Способ обнаружения днк возбудителя туберкулеза с одновременным установлением его генотипа и определением генетических детерминант множественной и широкой лекарственной устойчивости, олигонуклеотидный микрочип, набор праймеров и набор олигонуклеотидных зондов, используемые в способе

Способ обнаружения днк возбудителя туберкулеза с одновременным установлением его генотипа и определением генетических детерминант множественной и широкой лекарственной устойчивости, олигонуклеотидный микрочип, набор праймеров и набор олигонуклеотидных зондов, используемые в способе

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Область техники, к которой относится изобретение

Изобретение относится к молекулярной биологии, микробиологии и медицине и обеспечивает способ обнаружения ДНК возбудителя туберкулеза - микобактерий туберкулезного комплекса (Mycobacterium tuberculosis, M. bovis, M. bovis BCG, M. africanum, M. microti, Mycobacterium canettii, Mycobacterium caprae, Mycobacterium pinnipedii, Mycobacterium mungi) с одновременным установлением генотипа возбудителя и определением генетических детерминант устойчивости к широкому спектру противотуберкулезных препаратов, включая рифампицин, изониазид, фторхинолоны, канамицин, амикацин, капреомицин, этамбутол, в клиническом образце на дифференцирующем олигонуклеотидном микрочипе.

Уровень техники

Распространение устойчивых к противотуберкулезным препаратам штаммов M. tuberculosis представляет серьезную мировую проблему. Сегодня по классификации ВОЗ выделяют возбудителей туберкулеза с множественной лекарственной устойчивостью (МЛУ (MDR) ТБ), с широкой лекарственной устойчивостью (ШЛУ (XDR) ТБ) и возбудителей с тотальной (полной) устойчивостью к противотуберкулезным препаратам (суперустойчивый ТБ). МЛУ ТБ вызывается микобактериями, устойчивыми, по крайней мере, к двум наиболее эффективным препаратам первого ряда - изониазиду и рифампицину. ШЛУ ТБ - это форма туберкулеза, устойчивого к изониазиду и рифампицину, а также к любому фторхинолону, и, как минимум, к одному из трех инъекционных противотуберкулезных препаратов второй линии терапии (амикацин, канамицин или капреомицин). Лекарственно-устойчивые формы ТБ не отвечают на стандартную шестимесячную терапию противотуберкулезными средствами первой линии и лечатся в течение двух и более лет лекарствами второй линии, которые более токсичны и дороги. В то же время, курс лечения лекарственно-чувствительного туберкулеза обходится приблизительно в 200 USD, МЛУ ТБ - 5 000 USD, а лечение ШЛУ ТБ еще более дорого и, главное, занимает более продолжительное время.

В России, согласно данным официальной статистики, в 2009 г. МЛУ ТБ среди впервые выявленных больных был зарегистрирован в 15,4%, тогда как общая распространённость МЛУ-штаммов среди всех больных ТБ в 2009 г. составила 33,5%. Данные по ШЛУ ТБ и суперустойчивого ТБ в России не опубликованы, поскольку они не включены в отчетные формы («Туберкулез в Российской федерации 2009 г» Аналитический обзор статистических показателей по туберкулезу, используемых в Российской Федерации). По данным ВОЗ, в нашей стране ШЛУ штаммы составляют около 30 % всех МЛУ штаммов M. tuberculosis. В мире число случаев ШЛУ ТБ оценивается как 25 000 в год, и почти все они приводят к смертельному исходу (World Health Organization, 2010. Global tuberculosis control: a short update to the 2009 report).

Распространению лекарственно-устойчивого ТБ способствует длительность бактериологического тестирования выделенных от пациентов возбудителей ТБ. Даже с использованием автоматического анализатора BACTEC процедура оценки профиля чувствительности конкретного изолята к препаратам первого ряда занимает более месяца, при этом в большинстве бактериологических лабораторий тестирование на чувствительность к препаратам второй линии терапии (фторхинолоны, амикацин, канамицин, капреомицин, этамбутол и др.) вообще не проводится.

В этой связи необходимы методы быстрого и надежного определения устойчивости клинических штаммов туберкулеза, то есть причисления штаммов туберкулеза к классам устойчивости: лекарственно-чувствительный, МЛУ или ШЛУ. Результаты анализа будут непосредственно использоваться в клинической практике для своевременной коррекции противотуберкулезной терапии. Наиболее перспективными методами являются молекулярные технологии анализа генома возбудителя туберкулеза, позволяющие идентифицировать генетические детерминанты множественной и широкой лекарственной устойчивости.

Еще одной важной клинически значимой задачей является генотипирование возбудителя туберкулеза. Нарастающее количество секвенированных геномов в последние годы M. tuberculosis и последующее сравнение их in silico выявило достаточный уровень генетического разнообразия для филогенетически надежных построений, по крайней мере, на уровне генетических семейств. Анализ однонуклетидного полиморфизма геномов микобактерий туберкулезного комплекса позволил выявить пять основных линий - Beijing («пекинская» линия), CAS (Central Asian - «центрально-азиатская» линия), EuroAmerican («Евро-Американская» линия), EAI (East African-Indian - «восточная Африкано-Индийская» линия), M. bovis (Baker L, Brown T, Maiden MC, Drobniewski F. 2004. Silent nucleotide polymorphisms and a phylogeny for Mycobacterium tuberculosis. Emerging Infectious Diseases 10:1568-1577). К настоящему моменту на территории РФ и стран бывшего СССР отмечено повсеместное превалирование Beijing и Евро-Американской линий, последняя, в свою очередь, разделяется на три основных генотипа Ural, LAM и Haarlem (Casali N, Nikolayevskyy V, Balabanova Y, Ignatyeva O, Kontsevaya I, Harris SR, Bentley SD, Parkhill J, Nejentsev S, Hoffner SE, Horstmann RD, Brown T, Drobniewski F. Microevolution of extensively drug-resistant tuberculosis in Russia. Genome Research. 2012. 22(4):735-45).

Следует отметить, что в РФ генотип Beijing является самым распространённым и встречается в среднем у 50% пациентов (Igor Mokrousov. Insights into the origin, emergence, and current spread of a successful Russian clone of Mycobacterium tuberculosis. Clinical microbiology reviews 2013; 26(2):342-60). В настоящее время установление генотипа Beijing является клинически значимой задачей, поскольку его штаммы демонстрируют важные патогенные свойства, например повышенную вирулентность в организме мышей, вакцинированных БЦЖ (Lopez B, Aguilar D, Orozco H, Burger M, Espitia C, Ritacco V, et al. A marked difference in pathogenesis and immune response induced by different Mycobacterium tuberculosis geneotypes. Clin Exp Immunol. 2003;133:30-7), ассоциацию с множественной и широкой лекарственной устойчивостью (Mokrousov I, Narvskaya O, Vyazovaya A, Otten T, Jiao WW, Gomes LL, Suffys PN, Shen AD, Vishnevsky B. Russian "successful" clone B0/W148 of Mycobacterium tuberculosis Beijing genotype: a multiplex PCR assay for rapid detection and global screening. Journal of Clinical Microbiology 2012 Nov 50(11):3757-9), способность быстро размножаться в человеческих макрофагах и высокую трансмиссивность (Tran N Buu, Dick van Soolingen, Mai N T Huyen, Nguyen T N Lan, Hoang T Quy, Edine W Tiemersma, Kristin Kremer, Martien W Borgdorff, Frank G J Cobelens. Increased transmission of Mycobacterium tuberculosis Beijing genotype strains associated with resistance to streptomycin: a population-based study. PLoS One 2012 13; 7(8):e42323). Текущая эпидемия туберкулеза в России в значительной степени связана с активным распространением мультирезистентных штаммов генотипа Beijing и его варианта B0/W148 в популяции, иммунизированной БЦЖ (Casali, N., Nikolayevskyy, V., Balabanova, Y., Harris, S.R., Ignatyeva, O., Kontsevaya, I., Corander, J., Bryant, J., Parkhill, J., Nejentsev, S., Horstmann, R.D., Brown, T. & Drobniewski, F. Evolution and transmission of drug-resistant tuberculosis in a Russian population. Nature Genetics 2014 46, 279-86). Таким образом, наблюдаемое сейчас широкое распространение штаммов Beijing представляет серьезную угрозу успешной реализации национальных программ борьбы с туберкулезом.

Для двух других семейств возбудителя туберкулеза LAM и Ural, также широко представленных на территории РФ, в настоящее время ассоциаций с высокой вирулентностью и лекарственной устойчивостью не обнаружено. Это обусловлено отсутствием молекулярных диагностических инструментов, обеспечивающих одновременное определение генетических детерминант лекарственной устойчивости и генотипирование возбудителя туберкулеза.

В настоящее время для идентификации лекарственно-устойчивых штаммов микобактерий туберкулезного комплекса и их генотипирования применяются следующие молекулярные методы:

I. ПЦР с детекцией в режиме реального времени для идентификации мутаций, ответственных за лекарственную устойчивость. (Real-time PCR)

Заявка на патент WO/2011/140237 «Process for detection of multidrug resistant tuberculosis using real-time PCR and high resolution melt analysis»

Ramirez MV, Cowart KC, Campbell PJ, Morlock GP, Sikes D, Winchell JM, Posey JE. Rapid detection of multidrug-resistant Mycobacterium tuberculosis by use of real-time PCR and high-resolution melt analysis. Journal of clinical microbiology 2010 Nov; 48(11):4003-9

Chen X, Kong F, Wang Q, Li C, Zhang J, Gilbert GL. Rapid detection of isoniazid, rifampin, and ofloxacin resistance in Mycobacterium tuberculosis clinical isolates using high-resolution melting analysis. Journal of clinical microbiology 2011 Oct; 49(10):3450-7.

Yadav R, Sethi S, Mewara A, Dhatwalia SK, Gupta D, Sharma M. Rapid detection of rifampicin, isoniazid and streptomycin resistance in Mycobacterium tuberculosis clinical isolates by high-resolution melting curve analysis. Journal of Applied Microbiology 2012 Oct; 113(4):856-62.

Владимирский М.А., Аляпкина Ю.С., Варламов Д.А., Алексеев Я.И., Шипина Л.К., Шульгина М.В., Домотенко Л.В., Быкадорова К.Р., Гащенко Н.Н., Ендоурова Л.Б., Иванова О.В., Ильина Е.А., Левкова О.А., Маркова Т.В., Наземцева В.П., Павлова Е.П., Полозов А.И., Шишкина Н.В. Применение метода ПЦР в реальном времени для определения и контроля за распространением лекарственно-устойчивых штаммов микобактерий туберкулеза. Туберкулез и болезни легких. 2008. 85(4) 38-44

II. Автоматизированная процедура, совмещающая обработку клинического образца и выделение ДНК с последующей амплификацией с детекцией в режиме реального времени в отдельном картридже, изолированном от окружающей среды (например, коммерческая диагностическая тест-система Xpert® MTB/RIF компании Cepheid, США, и аналоги). (cartridge-based, automated diagnostic test that can identify Mycobacterium tuberculosis (MTB) and resistance to rifampicin (RIF))

Helb, D., M. Jones, E. Story, C. Boehme, E. Wallace, K. Ho, J. Kop, M.R. Owens, R. Rodgers, P. Banada, H. Safi, R. Blakemore, N.T. Lan, E.C. Jones-Lopez, M. Levi, M. Burday, I. Ayakaka, R.D. Mugerwa, B. McMillan, E. Winn-Deen, L. Christel, P. Dailey, M.D. Perkins, D.H. Persing, and D. Alland. Rapid detection of Mycobacterium tuberculosis and rifampin resistance by use of on-demand, near-patient technology. Journal of clinical microbiology 2010 48, 229-37

Список публикаций доступен на веб-сайте ВОЗ по следующей ссылке:

Published evidence and commentary on the Xpert MTB/RIF assay

Рекомендации ВОЗ по применению тест-системы Xpert® MTB/RIF приведены в следующих статьях:

Rapid implementation of the Xpert MTB/RIF diagnostic test (WHO/HTM/TB/2011.2)

Policy statement: Xpert MTB/RIF system (WHO/HTM/TB/2011.4)

Castan, P., de Pablo, A., Fernandez-Romero, N., Rubio, J.M., Cobb, B.D., Mingorance, J. & Toro, C. Point-of-care system for detection of Mycobacterium tuberculosis and rifampin resistance in sputum samples. Journal of clinical microbiology 2014 52, 502-7

III. Гибридизационные технологии на основе зондов, иммобилизованных на нитроцеллюлозных полосках («стрипах») (Line probe assay)

III.I Коммерческий набор INNO-LiPA Rif.TB компании Innogenetics (Бельгия)

Tortoli E, Marcelli F. Use of the INNO LiPA Rif.TB for detection of Mycobacterium tuberculosis DNA directly in clinical specimens and for simultaneous determination of rifampin susceptibility. European Journal of Clinical Microbiology and Infectious Diseases 2007 Jan; 26(1):51-5.

Skenders GK, Holtz TH, Riekstina V, Leimane V. Implementation of the INNO-LiPA Rif. TB® line-probe assay in rapid detection of multidrug-resistant tuberculosis in Latvia. International Journal of Tubercle and Lung Diseases 2011 Nov; 15(11):1546-52

III.II Коммерческие наборы GenoType^® MTBDRplus и GenoType^® MTBDRsl компании Hain Lifescience (Германия)

В основе наборов лежит заявка на патент WO/2003/039703 «Method in the form of a dry rapid test for detecting nucleic acids» компании Hain Lifescience.

Hillemann D, Rüsch-Gerdes S, Richter E. Evaluation of the GenoType MTBDRplus assay for rifampin and isoniazid susceptibility testing of Mycobacterium tuberculosis strains and clinical specimens. Journal of clinical microbiology 2007 Aug; 45(8):2635-40.

Nikolayevskyy V, Balabanova Y, Simak T, Malomanova N, Fedorin I, Drobniewski F. Performance of the Genotype MTBDRPlus assay in the diagnosis of tuberculosis and drug resistance in Samara, Russian Federation. BMC Clinical Pathology. 2009 Mar 10; 9:2.

Miotto P, Cabibbe AM, Mantegani P, Borroni E, Fattorini L, Tortoli E, Migliori GB, Cirillo DM. GenoType MTBDRsl performance on clinical samples with diverse genetic background. European Respiratory Journal. 2012 Sep; 40(3):690-8

Barnard M, Warren R, Van Pittius NG, van Helden P, Bosman M, Streicher E, Coetzee G, O'Brien R. GenoType MTBDRsl Line Probe Assay Shortens Time to Diagnosis of XDR-TB in a High-throughput Diagnostic Laboratory. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 2012 Oct 18

III.III Коммерческие наборы AID TB resistance line probe assay компании Autoimmun Diagnostika GmbH (AID) (Германия).

B. Molina-Moya, A. Lacoma, C. Prat, J. Diaz, A. Dudnyk, L. Haba, J. Maldonado, S. Samper, J. Ruiz-Manzano, V. Ausina, J. Dominguez. AID TB resistance line probe assay for rapid detection of resistant Mycobacterium tuberculosis in clinical samples. Journal of Infection 2014. In press. DOI: http://dx.doi.org/10.1016/j.jinf.2014.09.011

Ritter C, Lucke K, Sirgel FA, Warren RW, van Helden PD, Böttger EC, Bloemberg GV. Evaluation of the AID TB resistance line probe assay for rapid detection of genetic alterations associated with drug resistance in Mycobacterium tuberculosis strains. Journal of clinical microbiology 2014 Mar;52(3):940-6

IV. Гибридизационные технологии на основе олигонуклеотидных микрочипов (DNA microarrays (biochips)).

IV.I Гидрогелевые олигонуклеотидные микрочипы (биочипы) низкой плотности. Коммерческие наборы «ТБ-Биочип-1» и «ТБ-БИОЧИП-2», разработанные в Институте молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН, для идентификации штаммов возбудителя туберкулеза и определения его чувствительности к рифампицину/изониазиду и фторхинолонам.

Мирзабеков А.Д., Михайлович В.М., Соболев А.Ю. Грядунов Д.А., Лапа С.А., Заседателев А.С. Способ одновременного обнаружения микобактерий туберкулезного комплекса и идентификации мутаций в днк микобактерий, приводящих к устойчивости микроорганизмов к рифампицину и изониазиду, на биологических микрочипах, набор праймеров, биочип и набор олигонуклеотидных зондов, используемые в способе. Патент РФ 2376387. Опубликовано 20.12.2009. Приоритет от 26.12.2005

Gryadunov D., V. Mikhailovich, S. Lapa, N. Roudinskii, M. Donnikov, S. Pan'kov, O. Markova, A. Kuz'min, L. Chernousova, O. Skotnikova, A. Moroz, A. Zasedatelev and A. Mirzabekov. Evaluation of hybridisation on oligonucleotide microarrays for analysis of drug-resistant Mycobacterium tuberculosis. Clinical microbiology and infection 2005. Vol 11: p. 531-539.

О.В. Антонова, Д.А. Грядунов, С.А. Лапа, А.В. Кузьмин, Е.Е. Ларионова, Т.Г. Смирнова, Е.Ю. Носова, О.И. Скотникова, Л.Н. Черноусова, А.М. Мороз, А.С. Заседателев, В.М. Михайлович. Выявление мутаций в геноме Mycobacterium tuberculosis, приводящих к устойчивости к фторхинолонам, методом гибридизации на биологических микрочипах. Бюллетень экспериментальной биологии и медицины 2008. №1. стр. 115-120

Zimenkov DV, Antonova OV, Kuz Min AV, Isaeva YD, Krylova LY, Popov SA, Zasedatelev AS, Mikhailovich VM, Gryadunov DA. Detection of second-line drug resistance in mycobacterium tuberculosis using oligonucleotide microarrays. BMC Infectious Diseases. 2013 May 24; 13(1):240.

Зименков Д.В., Кулагина Е.В., Антонова О.В., Суржиков С.А., Беспятых Ю.А., Шитиков Е.А., Ильина Е.Н., Михайлович В.М., Заседателев А.С., Грядунов Д.А. Анализ генетических детерминант множественной и широкой лекарственной устойчивости возбудителя туберкулеза с использованием олигонуклеотидного микрочипа. 2014. Молекулярная биология. т. 48(2), стр. 251-264

IV.II Иные олигонуклеотидные микрочипы низкой плотности.

Huang WL, Hsu ZJ, Chang TC, Jou R. Rapid and accurate detection of rifampin and isoniazid-resistant Mycobacterium tuberculosis using an oligonucleotide array. Clinical microbiology and infection 2014 Sep; 20(9):O542-9

Linger, Y., Kukhtin, A., Golova, J., Perov, A., Lambarqui, A., Bryant, L., Rudy, G.B., Dionne, K., Fisher, S.L., Parrish, N. & Chandler, D.P. (2014). Simplified microarray system for simultaneously detecting rifampin, isoniazid, ethambutol, and streptomycin resistance markers in Mycobacterium tuberculosis. Journal of clinical microbiology 52, 2100-7

Zhang Z, Li L, Luo F, Cheng P, Wu F, Wu Z, Hou T, Zhong M, Xu J. Rapid and accurate detection of RMP- and INH- resistant Mycobacterium tuberculosis in spinal tuberculosis specimens by CapitalBioTM DNA microarray: A prospective validation study. BMC Infectious Diseases 2012 Nov 14; 12(1):303.

Yao C, Zhu T, Li Y, Zhang L, Zhang B, Huang J, Fu W. Detection of rpoB, katG and inhA gene mutations in Mycobacterium tuberculosis clinical isolates from Chongqing as determined by microarray. Clinical microbiology and infection 2010 Nov; 16(11):1639-43.

Volokhov DV, Chizhikov VE, Denkin S, Zhang Y. Molecular detection of drug-resistant Mycobacterium tuberculosis with a scanning-frame oligonucleotide microarray. Methods in Molecular Biology 2009; 465:395-417.

IV.III Олигонуклеотидные микрочипы высокой плотности

Sougakoff W, Rodrigue M, Truffot-Pernot C, Renard M, Durin N, Szpytma M, Vachon R, Troesch A, Jarlier V. Use of a high-density DNA probe array for detecting mutations involved in rifampicin resistance in Mycobacterium tuberculosis. Clinical microbiology and infection 2004 Apr; 10(4):289-94.

V. Масс-спектрометрические методы (Matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight (mass spectrometry))

Афанасьев М.В., Икрянникова Л.Н., Ильина Е.Н., Смирнова Т.Г., Ларионова Е.Е., Кузьмин А.В., Черноусова Л.Н., Камаев Е.Ю., Скорняков С.Н., Киншт В.Н., Чередниченко А.Г., Говорун В.М. Применение реакции мини-секвенирования с последующим MALDI-TOF масс-спектрометрическим анализом для оценки устойчивости к рифампицину и изониазиду штаммов Mycobacterium tuberculosis. Туберкулез и болезни легких. 2007. 84(7):27-42

Афанасьев М.В., Боровская А.Д., Ильина Е.Н., Смирнова Т.Г., Ларионова Е.Е., Кузьмин А.В., Андреевская С.Н., Черноусова Л.Н., Говорун В.М. Выявление мутаций в кодоне 306 embB гена для молекулярно-генетической характеристики клинических штаммов Mycobacterium tuberculosis. Туберкулез и болезни легких 2009. 86(5):48-53

Afanas′ev MV, Ikryannikova LN, Il′ina EN, Kuz′min AV, Larionova EE, Smirnova TG, Chernousova LN, Govorun VM. Molecular typing of Mycobacterium tuberculosis circulated in Moscow, Russian Federation. European Journal of Clinical Microbiology and Infectious Diseases 2011 Feb; 30(2):181-91.

Ikryannikova LN, Afanas′ev MV, Akopian TA, Il′ina EN, Kuz'min AV, Larionova EE, Smirnova TG, Chernousova LN, Govorun VM. Mass-spectrometry based minisequencing method for the rapid detection of drug resistance in Mycobacterium tuberculosis. Journal of Microbiology Methods 2007 Sep; 70(3):395-405.

VI.яАнализ конформационного полиморфизма и гетеродуплексный анализ с применением капиллярного электрофореза (conformation polymorphism analysis and heteroduplex mobility analysis using temperature gradient capillary electrophoresis)

Krothapalli S, May MK, Hestekin CN. Capillary electrophoresis-single strand conformation polymorphism for the detection of multiple mutations leading to tuberculosis drug resistance. Journal of Microbiology Methods 2012 Oct; 91(1):147-54.

Shi R, Otomo K, Yamada H, Tatsumi T, Sugawara I. Temperature-mediated heteroduplex analysis for the detection of drug-resistant gene mutations in clinical isolates of Mycobacterium tuberculosis by denaturing HPLC, SURVEYOR nuclease. Microbes and Infection 2006 Jan; 8(1):128-35.

VII. Конъюгаты нанолигандов со специфическими ДНК-зондами (nanoprobes for detection of SNPs associated with antibiotic resistance).

Veigas B, Machado D, Perdigão J, Portugal I, Couto I, Viveiros M, Baptista PV. Au-nanoprobes for detection of SNPs associated with antibiotic resistance in Mycobacterium tuberculosis. Nanotechnology 2010 Oct 15; 21(41):415101.

VIII. Секвенирование последовательностей генов M. tuberculosis, в которых возможны мутации, ответственные за лекарственную устойчивость. (DNA sequencing, Next-generation sequencing)

Daum LT, Rodriguez JD, Worthy SA, Ismail NA, Omar SV, Dreyer AW, Fourie PB, Hoosen AA, Chambers JP, Fischer GW. Next-Generation Ion Torrent Sequencing of Drug Resistance Mutations in Mycobacterium tuberculosis Strains. Journal of clinical microbiology 2012 Dec; 50(12):3831-7.

Liu CH, Li HM, Lu N, Wang Q, Hu YL, Yang X, Hu YF, Woo PC, Gao GF, Zhu B. Genomic sequence based scanning for drug resistance-associated mutations and evolutionary analysis of multidrug-resistant and extensively drug-resistant Mycobacterium tuberculosis. Journal of Infection 2012 Nov; 65(5):412-22.

Si J, Wang Z, Wang Z, Li H. Sequencing-based detection of drug-resistant Mycobacterium tuberculosis in patients with spinal tuberculosis. Archives of Orthopaedic and Trauma Surgery 2012 Jul; 132(7):941-5.

Feuerriegel S, Oberhauser B, George AG, Dafae F, Richter E, Rüsch-Gerdes S, Niemann S. Sequence analysis for detection of first-line drug resistance in Mycobacterium tuberculosis strains from a high-incidence setting. BMC Microbiology. 2012 May 30; 12:90.

Feuerriegel S, Cox HS, Zarkua N, Karimovich HA, Braker K, Rüsch-Gerdes S, Niemann S. Sequence analyses of just four genes to detect extensively drug-resistant Mycobacterium tuberculosis strains in multidrug-resistant tuberculosis patients undergoing treatment. Antimicrobial Agents and Chemotherapy 2009 Aug; 53(8):3353-6

IX. Мультиплексная лиганд-зависимая амплификация на микросферах. (Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification (MLPA) on a Bead Based Array)

Sengstake S, Bablishvili N, Schuitema A, Bzekalava N, Abadia E, de Beer J, Tadumadze N, Akhalaia M, Tuin K, Tukvadze N, Aspindzelashvili R, Bachiyska E, Panaiotov S, Sola C, van Soolingen D, Klatser P, Anthony R, Bergval I. Optimizing multiplex SNP-based data analysis for genotyping of Mycobacterium tuberculosis isolates. BMC Genomics. 2014 Jul 7; 15:572

Gomgnimbou MK, Hernández-Neuta I, Panaiotov S, Bachiyska E, Palomino JC, Martin A, del Portillo P, Refregier G, Sola C. Tuberculosis-spoligo-rifampin-isoniazid typing: an all-in-one assay technique for surveillance and control of multidrug-resistant tuberculosis on Luminex devices. Journal of Clinical Microbiology 2013 Nov; 51(11):3527-34

Bergval, I., Sengstake, S., Brankova, N., Levterova, V., Abadia, E., Tadumaze, N., Bablishvili, N., Akhalaia, M., Tuin, K., Schuitema, A., Panaiotov, S., Bachiyska, E., Kantardjiev, T., de Zwaan, R., Schurch, A., van Soolingen, D., van 't Hoog, A., Cobelens, F., Aspindzelashvili, R., Sola, C., Klatser, P. & Anthony, R. Combined species identification, genotyping, and drug resistance detection of Mycobacterium tuberculosis cultures by MLPA on a bead-based array. PLoS One 2012 7, e43240.

Методы, основанные на ПЦР с детекцией в режиме реального времени (ПЦР-РВ) (I), наиболее эффективны для идентификации, в т.ч. количественной, микобактерий туберкулезного комплекса в клинических образцах. Однако, данные подходы ограниченно применимы для одновременной идентификации большого (>100) количества однонуклеотидных полиморфизмов в геноме, что требуется при анализе детерминант лекарственной устойчивости и генотипирования возбудителя туберкулеза. Для анализа каждой мутации требуется индивидуальная пробирка (лунка планшета), соответственно, при одновременном определении ~100 мутаций в одном образце ДНК, как требуется при анализе ДНК пациента на ШЛУ ТБ, потребуется соответствующее количество пробирок (лунок), без учета положительного контроля. Принимая во внимание время проведения ПЦР-РВ - не менее 1,5 часов, общее время, затрачиваемое на каждый образец с учетом выделения ДНК (не менее 1 часа) составит не менее 3 часов. Следующий образец ДНК будет также проанализирован за 1,5 часа, и т.д., таким образом, за рабочую смену (8 часов) при наличии только одного высокопроизводительного ДНК-амплификатора, использующего 384-луночный планшет, количество проанализированных образцов не превысит 5. Реальные потребности диспансеров оцениваются на уровне 30-ти пациентов в день. Именно по этой причине методики, основанные на ПЦР-РВ, выявляют ограниченный набор мутаций и неприменимы для одновременного выявления всего спектра мутаций в геноме микобактерий туберкулезного комплекса, приводящих к множественной и широкой лекарственной устойчивости, не говоря уже об одновременном генотипировании.

Рекомендованная ВОЗ автоматизированная система на основе сменных картриджей Xpert® MTB/RIF (II) компании Cepheid выявляет 10 наиболее распространенных мутаций в гене rpoB, ответственных за устойчивость к рифампицину, и не может быть применена для определения ШЛУ ТБ и установления клинически важных генотипов M. tuberculosis.

Коммерческий набор INNO-LiPA Rif.TB (III.I), базовым элементом которого является нитроцеллюлозная полоска («стрип») с иммобилизованными специфичными олигонуклеотидами, выявляет только мутации в гене rpoB, ответственные за устойчивость к рифампицину.

Наборы GenoType® MTBDRplus и GenoType® MTBDRsl (Hain lifescience, Германия) (III.II), также использующие стрипы с иммобилизованными зондами, выявляют соответственно 10 генетических детерминант устойчивости к рифампицину и изониазиду и 11 генетических детерминант устойчивости к фторхинолонам, канамицину, амикацину и этамбутолу. При этом для анализа одного образца на предмет выявления МЛУ и ШЛУ требуется не менее 2 раздельных тестов (по одному - системами GenoType® MTBDRplus и GenoType® MTBDRsl). Описанные технологии не позволяют устанавливать генотип возбудителя туберкулеза одновременно с анализом генетических детерминант лекарственной чувствительности.

Набор AID TB resistance line probe assay (III.III) выявляет генетические детерминанты МЛУ и ШЛУ-туберкулеза, однако, не позволяет проводить одновременное генотипирование возбудителя.

Наборы «ТБ-Биочип-1» и «ТБ-БИОЧИП-2» (IV.I), основанные на гидрогелевых олигонуклеотидных микрочипах низкой плотности, выявляют, соответственно, 48 генетических детерминант устойчивости к рифампицину/изониазиду и 9 генетических детерминант устойчивости к фторхинолонам. При этом для анализа одного образца требуется не менее 2 раздельных тестов (по одному - системами «ТБ-Биочип-1» и «ТБ-БИОЧИП-2»). Даже суммарный анализ каждого образца с использованием тест-систем «ТБ-Биочип-1» и «ТБ-БИОЧИП-2» не позволит выявить штаммы ТБ с широкой лекарственной устойчивостью. Более того, при анализе каждого образца ДНК требуются две последовательные стадии мультиплексной ПЦР с обязательным электрофоретическим контролем ПЦР-продуктов после каждой стадии, что приводит к усложнению процедуры и увеличению времени анализа.

Альтернативные методы, основанные на ДНК-микрочипах низкой плотности (IV.II), выявляют отдельные мутации, ответственные за устойчивость к рифампицину, изониазиду фторхинолонам, канамицину, амикацину, этамбутолу, стрептомицину, пиразинамиду, но не обеспечивают комплексного анализа генома возбудителя туберкулеза, включающего идентификацию детерминант устойчивости и генотипирование.

Микрочипы высокой плотности (IV.III) разработаны только для анализа мутаций в гене rpoB, более того, судя по последним тенденциям в области разработки молекулярно-генетических тестов, данная технология не нашла потребителей в клинической лабораторной диагностике туберкулеза.

Масс-спектрометрические методы (V), aнализ конформационного полиморфизма и гетеродуплексный анализ с применением капиллярного электрофореза (VI) и гибридизационные подходы с использованием нанолигандов (VII) обеспечивают идентификацию ограниченного набора мутаций в геноме M. tuberculosis, ассоциированных с лекарственной устойчивостью, но не позволяют проводить одновременное генотипирование.

Несмотря на быстрое развитие технологий секвенирования нового поколения (VIII), включая таргетное и полногеномное /метагеномное секвенирование, транскриптомное профилирование и др., эти методы остаются дорогостоящими и пока не применимы для массового параллельного анализа и/или скрининга клинического материала в условиях потоковых тестов (десятков и сотен образцов в день) клинико-диагностической лаборатории (Lohmann, K. & Klein, C. Next Generation Sequencing and the Future of Genetic Diagnosis. Neurotherapeutics 2014. DOI: 10.1007/s13311-014-0288-8).

Наконец, описанный метод мультиплексной лиганд-зависимой амплификации на микросферах (IX), несмотря на возможность одновременного генотипирования и идентификации детерминант устойчивости к широкому спектру препаратов, требует многостадийной процедуры подготовки образца (лигирование, амплификация, две последовательных очистки продуктов реакций) и сложной интерпретации результатов, что делает данный подход трудоемким и рекомендованным только для лабораторий, обладающих персоналом высокой квалификации.

Таким образом, в данной области существует острая потребность в разработке способа обнаружения ДНК возбудителя туберкулеза, с одновременным установлением клинически значимых генотипов и идентификацией мутаций, ассоциированных с множественной и широкой лекарственной устойчивостью, который бы выгодно отличался от известных из уровня техники решений простотой проведения анализа, высокими специфичностью и информативностью в отношении количества определяемых детерминант устойчивости, а также невысокой стоимостью.

Раскрытие изобретения

В результате проведенных обширных научных исследований, анализа баз данных нуклеотидных последовательностей NCBI http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/genomes/166?subset=, Welcome Trust Sanger institute http://www.sanger.ac.uk/resources/downloads/bacteria/mycobacterium.html, TBDReaMDB (www.tbdreamdb.com), авторы настоящего изобретения обнаружили, что задача разработки способа обнаружения ДНК возбудителя туберкулеза, с одновременным установлением генотипа и идентификацией мутаций, ассоциированных с множественной и широкой лекарственной устойчивостью, может быть успешно решена путем использования олигонуклеотидных микрочипов (биочипов), содержащих олигонуклеотидные зонды, последовательности которых специфичны к фрагменту инсерционного элемента IS6110, характерного для возбудителя туберкулеза, однонуклеотидным полиморфизмам, устанавливающим принадлежность к генотипам Beijing, Haarlem, LAM, Ural, а также к мутантным вариантам генов rpoB, katG, inhA, ahpC, gyrA, gyrB, rrs, eis, embB, являющихся маркерами лекарственной устойчивости M. tuberculosis.

Заявляемый в настоящем изобретении способ выгодно отличается от известных из уровня техники методов возможностью идентификации возбудителя непосредственно в клиническом материале с одновременным установлением генотипов Beijing, Beijing B0/W148, Haarlem, LAM, Ural и определением 120 мутаций, определяющих устойчивость к рифампицину, изониазиду, фторхинолонам, канамицину, амикацину, капреомицину, этамбутолу. Метод не требует дорогостоящего оборудования и высококвалифицированного персонала. Данные, полученные с помощью заявленного способа, могут быть использованы для персонифицированного выбора эффективных противотуберкулезных препаратов, выявления клинически значимых особо опасных форм возбудителя (например, семейства Beijing) и эпидемиологического генотипирования.

В своем первом аспекте данное изобретение обеспечивает способ обнаружения ДНК возбудителя туберкулеза с одновременным установлением его генотипа и определением генетических детерминант устойчивости к рифампицину, изониазиду, фторхинолонам, канамицину, амикацину, капреомицину, этамбутолу. Способ основан на мультиплексной ПЦР с получением флуоресцентно-меченых фрагментов микобактериального генома с последующей гибридизацией этих фрагментов на олигонуклеотидном микрочипе, содержащем набор дифференцирующих олигонуклеотидов.

Способ предусматривает следующие стадии:

а) мультиплексную амплификацию генов rpoB, katG, inhA, ahpC, gyrA, gyrB, rrs, eis, embB, мобильного элемента IS6110, фрагментов микобактериального генома, содержащих генотип-специфичные однонуклеотидные полиморфизмы Rv0557, Rv0129c, Rv1811, Rv2629, Rv0118c, с одновременным флуоресцентным маркированием при использовании геномной ДНК микобактерий туберкулезного комплекса в качестве матрицы и набора праймеров, последовательности которых представлены SEQ ID NO: 1-36, с получением флуоресцентно-меченых фрагментов микобактериального генома.

б) обеспечение олигонуклеотидного микрочипа для идентификации ДНК микобактерии туберкулезного комплекса с одновременным установлением генотипов Beijing, Beijing B0, LAM, Haarlem, Ural и определением мутаций, ответственных за устойчивость возбудителя туберкулеза к рифампицину, изониазиду, фторхинолонам, канамицину, амикацину, капреомицину, этамбутолу, представляющий собой подложку, содержащую множество дискретных элементов, в каждом из которых иммобилизован уникальный олигонуклеотидный зонд, имеющий последовательность, комплементарную последовательности одноцепочечного фрагмента, полученного на стадии (а), и выбранную из группы, включающей: а) соответствующие последовательности фрагмента мобильного элемента IS6110; б) соответствующие последовательности фрагмента, включающего полиморфизм Rv0557, характерный для Евро-Американской линии; в) соответствующие последовательности фрагмента, включающего полиморфизм Rv0557, характерный для генотипа Haarlem, при установленной принадлежности к Евро-Американской линии; г) соответствующие последовательности фрагмента, включающего полиморфизм Rv0129c, характерный для генотипа LAM, при установленной принадлежности к Евро-Американской линии; д) соответствующие последовательности фрагмента, включающего полиморфизм Rv1811, характерный для генотипа Ural, при установленной принадлежности к Евро-Американской линии; е) соответствующие последовательности фрагмента, включающего полиморфизм Rv2629, характерный для семейства Beijing, при отсутствии принадлежности к Евро-Американской линии; ж) соответствующие последовательности фрагмента, включающего полиморфизм Rv0118c в гене oxcA, характерный для генотипа Beijing B0/W148 при установленном семействе Beijing; з) соответствующие последовательности фрагмента гена rpoB дикого типа; и) соответствующие последовательности фрагмента мутантного варианта гена rpoB, приводящего к устойчивости микроорганизмов к рифампицину; й) соответствующие последовательности фрагмента гена katG дикого типа; к) соответствующие последовательности фрагмента мутантного варианта гена katG, приводящего к устойчивости микроорганизмов к изониазиду; л) соответствующие последовательности фрагмента гена inhA дикого типа; м) соответствующие последовательности фрагмента мутантного варианта гена inhA, приводящего к устойчивости микроорганизмов к изониазиду; н) соответствующие последовательности фрагмента гена ahpC дикого типа; о) соответствующие последовательности фрагмента мутантного варианта гена ahpC, приводящего к устойчивости микроорганизмов к изониазиду; п) соответствующие последовательности фрагмента гена gyrA дикого типа; р) соответствующие последовательности фрагмента мутантного варианта гена gyrA, приводящего к устойчивости микроорганизмов к фторхинолонам; с) соответствующие последовательности фрагмента гена gyrB дикого типа; т) соответствующие последовательности фрагмента мутантного варианта гена gyrB, приводящего к устойчивости микроорганизмов к фторхинолонам; у) соответствующие последовательности фрагмента гена eis дикого типа; ф) соответствующие последовательности фрагмента мутантного варианта гена eis, приводящего к устойчивости микроорганизмов к канамицину, амикацину и капреомицину; х) соответствующие последовательности фрагмента гена rrs дикого типа; ц) соответствующие последовательности фрагмента мутантного варианта гена rrs, приводящего к устойчивости микроорганизмов к канамицину, амикацину и капреомицину; ч) соответствующие последовательности фрагмента гена embB дикого типа; ш) соответствующие последовательности фрагмента мутантного варианта гена embB, приводящего к устойчивости микроорганизмов к этамбутолу; при этом последовательности иммобилизованных олигонуклеотидных зондов представлены SEQ ID NO: 37-229;

(в) - гибридизацию амплифицированных флуоресцентно-меченых продуктов, полученных на стадии (а), на олигонуклеотидном микрочипе с образованием дуплексов с иммобилизованными зондами в условиях, обеспечивающих разрешение в один нуклеотид между образующимися в результате гибридизации совершенными и несовершенными дуплексами;

(г) - регистрацию результатов гибридизации на олигонуклеотидном микрочипе, проведенной на стадии (в) с использованием портативного анализатора флуоресценции и программного обеспечения, что позволяет использовать программную обработку интенсивностей сигналов с последующей интерпретацией результатов, которую проводят в два этапа: на первом этапе анализируют сигналы в ячейке микрочипа, содержащей олигонуклеотидный зонд, специфичный к фрагменту мобильного элемента IS6110, характерного для микобактерий туберкулезного комплекса, с целью обнаружения ДНК возбудителя туберкулеза; при наличии сигнала в данной ячейке, т.е. в случае обнаружения микобактериальной ДНК, на втором этапе одновременно анализируют элементы микрочипа, содержащие генотип-специфичные олигонуклеотидные зонды, исследующие полиморфизмы Rv0557, Rv0129c, Rv1811, Rv2629, Rv0118c, и элементы, в которых иммобилизованы олигонуклеотидные зонды для выявления мутаций в генах rpoB, katG, inhA, ahpC, gyrA, gyrB, rrs, eis, embB, тем самым устанавливая генотип возбудителя туберкулеза и определяя генетические детерминанты устойчивости к рифампицину, изониазиду, фторхинолонам, канамицину, амикацину, капреомицину, этамбутолу.

В одном из своих воплощений способ характеризуется тем, что амплификацию фрагментов микобактериального генома проводят, используя ДНК, выделенную из материала клинического образца (мокроту, экссудат, бронхоальвеолярный лаваж, кровь) или предварительно выращенной культуры микроорганизма.

В следующем воплощении способ характеризуется тем, что на стадии (а) в для флуоресцентного маркирования получаемых ПЦР-фрагментов используют флуоресцентно меченый дезоксиуридинтрифосфат.

В еще одном из воплощений способ характеризуется тем, что на стадии (г) на втором этапе интерпретации результатов при анализе элементов микрочипа, содержащих генотип-специфичные олигонуклеотидные зонды, в случае установления дикого типа по полиморфизму Rv0557_321 штамм относят к Евро-Американской линии, с дальнейшей идентификацией генотипа Haarlem (по полиморфизму Rv0557_455), либо генотипа LAM (по полиморфизму Rv0129c), либо Ural (по полиморфизму Rv1811); при выявлении другого варианта полиморфизма Rv0557_321 штамм относят к иной, не Евро-Американской линии, с дальнейшей идентификацией семейства Beijing (по полиморфизму Rv2629), и определением генотипа B0/W148 для семейства Beijing (по полиморфизму Rv0118).

В еще одном из своих воплощений способ характеризуется на стадии (г) на втором этапе интерпретации результатов анализируют группы элементов, содержащих олигонуклеотидные зонды, специфичные к одному из генов rpob, katG, inhA, ahpC, gyrA, gyrB, rrs, eis, tmbB; при этом каждая из групп включает элемент, содержащий зонд дикого типа, и элементы, содержащие зонды, соответствующие мутантным вариантам генов. Если максимальный сигнал в группе зарегистрирован в элементе, содержащем зонд дикого типа, то считают, что по данной аминокислотной/нуклеотидной позиции данного гена изучаемый образец ДНК возбудителя туберкулеза мутаций не имеет. Если максимальный сигнал в группе зарегистрирован в элементе, содержащем зонд, последовательность которого специфична для мутантного варианта одного из генов, то считают, что по данной аминокислотной/нуклеотидной позиции данного гена изучаемый образец ДНК возбудителя туберкулеза имеет аминокислотную/нуклеотидную замену, являющейся генетической детерминантой устойчивости.

Наконец, в еще одном своем воплощении способ дополнительно может включать подтверждение клинического диагноза «туберкулез», персонализированный выбор эффективных химиопрепаратов первого и второго ряда, установление клинически значимых генотипов и эпидемиологическое генотипирование на основе проведенной интерпретации результатов.

Краткий перечень фигур

Для более ясного понимания сущности заявленного изобретения, а также для демонстрации его характерных черт и преимуществ далее приводится подробное описание изобретения со ссылками на фигуры чертежей, на которых:

Фиг. 1. представляет схему размещения дискриминирующих олигонуклеотидов на биочипе.

Фиг. 2. Флуоресцентная картина гибридизации биочипа и результаты интерпретации при анализе ДНК лабораторного штамма M. tuberculosis H37Rv, чувствительного к рифампицину, изониазиду, фторхинолонам, канамицину, амикацину/капреомицину, этамбутолу.

Фиг. 3. Флуоресцентная картина гибридизации биочипа и результаты интерпретации при анализе ДНК, выделенной из клинического образца, содержащего штамм M. tuberculosis генотипа Ural, обладающий устойчивостью к изониазиду.

Фиг. 4. Флуоресцентная картина гибридизации биочипа и результаты интерпретации при анализе ДНК, выделенной из клинического образца, содержащего штамм M. tuberculosis генотипа Beijing B0/W148, обладающего устойчивостью к рифампицину, изониазиду, этамбутолу.

Фиг. 5. Флуоресцентная картина гибридизации биочипа и результаты интерпретации при анализе ДНК, выделенной из клинического образца, содержащего штамм M. tuberculosis генотипа Beijing, обладающего устойчивостью к рифампицину, изониазиду, фторхинолонам, канамицину, амикацину/капреомицину, этамбутолу.

Фиг. 6. Флуоресцентная картина гибридизации биочипа и результаты интерпретации при анализе ДНК, выделенной из клинического образца, содержащего штамм M. tuberculosis генотипа LAM, облада