Гибридный белок на основе l-аспарагиназы wolinella succinogenes, штамм escherichia coli - продуцент гибридного белка (варианты) и способ получения гибридного белка, обладающего противоопухолевой активностью

Гибридный белок на основе l-аспарагиназы wolinella succinogenes, штамм escherichia coli - продуцент гибридного белка (варианты) и способ получения гибридного белка, обладающего противоопухолевой активностью

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Изобретение относится к области биотехнологии и касается гибридных белков на основе рекомбинантной L-аспарагиназы Wolinella succinogenes, обладающих противоопухолевой активностью и характеризующихся повышенной протеолитической стабильностью и гепарин-связывающей активностью.

В качестве ферментов медицинского назначения L-аспарагиназы широко используют во всем мире для лечения острого лимфобластного лейкоза (ОЛЛ) [Горошкова с соавт., 2008], кроме того, имеются данные об эффективности L-аспарагиназ при лечении миелобластной лейкемии [Duval et al, 2002], Ходжкинской и не-Ходжкинской лимфом, миелосаркомы и множественной миеломы [Perel et al, 2002]; NK/T-клеточной и кожной Т-клеточной лимфом [Obama et al, 1999; Yong et al, 2003; Jaccard et al, 2009]; метастазирующих опухолей, имеющих неблагоприятный прогноз [Jaccard et al, 2011]; саркомы мягких тканей [Tardito et al, 2007], гепатоклеточной саркомы и гастросаркомы [Cappelletti et al, 2008; Scotti et al, 2011].

Биологической мишенью L-аспарагиназ являются непосредственно злокачественные клетки, пролиферация которых в естественных условиях зависит от поступления извне аминокислоты L-аспарагина. Введение L-аспарагиназ в системный кровоток пациентов обеспечивает расщепление свободно циркулирующего L-аспарагина с образованием аспарагиновой кислоты и аммония [Красоткина и Соколов, 2011]. Механизм противоопухолевого действия L-аспарагиназ основан на индукции "голодания", приводящего к гибели лейкозных клеток в результате ограничения доступа к источнику L-аспарагина.

Практически все известные L-аспарагиназы в большей или меньшей степени обладают L-глутаминазной активностью, вносящей вклад и в противоопухолевую активность ферментов и в проявление негативных эффектов [Reinert et al., 2006; Chan et al., 2014].

Известны препараты на основе немодифицированной L-аспарагиназы ЕсА бактерий Escherichia coli и на основе химически модифицированной, пэгилированной L-аспарагиназы ПЭГ-ЕсА [Avramis et al., 2002]. Спектр побочных эффектов обоих вариантов ЕсА довольно широкий и в значительной степени схожий. Кроме того, вследствие перекрывания иммунного ответа модифицированный вариант ЕсА не подходит на роль препарата второй очереди после обычной ЕсА [van den Berg, 2011].

Альтернативой ЕсА является L-аспарагиназа ErA бактерий Erwinia chrysanthemi (эрвиназа) [Duval et al., 2002], которая вызывает меньшее количество осложнений [Durden et al., 1983; Eden et al., 1990; Duval et al., 2002; Appel et al., 2006], но имеет худшие показатели эффективности [Duval et al., 2002; van den Berg, 2011]. Кроме того, у одной трети пациентов с чувствительностью к L-аспарагиназе ЕсА наблюдаются антитела, распознающие ErA [Billett et al., 1992; Vrooman et al., 2010], что затрудняет последовательное применение этих ферментов.

Поскольку L-аспарагиназы являются весьма эффективными, но не идеальными агентами для лечения ОЛЛ [Covini et al., 2012], первостепенный интерес представляют направления их качественного усовершенствования [Patel et al., 2009].

Известно, что эффективность клинического применения L-аспарагиназ коррелирует со временем их жизни в системном кровотоке [Asselin, 1999]. Вместе с тем детальный механизм инактивации и последующей элиминации L-аспарагиназ из системного кровотока до сих пор остается неизвестным [Patel et al., 2009], хотя имеются данные, что L-аспарагиназы деградируют под действием различных протеолитических ферментов крови, таких как ферменты трипсинового ряда [Newsted et al., 1995; Kotzia et al., 2007], и лизосомальные цистеиновые протеиназы [Patel et al., 2009].

Увеличения устойчивости к действию протеиназ достигают в результате направленного изменения аминокислотных последовательностей L-аспарагиназ путем замены чувствительных остатков на альтернативные, не узнаваемые соответствующими протеиназами [Kotzia et al., 2007; Patel et al., 2009; Offman et al., 2011].

Известны другие способы стабилизации L-аспарагиназ, а именно: упаковка L-аспарагиназ в матриксы на основе липосом, гидрогелей и др. [Verma et al., 2007], специфическое и неспецифическое экранирование сайтов протеолиза на поверхности молекул L-аспарагиназ с использованием генетически коньюгированных фрагментов антител [Newsted et al., 1995; Ramjeesingh et al., 1992] или химически коньюгированных природных и искусственных молекул, такие как альбумин, белок шелка, декстран, полисиаловые и жирные кислоты, полиэтиленгликоль, поливиниловый спирт, полимеры на основе повторяющихся аминокислотных остатков и др., соответственно [Poznansky et al., 1982; Zhang et al., 2005; Fu & Sakamoto, 2007; Abribat, 2011; Martins et al., 1990; Martins et al., 1996; Verma et al., 2007], инкапсуляции в живые клетки эритроцитов [Covini et al., 2012; van den Berg, 2011; Kwon et al., 2009; Kravtzoff et al., 1990; Kravtzoff et al., 1996; Hamidi et al., 2007; Domenech et al., 2011].

Одно из недавних открытий свидетельствует, что стабилизация и удлинение времени жизни фармацевтически активных белков достигается в результате их связывания с гепарансульфатсодержащими протеогликанами (ГСПГ) [Xia et al., 2012; Dubrac et al., 2010; Bramono et al., 2012; Sommer & Rifkin, 1989; Xu & Esko, 2014; http://sportswiki.ru/%D0%93%D0%B5%D0%BF%D0%B0%25Dl%80%D0%B8%D00/oBDl].

Гепарансульфаты (ГС) представляют собой модифицированные линейные отрицательно заряженные (кислые) полисахариды подкласса гликозаминогликанов, синтезируемые на белковой подложке [Bourin and Lindahl, 1993].

Один из видов ГС, гепарин представляет собой отделенный от белковой основы свободный гликозаминогликан, являющийся компонентом противосвертывающей системы крови. Гепарин играет важную роль в воспалительных, в частности, аллергических реакциях, однако в плазме здоровых людей его выявить не удается, так как его быстро захватывают и разрушают макрофаги [Forsberg et al., 1999].

Другой вид ГС постоянно связан с сердцевинным белком (core protein) в составе ГСПГ и содержит по сравнению с гепарином больше D-глюкуроновой кислоты и N-ацетилглюкозамина и меньше сульфатных групп. Доля ГС в общей массе ГСПГ составляет 90-95%.

ГС вовлечены во множество физиологических процессов и участвуют во взаимодействии с множеством различных белков [Rosenberg & Damus, 1973; Jin et al., 1997; Karlsson et al, 1988; van der Strate et al, 2001; Bramono et al, 2012; McKenzie, 2007; ; Bernfield et al., 1992; Rostand & Esko, 1997; Dechecchi et al., 2000; Dechecchi et al., 2001; Nicol et al., 2004; Smith et al., 2003a; Smith et al., 2003b; Tiwari et al., 2011; Ali et al., 2012; Lin et al., 2013; Galdiero et al., 2013; Shin et al., 2003; Wu et al., 2006; Dubrac et al., 2010; Zhao et al., 2010; Sommer & Rifkin, 1989; Xia et al., 2012]. Высокая аффинность ГС обусловлена наличием в их составе большого количества отрицательно заряженных сульфатных и карбоксильных групп, представляющих собой сильные природные полианионы, способные к электростатическим взаимодействиям со многими белковыми и синтетическими соединениями поликатионной природы.

Одним из органов, наиболее богатых ГС, является печень [http://www.medical-/enc.ru/4/heparinum.shtml]. Известно также, что печень способна задерживать до 20% всей крови организма, замедляя ее ток в 10-20 раз [http://www.medical-enc.ru/15/liver.shtml; Бабский с соавт., 1985]. Тем самым в печени создаются благоприятные условия для аккумулирования различных гепарин-связывающих белков, в том числе и L-аспарагиназ [Dubrac et al., 2010; Zhao et al, 2010; Xia et al., 2012]. В этой связи, для снижения гепатотоксичного действия представляется актуальным использование L-аспарагиназ со сниженной глутаминазной активностью.

Известны успешные попытки по снижению глутаминазной активности L-аспарагиназы ЕсА путем изменения аминокислотной последовательности фермента [Derst et al., 2000; Offman et al., 2011; Chan et al., 2014]. Мутации в положениях N24, R195, Y250 [Offman et al., 2011], а также N248 [Derst et al., 2000] и Q59 [Chan et al., 2014] приводят к снижению и аспарагиназной активности, и соотношения глутаминазной и аспарагиназной активности, в то время как другие мутации не влияют на аспарагиназную активность [Offman et al., 2011] или изменяют ее незначительно [Chan et al., 2014],

В этой связи особый интерес вызывает L-аспарагиназа WsA бактерий Wolinella succinogenes, природно обладающая исключительно низкой глутаминазной активностью, составляющей 0.015% от аспарагиназной, что в 130-600 раз меньше, чем у ферментов ЕсА или ErA [Distasio & Niederman, 1976], при том, что другие физико-химические свойства этого фермента схожи со свойствами ферментов ЕсА или ErA [Distasio et al., 1977; Distasio et al., 1982; Lubkowski et al., 1996]..

Выделение нативной L-аспарагиназы из биоиассы, полученной путем культивирования W. succinogenes, оказалось затруднительным в связи с низкой эффективностью процесса культивирования [Albanese & Kafkewitz, 1978]. Биосинтез рекомбинантной формы этого белка в гетерологичной системе экспрессии также не был удачным: результирующий фермент обладал высоким уровнем глутаминазной активности [Chan et al., 2014; Derst et al., 2000].

Одним из основных препятствий для эффективного применения L-аспарагиназ является их иммуногенность, связанная с бактериальным происхождением этих ферментов [Покровский с соавт., 2008; Kwon et al., 2009]. При этом рекомбинантная L-аспарагиназа W. succinogenes может проявлять дополнительную иммуногенность, обусловленную присутствием N-концевого формилметионина, характерного для цитоплазматических белков бактериального происхождения, в особенности получаемых в условиях сверхпродукции [Ben-Bassat & Bauer, 1987]. Наличие N-концевого метионина или формилметионина невыгодно отличает рекомбинантную L-аспарагиназу WsA, продуцируемую в цитоплазме бактериальных клеток, от секретируемых L-аспарагиназ ЕсА или ErA, подвергающихся внутриклеточному N-концевому процессингу и поэтому не содержащих N-концевой метионин или формилметионин.

Известны приемы получения в клетках бактерий безметиониновых форм цитоплазматических белков, основанные на использовании технологии гибридных предшественников этих белков [Shatzman and Rosenberg, 1987]. В этом случае осуществляют синтез гибридного предшественника, включающего целевой белок, слитый с белком-носителем, занимающим в составе предшественника N-концевое положение. Высвобождение целевого белка осуществляют, как правило, in vitro в процессе очистки с использованием высокоспецифичных протеиназ. Недостатком такой технологии является значительная ее дороговизна, обусловленная: необходимостью использования высокоочищенных препаратов протеиназ, а также количественными потерями, возникающими вследствие неспецифического протеолиза.

Исключить использование протеиназ позволяют способы, основанные на применении интеин-опосредованных систем биосинтеза и очистки белков [Fong et al, 2010], в частности, системы IMPACT (Intein-Mediated Purification and Affinity-Chitin binding Tag, NEB) [Chong et al., 1997]. В этом случае в качестве составной части гибридного белка, являющегося предшественником целевого белка, используют молекулу одного из интеинов, представляющих собой белки размером около 150 аминокислотных остатков, способные к автокаталитическому процессингу (гидролизу) пептидной связи на границе интеин-целевой белок и позволяющие таким образом получать безметиониновые формы целевых продуктов [Chong et al., 1997]. Примеров использования интеинов для получения безметиониновых форм L-аспарагиназ не известно.

На основе синтетического структурного гена нами получен вариант немодифицированной рекомбинантной L-аспарагиназы бактерий Wolinella succinogenes (обозначен Was02) имеющей аминокислотную последовательность [САА58658, GenBank], соответствующую продукту трансляции природного гена ansA [Х83689, GenBank] и разработан мутантный вариант этой L-аспарагиназы (обозначен как Was72), характеризующийся аминокислотной последовательностью, соответствующей аминокислотной последовательности L-аспарагиназы бактерий Wolinella succinogenes, в которой аминокислотный остаток валина в положении 23 заменен на остаток глутамина, а аминокислотный остаток лизина в положении 24 заменен на остаток треонина. Мутантный вариант Was72 рекомбинантной L-аспарагиназы Wolinella succinogenes обладает устойчивостью к протеолизу под действием трипсина (даже после 60 минут

инкубации) и пониженным более чем в 8 раз уровнем глутаминазной активности (по сравнению с Was02) при сохранении уровня специфической аспарагиназной активности. Задача заявляемого изобретения - расширить арсенал рекомбинантных белков на основе L-аспарагиназы Wolinella succinogenes. Задача решена путем

- получения гибридного белка, обладающего противоопухолевой активностью и заключающего в своем составе аминокислотную последовательность мутантной L-аспарагиназы бактерий Wolinella succinogenes Was72, слитую с аминокислотной последовательностью гепарин-связывающего пептида НВ1, где гибридный белок имеет последовательность, указанную в SEQ ID NO: 3 (обозначен как форма Was79M), или последовательность, указанную в положениях 161-508 SEQ ID NO: 1 (обозначен как форма Was79);

- конструирования штамма Escherichia coli ECR-89 - продуцента гибридного белка в форме Was79M, полученного путем трансформации реципиентного штамма E.coli BL21(DE3) плазмидой pET28-Was89, сконструированной на основе вектора pET28b(+) и содержащей структурный ген гибридного белка имеющего последовательность SEQ ID NO: 3;

- конструирования штамма Escherichia coli ECR-86- продуцента гибридного белка в форме Was79, имеющего последовательность, указанную в положениях 161-508 SEQ ID NO: 1, и депонированного во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов (ВКПМ) как Escherichia coli ВКПМ В-11955;

- разработки способа получения гибридного белка в форме Was79, путем культивирования штамма Escherichia coli ВКПМ В-11955 в условиях, обеспечивающих рост клеток этого штамма и биосинтез гибридного белка, с последующим отделением полученной клеточной биомассы и выделением из нее гибридного белка в условиях, обеспечивающих перевод гибридного белка либо во фракцию растворимых клеточных белков, либо во фракцию нерастворимых клеточных белков, и дальнейшей очисткой гибридного белка из белок-содержащей фракции с использованием методов ионообменной хроматографии и ультрафильтрации.

Штаммы Escherichia coli ВКПМ В-11955 (Escherichia coli ECR-86) и Escherichia coli ECR-79 - продуценты гибридного белка получены на основе реципиентного штамма E.coli BL21(DE3) [Novagen, ВКПМ В-10189].

Для получения гибридного белка Was79 использован подход, ранее не применявшийся в отношении L-аспарагиназ. Подход основан на первоначальном

биосинтезе белка в виде гибридного предшественника, содержащего дополнительную N-концевую область, заключающую в своем составе последовательность мутантного варианта int4b интеина Pch PRP8 Intein Penicillium chrysogenum (InBase, http://www.neb.com/neb/inteins.html). Мутантный вариант содержит в N-концевой части мутации CyslAla и Cys8Tyr, инактивирующие способность интеина к сплайсингу, но не затрагивающие его способность к C-концевому автокаталитическому процессингу, в результате которого в клетках штамма-продуцента образуется зрелая безметиониновая форма гибридного белка Was79.

Таким образом, получение гибридного белка Was79 осуществляют путем биосинтеза предшественника и его последующего автокаталитического процессинга (созревания), происходящего непосредственно в клетках штамма-продуцента in vivo исключительно за счет функциональной активности интеина.

Получение гибридного белка Was79M осуществляют путем непосредственного микробиологического синтеза зрелого гибридного белка в клетках штамма-продуцента (без биосинтеза предшественника и его последующего процессинга).

Полученный гибридный белок в форме Was79 или Was79M подвергают очистке.

Очистку гибридного белка осуществляют либо из фракции растворимых, либо из фракции нерастворимых клеточных белков, которые получают в результате разрушения биомассы штамма-продуцента и последующего центрифугирования. Очистку проводят с использованием методов хроматографии и ультрафильтрации, очистки позволяет

Предлагаемый способ очистки позволяет выделять целевой белок из той или другой фракции в зависимости от объема и возможностей производства.

Способ в общем виде

Биосинтез гибридного белка в форме Was79M или Was79 осуществляют следующим образом. Посевной материал штамма - продуцента культивируют в подходящей питательной среде, включающей источники углерода, азота и минеральные соли, обычно используемые для выращивания клеток E. coli при температуре от 24°С до 37°С [Маниатис с соавт., 1984, Москва, Мир]. Культивирование осуществляют в колбах или в биореакторах (ферментерах). Индукцию синтеза целевого гибридного белка осуществляют путем внесения в среду культивирования индуктора изопропил-β-D-1-тиогалактопиранозида в концентрации от 0,1 до 2 мМ или лактозы в концентрации от 0,5% до 3%. Индуктор вносят на стадии роста культуры, предшествующей стационарной фазе роста. Индукцию осуществляют на протяжении не менее 1 часа. В результате индукции клетки штамма-продуцента накапливают целевой гибридный белок в количестве до 30% от суммарного белка клеток.

Выделение и очистку гибридного белка осуществляют следующим образом. Гибридный белок выделяют из биомассы штамма-продуцента. С этой целью проводят разрушение клеток биомассы преимущественно с использованием механической гомогенизации, используя буфер, содержащий ингибиторы протеиназ фенилметилсульфонилфторид (PMSF) и динатриевую соль этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА), со значением pH, близким к нейтральному, предпочтительно 5-10 мМ калий-натрий фосфатный буфер, pH 6,2-7,2. С целью перевода гибридного белка либо во фракцию растворимых клеточных белков, либо во фракцию нерастворимых клеточных белков, изменяют ионную силу буфера для разрушения. Предпочтительно для этого в буфер для разрушения вносят хлористый натрий в концентрации от 0 до 3 М.

Выделение и очистку гибридного белка проводят в присутствии ингибитора, преимущественно в присутствии 1-10 мМ ЭДТА.

Выделение гибридного белка из фракции нерастворимых белков. В присутствии в буфере для дезинтеграции хлористого натрия в концентрации от 0,1 до 0,3 M гибридный белок преимущественно переходит во фракцию нерастворимых клеточных белков. Эту фракцию выделяют из общего клеточного лизата с помощью центрифугирования.

Гибридный белок экстрагируют из нерастворимой фракции клеточного лизата экстрагентом с высокой ионной силой (от 0 до 3 М NaCl), преимущественно 1 M раствором NaCl. Экстракт отделяют от клеточной массы центрифугированием и подвергают дальнейшей очистке.

Выделение гибридного белка из фракции растворимых белков. В присутствии в буфере для дезинтеграции хлористого натрия в концентрации менее 0,1 M или более 0,3 M гибридный белок преимущественно переходит во фракцию растворимых клеточных белков. Эту фракцию отделяют от фракции нерастворимых клеточных белков центрифугированием и подвергают дальнейшей очистке.

Очистка выделенного гибридного белка

Далее очистку гибридного белка проводят методом ионообменной хроматографии при pH 5,8-7,2 на катионообменнике, преимущественно на сорбенте SP-Сефароза (GE Healthcare, Швеция). Для этого содержащий гибридный белок центрифугат, полученный при выделении либо из растворимой фракции, либо из нерастворимой фракции клеточных белков доводят до содержания хлористого натрия 0,5-0,7 M и наносят на колонку с сорбентом SP-Сефароза. Элюируют целевой белок, повышая ионную силу до 1М NaCl.

Затем элюат гибридного белка подвергают ультрафильтрации производя замену буфера на более щелочной со значением pH 8,5-9,3, содержащий 0,15 М NaCl.

Затем фильтрат подвергают анионообменной хроматографии, в частности на сорбенте HiTrapQ (GE Healthcare, Швеция). Целевой белок выходит в проскоке. Полученный раствор подкисляют до достижения pH 5,8-7,2 и дочищают методом катионообменной хроматографии в частности на сорбенте SP-сефароза. После промывки сорбента натрий-фосфатноым буфером, содержащим до 0,5 М NaCl целевой белок элюируют буфером, содержащим 1 М NaCl. Элюат, содержащий гибридный белок, обессоливают и концентрируют с помощью ультрафильтрации, предпочтительно в тангенциальном потоке с использованием мембранного модуля с отсекающим размером 50 кДа. Выход очищенного гибридного белка, выделеного либо из растворимой фракции, либо из нерастворимой фракции клеточных белков составляет не менее 30% от исходного содержания в клеточном лизате. Чистота очищенного гибридного белка по данным электрофореза в полиакриламидном геле в денатурирующих условиях составляет не менее 95%.

Фиг. 1 - Профиль элюции белков Was02 и Was79 в условиях хроматографии на колонке HiTrap Heparin (GE Healthcare), содержащей в качестве сорбента гепарин-сефарозу. Элюцию осуществляют градиентом концентрации буфера В, представляющего собой раствор 1М NaCl в буфере нанесения. По горизонтали время элюции (мин). Вертикальная ось (слева) - оптическая плотность ОД₂₈₀ (mAU, верхняя кривая) и ОД₂₅₄ (mAU, нижняя кривая) раствора, элюируемого с колонки. Вертикальная ось (справа) - концентрация буфера В (%). Изображена наклонная линия градиента.

Фиг. 2 - Зависимость уровня излечивания лимфаденоза Фишера у мышей от дозировки препарата L-аспарагиназы, использованного для лечения. По горизонтали - дозировка фермента (МЕ/кг), по вертикали - доля излеченных животных (%). Условные обозначения препаратов L-аспарагиназ: ромб - Was02, квадрат - Was79, треугольник - Медак.

Пример 1. Конструирование синтетического гена рекомбинантной немодифицированной L-аспарагиназы W. succinogenes Was02

Синтетический структурный ген L-аспарагиназы W. succinogenes получают с использованием традиционных методов химического синтеза в составе BamHI/XhoI фрагмента ДНК (SEQ ID NO 4). Синтетический структурный ген представляет собой нуклеотидную последовательность ДНК, кодирующую немодифицированную L-

аспарагиназу W.succinogenes, имеющую аминокислотную последовательность [САА58658, GenBank], соответствующую продукту трансляции природного гена ansA [Х83689, GenBank]. В составе синтетического гена в области стартового кодона ATG локализован сайт узнавания рестриктазы NcoI. BamHI/XhoI фрагмент ДНК, заключающий синтетический ген немодифицированной L-аспарагиназы W.succinogenes, клонируют в векторе pUC57 (Y14837, GenBank), результирующую плазмиду называют pUC57-WAS.

Результирующая плазмида pUC57-WAS содержит в своем составе нуклеотидную последовательность NcoI/XhoI фрагмента ДНК, заключающего структурный ген немодифицированной L-аспарагиназы W.succinogenes.

Пример 2. Конструирование вектора pET28-Was02 и получение штамма BL21-Was02 - продуцента рекомбинантной немодифицированной L-аспарагиназы Was02 W.succinosenes

Рекомбинантная плазмида pET28-Was02 представляет собой совокупность XhoI/NcoI фрагмента ДНК векторной плазмиды pET28b(+) (Novagen) размером 5231 п.о. и NcoI/XhoI фрагмента ДНК плазмиды pUC57-WAS (пример 1) размером 995 п.о., заключающего структурный ген рекомбинантной немодифицированной L-аспарагиназы W.succinogenes.

Для получения плазмиды pET28-Was02 плазмиду pUC57-WAS расщепляют с помощью рестриктаз NcoI и XhoI, образовавшийся фрагмент ДНК размером 995 п.о. элюируют из геля с использованием кита Qiagen (Qiagen, cat. №28706) и лигируют с ДНК вектора pET28b(+), расщепленного с помощью рестриктаз NcoI и XhoI. Лигирование проводят с помощью ДНК-лигазы фага Т4. В результате получают плазмиду pET28-Was02 размером 6226 п.о.

Плазмида pET28-Was02 является экспрессионной, ее используют для биосинтеза немодифицированной L-аспарагиназы Was02 W.succinogenes в клетках E. coli. В составе плазмиды pET28-Was02 структурный ген немодифицированной L-аспарагиназы Was02 W.succinogenes находится под контролем промотора фага Т7.

Пример 3. Конструирование структурного гена рекомбинантной мутантной L-аспарагиназы Was72, содержащей мутации VK23,24QT, и получение плазмиды pUC57-Was72

Фрагмент ДНК, заключающий структурный ген рекомбинантной мутантной L-аспарагиназы Was72, получают в процессе ПЦР-амплификации с использованием в качестве матрицы ДНК плазмиды pET28-Was02. Амплификацию проводят в две стадии. Сначала амплифицируют два перекрывающихся фрагмента ДНК, для чего используют следующие пары праймеров:

Амплифицированные фрагменты ДНК элюируют из агарозного геля с использованием кита Qiagen (Qiagen, cat. №28706) и используют для ПЦР-лигирования. Для этого проводят ПЦР-амплификацию на смеси фрагментов 1 и 2 в качестве матрицы. Праймерами для амплификации служат N685 и N898. Полученный в результате ПЦР фрагмент ДНК размером 1093 п.о. элюируют из агарозного геля, обрабатывают рестриктазами Eco91I и Xhol и клонируют в векторе pUC57-WAS, расщепленном по уникальным сайтам с помощью рестриктаз Eco91I и XhoI. Сайт узнавания рестриктазы Eco91I локализован в области между стартовым кодоном ATG структурного гена L-аспарагиназы и областью, в которую были введены мутации. В результате клонирования получают плазмиду pUC57-Was72, в составе которой нуклеотидную последовательность клонированного фрагмента ДНК подтверждают с помощью секвенирования.

Плазмида pUC57-Was72 содержит уникальный BamHI/XhoI фрагмент ДНК, заключающий структурный ген рекомбинантной мутантной L-аспарагиназы Was72 W.succinogenes, в составе которой произведена замена VK23,24QT, в результате которой 23-й и 24-й аминокислотные остатки валина и лизина заменены на остатки глутамина и треонина, соответственно.

Пример 4. Конструирование вспомогательной плазмиды рЕТ28-Bam

Для получения вспомогательной плазмиды рЕТ28-Bam концы векторной части плазмиды pET28b(+) (Novagen), расщепленной с помощью рестриктаз NcoI и XhoI, лигируют в присутствии двуцепочечного ДНК-адаптера, полученного в результате отжига следующих олигонуклеотидов:

В результате получена вспомогательная плазмида рЕТ28-Bam, в составе которой между сайтами узнавания рестриктаз NcoI и XhoI сконструирован сайт узнавания рестриктазы BamHI.

Вспомогательную плазмиду рЕТ28-Bam используют для клонирования BamHI/XhoI или BglII/XhoI фрагментов ДНК.

Пример 5. Клонирование фрагмента ДНК, кодирующего мутантный вариант int4b интеина Pch PRP8 Intein, и конструирование плазмиды pET28-Int4b

Фрагмент ДНК, кодирующий мутантный вариант int4b интеина Pch PRP8 Intein, содержащего аминокислотные замены CyslAla и Cys8Tyr, получают с помощью ПЦР. Источником информации о нуклеотидной последовательности гена интеина служит файл базы данных GenBank: АМ042015. Источником информации об аминокислотной последовательности интеина служит файл базы данных InBase (New England Biolabs, USA): Pch PRP8 Intein. Матрицей для амплификации служит хромосомная ДНК штамма Penicillium chrysogenum ВКПМ F4. Амплификацию осуществляют с использованием праймеров:

Полученный в результате ПЦР фрагмент ДНК размером 497 п.о. элюируют из агарозного геля, обрабатывают рестриктазами BglII и XhoI и клонируют в векторе рЕТ28-Bam, расщепленном с помощью рестриктаз BamHI и XhoI. В результате клонирования получают плазмиду pET28-int4b, в составе которой нуклеотидную последовательность клонированного фрагмента ДНК подтверждают с помощью секвенирования.

Плазмида pET28-int4b содержит уникальный NcoI/XhoI фрагмент ДНК, заключающий структурный ген мутантного варианта int4b интеина Pch PRP8 Intein Penicillium chrysogenum. В 3′-концевой области клонированного фрагмента ДНК локализован уникальный сайт узнавания рестриктазы BamHI, который используют для получения гибридных конструкций.

Пример 6. Клонирование фрагмента ДНК, кодирующего гепарин-связываюший пептид НВ1, и конструирование плазмиды рЕТ28-НВ1

Плазмиду рЕТ28-НВ1 получают путем лигирования концов векторной части плазмиды рЕТ28-Bam, расщепленной с помощью рестриктаз BamHI и XhoI, в присутствии двуцепочечного ДНК-адаптора, полученннного в результате отжига олигонуклеотидов:

В результате получена плазмида рЕТ28-НВ1, содержащая фрагмент ДНК, кодирующий гепарин-связывающий пептид НВ1. В 3′-концевой области этого фрагмента локализован уникальный сайт узнавания рестриктазы BamHI.

Пример 7. Конструирование вспомогательной плазмиды pET28-Int4b-HB1

Плазмиду pET28-Int4b-HB1 получают путем лигирования концов векторной части плазмиды pET28-Int4b, расщепленной с помощью рестриктаз BamHI и XhoI, в присутствии двуцепочечного ДНК-адаптора, полученннного в результате отжига олигонуклеотидов N867 и N868 (пример 6):

В результате получена плазмида pET28-Int4b-HB1, содержащая фрагмент ДНК, кодирующий белок, заключающий в своем составе мутантный вариант int4b интеина Pch PRP8 Intein, слитый с гепарин-связывающим пептидом НВ1. В 3′-концевой области этого фрагмента локализован уникальный сайт узнавания рестриктазы BamHI.

Пример 8. Конструирование плазмиды pET28-Was79 для экспрессии гибридного белка Was79

Плазмиду pET28-Was79 получают путем лигирования концов векторной части вспомогательной плазмиды pET28-Int4b-HB1, расщепленной с помощью рестриктаз BamHI и XhoI, с фрагментом ДНК BamHI/XhoI плазмиды pUC57-Was72, содержащим структурный ген рекомбинантной мутантной L-аспарагиназы Was72 W.succinogenes, в составе которой присутствует замена VK23,24QT, в результате которой 23-й и 24-й аминокислотные остатки валина и лизина заменены на остатки глутамина и треонина, соответственно.

Плазмида pET28-Was79 содержит фрагмент ДНК, кодирующий белок-предшественник, характеризующийся последовательностью SEQ ID NO 1, заключающей в своем составе мутантный вариант int4b интеина Pch PRP8 Intein, слитый с последовательностью гибридного белка Was79. Гибридный белок Was79 включает в свой состав гепарин-связывающий пептид НВ1 и аминокислотную последовательность рекомбинантной мутантной L-аспарагиназы Was72 W.succinogenes, в составе которой присутствует замена VK23,24QT, в результате которой 23-й и 24-й аминокислотные остатки валина и лизина заменены на остатки глутамина и треонина, соответственно.

Плазмида pET28-Was79 является экспрессионной и может быть использована для получения гибридного белка Was79.

Состав кодонов в последовательности ДНК, кодирующей мутантный вариант int4b интеина Pch PRP8 Intein, в составе плазмиды pET28-Was79 отличается от оптимального для экспрессии в клетках Escherichia coli, и его подвергают оптимизации с получением плазмиды pET28-Was86.

Пример 9. Синтез фрагмента ДНК с оптимизированным кодоновым составом и конструирование плазмиды pET28-Was86 для экспрессии гибридного белка Was79

С использованием подходящих компьютерных программ оптимизируют состав кодонов в последовательности ДНК, кодирующей мутантный вариант int4b интеина Pch PRP8 Intein в составе плазмиды pET28-Was79, для экспрессии в клетках Escherichia coli. Далее с использованием традиционных методов синтеза генов синтезируют BglII/SalI фрагмент ДНК, содержащий оптимизированный состав кодонов и кодирующий 142 N-концевых остатка мутантного варианта int4b интеина Pch PRP8 Intein, включающего аминокислотные замены Cys1Ala и Cys8Tyr. Синтезированный BglII/SalI фрагмент ДНК клонируют в векторе pUC57, результирующую плазмиду называют pUC57-Sint4b.

Плазмиду pET28-Was86 получают путем лигирования трех фрагментов ДНК:

- уникального MluI/BamHI фрагмента ДНК вспомогательной плазмиды рЕТ28-Bam, заключающего промоторную область РНК-полимеразы фага Т7;

- BglII/SalI фрагмента ДНК плазмиды pUC57-Sint4b, заключающего оптимизированную часть структурного гена мутантного варианта int4b интеина Pch PRP8 Intein;

- SalI/MluI векторного фрагмента ДНК плазмиды pET28-Was79, заключающего C-концевую неоптимизированную часть последовательности ДНК, кодирующей мутантный вариант int4b интеина Pch PRP8 Intein, и последовательность ДНК, кодирующую гибридный белок Was79.

В результате получают плазмиду pET28-Was86, которая содержит последовательность ДНК (SEQ ID NO 2), имеющую оптимизированный состав кодонов и кодирующую белок-предшественник, заключающий в своем составе мутантный вариант int4b интеина Pch PRP8 Intein, слитый с последовательностью гибридного белка Was79.

Плазмида pET28-Was86 является экспрессионной, ее используют для биосинтеза гибридного белка Was79, содержащего в качестве N-концевого остатка серии.

Пример 10. Конструирование плазмиды pET28-Was89 для экспрессии гибридного белка Was79M

Плазмиду pET28-Was89 получают путем лигирования концов векторной части вспомогательной плазмиды рЕТ28-НВ1, расщепленной с помощью рестриктаз BamHI и XhoI, и BamHI/XhoI фрагмента ДНК плазмиды pUC57-Was72, заключающего последовательность ДНК, кодирующую мутантную L-аспарагиназу Was72 W.succinogenes, в составе которой присутствует замена VK23,24QT, в результате которой 23-й и 24-й аминокислотные остатки валин и лизин заменены на остатки глутамина и треонина, соответственно.

Результирующая плазмида pET28-Was89 содержит последовательность ДНК, кодирующую гибридный белок Was79M (SEQ ID NO 3), включающий гепарин-связывающий пептид НВ1, слитый с последовательностью мутантной L-аспарагиназы Was72 W.succinogenes, в составе которой присутствует замена VK23,24QT, в результате которой 23-й и 24-й аминокислотные остатки валин и лизин заменены на остатки глутамина и треонина, соответственно.

Плазмида pET28-Was89 является экспрессионной, ее используют для биосинтеза гибридного белка Was79M, содержащего N-концевой метионин или формилметионин.

Пример 11. Получение штамма E. coli ECR-79 - продуцента гибридного белка Was79

Штамм E. coli ECR-79, продуцент гибридного белка Was79, получают путем трансформации реципиентного штамма E. coli BL21(DE3) (Novagen) - ВКПМ В-10189 плазмидой pET28-Was79, содержащей не оптимизированную по составу кодонов последовательность ДНК, кодирующую мутантный вариант int4b интеина Pch PRP8 Intein. Трансформацию осуществляют с применением реактива CaCl₂ [Маниатис с соавт., 1984]. Колонии трансформированного штамма отбирают на селективной среде, содержащей антибиотик канамицин.

В результате трансформации получают штамм E. coli ECR-79, который используют для биосинтеза гибридного белка Was79.

Клетки штамма E. coli ECR-79 содержат экспрессионную плазмиду pET28-Was79 и в ответ на внесение в среду культивирования индукторов изопропил-β-D-1-тиогалактопиранозида (ИПТГ) или лактозы синтезируют гибридный белок Was79.

Пример 12. Получение штамма E. coli ВКПМ В-11955 - продуцента гибридного белка Was79

Второй штамм - продуцент гибридного белка Was79, а именно штамм E. coli ECR-86 - получают как описано в примере 11, за исключением того, что для трансформации используют плазмиду pET28-Was86, содержащую оптимизированную по составу кодонов последовательность ДНК, кодирующую мутантный вариант int4b интеина Pch PRP8 Intein.

Штамм E. coli ECR-86 используют для биосинтеза гибридного белка Was79.

Клетки штамма E. coli ECR-86 содержат экспрессионную плазмиду pET28-Was86 и в ответ на внесение в среду культивирования индукторов ИПТГ или лактозы синтезируют гибридный белок Was79.

Штамм E. coli ECR-86 депонирован в коллекции Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов под регистрационным номером ВКПМ В-11955.

Пример 13. Получение штамма E. coli ECR-89 - продуцента гибридного белка Was79M

Штамм E. coli ECR-89 - продуцент гибридного белка Was79M, содержащего N-концевой метионин или формилметионин, получают как описано в примере 11, за исключением того, что для трансформации используют плазмиду pET28-Was89.

Штамм E. coli ECR-89 используют для биосинтеза гибридного белка Was79M.

Клетки штамма E. coli ECR-89 содержат экспрессионную плазмиду pET28-Was89 и в ответ на внесение в среду культивирования индукторов ИПТГ или лактозы синтезируют гибридный белок Was79M.

Пример 14. Получение штамма E. coli ECR-02 - продуцента рекомбинантной немодифицированной L-аспарагиназы Was02

Штамм E. coli ECR-02 - продуцент рекомбинантной немодифицированной L-аспарагиназы Was02 W.succinogenes получают как описано в примере 11, за исключением того, что для трансформации используют плазмиду pET28-Was02.

Штамм E. coli ECR-02 используют для биосинтеза рекомбинантной немодифицированной L-аспарагиназы W.succinogenes.

Клетки штамма E. coli ECR-02 содержат экспрессионную плазмиду pET28-Was02 и в ответ на внесение в среду культивирования индукторов ИПТГ или лактозы синтезируют рекомбинантную немодифицированную L-аспарагиназу W.succinogenes Was02, которую используют далее в качестве контроля.

Пример 15. Биосинтез гибридного белка Was79 в колбах с использованием индуктора-лактозы

Биосинтез гибридного белка Was79 в колбах осуществляют следующим образом. Сначала получают посевную культуру. Для этого одну колонию штамма E. coli ECR-79 или штамма E. coli ВКПМ В-11955 засевают в пробирку, содержащую 3 мл среды YTS следующего состава (мас. %): дрожжевой экстракт - 1, триптон бакто - 2, NaCl - 1, канамицин - 0,003, вода - остальное. Культуру выращивают на роторной качалке со скоростью 250 об/мин в течение 18 часов при температуре 37°С.

На втором этапе выросшую посевную культуру переносят в среду для индукции. С этой целью 0,5 мл посевной культуры переносят в колбу, содержащую 50 мл среды TRB следующего состава (мас. %): дрожжевой экстракт - 2,4; триптон бакто - 1,2; одномолярный фосфатный буфер (рН7) - 10; одномолярный раствор сульфата магния - 0,2; лактоза - 0,5; глицерин - 0,5; канамицин - 0,009; вода - остальное. Культивирование в среде для индукции продолжают в течение 20 часов в тех же условиях.

Для индукции синтеза гибридного белка Was79 в описанных условиях используют лактозу, изначально входящую в состав среды TRB.

Полученную в результате культивирования биомассу осаждают центрифугированием в пластмассовых пробирках объемом 50 мл в течение 10 минут со скоростью 9000 об/мин с охлаждением (4°С). Надосадочную жидкость сливают. Клеточный осадок суспедируют в 30 мл буфера PBS следующего состава: 137 мМ NaCl, 2 мМ KCl, 10 мМ фосфатный буфер, pH 7,4, после чего вновь подвергают центрифугированию в течение 10 минут со скоростью 9000 об/мин с охлаждением (4°С). Надосадочную жидкость сливают, и остатки жидкости тщательно удаляют с помощью вакуумного насоса.

В результате культивиро