Антитела против ох40 и способы их применения

Антитела против ох40 и способы их применения

Иллюстрации

Показать все

Реферат

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ, К КОТОРОЙ ОТНОСИТСЯ ИЗОБРЕТЕНИЕ

Настоящее изобретение, в целом, относится к модулированию активации рецептора OX40, и более конкретно, к модулированию ингибирования рецептором OX40 иммуносупрессорной функции продуцирующих интерлейкин 10 (IL-10) регуляторных T-клеток типа 1 CD4⁺ («клеток Tr1») и экспрессирующих Foxp3⁺ регуляторных T-клеток (также иногда называемых в настоящем описании клетками «Foxp3⁺ T-reg»), и образования клеток Tr1 из клеток CD4⁺ или наивных клеток и продукции IL-10.

ПЕРЕКРЕСТНАЯ ССЫЛКА НА РОДСТВЕННУЮ ЗАЯВКУ

Настоящая заявка является частичным продолжением предыдущей заявки PCT № PCT/US11/48752, поданной 23 августа 2011, по которой испрашивается приоритет предварительной заявки на выдачу патента США № 61/375999, поданной 23 августа 2010, и предварительной заявки на выдачу патента США № 61/380827, поданной 8 сентября 2010. Указанные заявки включены в настоящее описание в качестве ссылки.

ИНФОРМАЦИЯ О ФИНАНСИРУЕМОМ ИЗ ФЕДЕРАЛЬНОГО БЮДЖЕТА ИССЛЕДОВАНИИ ИЛИ РАЗРАБОТКЕ

Настоящее изобретение было создано при поддержке правительства по грантам номер R01 AI061645-01, R01 AI062888-01, и U19 AI071130-01, присужденным национальными институтами здравоохранения. Правительство обладает определенными правами на изобретение.

НАИМЕНОВАНИЯ СТОРОН СОГЛАШЕНИЯ О СОВМЕСТНОМ ИССЛЕДОВАНИИ

Нет.

ССЫЛКА НА СПИСОК ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

В настоящее описание включен список последовательностей, поданный в виде текстового файла согласно 37 C.F.R. § 1.52(e)(v), названного sequence listing.txt, созданного 1 февраля 2012, размером 32796 байт, который включен в настоящее описание в качестве ссылки. Прилагаемое описание последовательностей и список последовательностей соответствуют правилам, установленным для описания нуклеотидных и/или аминокислотных последовательностей в заявках на выдачу патента, которые указаны в 37 C.F.R. §§ 1.821-1.825. Список последовательностей содержит однобуквенный код для записи нуклеотидных последовательностей и трехбуквенный код для аминокислот, которые определены в соответствии со стандартами ИЮПАК-МСБМБ, описанными в Nucleic Acids Res. 13: 3021-3030 (1985) и в Biochemical J. 219 (№2): 345-373 (1984). Символы и формат, используемые для представления данных о нуклеотидных и аминокислотных последовательностях соответствуют правилам, указанным в 37 C.F.R. § 1.822.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Клетки Tr1 играют решающую роль в периферической толерантности. Клетки Tr1 особенно важны для ограничения повреждения тканей хозяина во время воспалительных иммунных ответов. Образование клеток Tr1 сопровождает как TH1-, так и TH2-иммунные ответы in vivo и in vitro.

Клетки Tr1 образуются из наивных T-клеток CD4⁺ во время запускаемого антигеном T-клеточного иммунного ответа. Клетки Tr1 являются анергическими в случае ответа на передачу сигнала через рецепторы TCR, CD28 и IL-2 и обладают способностью супрессировать запускаемую антигеном пролиферацию наивных T-клеток CD4⁺ in vivo и in vitro. Клетки Tr1 обладают способностью ингибировать развитие аутоиммунных заболеваний и ограничивают величину иммунных ответов на микробные патогены.

Хотя молекулярные сигналы, которые приводят к появлению клеток Tr1, были изучены, мало известно о молекулярных сигналах, которые отрицательно регулируют образование таких клеток. Хотя было показано, что иммунодепрессивные лекарственные средства, цитокины, костимулирующие молекулы и ДК вовлечены в индукцию клеток Tr1, сигналы, которые отрицательно регулируют образование клеток Tr1, остаются неясными.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Активация рецептора OX40 блокирует образование Tr1 из наивных T-клеток CD4⁺ или T-клеток памяти CD4⁺, а также продукцию IL-10 клетками Tr1 и иммуносупрессорную функцию клеток Tr1. Активация рецептора OX40 также блокирует продукцию IL-10 клетками Foxp3⁺ T-reg и иммуносупрессорную функцию. В связи с этим в настоящем описании представлены агонистические антитела, которые связываются с рецептором OX40, при этом агонист модулирует активацию рецептора OX40, блокируя секрецию цитокина IL-10 и/или общую иммуносупрессорную функцию клеток Tr1 и Foxp3⁺ T-reg. По существу, антитела могут имитировать лиганд OX40 и запускать рецептор OX40 на клетках Tr1 и/или на природных регуляторных T-клетках («nTreg»), также называемых «Foxp3⁺ T-reg».

Как было показано авторами в одновременно находящихся на рассмотрении заявках на выдачу патента США с регистрационными номерами 11/659266 и 12/861135, OX40L ингибирует образование и функцию IL-10-продуцирующих клеток Tr1 из наивных T-клеток и T-клеток памяти CD4⁺, которые индуцировали иммунодепрессивными лекарственными средствами дексаметазоном и витамином D3. Авторы изобретения обнаружили, что OX40L ингибирует образование и функцию IL-10-продуцирующих регуляторных T-клеток. Такие открытия демонстрируют, что передача сигнала OX40 при действии OX40L подавляет образование IL-10-продуцирующих иммуносупрессорных T-клеток человека в культуре. Такая уникальная функция OX40L не свойственна двум другим костимулирующим представителям TNF-семейства, GITR-лиганду и 4-1BB-лиганду. OX40L также сильно ингибирует образование и функцию IL-10-продуцирующих клеток Tr1, индуцируемых двумя физиологическими стимулами, обеспечиваемыми индуцируемым костимулирующим лигандом и незрелыми ДК. Передача сигнала через рецептор OX40 на T-клетках человека при действии моноклональных антител, малых молекул или OX40L или белком, который по меньшей мере на 90 процентов гомологичен ими, модулирует и регулирует образование и функцию IL-10-продуцирующих иммуносупрессорных T-клеток.

Такое обнаружение дает возможность многочисленным вариантам использования при лечении. Например, агонистические антитела, малые молекулы или OX40L можно использовать для подавления образования и функции IL-10-продуцирующих иммуносупрессорных T-клеток и, следовательно, их можно использовать для усиления иммунных ответов для лечения злокачественной опухоли и инфекционных болезней, или в качестве адъюванта противораковых вакцин. Антагонистические антитела против OX40 или против OX40L или антагонистические малые молекулы можно использовать для усиления образования и функции IL-10-продуцирующих иммуносупрессорных T-клеток и, следовательно, их можно использовать для создания способов терапии аутоиммунных заболеваний и заболеваний «трансплантат против хозяина». Обнаружение, сделанное авторами изобретения также обеспечивает возможность осуществления способов высокопроизводительного скрининга антител или малых молекул, либо активирующих рецептор OX40 (либо наоборот блокирующих передачу сигнала OX40) на T-клетках для создания способов лечения злокачественной опухоли, или альтернативно, аутоиммунных заболеваний и болезней «трансплантат против хозяина».

Настоящее изобретение относится к моноклональным антителам и антителам человека (иногда называемым в настоящем описании «антителом против OX40» и/или другими вариантами такого названия), которые связывают рецептор OX40 человека. Такие антитела могут использоваться для лечения или профилактики острых или хронических заболеваний или состояний, патология которых связана с OX40. В одном из аспектов раскрыто выделенное антитело человека или его антигенсвязывающая часть, которые связываются с OX40 человека и являются эффективными в качестве средства лечения злокачественной опухоли или лечения, направленного против аутоиммунного заболевания. Любое из антител против OX40, описанных в настоящем описании, можно использовать в качестве лекарственного средства. Любое, одно или несколько, антител против OX40 можно использовать для лечения одной или нескольких различных злокачественных опухолей или аутоиммунного заболевания, описанных в настоящем описании.

Настоящее изобретение относится к выделенным гуманизированным антителам, которые связываются с OX40. Выделенные антитела, которые описаны в настоящем описании, связываются с OX40 и могут связываться с OX40, кодируемым следующими генами: с номером доступа в NCBI NP_003317, с номером доступа в Genpept Accession P23510, или генами, которые на 90 процентов гомологичны им. Выделенное антитело, предлагаемое в настоящем описании, может дополнительно связываться с рецептором OX40, имеющим один из следующих номером доступа в GenBank: AAB39944, CAE11757 или AAI05071.

Как указано в настоящем описании, примером является выделенное антитело, которое связывается с OX40, содержащее: (a) вариабельную область тяжелой цепи CDR1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:1; (b) вариабельную область тяжелой цепи CDR2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:2; (c) вариабельную область тяжелой цепи CDR3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:3; (d) вариабельную область легкой цепи CDR1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:7; (e) вариабельную область легкой цепи CDR2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:8; и (f) вариабельную область легкой цепи CDR3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:9.

Кроме того, другим примером является выделенное антитело, которое связывается с OX40, содержащее: (a) вариабельную область тяжелой цепи CDR1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:13; (b) вариабельную область тяжелой цепи CDR2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:14; (c) вариабельную область тяжелой цепи CDR3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:15; (d) вариабельную область легкой цепи CDR1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:19; (e) вариабельную область легкой цепи CDR2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:20; и (f) вариабельную область легкой цепи CDR3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:21.

Кроме того, другим примером является выделенное антитело, которое связывается с OX40, содержащее: (a) вариабельную область тяжелой цепи CDR1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:25; (b) вариабельную область тяжелой цепи CDR2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:26; (c) вариабельную область тяжелой цепи CDR3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:27; (d) вариабельную область легкой цепи CDR1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:32; (e) вариабельную область легкой цепи CDR2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:33; и (f) вариабельную область легкой цепи CDR3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:34.

Альтернативно, выделенное антитело может иметь вариабельную область тяжелой цепи CDR1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:1 или 13; вариабельную область тяжелой цепи CDR2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:2 или 14; и/или вариабельную область тяжелой цепи CDR3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:3 или 15, или вариабельную область тяжелой цепи CDR, которая на 90 процентов гомологична указанным последовательностям.

Кроме того, выделенное антитело может иметь вариабельную область легкой цепи CDR1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:7 или 19; вариабельную область легкой цепи CDR2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:8 или 20, и/или вариабельную область легкой цепи CDR3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:9 или 21, или вариабельную область тяжелой цепи, которая на 90 процентов гомологична указанным последовательностям.

Выделенное антитело может иметь вариабельную область легкой цепи («VL»), содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:10, 11, 22 или 23, или аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 90 процентов идентична аминокислотным последовательностям SEQ ID NO:10, 11, 22 или 23. Выделенное антитело может иметь вариабельную область тяжелой цепи («VH»), содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:4, 5, 16 и 17 или аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 90 процентов идентична аминокислотным последовательностям SEQ ID NO:4, 5, 16 и 17. По существу, в качестве примера выделенное антитело может содержать вариабельную последовательность тяжелой цепи SEQ ID NO:5 и вариабельную последовательность легкой цепи SEQ ID NO:11 или последовательность, которая на 90 процентов гомологична указанным последовательностям. Подобным образом, выделенное антитело может иметь вариабельную последовательность тяжелой цепи SEQ ID NO:17 и вариабельную последовательность легкой цепи SEQ ID NO:23 или последовательность, которая на 90 процентов гомологична указанным последовательностям.

Выделенное антитело может иметь вариабельную легкую цепь, кодируемую последовательностью нуклеиновой кислоты SEQ ID NO:12 или 24 или последовательностью нуклеиновой кислоты, которая по меньшей мере на 90 процентов идентична нуклеотидным последовательностям SEQ ID NO:12 или 24. Выделенное антитело может иметь вариабельную тяжелую цепь, кодируемую последовательностью нуклеиновой кислоты SEQ ID NO:6 или 18 или последовательностью нуклеиновой кислоты, которая по меньшей мере на 90 процентов идентична нуклеотидными последовательностями SEQ ID NO:6 или 18.

Также настоящее изобретение относится к моноклональному антителу. Моноклональные антитела могут иметь вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:10 или 22, или аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 90 процентов идентична аминокислотным последовательностям SEQ ID NO:10 или 22. Кроме того, изобретение отнросится к моноклональным антителам с вариабельной областью тяжелой цепи, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO:4 или 16 или аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 90 процентов идентична аминокислотным последовательностям SEQ ID NO:4 или 16.

Также настоящее описание относится к выделенной нуклеиновой кислоте, кодирующей антитело против OX40, описанной в настоящем описании. Кроме того, настоящее изобретение относится к клеткам-хозяевам, которые содержат нуклеиновую кислоту, кодирующую любое из антител против OX40, описанных в настоящем описании. Кроме того, изобретение относится к способам получения антитела (например, клетки-хозяина, содержащей нуклеиновую кислоту, кодирующую любое из антител против OX40, описанных в настоящем описании), включающим культивирование клетки-хозяина так, чтобы она продуцировала антитело, и/или извлечение антитела из клетки-хозяина.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

Для того, чтобы перечисленные выше признаки, аспекты и преимущества изобретения, а также другое, которое будет очевидно, были достигнуты и могли быть понятны в деталях, может быть приведено более конкретное описание изобретения, кратко суммированного выше, при обращении к его вариантам, которые проиллюстрированы на чертежах, которые составляют часть настоящего описания. Однако следует отметить, что прилагаемые чертежи иллюстрируют некоторые варианты осуществления изобретения, и поэтому их не следует рассматривать как ограничивающие объем изобретения, так как изобретение может допускать другие эквивалентно эффективные варианты осуществления.

На фиг. 1 показано, что FOXP3⁺ Treg инфильтруют ткани фолликулярной лимфомы (FL) человека и локализованы вместе с опухолевыми B-клетками и моноцитами. Слева: двойное иммуноокрашивание клеток FOXP3⁺ Treg (красные) и B-клеток лимфомы CD20⁺ (зеленые); Справа: FOXP3⁺ Treg (красные) и CD11c⁺ моноциты/макрофаги/ДК (зеленые).

На фиг. 2A и 2B показаны увеличенные количества CD4⁺FOXP3⁺ Treg у пациентов с FL. Опухолевые клетки и PBMC получали от шести пациентов с FL при первичном диагнозе перед терапией. PBMC также получали от шести здоровых доноров для сравнения. Процентное содержание регуляторных T-клеток среди суммарных T-клеток CD4⁺ определяли в проточно-цитометрическом анализе CD4⁺CD25⁺CD127^lowFOXP3⁺ Treg. На фиг. 2A показан типичный FACS-анализ клеток Treg. FL PBMC и опухолевые клетки FL были получены от одного и того же пациенты и разделены. На фиг. 2B показано процентное содержание Treg у всех доноров. Горизонтальные полоски показывают средние значения.

На фиг. 3 показано выделение ICOS⁺FOXP3⁺ Treg или ICOS^-FOXP3⁺ Treg из FL. Суспензию отдельных клеток получали из образца селезенки перед любой обработкой. Клетки размораживали в день анализа. Обогащенные T-клетки CD4⁺CD8^-CD14^-CD16^-CD56^-CD11c^-TCRγδ^- делили на подгруппы CD25^low и CD25^high. CD4⁺CD25^highFOXP3⁺ Treg дополнительно сортировали на подгруппы ICOS^high и ICOS^low на основании поверхностной экспрессии ICOS. Внутриклеточную экспрессию FOXP3 определяли во всех подгруппах.

На фиг. 4 показано, что внутриопухолевые Treg ингибируют пролиферацию инфильтрующих T-клеток CD4⁺CD25^- в FL, и ингибирование может быть частично блокировано нейтрализующими антителами против IL-10. CFSE-меченые инфильтрующие опухоль T-клетки CD4⁺CD25^- культивировали с аутологичными опухолевыми клетками, предварительно активированными рекомбинантным CD40L в присутствии или отсутствии аутологичных ICOS⁺FOXP3⁺ Treg или ICOS^-FOXP3⁺ Treg, или анти-IL-10 (10 мкг/мл). Через 72 часа культивирования определяли пролиферацию клеток CD4⁺CD25^- в проточно-цитометрическом анализе разбавления CFSE.

На фиг. 5A показан внутриклеточный анализ продукции цитокинов наивными T-клетками CD4⁺, которую определяли с использованием проточной цитометрии согласно варианту осуществления способа по настоящему изобретению.

На фиг. 5B показана продукция цитокинов наивными T-клетками CD4⁺, которую определяли в ELISA согласно варианту осуществления способа по настоящему изобретению.

На фиг. 5C показана супрессорная функция IL-10-продуцирующих клеток Tr1, которую определяли по включению [³H]-тимидина согласно варианту осуществления способа по настоящему изобретению.

На фиг. 6A показан внутриклеточный анализ продукции цитокинов T-клетками памяти CD4⁺, которую определяли с использованием проточной цитометрии согласно осуществления способа по настоящему изобретению.

На фиг. 6B показана продукция IL-10 T-клетками памяти CD4⁺, которую определяли в ELISA согласно варианту осуществления способа по настоящему изобретению.

На фиг. 7A показан внутриклеточный анализ продукции цитокинов наивными T-клетками CD4⁺, которую определяли с использованием проточной цитометрии согласно варианту осуществления способа по настоящему изобретению.

На фиг. 7B показана продукция IL-10 наивными T-клетками CD4⁺, которую определяли в ELISA согласно варианту осуществления способа по настоящему изобретению.

На фиг. 7C показано количество живых T-клеток, подсчитанное согласно варианту осуществления способа по настоящему изобретению.

На фиг. 8A показан внутриклеточный анализ продукции цитокинов наивными T-клетками CD4⁺, которую определяли с использованием проточной цитометрии согласно варианту осуществления способа по настоящему изобретению.

На фиг. 8B показана продукция IL-10 наивными T-клетками CD4⁺, которую определяли в ELISA согласно варианту осуществления способа по настоящему изобретению.

На фиг. 8C показан внутриклеточный анализ продукции цитокинов T-клетками памяти CD4⁺, которую определяли с использованием проточной цитометрии согласно варианту осуществления способа по настоящему изобретению.

На фиг. 8D показана продукция IL-10 T-клетками памяти CD4⁺, которую определяли в ELISA согласно варианту осуществления способа по настоящему изобретению.

На фиг. 8E показан внутриклеточный анализ продукции цитокинов наивными T-клетками CD4⁺, которую определяли с использованием проточной цитометрии согласно варианту осуществления способа по настоящему изобретению.

На фиг. 8F показана продукция IL-10 наивными T-клетками CD4⁺, которую определяли в ELISA согласно варианту осуществления способа по настоящему изобретению.

На фиг. 9 показана продукция IL-10 регуляторными T-клетками, которую определяли в ELISA согласно варианту осуществления способа по настоящему изобретению.

На фиг. 10 показаны результаты скрининга супернатантов гибридом, продуцирующих антитела против OX40 человека, против L-OX40 по сравнению с исходными L-клетками, которые были получены в ELISA.

На фиг. 11 показан скрининг специфичных моноклональных антител против OX40 человека, который осуществляли с использованием проточно-цитометрического анализа согласно варианту осуществления способа по настоящему изобретению.

На фиг. 12 показано подтверждение специфичности моноклональных антител против hOX40 с использованием клеток SUPM2, экспрессирующих OX40 (SUPM2-OX40) согласно варианту осуществления способа по настоящему изобретению.

На фиг. 13 показаны OX40-специфичные моноклональные антитела, которые могут ингибировать образование IL-10-продуцирующих клеток (Tr1) из T-клеток CD4⁺, стимулированных витамином D₃ (0,1 мкМ)/Dex (50 нм), CD32L/ICOSL и анти-CD3/CD28 (0,2 мкг/мл) согласно варианту осуществления способа по настоящему изобретению. Типичные данные, полученные с использованием активируемой флуоресценцией сортировки клеток (FACS), показаны на фиг. A, и процент IL-10-продуцирующих клеток в случае всех обработок моноклональными OX40-антителами показан на фиг. B.

На фиг. 14 показаны результаты, свидетельствующие, что hOX40-специфичные моноклональные антитела, которые ингибируют образование клеток Tr1, также стимулируют пролиферацию T-клеток CD4⁺ согласно варианту осуществления способа по настоящему изобретению.

На фиг. 15A, 15B и 15C подробно показано титрование моноклональных OX40-антител в отношении их способности ингибировать образование клеток Tr1 из T-клеток CD4⁺ согласно варианту осуществления способа по настоящему изобретению. Типичные данные FACS показаны на фиг. 15A, и процентное содержание клеток Tr1 после обработки девятью моноклональными OX40-антителами показано на фиг. 15B.

На фиг. 16A, 16B и 16C показаны OX40-специфичные моноклональные антитела, которые ингибируют образование IL-10-продуцирующих клеток Tr1 из T-клеток CD4⁺, а также ингибируют продукцию IL-10 и иммуносупрессорную функцию ICOS⁺CD4⁺CD25^highCD127^- Treg. Свежие отсортированные ICOS⁺CD4⁺CD25^highCD127^- Treg (ICOS⁺Treg) стимулировали анти-CD3 (0,2 мкг/мл) в присутствии клеток CD32L/ICOSL и клеток CD32L/OX40L (фиг. 16A) или моноклональными OX40-антителами или контрольным антителом (фиг. 16B) в течение пяти дней. Затем клетки повторно стимулировали анти-CD3/CD28 в течение 24 часов и супенатанты анализировали в отношении IL-10 в твердофазном иммуноферментном анализе (ELISA). На фиг. 16C представлен основанный на моноцитах анализ пролиферации, показывающий, что два антитела блокировали функцию ICOS⁺Treg.

На фиг. 17A и 17B показана идентификация моноклональных анти-hOX40-антител, которые ингибируют образование клеток Tr1 и блокируют функцию FOXP3⁺CD4⁺CD25^high Treg, согласно варианту осуществления способа по настоящему изобретению. Типичные проточно-цитометрические анализы показаны на фиг. 17A. Данные для шести моноклональных антител показаны на фиг. 17B.

На фиг. 18 показана идентификация анти-hOX40 моноклональных антител, которые не ингибируют образование клеток Tr1, но блокируют функцию FOXP3⁺CD4⁺CD25^high Treg, согласно варианту осуществления способа по настоящему изобретению.

На фиг. 19A и 19B показано блокирование агонистическими анти-hOX40-антителами функции полученных из лимфомы CD4⁺CD25^high Treg, согласно варианту осуществления способа по настоящему изобретению. Типичные анализы FACS показаны на фиг. 19A, и данные всех экспериментов показаны на фиг. 19B.

На фиг. 20 показано, что моноклональные анти-hOX40- антитела могут связываться с T-клетками CD4⁺ резус. Как показано, шесть анти-hOX40-мАт могут связываться с активированными T-клетками CD4⁺ резус, и будут связываться с OX40 резус и активировать передачу сигнала OX40.

На фиг. 21 показано, что каждое из антител Hu106-222 партии I и II из примера I состоит из тяжелой цепи с молекулярной массой примерно 50 кД и легкой цепи с молекулярной массой примерно 25 кД. Чистота антител Hu106-222 партии I и II, по-видимому, составляет более 95%.

На фиг. 22 показан анализ антител мыши 106-122, Ch106 и Hu106-222 (партия II) в отношении связывания с клетками L/OX40 (пример I).

На фиг. 23 изображена схематичная структура вектора экспрессии для IgG1/каппа-антитела Hu106 (вектор экспрессии). В направлении по часовой стрелке от сайта SalI сверху плазмида содержит единицу транскрипции тяжелой цепи, начинающуюся основным немедленным ранним промотором цитомегаловируса (CMV) человека и энхансером (промотор CMV) для инициации транскрипции гена тяжелой цепи антитела. За промотором следует экзон VH, геномная последовательность, содержащая константную область тяжелой цепи гамма-1 человека, включая экзоны CH1, шарнирный, CH2 и CH3 с находящимися между ними интронами, и сайт полиаденилирования, следующий за экзоном CH3. Вслед за последовательностью гена тяжелой цепи единица транскрипции легкой цепи начинается промотором CMV, за которым следует экзон VL и геномная последовательность, содержащая экзон константной области цепи каппа человека (CL) с предшествующей ему частью интрона, и сайт полиаденилирования, следующий за экзоном CL. После гена легкой цепи следует ранний промотор SV40 (промотор SV40), ген ксантингуанинфосфорибозилтрансферазы (gpt) E. coli и участок, содержащий сайт полиаденилирования SV40 (сайт поли(A) SV40). Наконец, плазмида содержит часть плазмиды pUC19, включающую бактериальное начало репликации (pUC ori) и ген бета-лактамазы (бета-лактамаза). На фигуре показаны положения соответствующих сайтов рестрикции.

На фиг.24 показано сравнение между антителами Hu 106-222 партии I и II в отношении связывания с клетками L/OX40 (пример I ниже).

На фиг. 25 показано, что Hu119-122 состоит из тяжелой цепи с молекулярной массой примерно 50 кД и легкой цепи с молекулярной массой примерно 25 кД. Чистота Hu119, по-видимому, составляет более 95% (пример II ниже).

На фиг. 26 показан результат FACS-анализа антител Ch119-122 и Hu119-122, описанных в настоящем описании (пример II ниже).

На фиг. 27 показано, что клон 119-122 гуманизированных мАт против OX40 человека (Hu119) и соответствующее ему FcR-связывающее мутантное антитело (Hu1l9-AA) усиливали пролиферацию наивных T-клеток CD4⁺. Hu119-122 обладало более высокой стимулирующей T-клетки активностью по сравнению с исходным мАт мыши против OX40 человека (119-122 мыши). Однако химерное мАт против OX40 человека (Ch119, VH и VL мыши, но константные области гамма-1 и каппа человека) не могло усиливать пролиферацию T-клеток.

На фиг. 28 показано, что клон FcR-связывающих мутантных гуманизированных мАт против OX40 человека 106-222 (Hu222AA) и клон химерных мАт против OX40 человека 106-222 (Ch222) усиливали стимулированную анти-CD3 пролиферацию наивных T-клеток CD4⁺. Указанные антитела обладали стимулирующей активностью, сходной с активностью исходного мАт мыши против OX40 человека (222 мыши). Однако полностью гуманизированное антитело против OX40 человека, Hu222, не усиливало пролиферацию T-клеток по сравнению с IgG1 человека.

На фиг. 29A и B показано, что гуманизированный и мышиный клоны мАт против OX40 человека 119-122 блокируют супрессорную функцию CD4⁺ Treg.

На фиг. 30 представлены данные, показывающие, что антитела против OX40 человека усиливают пролиферацию T-клеток CD4⁺ и CD8⁺ в случае использования связанных с планшетом антител.

На фиг. 31 показано, что гуманизированные антитела и антитела мыши против OX40 человека требуют перекрестного связывания для того, чтобы усилить пролиферацию T-клеток.

На фиг. 32 показано, что антитела против OX40 человека блокируют активность CD4⁺FOXP3⁺nTreg при использовании связанных с планшетом антител.

На фиг. 33 показано, что высокая концентрация антител мыши против OX40 человека преимущественно убивает FOXP3⁺ Treg.

На фиг. 34 показано, что мАт мыши против OX40 человека непосредственно действуют либо на эффекторные T-клетки, либо на nTreg, блокируя супрессорную функцию Treg.

На фиг. 35A, 35B и 35C показаны результаты лечения с использованием анти-hOX40-мАт у мышей, у которых был осуществлен адоптивный перенос T-клеток hOX40⁺CD8⁺. мАт против OX40 человека стимулирует экспансию и выживаемость T-клеток in vivo. Схема терапевтической вакцинации показана на фиг. 35A. Типичные изображения биолюминесценции in vivo показаны на фиг. 35B. Результаты лечения опухолей антителами показаны на фиг. 35C.

На фиг. 36 показано выравнивание аминокислотных последовательностей VH 106-222, гуманизированного 106-222 (Hu106) и последовательности VH акцептора человека X61012 (номер доступа в GenBank). Аминокислотные остатки показаны с использованием однобуквенного кода. Числа над последовательностями указывают положения согласно системе Kabat et al. (Sequences of Proteins of Immunological Interests, Fifth edition, NIH Publication No. 91-3242, U.S. Department of Health and Human Services, 1991). Такие же последовательности, как и последовательности, заявленные в настоящем описании, также представлены в списке последовательностей, но номера положений могут отличаться. На фигуре 36, последовательности CDR, определенные согласно системе Kabat et al. (1991), подчеркнуты в VH 106-222. Остатки CDR в VH X61012 на фигуре пропущены. Проводили поиск последовательностей VH человека, гомологичных каркасам VH 106-222, в базе данных GenBank, и последовательность VH, кодируемая кДНК X61012 человека (X61012 VH) была выбрана в качестве акцептора для гуманизации. Последовательности CDR VH 106-222 сначала переносили в соответствующие положения VH X61012. Затем в положениях каркаса, в которых, как свидетельствовала трехмерная модель вариабельных областей 106-222, происходит значимый контакт с CDR, аминокислотными остатками VH 106-222 мыши заменяли соответствующие остатки человека. Такие замены осуществляли в положениях 46 и 94 (подчеркнуты в VH Hu106). Кроме того, остаток каркаса человека, который, как было обнаружено, является нетипичным в соответствующей подгруппе V-областей, заменяли наиболее типичным остатком, чтобы снизить потенциальную иммуногенность. Такую замену осуществляли в положении 105 (подчеркнуто двумя чертами в VH Hu106).

На фиг. 37 показано выравнивание аминокислотных последовательностей VL 106-222, гуманизированного 106-222 (Hu106) и последовательности VL акцептора AJ388641 человека (номер доступа в GenBank). Аминокислотные остатки показаны с использованием однобуквенного кода. Числа над последовательностями указывают положения согласно системе Kabat et al. (1991). Такие же последовательности, как и последовательности, заявленные в настоящем описании, также представлены в списке последовательностей, хотя номера положений могут отличаться. Последовательности CDR, определенные согласно системе Kabat et al. (1), подчеркнуты в VH 106-222. Остатки CDR в VL AJ388641 на фигуре пропущены. Проводили поиск последовательностей VL человека, гомологичных каркасам VL 106-222, в базе данных GenBank, и последовательность VL, кодируемая кДНК AJ388641 человека (VL AJ388641 VL) была выбрана в качестве акцептора для гуманизации. Последовательности CDR VL 106-222 переносили в соответствующие положения VL AJ388641. В гуманизированной форме не проводили замен в каркасе.

На фиг. 38 показана нуклеотидная последовательность гена VH Hu106, фланкированная сайтами SpeI и HindIII (подчеркнуты) вместе с рассчитанной аминокислотной последовательностью. Аминокислотные остатки показаны с использованием однобуквенного кода. Последовательность сигнального пептида показана курсивом. N-концевой аминокислотный остаток (Q) зрелой VH подчеркнут двойной чертой. Последовательности CDR согласно определению Kabat et al. (1991) подчеркнуты. Такие же последовательности, как и последовательности, заявленные в настоящем описании, также представлены в списке последовательностей, но номера положений в списке последовательностей могут отличаться. Последовательность интрона показана курсивом. Фрагмент гена VH Hu106, расщепленного SpeI и HindIII, клонировали между соответствующими сайтами в векторе экспрессии, показанном на фиг. 23.

На фиг. 39 показана нуклеотидная последовательность гена VL Hu106-222, фланкированная сайтами NheI и EcoRI (подчеркнуты), вместе с рассчитанной аминокислотной последовательностью. Аминокислотные остатки показаны с использованием однобуквенного кода. Последовательность сигнального пептида показана курсивом. N-концевой аминокислотный остаток (D) зрелой VL подчеркнут двумя чертами. Последовательности CDR согласно определению Kabat et al. (1991) подчеркнуты. Последовательность интрона указана курсивом. Фрагмент гена VL Hu106, расщепленного NheI и EcoRI, клонировали между соответствующими сайтами в векторе экспрессии, показанном на фиг. 23. Такие же последовательности, как и последовательности, заявленные в настоящем описании, также представлены в списке последовательностей, но номера положений в списке последовательностей могут отличаться.

На фиг. 40 показано выравнивание аминокислотных последовательностей VH 119-122, гуманизированного 119-122 (Hu1l9) и последовательности акцептора Z14189 человека (номер доступа в GenBank). Аминокислотные остатки показаны с использованием однобуквенного кода. Числа над последовательностями указывают положения согласно системе Kabat et al. (Sequences of Proteins of Immunological Interests, Fifth edition, NIH Publication No. 91-3242, U.S. Department of Health and Human Services, 1991). Последовательности CDR, определенные согласно системе Kabat et al. (1991), подчеркнуты в VH 119-122. Остатки CDR в VH Z14189 пропущены на фигуре. Осуществляли поиск последовательностей VH человека, гомологичных каркасам VH 119-122, в базе данных GenBank, и была выбрана последовательность VH, кодируемая кДНК Z14189 человека (Z14189 VH) в качестве акцептора для гуманизации. Последовательности CDR VH 119-122 сначала переносили в соответствующие положения VH Z14189. Затем положения в каркасе, в случае которых трехмерная модель вариабельных областей 119-122 свидетельствовала о значимом контакте с CDR, аминокислотными остатками VH 119-122 мыши заменяли соответствующие остатки человека. Такие замены осуществляли в положениях 26, 27, 28, 30 и 47 (подчеркнуты в последовательности VH Hu119), которые показаны на фигуре. Такие же последовательности, как и последовательности, заявленные в настоящем описании, также представлены в списке последовательностей, но номера положений в списке последовательностей могут отличаться.

На фиг. 41 показано выравнивание аминокислотных последовательностей VL 119-122, гуманизированного 119-122 (Hu119) и последовательности VL акцептора M29469 человека (номер доступа GenBank). Аминокислотные остатки показаны с использованием однобуквенного кода. Числа над последовательностями указывают положения согласно системе Kabat et al. (1991). Последовательности CDR, определенные согласно Kabat et al. (1), подчеркнуты в VL 119-122. Остатки CDR в VL M29469 пропущены в последовательности. Осуществляли поиск последовательностей VL человека, гомологичных каркасам VL 119-122, в базе данных GenBank, и последовательность VL, кодируемая кДНК M29469 человека (M29469 VL), была выбрана в качестве акцептора для гуманизации. Последовательности CDR VL 119-122 переносили в соответствующие положения VL M29469. Замены в каркасе в гуманизированной форме не требовались. Такие же последовательности, как и последовательности, заявленные в настоящем описании, также представлены в списке последовательностей, но номера положений в списке последовательностей могут отличаться.

На фиг. 42 показана нуклеотидная последовательность гена VH Hu119, фланкированная сайтами SpeI и HindIII (подчеркнуты) вместе с рассчитанной аминокислотной последовательностью. Аминокислотные остатки показаны с использованием однобуквенного кода. Последовательность сигнального пептида показана курсивом. N-концевой аминокислотный остаток (E) зрелой VH подчеркнут двумя чертами. Последовательности CDR согласно определению Kabat et al. (1991) подчеркнуты. Последовательность интрона указана курсивом. Фрагмент гена VH Hu119, расщепленного SpeI и HindIII, клонировали между соответствующими сайтами в векторе экспрессии, показанном на фиг. 23. Такие же последовательности, как и последовательности, заявленные в настоящем описании, также представлены в списке последовательностей, но номера положений в списке последовательностей могут отличаться.

На фиг. 43 показана нуклеотидная последовательность гена VL Hu119, фланкированная сайтами NheI и EcoRI (подчеркнуты) вместе с рассчитанной аминокислотной последовательностью. Аминокислотные остатки показаны с использованием однобуквенного кода. Последовательность сигнального пептида показана курсивом. N-концевой аминокислотный остаток (E) зрелой VL подчеркнут двумя чертами. Последовательности CDR согласно определению Kabat et al. (1991) подчеркнуты. Последовательность интрона указана курсивом. Фрагмент гена VL Hu1119, расщепленного NheI и EcoRI, клонировали между соответствующими сайтами в векторе экспрессии, показанном на фиг. 23. Такие же последовательности, как и последовательности, заявленные в настоящем описании, также представлены в списке последовательностей, но номера поло