и более предпочтительно имеют последовательность аминокислот, выбранную из SEQ ID NO: 1-16. Среди них пептиды, имеющие последовательность аминокислот, выбранную из SEQ ID NO: 2, 3, 4, 7 и 12, демонстрировали сильную способность индуцировать ЦТЛ и, таким образом, являются наиболее предпочтительными.

Пептиды по настоящему изобретению включают такие, у которых одна, две или несколько аминокислот заменены, удалены или добавлены, при условии, что полученные модифицированные пептиды сохраняют исходную способность индуцировать ЦТЛ.

Настоящее изобретение также предоставляет выделенные полинуклеотиды, кодирующие любой из пептидов по настоящему изобретению. Эти полинуклеотиды можно использовать для индуцирования антигенпредставляющих клеток (АПК) со способностью индуцировать ЦТЛ, и можно вводить субъекту для стимулирования иммунного ответа против рака подобно настоящим пептидам.

При введении субъекту настоящие пептиды предпочтительно представлены на поверхности АПК, чтобы индуцировать ЦТЛ, нацеливающие соответствующие пептиды. Соответственно, еще одним объектом по настоящему изобретению является предоставление композиций или веществ, которые индуцируют ЦТЛ, где такие композиции или вещества включают один или несколько пептидов или полинуклеотидов по настоящему изобретению. Настоящее изобретение также рассматривает композиции или вещества, включающие один или несколько пептидов или полинуклеотидов по настоящему изобретению, составленные для лечения и/или профилактики раковых заболеваний, а также предупреждения их послеоперационных рецидивов, таких видов рака, в качестве неограничивающих примеров, как опухоль яичка, рак поджелудочной железы, рак мочевого пузыря, немелкоклеточный рак легкого, мелкоклеточный рак легкого, рак молочной железы, рак пищевода, рак предстательной железы, хронический миелоидный лейкоз (ХМЛ), опухоль мягких тканей, рак желудка, гепатобилиарный рак и рак прямой кишки. Таким образом, настоящее изобретение также предоставляет фармацевтические композиции или вещества для лечения и/или профилактики рака и/или предупреждения его послеоперационных рецидивов, где такие фармацевтические композиции или вещества включают один или несколько пептидов или полинуклеотидов по настоящему изобретению. В дополнение к и/или вместо вышеупомянутых пептида или полинуклеотида, фармацевтические композиции или вещества по настоящему изобретению могут необязательно включать, в качестве активных ингредиентов, АПК или экзосомы, которые представляют один или несколько представленных пептидов по настоящему изобретению.

Пептиды и полинуклеотиды по настоящему изобретению могут индуцировать АПК, которые представляют на своей поверхности комплекс HLA-антигена и настоящего пептида, например, путем контактирования АПК, полученных от субъекта, с пептидом по настоящему изобретению или путем введения полинуклеотида, кодирующего такой пептид, в АПК. Такие АПК обладают высокой способностью индуцировать ЦТЛ в отношении пептидов-мишеней и находят применение в иммунотерапии рака. Таким образом, настоящее изобретение охватывает способы индуцирования АПК со способностью индуцировать ЦТЛ, и АПК, полученные с помощью таких способов.

Настоящее изобретение также предоставляет способ индуцирования ЦТЛ, который включает стадию совместного культивирования CD8-положительных клеток с АПК или экзосомами, представляющими пептид по настоящему изобретению на своей поверхности. Альтернативно, способ может включать стадию введения гена, который содержит полинуклеотид, кодирующий субъединицу Т-клеточного рецептора (ТКР), способную связываться с пептидом по настоящему изобретению. ЦТЛ, полученные с помощью таких способов, могут найти применение при лечении и/или предупреждении раковых заболеваний, неограничивающие примеры которых включают опухоль яичка, рак поджелудочной железы, рак мочевого пузыря, немелкоклеточный рак легкого, мелкоклеточный рак легкого, рак молочной железы, рак пищевода, рак предстательной железы, хронический миелоидный лейкоз (ХМЛ), опухоль мягких тканей, рак желудка, гепатобилиарный рак и рак прямой кишки. Таким образом, настоящее изобретение охватывает ЦТЛ, полученные при помощи настоящих способов.

Еще одним предметом по настоящему изобретению является предоставление способов индуцирования иммунного ответа против рака у нуждающегося в этом субъекта, где такие способы включают стадию введения композиций или веществ, содержащих полипептиды CDC45L по настоящему изобретению или их иммунологически активные фрагменты, полинуклеотиды, кодирующие полипептиды CDC45L по настоящему изобретению, или экзосомы или АПК, представляющие такие полипептиды CDC45L.

В частности, настоящее изобретение представляет следующие [1]-[22]:

[1] Выделенный пептид, связывающийся с HLA-антигеном и обладающий способностью индуцировать цитотоксические Т-лимфоциты (ЦТЛ), где пептид получен из полипептида, состоящего из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 18, или иммунологически активного фрагмента,

[2] Выделенный пептид по [1], где HLA-антиген представляет собой HLA-А24 или HLA-А2,

[3] Выделенный пептид по [1] или [2], где указанный пептид содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из:

(a) SEQ ID NO: 4, 2, 3, 7 и 12; и

(b) SEQ ID NO: 4, 2, 3, 7 и 12, где 1, 2 или несколько аминокислот заменены, встроены, удалены и/или добавлены:

[4] Выделенный пептид по любому из [1]-[3], где пептид обладает одной или обеими из следующих характеристик:

(a) вторая аминокислота с N-конца представляет собой или модифицирована, чтобы представлять собой аминокислоту, выбранную из группы, состоящей из фенилаланина, тирозина, метионина и триптофана; и

(b) C-концевая аминокислота представляет собой или модифицирована, чтобы представлять собой аминокислоту, выбранную из группы, состоящей из фенилаланина, лейцина, изолейцина, триптофана и метионина.

[5] Выделенный пептид по любому из [1]-[3], где пептид обладает одной или обеими из следующих характеристик:

(a) вторая аминокислота с N-конца представляет собой или модифицирована, чтобы представлять собой аминокислоту, выбранную из группы, состоящей из лейцина и метионина; и

(b) C-концевая аминокислота представляет собой или модифицирована, чтобы представлять собой аминокислоту, выбранную из группы, состоящей из валина и лейцина,

[6] Выделенный пептид по любому из [1]-[5], где пептид представляет собой нонапептид или декапептид,

[7] Выделенный полинуклеотид, кодирующий пептид по любому из [1]-[6],

[8] Композиция для индуцирования ЦТЛ, где композиция содержит один или несколько из пептидов, описанных в любом из [1]-[6], или один или несколько из полинуклеотидов, описанных в [7],

[9] Фармацевтическая композиция для лечения и/или профилактики рака и/или предупреждения его послеоперационных рецидивов, где композиция содержит один или несколько из пептидов, описанных в любом из [1]-[6], или один или несколько из полинуклеотидов, описанных в [7],

[10] Фармацевтическая композиция по [9], составленная для введения субъекту, чей HLA-антиген представляет собой HLA-А24 или HLA-A2,

[11] Фармацевтическая композиция по [9] и [10], составленная для лечения рака,

[12] Способ индуцирования антигенпредставляющих клеток (АПК) со способностью индуцировать ЦТЛ, включающий стадию, выбранную из группы, состоящей из следующего:

(a) контактирование АПК с пептидом по любому из [1]-[6] in vitro, ex vivo и in vivo, и

(b) введение полинуклеотида, кодирующего пептид по любому из [1]-[6], в АПК,

[13] Способ индуцирования ЦТЛ, где способ включает стадию, выбранную из группы, состоящей из:

a) совместное культивирование CD8-положительных Т-клеток с АПК, которые представляют на своей поверхности комплекс HLA-антигена и пептида по любому из [1] до [6];

(b) совместное культивирование CD8-положительных Т-клеток с экзосомами, которые представляют на своей поверхности комплекс HLA-антигена и пептида по любому из [1]-[6]; и

(c) введение гена, который содержит полинуклеотид, кодирующий полипептид субъединицы Т-клеточного рецептора (ТКР), способный связывать пептид по любому из [1]-[6], в Т-клетки,

[14] Выделенная АПК, которая представляет на своей поверхности комплекс HLA-антигена и пептида по любому из [1]-[6],

[15] АПК по [14], которую индуцируют при помощи способа по [12],

[16] Выделенный ЦТЛ, который нацелен на любой из пептидов по [1]-[6],

[17] ЦТЛ по [16], который индуцируют при помощи способа по [13],

[18] Способ индуцирования иммунного ответа против рака у субъекта, где способ включает введение субъекту композиции, содержащей один или несколько пептидов по [1]-[6], один или несколько их иммунологически активных фрагментов или один или несколько полинуклеотидов, кодирующих пептид или фрагмент,

[19] Антитело или его фрагмент против любого из пептидов по [1]-[6],

[20] Вектор, включающий нуклеотидную последовательность, кодирующую любой из пептидов по [1]-[6],

[21] Клетка-хозяин, трансформированная или трансфицированная экспрессионным вектором по [20], и

[22] Диагностический набор, содержащий любой из пептидов по [1]-[6], нуклеотид по [7] или антитело по [19].

Применимость настоящего изобретения распространяется на любое число заболеваний, связанных с или являющихся результатом сверхэкспрессии CDC45L, таких как рак, неограничивающие примеры которого включают опухоль яичка, рак поджелудочной железы, рак мочевого пузыря, немелкоклеточный рак легкого, мелкоклеточный рак легкого, рак молочной железы, рак пищевода, рак предстательной железы, хронический миелоидный лейкоз (ХМЛ), опухоль мягких тканей, рак желудка, гепатобилиарный рак и рак прямой кишки.

В дополнение к вышесказанному, другие предметы и признаки изобретения станут в более полной степени очевидными после прочтения следующего подробного описания в сочетании с сопутствующими фигурами и примерами. Однако необходимо понимать, что как предшествующее краткое описание настоящего изобретения, так и нижеследующее подробное описание представляют собой иллюстративные варианты осуществления и не являются ограничивающими настоящее изобретение или другие альтернативные варианты осуществления настоящего изобретения. В частности, хотя изобретение и описывается в настоящем документе с учетом ряда конкретных вариантов осуществления, следует принять во внимание, что описание является иллюстрацией изобретения и не построено как ограничение изобретения. Различные модификации и приложения могут быть определены тем, кто специализируется в рассматриваемой области, без отступления от сущности и объема изобретения, как описано в прилагаемых пунктах формулы изобретения. Аналогичным образом, другие объекты, признаки, достоинства и преимущества настоящего изобретения будут понятны из этого краткого описания и конкретных вариантов осуществления, описанных ниже, и будут совершенно очевидны тем, кто специализируется в рассматриваемой области. Такие предметы, признаки, достоинства и преимущества будут очевидны из вышесказанного в сочетании с прилагаемыми примерами, данными, фигурами и всеми разумными заключениями, вытекающими из этого, сами по себе или с учетом ссылок, включенных в настоящий документ.

Краткое описание чертежей

Различные аспекты и приложения по настоящему изобретению станут очевидными специалисту в рассматриваемой области после рассмотрения краткого описания фигур и подробного описания настоящего изобретения и его предпочтительных вариантов осуществления, которые следуют.

[Фиг. 1a-d] Фигура 1 состоит из серий фотографий, от A до F, описывающих результаты анализов экспрессии мРНК CDC45L человека в нормальных тканях, раковых клеточных линиях и раковых тканях. Части A, B: RT-PCR и Нозернблот-анализ мРНК CDC45L, экспрессируемых в различных нормальных тканях. Часть C: Анализ при помощи ПЦР в реальном времени мРНК CDC45L, экспрессируемых в различных раковых линиях клеток. Часть D: Анализ при помощи RT-PCR мРНК CDC45L, экспрессируемых в раковых тканях легких и прилегающих нормальных тканях легких.

[Фиг. 1e-f] Часть E: Анализ при помощи RT-PCR мРНК CDC45L, экспрессируемых в различных раковых линиях клеток, полученных из рака желудка, гепатобилиарного рака, рака молочной железы, рака поджелудочной железы и колоректального рака. Часть F: Иммуногистохимический анализ белка CDC45L, экспрессируемого в аденокарциноме, плоскоклеточной карциноме, мелкоклеточной карциноме, нормальных легких, яичке и нормальной коже (первоначальное увеличение - 400-кратное). Сигналы положительного окрашивания выглядят, как коричневые. Масштаб линейки 50 мкм.

[Фиг. 2] На фигуре 2 представлен протокол индукции CDC45L-специфичных ЦТЛ из PBMC. PBMC были выделены из доноров, и Т-клетки CD8+ и клетки CD14+ выделяли при помощи микробус, покрытых анти-CD8 mAb или анти-CD14 mAb, соответственно, из PBMC HLA-А24-положительных здоровых доноров и пациентов с раком легких. DC (дендритные клетки) были получены из клеток CD14+, глубокой культуры в присутствии GM-CSF и IL-4 в течение 5 дней. DC подвергали импульсному воздействию HLA-А24-связывающихся пептидов в присутствии бета-2-микроглобулина в течение 2 ч при 37 градусах C. Эти подвергнутые импульсному воздействию пептидов DC затем облучали и смешивали в соотношении 1:20 с аутологичными Т-клетками CD8+ для образования пептид-реактивных ЦТЛ. Клетки культивировали с IL-7 в AIM-V с добавлением 2% аутосыворотки в день 0, и к этим культурам добавляли IL-2 на 2-ой день. Две дополнительные еженедельные стимуляции нагруженными пептидами аутологичными PHA-бластными клетками проводили на 7-ой и 14-ый день. INF-гамма ELISPOT, CD107a-мобилизацию и тесты по высвобождению ⁵¹Cr проводили на 6-ые дни после третьего раунда пептидного стимулирования Т-клеток CD8+.

[Фиг. 3] Фигура 3 состоит из серий гистограмм А-C, представляющих ЦТЛ-ответ у здоровых доноров на пептиды, полученные из CDC45L. Части A, B, C: анализ ELISPOT CDC45L пептид-реактивных ЦТЛ, образованных из PBMC HLA-А24-положительных здоровых доноров (A, C - здоровый донор-1; В - здоровый донор-4). Т-клетки CD8+ стимулировали аутогенными DC, полученными из моноцитов, (день 0) и аутогенными PHA-бластными клетками (7-ой и 14-ый день), подвергнутыми импульсному воздействию смеси 4 из 16 пептидов-кандидатов (SEQ ID NO: от 1 до 16). ЦТЛ собирали на 20-ый день, и ЦТЛ, продуцирующие IFN-гамма, детектировали при помощи анализа ELISPOT. Столбцы указывают на количество точек IFN-гамма, когда линии ЦТЛ повторно стимулировали клетками C1R-A2402, подвергнутых импульсному воздействию пептидами, полученными из CDC45L, (открытый столбец) или посторонним пептидом HIV-А24 (закрытый столбец). Соотношение эффекторов к клеткам-мишеням составляет 10:1. Данные представлены как среднее +/- SD из трех повторностей. Для каждого донора приведен образец двух независимых экспериментов с похожими результатами.

[Фиг. 4] Фигура 4 состоит из серии панелей, представляющих уровень CD107a, экспонированных на поверхности CD8+ Т-клеток после стимуляции антигеном. Все пептиды были использованы в конечной концентрации 1 мкг/мл. Представленные события являются окнами для CD8+ Т-клеток. Верхняя и средняя панели: стимулировали родственными пептидами, полученными из CDC45L. Нижняя панели: стимулировали посторонним пептидом HIV-А24. Числа внутри графиков показывают процент клеточной популяции с квадрантной характеристикой (CD8+ CD107a+ Т-лимфоциты). Каждая линия является представителем двух независимых экспериментов с похожими результатами.

[Фиг. 5-c] Фигура 5 состоит из серии графиков A-D, представляющих индукцию CDC45L-специфических ЦТЛ человека из PBMC HLA-А24-положительных пациентов с раком легких. Часть A: анализ ELISPOT ЦТЛ, индуцированных от пациентов с раком легких, культивируемых совместно с клетками-мишенями, подвергнутых импульсному воздействию CDC45L-А24-9-109-2(SEQ ID NO: 2), CDC45L-А24-9-294-3(SEQ ID NO: 3), CDC45L-А24-9-556-4(SEQ ID NO: 4), CDC45L-А24-9-370-7(SEQ ID NO: 7) или пептида CDC45L-А24-10-556-12(SEQ ID NO: 12). Продуцирование IFN-гамма клетками C1R-А*2402, стимулированных импульсным воздействием пептидов, было значительно большим, чем клетками C1R-А*2402, стимулированными импульсным воздействием HIV-пептида. Столбцы указывают на число точек IFN-гамма, когда образованные линии ЦТЛ были повторно стимулированы клетками C1R-A2402, подвергнутых импульсному воздействию пептидов, полученных из CDC45L (открытый столбец), или постороннего пептида HIV-А24 (закрытый столбец). Соотношение эффектор:клетки-мишени составляет 10:1. Данные представлены как среднее +/- SD трех повторностей. Часть B: Цитотоксичность ЦТЛ против клеток C1R-A2402, подвергнутых импульсному воздействию родственных пептидов, полученных из CDC45L (белый треугольник; CDC45L-А24-9-109-2(SEQ ID NO: 2), CDC45L-А24-9-294-3(SEQ ID NO: 3), CDC45L-А24-9-556-4(SEQ ID NO: 4), CDC45L-А24-9-370-7(SEQ ID NO: 7) или CDC45L-А24-10-556-12(SEQ ID NO: 12), и клеток C1R-A2402, подвергнутых импульсному воздействию постороннего пептида HIV-А24 (черный треугольник), в тесте по высвобождению ⁵¹Cr. Каждое значение представляет собой процент от специфического лизиса, рассчитанное на основе средних значений из трех повторностей. Часть C: Вестерн-блот-анализ суммарных лизатов клеток, полученных из клеток Lu99 (левая панель, линия 1), клеток Lu99, трансфицированных siRNA CDC45L (левая панель, линия 2) или контрольной siRNA GFP (левая панель, линия 3) и клеток ЕВС-1 (правая панель, линия 1), клеток EBC-1, трансфицированных siRNA CDC45L (правая панель, линия 2) или контрольной siRNA GFP (правая панель, линия 3), с использованием антитела anti-CDC45L. Бета-актин служил в качестве внутреннего контроля.

[Фиг. 5d] Часть D: Аннулирование CDC45L-специфической цитотоксической активности ЦТЛ путем понижающей регуляции белка CDC45L в клетках-мишенях Lu99 и EBC-1 (CDC45L*, HLA-A*2402+). Цитотоксические активности ЦТЛ в отношении Lu99, EBC-1, CDC45L siRNA Lu99, CDC45L siRNA EBC-1, GFP siRNA Lu99, GFP siRNA EBC-1 или A549 анализировали при помощи теста по высвобождению ⁵¹Cr. Каждое значение представляет процент специфического лизиса, рассчитанный на основе средних значений трех повторностей.

[Фиг. 6] Фигура 6 состоит из серии графиков, представляющих ингибирование ответов CDC45L-реактивных ЦТЛ при помощи mAb против HLA класса I. После инкубации клеток-мишеней Lu99 с mAb против HLA класса I (W6/32, IgG2a) или контрольными mAb против HLA класса II (IgG2a) в течение 1 ч клетки Lu99 культивировали совместно с ЦТЛ, образованными от CD8+ Т-клеток здоровых доноров или пациентов с раком легких путем стимуляции с пептидами CDC45L-А24-9-109-2(SEQ ID NO: 2), CDC45L-А24-9-294-3(SEQ ID NO: 3), CDC45L-А24-9-556-4(SEQ ID NO: 4) или CDC45L-А24-9-370-7(SEQ ID NO: 7). Показаны продуцирование IFN-гамма (Часть А) и цитотоксичность (Часть Б), обусловленная ЦТЛ. Белый кружок, Lu99; черный кружок, Lu99+W6/32; белый квадрат, Lu99+контрольное mAb. Данные представлены как среднее +/- SD трех повторностей. Статистически существенные различия отмечены звездочками (*P<0,05).

[Фиг. 7] Фигура 7 состоит из серии графиков А-C, представляющих индукцию как HLA-А24(А*2402)-, так и HLA-A2(*0201)-рестриктированных ЦТЛ путем стимуляции пептидом CDC45L-A2-9-556-4(SEQ ID NO: 4, также упоминаемый в настоящем документе как CDC45L-А24-9-556-4), ⁵⁵⁶KFLDALISL⁵⁶⁴. Часть A: анализ IFN-гамма ELISPOT ЦТЛ, индуцированных от HLA-A*0201-положительного здорового донора, совместно культивируемых с клетками T2, подвергнутых импульсному воздействию пептида CDC45L-A2-9-556-4(SEQ ID NO: 4). Данные представлены как среднее +/- SD из трех повторностей. Часть B: Цитотоксическая активность ЦТЛ против клеток T2, подвергнутых импульсному воздействию пептида CDC45L-A2-9-556-4(SEQ ID NO: 4) (белый треугольник), клеток T2, подвергнутых импульсному воздействию пептида HIV-A2 (черный треугольник), и клеток C1R-A2402, подвергнутых импульсному воздействию пептида CDC45L-A2-9-556-4(SEQ ID NO: 4) (черный ящик), анализируемая в тесте по высвобождению ⁵¹Cr. Часть C: Ингибирование ответов CDC45L-реактивных ЦТЛ при помощи mAb против HLA класса I, анализируемая в тесте по высвобождению ⁵¹Cr. После инкубирования клеток-мишеней Panc1 (CDC45L+, HLA-A2+ и HLA-А24-) с mAb против HLA класса I (W6/32, IgG2a) или контрольным mAb против HLA класса II (IgG2a), в течение 1 ч, клетки Panc1 культивировали совместно с ЦТЛ, образованными от CD8+ Т-клеток HLA-A*0201-положительного здорового донора путем стимуляции пептидом CDC45L-A2-9-556-4(SEQ ID NO: 4). Белый кружок, клетки Panc1; черный кружок, Panc1+W6/32; белый квадрат, Panc1+контрольное mAb. Каждое значение представляет собой процент от специфического лизиса, рассчитанный на основе средних значений из трех повторностей. Представлены репрезентативные данные трех независимых экспериментов с похожими результатами.

[Фиг. 8а-b] Фигура 8 состоит из серии графиков А-D, представляющих противоопухолевую активность in vivo CDC45L-реактивных ЦТЛ человека у мышей NOD/SCID. Части A, B, C: Пептид-специфическая цитотоксическая активность ЦТЛ человека, образованных от двух здоровых доноров путем стимуляции смесью из трех полученных из CDC45L пептидов. Часть A: анализ IFN-гамма ELISPOT ЦТЛ, культивируемых совместно с клетками C1R-A2402, подвергнутых импульсному воздействию либо пептидом CDC45L-А24-9-109-2(SEQ ID NO: 2), CDC45L-А24-9-294-3(SEQ ID NO: 3) либо пептидом CDC45L-А24-9-556-4(SEQ ID NO: 4). Часть B: CDC45L-специфическая цитотоксичность ЦТЛ против Lu99 (CDC45L+, HLA-А24+) в случае отсутствия (белый кружок) или наличия mAb против HLA класса I (W6/32, черный кружок) или контрольного mAb против HLA класса II (белый квадрат), анализируемая в тесте по высвобождению ⁵¹Cr.

[Фиг. 8c-d] Часть C: Цитотоксическая активность ЦТЛ в отношении клеток C1R-A2402, подвергнутых импульсному воздействию одного из трех полученных из CDC45L пептидов (белый кружок, CDC45L-А24-9-109-2(SEQ ID NO: 2); белый квадрат, CDC45L-А24-9-294-3(SEQ ID NO: 3); белый треугольник, CDC45L-А24-9-556-4(SEQ ID NO: 4) и посторонний пептид HIV-А24 (черный кружок), анализируемая в тесте по высвобождению ⁵¹Cr. Часть D: Опухоли у мышей NOD/SCID, привитых внутривенно CDC45L-индуцированными ЦТЛ (черный квадрат, n=5), контрольные CD8+ Т-клетки (белый ромб, n=5) или один PBS (белый кружок, n=5). Когда размер опухоли достигал примерно 25 мм² на 7 день после подкожной имплантации опухоли, внутривенно прививали ЦТЛ человека (4×10⁶), реагирующие на смесь из трех CDC45L-пептидов. Прививку ЦТЛ повторяли на 14 день. Контрольные CD8+ Т-клетки, стимулированные посторонним HLA-А24-рестриктированным HIV-пептидом, также прививали мышам в качестве контроля. Размер опухоли выражался в квадратных миллиметрах. Каждый символ представляет средние размеры опухоли в каждой группе мышей, отрезки показывают SD. Двусторонний t-теста Стьюдента применяли для определения значимости различий между двумя группами на 42 день.

Описание вариантов осуществления

Несмотря на то, что любые способы и материалы, аналогичные или эквивалентные тем, которые описаны в настоящем документе, могут быть использованы в практике или выполнении вариантов осуществления по настоящему изобретению, сейчас описываются предпочтительные способы, приборы и материалы. При этом перед описанием настоящих материалов и способов следует понимать, что настоящее изобретение не ограничивается конкретными размерами, формами, величинами, материалами, методиками, протоколами и т.п., описанными в рассматриваемом документе, поскольку они могут меняться в соответствии с определенным режимом проведения экспериментов и/или оптимизацией. Следует также понимать, что терминология, используемая в описании, служит лишь для характеристики конкретных версий или вариантов осуществления и не предназначена для ограничения сферы применения настоящего изобретения, которая ограничивается только прилагаемыми пунктами формулы изобретения.

Раскрытие каждой публикации, патента или патентной заявки, упомянутых в данной спецификации, специально включено здесь в качестве ссылки в полном объеме. При этом ничто в настоящем документе не может быть истолковано в качестве признания того, что изобретение не дает права датировать более ранним числом такое раскрытие на основании изобретения или до изобретения.

I. Определения

Формы единственного числа, как используется здесь, означают «по крайней мере, один», если иное специально не указано.

Термины «полипептид», «пептидные» и «белок» используются взаимозаменяемо в данном документе по отношению к полимеру из аминокислотных остатков. Термины относятся к аминокислотным полимерам, в которых один или несколько аминокислотных остатков представляет собой модифицированный остаток или не встречающийся в природе остаток, такой как рассматриваемый химический миметик соответствующей аминокислоты естественного происхождения, а также к аминокислотным полимерам естественного происхождения.

Термин «аминокислоты», как используется здесь, относится к аминокислотам естественного происхождения и синтетическим аминокислотам, а также к аналогам аминокислот и миметикам аминокислот, которые функционируют аналогично аминокислотам естественного происхождения. Аминокислоты могут быть как L-, так и D-аминокислотами. Аминокислоты естественного происхождения представляют собой аминокислоты, кодируемые генетическим кодом, а также аминокислоты, модифицированные после трансляции в клетках (например, гидроксипролин, гамма-карбоксиглутаминовая кислота и О-фосфосерин). Выражение «аминокислотный аналог» относится к соединениям, которые обладают той же основной химической структурой (альфа-углеродный атом, связанными с водородом, карбоксильная группа, аминогруппа и R-группа), что и у аминокислоты естественного происхождения, но имеет модифицированную R-группу или модифицированный каркас (например, гомосерин, норлейцин, метионин, сульфоксид, метионинметилсульфоний). Выражение «миметик аминокислоты» относится к химическим соединениям, которые имеют отличные структуры, но аналогичные с обычными аминокислотами функции.

Аминокислоты могут называться здесь их широко известными трехбуквенными символами или однобуквенными символами, рекомендованными Биохимической номенклатурной комиссией IUPAC-IUB.

Термины «ген», «полинуклеотиды», «нуклеотиды» и «нуклеиновые кислоты» используются взаимозаменяемо здесь, и, если специально не указано, сходно с аминокислотами их называют по общепринятым однобуквенным кодам.

Термин «композиция», используемый в настоящем документе, предназначен для охватывания продукта, включающего определенные ингредиенты в определенных количествах, а также любого продукта, который образуется, прямо или косвенно, от комбинации определенных ингредиентов в определенных количествах. Такой термин по отношению к «фармацевтической композиции» предназначен для охватывания продукта, включающего активный ингредиент(ты), и любого инертного ингредиента(ов), которые составляют носитель, а также любого продукта, который образуется, прямо или косвенно, от комбинации, комплексообразования или агрегации двух или нескольких ингредиентов, или от диссоциации одного или нескольких ингредиентов, или от других типов реакций и взаимодействий одного или нескольких ингредиентов. Соответственно, в контексте настоящего изобретения выражение «фармацевтическая композиция» охватывает любую композицию, изготовленную путем смешивания соединения по настоящему изобретению и фармацевтически или физиологически приемлемого носителя. Выражение «фармацевтически приемлемый носитель» или «физиологически приемлемый носитель», как используется в настоящем документе, означает фармацевтически или физиологически приемлемый материал, композицию, вещество или средство доставки, включая, в качестве неограничивающих примеров, жидкий или твердый наполнитель, растворитель, связующее средство, растворитель или инкапсулирующий материал, принимающий участие в переносе или транспортировке активного ингредиента(ов) от одного органа или части тела к другому органу или части тела.

Если иное не определено, термин «рак» относится к ракам и опухолям, в которых сверхэкспрессируется ген CDC45L, неограничивающих примеры которых включают опухоль яичка, рак поджелудочной железы, рак мочевого пузыря, немелкоклеточный рак легкого, мелкоклеточный рак легкого, рак молочной железы, рак пищевода, рак предстательной железы, хронический миелоидный лейкоз (ХМЛ), опухоль мягких тканей, рак желудка, гепатобилиарный рак и рак прямой кишки.

Если не определено иначе, термины «цитотоксический Т-лимфоцит», «цитотоксическая Т-клетка» и «ЦТЛ» используются взаимозаменяемо в настоящем документе и, если иное специально не указано, относятся к подгруппе Т-лимфоцитов, которые способны распознавать «не свои» клетки (например, опухолевые клетки, инфицированные вирусом клетки) и индуцировать гибель таких клеток.

Если иное не определено, термины «HLA-А24» относятся к типу HLA-А24, содержащему подтипы, такие как HLA-A*2402.

Если иное не определено, термин «HLA-А2», как используется в настоящем документе, репрезентативно относится к подтипам, таким как HLA-A*0201 и HLA-A*0206.

Если иное не определено, термин «набор», как используется в настоящем документе, применяется по отношению к комбинации реактивов и других материалов. Предполагается в настоящем документе, что набор может включать микрочип, чип, маркер и так далее. Не подразумевается, что термин «набор» ограничивается конкретным сочетанием веществ и/или материалов.

В пределах того, что способы и композиции по настоящему изобретению находят применение в контексте «лечения» рака, лечение считается «эффективным», если это приводит к клиническому преимуществу, такому как уменьшение экспрессии гена CDC45L или уменьшение размера, распространенности или метастатического потенциала рака у субъекта. В случае, когда лечение применяется профилактически, «эффективное» означает, что оно замедляет или предотвращает образование рака или предотвращает или ослабляет клинический симптом рака. Эффективность определяется в связи с каким-либо известным способом диагностики или лечения конкретного типа опухоли.

В пределах того, что способы и композиции по настоящему изобретению находят применение в контексте «предупреждения» и «профилактики» рака, такие термины взаимозаменяемо используются в настоящем документе для обозначения любой активности, кото