Альфатела для ингибирования проникновения вич

Альфатела для ингибирования проникновения вич

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Область техники, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение относится к вирусу иммунодефицита человека (ВИЧ) и к лечению ВИЧ-инфекций. Более конкретно, настоящее изобретение относится к новому классу ингибиторов проникновения ВИЧ. Дополнительно настоящее изобретение относится к применению одноцепочечных 3-нитевых альфа-спиральных суперспирализованных молекул, обозначенных "альфатела", для применения в качестве ингибиторов проникновения ВИЧ, воздействующих на субобласти gp41.

Уровень техники

Env комплексы ВИЧ-1, также известные как "комплексы гликопротеинов оболочки" или "gp120/gp41 комплексы" или "шипы ВИЧ", являются основной мишенью для лечения ВИЧ-инфекции. Они обнаружены на поверхности вирионов ВИЧ и клеток, которые сконструированы так, что экспрессируют шипы оболочки. Проникновение ВИЧ в клетку-мишень и слияние "клетка-клетка" опосредованы, главным образом, действием гликопротеиновых комплексов Env, расположенных на поверхности. В общем, считается, что способность блокировать проникновение вируса или клеточное слияние имеет важное значение в лечении ВИЧ-инфекции.

Ингибирование проникновения вируса может быть осуществлено с помощью антивирусных соединений, которые особым образом воздействуют на субобласти gp120, gp41 или на опосредующие слияние рецепторы CD4, CCR5 или CXCR4. Считается, что соединения, которые особым образом воздействуют на gp41, такие как энфувиртид (Фузеон, T-20), проявляют свой антивирусный эффект за счет блокирования ключевой стадии механизма слияния. Эта ключевая стадия хорошо известна как формирование шестиспирального пучка. Шестиспиральные пучки образуются в результате формирования фрагментами gp41-HR1 тримерной параллельной суперспирализованной структуры и прочного связывания HR2 фрагментов с этой суперспиралью. Так как HR1 может связываться с мембраной клетки-мишени через расположенный на N-конце пептид слияния, тогда как HR2 прикреплен к вирусной мембране через расположенный на С-конце трансмембранный фрагмент, то предполагают, что конденсация эктодомена цепи gp41 в компактный шестиспиральный пучок приводит к непосредственному сближению двух мембран, способствует слиянию мембран и, следовательно, проникновению вириона (или точнее его содержимого) в клетку-мишень.

Сущность изобретения

Настоящее изобретение относится к новому классу ингибиторов проникновения ВИЧ, которые, в частности, направлены (нацелены) на субобласти gp41, с целью блокирования образование шестиспирального пучка. Этот новый класс ингибиторов представляет собой одноцепочечный суперспирализованный белковый остов, обозначенный "Альфатело", который сконструирован таким образом, что связывается либо с gp41-HR1 (или с фрагментом, расположенным возле этой последовательности), либо с gp41-HR2 (или с близкорасположенным фрагментом). Настоящее изобретение также относится к бифункциональному Альфателу, которое может одновременно связываться с областями HR1 и HR2 gp41 или близкорасположенными областями. Кроме того, настоящее изобретение относится к применению таких Альфател для ингибирования опосредованного Env ВИЧ межклеточного слияния, ингибирования проникновения ВИЧ, ингибирования вирусной репликации, лечения ВИЧ-инфекции в клетках млекопитающих и человека, к способу лечения ВИЧ-инфицированных индивидуумов, к способу отбора новых анти-ВИЧ соединений с использованием Альфатела, к способу, известному под названием конкурентный анализ, и к способу вакцинации индивидуума против ВИЧ.

Настоящее изобретение относится к применению одноцепочечного 3-нитевого суперспирализованного остова, обозначенного как "Альфатело", который сконструирован для связывания с субобластями gp41 ВИЧ, такими как HR1, HR2 и прилегающими субобластями в двух различных субобластях gp41 (бифункциональное, биспецифическое связывание). В описании приведены примеры практического получения таких Альфател. Настоящее изобретение также относится к способам ингибирования ВИЧ-инфекции у индивидуума. Кроме того, предполагается, что Альфатела по настоящему изобретению могут использоваться в качестве средств скрининга для идентификации новых молекул, ингибирующих ВИЧ, как посредством анализа прямого связывания, так и посредством конкурентного анализа. Наконец, в описании приведены способы введения Альфател по изобретению в виде вакцины или лекарственного средства.

Краткое описание чертежей

Фиг.1. Образование шестиспирального пучка, состоящего из полученных из HR1 и HR2 пептидов. Белые цилиндры представляют отображение полученных из gp41-HR1 пептидных фрагментов, образующих тримерную параллельную суперспираль (N-тример); серые цилиндры представляют отображение полученных из gp41-HR2 пептидных фрагментов, связанных с бороздками между парами HR1-спиралей. Обозначения "N" и "C" указывают на N- и C-концевые области спирали, соответственно. Таким образом, HR2 спирали связаны в антипаралельной ориентации относительно HR1 спиралей. Результатом связывания является шестиспиральный пучок, как изображено справа от белой стрелки.

Фиг.2. Образование шестиспирального пучка, состоящего из HR1- и HR2-фрагментов gp41, связанных петлевым участком. Окраска и обозначения такие же, как на Фиг.1. Изогнутые стрелки представляют петлевой участок (дисульфидная петля, шпилечная петля), соединяющий HR1 фрагменты (белые цилиндры) с HR2 фрагментами (серые цилиндры) в шипах Env ВИЧ перед образованием шестиспирального пучка (слева от белой стрелки) и после образования шестиспирального пучка (справа). Взаимная ориентация HR1 и HR2 спиралей в нативных или рецептор-активированных шипах необязательно является такой, как обозначено в левой части; последняя предназначена для иллюстрации того, что HR1 и HR2 фрагменты ковалентно связаны, когда они еще разделены в пространстве.

Фиг.3. Параллельные и антипараллельные Альфатела. В блоке A представлено параллельное Альфатело; в блоке B представлено антипараллельное Альфатело. Параллельные спирали представлены белыми цилиндрами, тогда как спираль, которая является антипараллельной по отношению к другим в блоке В, изображена серым цилиндром. Изогнутые стрелки, соединяющие различные спирали, представляют линкерные фрагменты. Маленькие несоединяющие стрелки представляют N- и C-конечные удлинения Альфатела. Спирали обозначены А, В, С в соответствии с их расположением в Альфателе, которое состоит из одноцепочечной аминокислотной последовательности.

Фиг.4. Связывание Альфатела с HR2 gp41. Окраска и обозначения такие же, как на Фиг.2 и 3. Альфатело показано выделенными жирными линиями цилиндрами. Эта фигура иллюстрирует то, что Альфатело, связанное с HR2 фрагментом gp41, предотвращает его от связывания с N-тримером gp41 и тем самым препятствует образованию шестиспирального пучка. Вероятность того, что два или три HR2 фрагмента в шипе ВИЧ связаны с одинаковым количеством Альфател, не показана на фигуре, но также не исключается.

Фиг.5. Связывание Альфатела с HR1 gp41. Окраска и обозначения такие как на Фиг.4. Эта фигура иллюстрирует то, что Альфатело, связанное с N-тримером gp4, предотвращает его от связывания с HR2 фрагментом gp41 и тем самым препятствует образованию шестиспирального пучка. Вероятность того, что два или три Альфатела связываются с одинаковым количеством бороздок N-тримера ВИЧ шипа, не показана на фигуре, но также не исключается.

Фиг.6. Одновременное связывание Альфатела с HR1 gp41 и HR2. Окраска и обозначения такие, как на Фиг.4. Эта фигура иллюстрирует то, что Альфатело, связанное одновременно с N-тримером gp4 и с HR2 фрагментом gp41, препятствует связыванию последнего с N-тримером и тем самым препятствует образованию шестиспирального пучка. Эта фигура, таким образом, иллюстрирует бифункциональное Альфатело. Вероятность того, что два или три Альфатела связывают по подобному пути ВИЧ шип, не показана на фигуре, но также не исключается.

Фиг.7. Структурные аспекты, связанные с трансплантацией остатков. Блок A демонстрирует изображение N-тримера и HR2 спирали. В этом примере N-тример является N40 последовательностью, опубликованной в Root et al. Science 2001, 291: 884-888. Последовательность HR2 является C38 последовательностью (ibid). Спирали представлены в виде, в котором Z-ось N-тримера направлена в обратном направлении (N-конец впереди) и HR2 спиральная ось HR2 направлена в прямом направлении (N-конец сзади). Таким образом, описанные спирали антипараллельны друг другу. Маленькая стрелка между окружностями предполагает наложение HR2 (C-)спирали сверху на N-спираль, не учитывая несогласование направления. На практике это будет соответствовать наложению позиций c, f, b, e, a, d, g HR2 на позиции d, a, e, b, f, c, g N-спирали, соответственно. Замена N-спирали соответствующей C-спиралью приведет к структуре, сходной с изображенной в блоке B. Тем не менее, прямой и значительной проблемой этого пути рекомбинирования N- и C-пептидных фрагментов является неизбежное нарушение укладки внутреннего слоя. Отличительной особенностью настоящего изобретения является то, что такой проблемы не возникает при применении антипараллельных Альфател. Достаточно того, чтобы перенести позиции HR2, обозначенные d, a и e в блоке A, к позициям, обозначенным b, f и с в блоке B, соответственно, для получения структуры Альфатела с плотно уложенным изолейциновым кором и которая имеет как бороздку связывания HR2, так и спираль, несущую остатки HR2, связывающие бороздку. Блоки С и D иллюстрируют то, как такая структура может фиксировать соответствующие области в вирусной молекуле gp41; на блоках С и D представлены продольный и перпендикулярный по отношению к осям спиралей виды, соответственно (все спирали идеализированы, и суперспирализацией пренебрегли). Двойные стрелки обозначают не создающие связь взаимодействия (связывание). Длинная стрелка, соединяющая N-спираль с HR2 спиралью вируса, представляет шпилеобразную петлю. Блок D явно иллюстрирует то, что спираль B в Альфателе (с трансплантированными HR2 остатками) и пара спиралей вирусного N-тримера (формирующего сайт связывания) направлены антипараллельно. Подобным образом, образующие бороздку спирали A и С Альфатела и вирусная HR2 спираль также антипараллельны. Эта фигура, таким образом, предоставляет логичное обоснование, которое лежит в основе конструкции биспецифического Альфатела с возможностью одновременно воздействовать на N-тример и HR2 фрагмент шипов Env ВИЧ-1.

Фиг.8. Выравнивание последовательности Альфатела с HR1 и HR2 последовательностями. A представляет собой выравнивание HR1 последовательности, обозначенной "N-40" (остатки между положениями 543 и 582 HXB2 gp160), с последовательностью отобранного Альфатела, обозначенного scAB013" (только 1 его спираль), в трех различных рамках. Гептадные a/d-позиции окрашены серым. B представляет собой выравнивание HR2 последовательности, обозначенной "C38" (остатки между положениями 625 и 662 HXB2 gp160), с последовательностью выбранного Альфатела scAB013 (1 спираль) в двух различных рамках, таких, что позиции a, d и e C38 сопоставляются с позициями f, b и c Альфатела, соответственно. Таким образом, вступающие во взаимодействие остатки HR2 (С38) (окрашенные серым), при трансплантации в Альфатело будут повернуты от центра Альфатела.

Фиг.9. Предварительный отбор аминокислот бороздки. A представляет отбор остатков, которые должны быть трансплантированы в g- и c-позиции A-спирали Альфатела (окрашенные серым) в трех диапазонах, которые возможны для выравнивания Альфатело/HR1. B представляет собой аминокислотную последовательность немутированной B-спирали Альфатела, дополненной соответствующими фланкирующими линкерами L1 и L2. C представляет собой отбор остатков, которые должны быть трансплантированы в позиции e и b C-спирали Альфатела (окрашенные серым) в трех возможных гептадных диапазонах.

Фиг.10. Структурно оптимизированные последовательности бороздок. A представляет собой аминокислотную последовательность структурно оптимизированной A-спирали в трех диапазонах, которые возможны для выравнивания Альфатело/HR1. B представляет собой аминокислотную последовательность немутированной B-спирали Альфатела, дополненной соответствующими фланкирующими линкерами L1 и L2. C представляет собой аминокислотную последовательность структурно оптимизированной C-спирали в трех диапазонах выравнивания. Остатки, появляющиеся в первоначальном Альфателе scAB013, не подчеркнуты. Подчеркнутые одной чертой остатки являются трансплантированными из HR1 аминокислотами. Подчеркнутые двумя чертами остатки являются мутациями, выбранными на основании структурных расчетов.

Фиг.11. Предварительная трансплантация остатков HR2. B представляет собой аминокислотную последовательность B-спирали Альфатела c трансплантированными остатками HR2 (окрашенные серым) в двух возможных диапазонах для выравнивания с пептидом C38 HR2. Обозначение "B" служит только для того, чтобы продемонстрировать, что трансплантация должна быть выполнена в B-спирали Альфатела.

Фиг.12. Структурно оптимизированные последовательности B-спирали. A представляет собой аминокислотную последовательность немутированной A-спирали Альфатела, дополненной соответствующим фланкирующим линкером L1. B представляет собой структурно оптимизированную B-спираль в двух диапазонах, которые возможны для выравнивания Альфатело/HR2. C представляет собой аминокислотную последовательность немутированной C-спирали Альфатела с предшествующим соответствующим фланкирующим линкером L2. Остатки, появляющиеся в первоначальном Альфателе scAB013, не подчеркнуты. Подчеркнутые одной чертой остатки являются трансплантированными из HR2 аминокислотами. Подчеркнутые двумя чертами остатки являются мутациями, выбранными на основании структурных расчетов.

Фиг.13. Итоговые структуры Альфатела с подобными N-тримеру связывающими бороздками. A представляет собой 3 аминокислотные последовательности, которые должны быть включены в качестве A-спирали в Альфатело; L1 представляет последовательность линкера 1; B представляет собой аминокислотную последовательность, которая должна быть включена в состав Альфатела в качестве B-спирали, независимо от последовательностей A- и C-спирали; L2 представляет последовательность линкера 2; C представляет собой 3 аминокислотные последовательности, которые должны быть включены в качестве C-спирали в состав Альфатела. Остатки подчеркнуты в соответствии с Фиг.10. Последовательности должны быть соединены в Альфателе в порядке Ai-L1-B-L2-Ci, где i относится к любому из показателей, стоящих перед последовательностями A и C. Таким образом, эти фигуры представляют три различные структуры, которые сконструированы для воздействия на различные субобласти HR2 в gp41 ВИЧ-1.

Фиг.14. Итоговые структуры Альфатела с подобными HR2 поверхностными остатками. A представляет собой аминокислотную последовательность, которая должна быть включена в состав Альфатела в качестве A-спирали независимо от последовательности B-спирали; L1 является последовательностью линкера 1; B представляет собой 2 аминокислотные последовательности, которые должны быть включены в состав Альфатела в качестве B-спирали; L2 является последовательностью линкера 2; C представляет собой аминокислотную последовательность, которая должна быть включена в состав Альфатела в качестве C-спирали, независимо от последовательности B-спирали. Остатки подчеркнуты в соответствии с описанием к Фиг.12. Последовательности должны быть соединены в Альфателе в порядке A-L1-Bi-L2-C, где i относится к любому из показателей, стоящих перед последовательностями B. Таким образом, эти фигуры представляют две различные структуры, которые сконструированы для взаимодействия с различными субобластями N-тримера gp41 ВИЧ-1.

Фиг.15. CD термосканы scAB013_N3 в различных концентрациях GuHCl. Альфатело растворили в 20 мМ PBS, 150 мМ NaCl, pH 7,2 и в указанных концентрациях GuHCl: ромбы, 2 M; квадраты, 4 M; круги, 6 M денатурирующего агента. Концентрация Альфатела составляла приблизительно 12 мкМ. Средняя остаточная эллиптичность ([Theta]) была измерена при длине волны 222 нМ. Закрашенные обозначения соответствуют анализам повышения (нагревания) и обозначения соответствуют анализам понижения (охлаждения).

Фиг.16. Изотермическая титрационная калориметрия (ITC) scAB013_N3, титруемого производным C36 bL4_C36. В камеру было помещено 2,46 мкМ scAB013_N3 в 20 мМ PBS, 150 мМ NaCl, pH 7,2, и инъекционный шприц был наполнен 50 мкМ bL4_C36 в таком же буфере. На Фиг.16A показана необработанная термограмма после корректировки по базовой линии. Пики были проинтегрированы, скорректированы по шумам и эффекту разбавления вычитанием среднего последних четырех пиков и после этого были проинтегрированы еще раз для получения совокупного изменения энтальпии (ΔН) Фиг.16B, на которой последнее отображено как функция молярного отношения bL4_C36 к scAB013_N3. Обработка кривых с использованием равновесной модели со стехиометрией связывания 1:1 привела в результате к термодинамическим параметрам ΔH=-30 кДж/моль и Kd=150 нМ.

Подробное описание изобретения

Комплекс гликопротеинов оболочки вируса иммунодефицита типа 1 (ВИЧ-1) человека (ВИЧ-1 Env, шип) состоит из тримера гетеродимеров гликопротеина 120 (gp120) и гликопротеина 41 (gp41). Такие шипы обнаруживаются в состоянии, предшествующем слиянию. При прикреплении к клетке-мишени, опосредованном клеточными рецепторами CD4 и корецепторами хемокинов (CXCR4 или CCR5), происходят некоторые конформационные изменения, приводя в конечном счете, к состоянию после слияния и сопутствующему слиянию мембран. В промежутке между состояниями до и после слияния и в результате частичных конформационных изменений, шипы принимают состояние, известное как пре-шпиличное состояние или промежуточный продукт слияния. Несмотря на то, что о структурной природе пре-шпиличного состояния или состояний известно не много, последнее считают важным объектом воздействия, так как некоторые субобласти, которые скрыты в состояниях до и после слияния, во время этого состояния становятся доступными для ингибиторных молекул.

Субобласти внутри ВИЧ-1 Env шипов, которые привлекли особое внимание, представляют собой фрагменты, известные как гептадные повторы 1 (HR1) и гептадные повторы 2 (HR2). При переходе от состояния до слияния в состояние после слияния, HR1 фрагменты образуют тримерную (3-нитевую) параллельную суперспирализованную структуру, также известную как "N-тример". Эта суперспирализованная структура состоит из трех прочно взаимодействующих параллельных альфа-спиралей. В продольном направлении этих альфа-спиралей, между каждой спиральной парой имеется неглубокая бороздка. Таким образом, на каждый N-тример приходится три бороздки. Так как аминокислотные последовательности HR1 в каждом шипе идентичны, N-тример по-видимому по существу структурно симметричен, несмотря на то, что во время динамического процесса конформационных изменений из состояния до в состояние после слияния эта структурная симметрия, вероятно, не будет сохранена все время.

Как известно из экспериментально определенной трехмерной (3-D) структуры, представляющей состояние после слияния, каждая из трех бороздок в N-тримере по меньшей мере обладает способностью связывать фрагмент. Таким образом, на N-тример приходится три связывающие HR2 бороздки (участка, поверхности). Эти 3-D структуры также демонстрируют, что HR2 фрагменты связывают в альфа-спиральной конформации и эти альфа-спирали связаны в антипараллельной ориентации по отношению к HR1 спиралям N-тримера. HR1 спирали образуют внутреннюю тримерную параллельную суперспираль, и HR2 спирали образуют внешние спирали.

Комплекс между пептидами, полученными из HR1 и HR2, обычно называют "шестиспиральным клубком" (см. Фиг.1). Последний может быть образован простым смешением пептидов, полученных из HR1 и HR2, также называемых N- и C-пептиды, соответственно.

Тем не менее, в шипах ВИЧ HR1- и HR2-фрагменты не присутствуют в виде свободных пептидов. В шипах они образуют субобласти в непрерывной аминокислотной цепи, известной под названием гликопротеин 41 (gp41). Последняя была поделена на функциональные области следующим образом (см., например, Noah et al, Biochemistry 2008, 47:6782-6792): (i) пептид слияния (FP, остатки от 512 до 527), проксимальная к пептиду слияния область (FP-PR, остатки от 528 до 540), N-пептидная область или гептадные повторы 1 (HR1, остатки от 541 до 581), дисульфидная петля или образующая шпильку петля или область петли (LR, остатки от 582 до 627), область C-пептида или гептадные повторы 2 (HR2, остатки от 628 до 665), проксимальная к мембране наружная область (MPER, остатки от 666 до 683), трансмембранная область (TM, остатки от 684 до 705) и внутриклеточная или цитоплазматическая область (CP, остатки от 706 до 856). Нумерация остатков в настоящем описании основана на gp160 ВИЧ-1 HXB2. В различных публикациях границы указанных функциональных областей могут отличаться на около 5 остатков. Внеклеточный домен (эктодомен) gp41 соответствует остаткам от 512 до 683, Таким образом, HR1 и HR2 соответственно локализованы в первой (N-концевая) и второй (C-концевая) половинах эктодомена gp41, и они разделены областью петли.

В пределах эктодомена gp41 фрагменты HR1 и HR2 могут образовывать шестиспиральный пучок, который имеет большое структурное сходство с пептидными шестиспиральными пучками. Следовательно, шестиспиральный пучок состоит из тримера гетеродимеров HR1/HR2, также известных как тример шпилек, и в котором каждый HR1 связан с HR2 областью петли (см. Фиг.2). Таким образом, область петли выполняет двойственную роль: линкера и разделителя.

В данной области неизвестно как конкретно HR1 и HR2 остаются разделенными в нативных пре-слитых шипах. Тем не менее, известно, что шип существует в виде тримера гетеродимеров gp120/gp41 (необходимо отличать их от гетеродимеров HR1/HR2). Имеются лишь скудные сведения, в соответствии с которыми остатки из gp120 и gp41 образуют поверхность раздела между двумя типами субъединиц в состоянии до слияния, и нет никаких прямых структурных доказательств. Тем не менее, увеличивается количество фактов, в соответствии с которыми различные субобласти из gp41 вовлечены во взаимодействие с gp120, и эти субобласти связываются более или менее независимо друг от друга (смотрите, например, Kim et al. J Mol Biol 2008, 376:786-797). Следовательно, возможно, что gp120 играет роль пространственного разделителя для фрагментов gp41 в состоянии до слияния. Известно также, что gp41 встраивается в клетку-мишень посредством своего пептида слияния, который соединен с HR1 через FP-PR. Последнее приводит к промежуточному состоянию перед слиянием, в котором необходимо, чтобы HR1 был расположен дистально (отдельно в пространстве) от HR2, который сам по себе прикреплен к вирусной мембране через области MPER и TM. Все конформационные изменения вызывает CD4 и/или корецепторное связывание с gp120 (но не с gp41). Следовательно, предполагают, что существует "удобный момент" во время механизма слияния, во время которого противоположно уложенные фрагменты HR1 и HR2 доступны для воздействия и последующего ингибирования процесса слияния.

Общепринято, что функциональная роль фрагментов HR1 и HR2 в gp41 заключается в запуске слияния вирусной мембраны и мембраны клеток мишеней через образование шестиспирального пучка. Таким образом, ингибирование образования шестиспирального пучка считают обоснованным подходом для предотвращения слияния мембран и вирусной инфекции.

Особый интерес для настоящего изобретения представляют некоторые пептиды, которые получены непосредственно из HR1 и HR2 последовательностей gp41. Например, предполагается, что полученные из HR2 пептиды, такие как C34 (остатки 628-661), непосредственно воздействуют на N-тример, где они образуют стерическое препятствие для HR2, таким образом, предотвращая образование шестиспирального пучка и слияние мембран. И наоборот, одним из предложенных механизмов действия для N-пептидов, например N36 (остатки 546-581), является то, что они образуют тримерные комплексы в растворе, которые способны удерживать HR2, когда он становится доступным. Несмотря на то, что последняя возможность остается предметом споров, комплексы тем не менее стимулировали образование пятиспирального пучка (см., например, Root et at. Science 2001, 291:884-888 и заявку на патент США 2006/0014139 A1). Кроме того, другие исследователи сконструировали стабилизированные N-тримерные структуры (например, NCCG-gp41, N35CCG-N13, IQ-N23, см. источники в Gustchina et al. J Virol 2008, 82:10032-10041). Было продемонстрировано, что все они проявляли сильное антивирусное действие, с IC50 в основном в низконаномолярных пределах. Таким образом, была продемонстрирована способность воздействовать на области gp41 ВИЧ-1 как для HR1-, так и для HR2-субфрагмента.

Ранее с различным успехом были разработаны различные молекулы, ингибирующие проникновение ВИЧ (ингибиторы проникновения или слияния). Они могут быть упрощенно разделены на антитела, неиммуноглобулиновые белки, пептиды и малые молекулы. Неограничивающими примерами моноклональных антител являются D5, 2F5 и 4E10. Неограничивающими примерами неиммуноглобулиновых белков являются растворимые CD4 и пятичленная спираль. Неограничивающими примерами пептидов являются T20, T-1249 и N36. Неограничивающими примерами малых молекул являются BMS-806, Maraviroc и AMD070. Единственным ингибитором проникновения, одобренным для клинического использования, является энфувиртид (Fuzeon, T20). Тем не менее, проблемами последнего лекарственного средства являются безопасность, переносимость, реакции в месте инъекции, соблюдение пациентами инструкций по приему препарата и развитие резистентности. Вследствие этого, существует постоянная необходимость в лекарственных средствах против ВИЧ, включая ингибиторы проникновения ВИЧ. Существует также постоянная необходимость в новых лекарственных средствах и лекарственных образцах с улучшенными характеристиками по сравнению с существующими лекарственными средствами и лекарственными образцами. Более конкретно, существует необходимость в пептидных или белковых лекарственных средствах, которые препятствуют проникновению ВИЧ и межклеточному слиянию с повышенной активностью (противовирусная активность, противовирусная эффективность, более низкие дозировки, более низкие значения EC50). Также существует необходимость в белковых лекарственных средствах, молекулярный размер которых меньше, чем, например, у антител или пятичленной спирали; вероятно, такие лекарственные средства могут быть произведены с меньшими затратами, для них требуется меньшее количество исходного материала (при постоянной молярной EC50), возможно могут быть введены местно (т.е., в виде крема, на пластыре) и, вероятно, более пригодны для воздействия на частично окклюдированные области связывания в шипах (т.е., они, вероятно, менее подвержены эффектам стерических препятствий и имеют более высокий коэффициент диффузии). Дополнительно, также существует необходимость в устойчивых лекарственных средствах с длительным сроком хранения, высокой растворимостью и устойчивостью к действию протеаз. В наибольшей степени существует острая необходимость в новых лекарственных средствах с пониженной способностью вызывать спасательные мутации (мутации резистентности).

Все варианты осуществления настоящего изобретения относятся к одноцепочечным суперспирализованным молекулам, которые в настоящем описании обобщенно обозначены "Альфатела". Подобные одноцепочечные суперспирали были описаны в Desmet et al., EP 081720179 и Desmet et al., US 61/120642. Вкратце, Альфатело в настоящем описании будет означать одноцепочечную суперспираль, имеющую одиночную смежную аминокислотную цепь с формулой HRS1-L1-HRS2-L2-HRS3, по желанию дополненную N- и C-конечными удлинениями с итоговой формулой N-HRS1-L1-HRS2-L2-HRS3-C, в которой (a) каждый из HRS1, HRS2 и HRS3 является независимой последовательностью гептадных повторов (HRS), состоящей из от 2 до 7 последовательных областей гептадных повторов (HR), последовательность которых может быть обозначена как a-b-c-d-e- f-g, по меньшей мере 50% всех гептадных позиций a и d заняты изолейциновыми остатками, и HRS1, HRS2 и HRS3 вместе составляют 3-нитевую альфа-спиральную суперспирализованную структуру; (b) каждый из L1 и L2 независимо является линкерным фрагментом, ковалентно соединяющим HRS1 с HRS2 и HRS2 с HRS3, соответственно, начинающимся и заканчивающимся пролином или глицином и состоящим из от 3 до 30 аминокислотных остатков, из которых по меньшей мере 50% выбраны из группы пролин, глицин, серин; и (c) N и С независимо являются необязательным удлинением, ковалентно присоединенным к N- и C-концу HRS1 и HRS3, соответственно, при этом эта связь должна характеризоваться наличием нарушающих спираль пролина или глицина.

Как указано выше, по меньшей мере 50% всех гептадных позиций a и d заняты изолейциновыми остатками. Оставшиеся позиции a и d могут быть любой из 20 аминокислот природного происхождения или аминокислотами неприродного происхождения.

Кроме того, аминокислоты в каждом из L1 и/или L2, которые не являются пролином, глицином или серином могут быть любой из 20 аминокислот природного происхождения или аминокислотами неприродного происхождения.

Аминокислоты в позициях b, c, e, f и g могут также быть любой из 20 аминокислот природного происхождения или аминокислотами неприродного происхождения.

Выражение "аминокислота природного происхождения" относится к следующим аминокислотам: аланин, аспарагиновая кислота, аспарагин, цистеин, глутамин, глутаминовая кислота, фенилаланин, глицин, гистидин, изолейцин, лизин, лейцин, метионин, пролин, аргинин, серин, треонин, валин, триптофан и тирозин.

Выражение "аминокислоты неприродного происхождения" в используемом в настоящем описании значении, относится к аминокислотам, имеющим боковую цепь, которая не встречается в L-аминокислотах природного происхождения. Примеры неприродных аминокислот и производных включают в себя, но не ограничены ими, агматин, (S)-2-амино-4-((2-амино)пиримидинил)бутановую кислоту, 4-аминобутановую кислоту, 4-амино-3-гидрокси-5-фенилпентановую кислоту, 4-амино-3-гидрокси-6-метилгептановую кислоту, 6-аминогексановую кислоту, альфа-аминометилпропановую кислоту, бензофенон, т-бутинглицин, цитруллин, циклогексилаланин, дезаминотирозин, L-(4-гуанидино)фенилаланин, гомоаргинин, гомоцистеин, гомосерин, гомолизин, н-формилтриптофан, норлейцин, норвалин, фенилглицин, (S)-4-пиперидил-N-амидино)глицин, орнитин, парабензоил-L-фенилаланин, саркозин, статин, 2-тиенилаланин и/или D-изомеры аминокислот природного или неприродного происхождения.

Альфатела имеют относительно маленький размер (приблизительно от 10 до 20 кДа). Таким образом, это свойство согласуется с необходимостью в терапевтических белковых молекулах с размером, который меньше, чем размер антитела или пятичленной спирали. Альфатела также являются чрезвычайно термоустойчивыми и относительно нечувствительными к изменениям pH и протеолитическому разрушению. Эти свойства формируют прочную основу для совершенствования сконструированных Альфател с сохранением требуемых физико-химических свойств и с достигнутыми терапевтическими функциями. Следовательно, Альфатела согласуются с необходимостью в терапевтических молекулах, которые имеют длительный срок хранения. Альфатела также высокорастворимы, что согласуется с необходимостью в терапевтических молекулах, которые можно без труда испытывать in vitro. Наиболее важен тот факт, что Альфатела хорошо конструируемы (взаимозаменяемы, подвергаются мутациям), что согласуется с необходимостью в создании новых терапевтических молекул с высоким сродством и специфичностью к выбранным молекулам-мишеням.

В целом Альфатела хорошо выполняют роль молекулы-остова для распознавания мишени, так как они относительно нечувствительны к множественным одновременным аминокислотным заменам. Например, структурная целостность Альфател в целом не значительно изменяется, когда все аминокислотные остатки отдельной бороздки одновременно мутированы. Схожим образом, структурная целостность не изменяется значительно, когда все экспонированные на поверхность аминокислотные остатки отдельной альфа-спирали одновременно мутированы.

Вследствие этого, заявители рассмотрели вероятность введения многочисленных замен в первоначальное Альфатело с целью предоставления Альфатела, которое связывает внеклеточный домен gp41 ВИЧ-1, при этом указанный внеклеточный домен определяется как аминокислотные остатки от 1 до 683 SEQ ID NO: 1.

Следовательно, настоящее изобретение относится к Альфателу, которое связывает HR1 фрагмент gp41 ВИЧ-1, при этом указанный HR1 фрагмент определяется как аминокислотные остатки от 546 до 581 SEQ ID NO: 1.

Настоящее изобретение также относится к Альфателу, которое связывает HR2 фрагмент gp41 ВИЧ-1, при этом указанный HR2 фрагмент определяется как аминокислотные остатки от 628 до 661 SEQ ID NO: 1.

Настоящее изобретение также относится к Альфателу, которое связывает одновременно HR1 и HR2 фрагменты из gp41 ВИЧ-1, при этом указанные HR1 и HR2 фрагменты определяются как аминокислотные остатки от 546 до 581 и от 628 до 661 SEQ ID NO: 1, соответственно.

Дополнительно, настоящее изобретение также относится к Альфателам, проявляющим участок связывания субобласти gp41 рядом с HR1, т.е., пептидом слияния, областью, проксимальной пептиду слияния, и первой половиной области петли. Аналогичным образом предоставление Альфател, проявляющих участки связывания с субобластями gp41 рядом с HR2, т.е., второй половиной области петли и проксимальной к мембране наружной областью, включено в рамки изобретения, как и предоставление Альфател, проявляющих как участки связывания субобласти gp41 рядом с HR1, так и рядом с HR2, соответственно, бифункциональных Альфател.

Альфатела могут существовать как в виде параллельных, так и в виде антипараллельных одноцепочечных суперспиралей (Фиг.3). Как параллельные, так и антипараллельные Альфатела пригодны для воздействия на субобласти gp41. Предполагают, что непосредственный функциональный эффект связывания таких субобластей является блокирующим (например, предотвращение или ингибирование) образование шестиспирального пучка. Такое блокирование посредством связывания с субобластями gp41 вблизи HR2 проиллюстрировано на Фиг.4. Такое блокирование посредством связывания с субобластями gp41 вблизи HR1 проиллюстрировано на Фиг.5. Такое блокирование посредством связывания одновременно с субобластями gp41 вблизи HR1 и HR2 проиллюстрировано на Фиг.6.

Принимая во внимание то, что HR2 фрагменты в шестиспиральном пучке антипараллельны по отношению к спирали центрального N-тримера, заявители предположили, что антипараллельные Альфатела могут быть лучше, чем параллельные Альфатела, приспособлены к одновременному связыванию с субобластями gp41 вблизи HR1 и HR2, хотя параллельные Альфатела также могут обеспечивать лучшее бифункциональное связывание.

Одним из преимуществ бифункционального связывания может быть большая связывающая способность или более сильный антивирусный эффект. Другим преимуществом бифункционального связывания может быть более низкая склонность к появлению мутаций резистентности. Вследствие этого, некоторые варианты осуществления настоящего изобретения могут согласоваться с необходимостью в новых антивирусных лекарственных средствах, которые менее подвержены вирусной резистентности.

В предпочтительном варианте осуществления предоставлены Альфатела, для которых связывание с gp41 ВИЧ-1 характеризуется константой диссоциации (Kd) или половиной максимальной эффективной концентрации (EC50) в субмикромолярных пределах, предпочтительно константа диссоциации (Kd) или половина максимальной эффективной концентрации (EC50) менее 1,0 микромолярной, или в субнаномолярных пределах, предпочтительно константа диссоциации (Kd) или половина максимальной эффективной концентрации (EC50) менее 1,0 наномолярной, или в субпикомолярных пределах, предпочтительно константа диссоциации (Kd) или половина максимальной эффективной концентрации (EC50) менее 1,0 пикомолярной. Эти технологии включают в себя, но не ограничиваются ими, RIA (радиоиммуноанализы), ELISA (твердофазный иммуноферментный анализ), "сандвичевые" иммуноанализы, радиоиммуноанализы, гельдиффузионные реакции преципитации, быстрые иммунодиффузионные анализы, Вестерн блоттинг, реакции преципитации, реакции агглютинации (например, реакции гелевой агглютинации, реакции гемагглютинации, и т.д.), реакции связывания комплемента, иммунофлуоресцентные анализы, анализы с протеином A и анализы с иммуноэлектрофорезом и т.д.

В используемом в настоящем описании значении термин "Вестерн блоттинг" относится к анализу белка(ов) (или полипептидов), иммобилизованных на н