Химерные молекулы фактора vii

Химерные молекулы фактора vii

Иллюстрации

Показать все

Реферат

ЗАЯВЛЕНИЕ О ПРИОРИТЕТЕ

Настоящая заявка подтверждает полезность, в соответствии с п.35U.S.C. § 119(e), предварительной заявки на патент США, серия No. 61/220278, зарегистрированной 25 июня, 2009 г., полное содержание которой включено в настоящую заявку в качестве ссылки.

ЗАЯВЛЕНИЕ ОТНОСИТЕЛЬНО ПРАВИТЕЛЬСТВЕННОЙ ПОДДЕРЖКИ ИССЛЕДОВАНИЙ

Настоящее изобретение было сделано при правительственной поддержке в рамках гранта номер 5-P01-HL06350, выданного Национальному Институту Здоровья. Соответственно, правительство США имеет определенные права на настоящее изобретение.

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ, К КОТОРОЙ ОТНОСИТСЯ ИЗОБРЕТЕНИЕ

Настоящее изобретение относится к химерным полипептидам человеческого фактора свертывания крови VII (FVII), обладающим повышенной свертывающей активностью и меньшими тромботическим осложнениями, чем доступные в настоящее время полипептиды фактора VII, а также к полинуклеотидным конструкциям, кодирующим такие полипептиды, к векторам и клеткам-хозяевам, включающим и экспрессирующим указанные полинуклеотиды, к фармацевтическим композициям, их применению и способам лечения.

ПРЕДПОСЫЛКИ СОЗДАНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Свертывание крови представляет собой процесс, состоящий из целого ряда сложных взаимодействий различных компонентов (или факторов) крови, которые в итоге приводят к образованию фибринового сгустка. В основном, компоненты крови, которые участвуют в том, что называется коагуляционный "каскад", представляют собой энзиматически неактивные белки (пронзимы или зимогены), которые превращаются в протеолитические ферменты под действием активатора (который сам представляет собой активированный фактор свертывания крови).

Факторы свертывания крови, которые подвергаются таким превращениям, в целом называются "активными факторами", и на письме такие факторы обозначают с добавлением буквы "a" к наименованию соответствующего фактора свертывания крови (например, активированный фактор VII будет обозначаться как фактор VIIa или FVIIa).

В норме, инициация гемостатического процесса опосредована образованием комплекса между тканевым фактором и фактором VIIa. Этот комплекс затем превращает факторы IX (FIX) и X (FX) в их активные формы. Фактор Xa (FXa) превращает ограниченные количества протромбина в тромбин на клетках, содержащих тканевой фактор. Тромбин активирует тромбоциты и факторы V (FV) и VIII (FVIII) в факторы Va (FVa) и VIIIa (FVIIIa), где оба выполняют функцию кофакторов в дальнейшем процессе, ведущем к полной тромбиновой активации. Этот процесс включает образование фактора Xa под действием фактора IXa (FIXa) (в комплексе с фактором VIIIa) и происходит на поверхности активированных тромбоцитов. В конечном счете, тромбин превращает фибриноген в фибрин, что приводит к образованию фибринового сгустка. Исследования последних лет показали, что фактор VII и тканевой фактор являются основными инициаторами процесса свертывания крови.

Фактор VII представляет собой гликопротеин плазмы, который циркулирует в крови в виде одноцепочечного зимогена. Зимоген обладает слабой каталитической активностью. Одноцепочечный фактор VII может быть превращен в двухцепочечный фактор VIIa под действием фактора Xa, фактора XIIa, фактора IXa, фактора VIIa или тромбина in vitro. Считается, что фактор Xa является основным физиологическим активатором фактора VII. Как и в случае некоторых других белков, вовлекаемых в гемостаз, активность фактора VII зависит от витамина K, который необходим для гамма-карбоксилирования множества остатков глютаминовой кислоты, которые объединяются в кластеры вблизи амино-конца белка. Эти гамма-карбоксилированные глютаминовые кислоты необходимы для индуцированного ионом металла взаимодействия фактора VII с фосфолипидами. Превращение зимогена фактора VII в активированную двухцепочечную молекулу происходит путем расщепления пептидной связи во внутреннем пептиде Arg₁₅₂-Ile₁₅₃. Кроме того, хорошо известно, что высокие концентрации фактора VII ведут к аутоактивации in vitro. В присутствии тканевого фактора, фосфолипидов и ионов кальция, двухцепочечный фактор VIIa быстро активирует фактор X или фактор IX путем ограниченного протеолиза.

Ген, кодирующий FVII (hFVII), был картирован на хромосоме 13 в положении q34-qter 9 (de Grouchy et al., Hum Genet 1984; 66:230-233). Он содержит девять экзонов и охватывает 12,8 тыс. н.п. (O'Hara et al., Proc Natl Acad Sci USA 1987; 84:5158-5162). Организация гена и структура белка FVII аналогичны таковым для К-зависимых белков с прокоагулянтной активностью, где экзоны 1a и 1b кодируют сигнальную последовательность; экзон 2 - пропептид и домен GLA; экзон 3 - короткий гидрофобный участок; экзоны 4 и 5 - домены GLA, подобные таковым для эпидермального фактора роста; и экзоны 6-8 - каталитический домен GLA сериновой протеазы (Yoshitake et al., Biochemistry 1985; 24: 3736-3750).

Фактор IX (кристмас-фактор) представляет собой зимоген сериновой протеазы, активный в нормальном процессе гемостаза, и в этом случае для проявления ферментативной активности требуется карбоксилирование специфических остатков глютаминовой кислоты. Факторы IX, X, VII и белок C являются близко родственными паралогами одного семейства сериновых протеаз, с высокой степенью идентичности по аминокислотной последовательности и соответствующей интрон-экзоновой организацией генов, кодирующих эти белки. Указанные близко родственные белки характеризуются сходной структурой функциональных доменов GLA от амино- до карбокси-конца и включают домен GLA γ-карбоксиглютаминовой кислоты (GLA), два домена GLA фактора, подобного эпидермальному фактору роста (EGF), пептид активации и каталитический домен. Белок S включает 666 аминокислот, витамин K-зависимый белок с доменом GLA, 4 EGF-подобных домена, чувствительный к тромбину участок и 2 домена ламинина.

Зависимые от витамина K белки свертывания плазмы крови содержат домен GLA, который функционирует как сайт прикрепления белка к мембранам, где указанный домен GLA характеризуется высокой консервативностью среди различных коагулирующих белков. Несмотря на сходство, домены GLA демонстрируют широко варьирующую аффинность в отношении фосфолипидов, при этом домен GLA белка S обладает наивысшей аффинностью для фосфолипидов. (Ellison et al., Biochemistry, 1998; 37:7997-8003), (McDonald et al., Biochemistry 1997; 36:5120-27).

Зачастую бывает желательно стимулировать или усиливать коагулирующий каскад в системе свертывания крови у субъекта. Фактор VIIa применялся для контроля расстройств, сопровождающихся кровотечением, которые имеют несколько причин, таких как недостаточность фактора свертывания крови (например, гемофилия A и B или недостаточность факторов свертывания крови XI или VII) или присутствие ингибиторов факторов свертывания. Фактор VIIa применялся также для контроля сильного кровотечения у субъектов с нормально функционирующей системой свертывания крови (в отсутствие недостаточности фактора свертывания крови или ингибиторов каких-либо факторов свертывания крови). Такое кровотечение может быть, например, вызвано дефектом в тромбоцитарной функции, тромбоцитопенией или болезнью Виллебранда.

Кровотечение является одной из важнейших проблем хирургии и в случае других форм травмы. Например, фактор VII широко применялся для лечения раненых солдат в Ираке и Афганистане. (Perkins JG, et al. The Journal of Trauma. 2007; 62: 1095-9; discussion 9-101). Его использование позволило спасти много жизней, но во многих случаях медицинского применения, после лечения этим средством наблюдаются побочные эффекты, такие как инсульт или другие тромботические явления. Однако, согласно общему мнению врачей, использующих FVIIa, его применение спасло значительно больше жизней, чем потеряло. Возможно, самой хорошей иллюстрацией этого является то, что в предшествующих войнах примерно 30 процентов раненых умирало от полученных повреждений, тогда как во время военных действий в Персидском заливе это количество сократилось примерно до 10 процентов. (Gawande A, et al., N Engl J Med. 2004;351:2471-5).

Исследование гемофилии B у трансгенных мышей, экспрессирующих фактор VIIa, показало, что постоянная экспрессия фактора VIIa на низких уровнях (ниже 1,5 мкг/мл) восстанавливает свертывающую активность у мышей с геомофилией В. Однако, уровни фактора VIIa у мышей дикого типа или у мышей с гемофилией В свыше 2 мкг/мл ведут к тромбозам в сердце и легких; при этом и сердце, и легкие являются сайтами высокой экспрессии тканевого фактора. Эти данные позволяют полагать, что высокие уровни фактора VIIa в кровотоке индуцируют тромбоз в том случае, если они контактируют с тканевым фактором, который становится доступным после повреждения сосудов в сердце и легких. (Margaritas et al., J. Clin. Invest. 2004; 113:1025-31). Кроме того, эти исследования показали, что осуществляемый через вектор перенос от собаки гена фактора VIIa собакам с гемофилией является и безопасным, и эффективным подходом в краткосрочной и среднесрочной перспективе. (Margaritas et al., Gene Therapy 2009; 113:3682-3689).

Ввиду тех опасностей, с которыми сопряжено лечение фактором VII, этот продукт, как и многие другие продукты, должен применяться по разрешению и в соответствии с рекомендациями регламентирующих органов. Например, по данным Европейского Медицинского Агентства (The European Medicines Agency), Подразделение по оценке препаратов для применения человеком (Human Medicines Evaluation Unit), проводимая в настоящее время терапия фактором VII сопряжена с риском тромбоза и развитием синдрома диссеминированного внутрисосудистого свертывания, особенно в тех ситуациях, когда фактор VII вводится пациентам с наличием в анамнезе ишемической болезни сердца или болезни печени, пациентам после проведения операций, новорожденным и лицам, имеющим риск тромбоза и диссеминированной внутрисосудистой коагуляции. См., например, Core SPC for Human Plasma Derived Coagulation Factor VII Products (CPMP/BPWG/2048/01), July, 2004.

Ранее было показано, что домен EGF-1 фактора VIIa играет решающую роль в определении аффинности фактора VIIa для тканевого фактора. С использованием синтетического субстрата и фактора X, в обоих случаях при наличии и в отсутствие тканевого фактора, было показано, что полипептиды фактора VIIa с доменом EGF-1 фактора IX обладают меньшей каталитической активностью, чем фактор VIIa дикого типа. (Jin et al., Biochemistry, 1999, 28:1185-92). С первого взгляда, может сложиться впечатление, что это позволяет обходиться без использования химерных конструкций для лечения кровотечений; однако, в соответствии с предположением Monroe (British Journal of Haematology 1997; 99:542-549), механизм действия FVIIa при лечении гемофилии и кровотечения не зависит от тканевого фактора. При этом, общее мнение специалистов в данной области разделилось в вопросе об активности фактора VIIa, независимого от тканевого фактора.

Коммерческие препараты рекомбинантного человеческого FVIIa продаются под торговой маркой NovoSeven® и NovoSeven® RT. Указанные препараты NovoSeven® и NovoSeven® RT показаны для лечения эпизодов кровотечения у пациентов с гемофилией A или B, и на фармацевтическом рынке доступен лишь препарат rFVIIa для лечения эпизодов кровотечения. В последнее время было показано, что NovoSeven® может связываться с регидратированными лиофилизированными тромбоцитами, которые могут вводиться в сочетании для локализации фактора VII в сайте повреждения. (Fischer et al., Platelets, 2008; 19:182-91). Дополнительно, было показано, что селективное ПЭГилирование фактора VII может повышать его период полувыведения из плазмы (Stennicke et al., Thromb. Haemost, 2008; 100:920-28) и что рекомбинантный человеческий фактор VII с 3 аминокислотными замещениями имеет повышенную активность на поверхности тромбоцитов. (Moss et al., J. Thromb. Haemost., 2009; 7:299-305). Ожидается, что ПЭГилирование химерных молекул фактора VIIa по настоящему изобретению будет действовать в том же направлении, приводя к повышению периода полувыведения из плазмы. Аналогично, можно полагать, что другие модификации белков, известные в данной области, такие как ковалентное присоединение не полипептидных фрагментов с образованием конъюгатов, например, гликозилирование, будут действовать аналогично молекулам фактора VIIa по настоящему изобретению, т.е., можно ожидать, что свойства, придаваемые белку за счет ковалентного присоединения не полипептидного фрагмента будут переданы также химерным молекулам фактора VII.

В этой связи, имеется потребность в вариантах фактора VIIa, обладающих высокой свертывающей способностью, которые могут вводиться в относительно низких дозах, и в вариантах, которые создают меньше нежелательных побочных эффектов, таких как тромботические осложнения, ассоциированные с проводимой в настоящее время терапией.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ СУЩНОСТИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

В настоящей заявке описываются химерные молекулы фактора FVIIa, в частности, химерные молекулы hFVIIa, включающие домены hFVIIa и домены из одного или нескольких белков системы свертывания крови, обеспечивающих одно или несколько желательных качеств. В этой связи, химерные молекулы FVIIa по настоящему изобретению, характеризуются одним или несколькими улучшенными свойствами, в сравнении с коммерчески доступным rFVIIa, включая такие показатели, как более высокая свертывающая активность и/или возможность их введения в относительно низких дозах и/или снижение возникающих при этом неблагоприятных побочных эффектов. Следовательно, медицинское лечение химерными молекулами по настоящему изобретению дает преимущества в сравнении с доступным в настоящее время соединением rFVIIa, такие как потенциально сниженные дозы и/или ослабленные нежелательные побочные эффекты.

Репрезентативные химерные полипептиды FVIIa по настоящему изобретению включают химерный FVIIa, включающий EGF-2 и каталитические домены FVII и домен GLA витамин K-зависимого белка коагуляции и домен EGF-1 витамин K-зависимого белка коагуляции. В конкретных вариантах осуществления настоящего изобретения, химерные полипептиды FVIIa по настоящему изобретению включают 1) химерный FVIIa, включающий домены GLA и EGF-1 из FIX и домен EGF-2 и каталитический домен FVII; 2) химерный FVIIa, включающий домен EGF-1 из FIX и домены GLA, EGF-2 и каталитический домен FVII; 3) химерный FVIIA, включающий домен GLA белка S, домен EGF-1 из FIX и домен EGF-2 и каталитический домен FVII; 4) химерный FVIIa, включающий домены GLA и EGF-1 белка S и домен EGF-2 и каталитический домен FVII; 5) химерный FVIIa, включающий домен EGF-1 белка S и домены GLA, EGF-2 и каталитический домен FVII; и 6) химерный FVIIa, включающий домен EGF-1 белка S, домен GLA из FIX и домен EGF-2 и каталитический домен FVII. Репрезентативные химерные полипептиды FVIIa по настоящему изобретению могут также включать FVIIa дикого типа или любой из описанных выше химерных полипептидов FVIIa, которые содержат аминокислотные замещения в домене EGF-1 или в домене GLA. Указанные замещения могут представлять собой консервативные замещения или неконсервативные замещения. Такие замещения могут включать замещение изолейцина по остатку 69 аланином и/или замещение аргинина по остатку 79 аланином из домена EGF-1. Дополнительные замещения могут включать замещение лизина по остатку 5 аргинином, которое придает домену GLA более высокую связывающую аффинность с коллагеном типа IV, но, по всей видимости, не затрагивает связывание с тромбоцитами (Gui et al., J. Thromb Haemost. 2009; 7:1843-1851); замещение метионина по остатку 306 другой аминокислотой, предпочтительно консервативное аминокислотное замещение, более предпочтительно аланином, что также снижает аффинность в отношении тканевого фактора; и замещение валина по остатку 158 аспартатом, замещение глютамата по остатку 296 валином и/или замещение метионина по остатку 298 глютамином, что приводит к повышению удельной активности фактора VIIa.

Настоящее изобретение также относится к способам лечения расстройств, ассоциированных с кровотечением, у субъекта с указанным расстройством путем введения одного или нескольких химерных полипептидов FVIIa по настоящему изобретению. Способ лечения расстройства, ассоциированного с кровотечением, может включать способ введения указанному субъекту молекулы нуклеиновой кислоты, включающей нуклеотидную последовательность, кодирующую полипептид фактора VIIa по настоящему изобретению.

Дополнительно, настоящее изобретении относится к способу лечения расстройства, ассоциированного с кровотечением, у субъекта, имеющего такое расстройство, путем введения белка, включающего домен GLA, где указанный белок направлен и/или концентрируется вблизи сайта появления сгустка в определенной концентрации белка в кровотоке в плазме у субъекта. Это может включать использование доменов, которые связываются с большей аффинностью с тромбоцитами, находящимися на месте образования сгустка или в непосредственной близости от него, чем применяемые в настоящее время полипептиды фактора VII. Примеры таких доменов включают домен GLA разных белков коагуляции, которые связываются с отрицательно заряженными фосфолипидными слоями, локализованными на поверхности тромбоцитов. Неограничивающие примеры таких домен GLA включают домен GLA из FIX, который связывается более прочно, чем домен GLA из FVIIa, с тромбоцитами и фосфолипидами (Melton et al. "Location of the platelet binding site in zymogen coagulation factor IX" Blood Coagul Fibrinolysis 12:237-243 (2001)) и домен GLA белка S, который связывается с фосфолипидами более прочно, чем любой другой известный домен GLA (McDonald et al. "Comparison of naturally occurring vitamin K-dependent proteins: correlation of amino acid sequences and membrane binding properties suggests a membrane contact site" Biochemistry:36:5l20-5127 (1997)). Неограничивающие примеры белка, содержащего домен GLA, включают рекомбинантный белок, включающий домен GLA из FIX или белка S, химерный белок, включающий домен GLA из FIX или белка S, и/или химерный полипептид FVIIa по настоящему изобретению, включающий домен GLA из FIX или белка S.

Настоящее изобретение, в другом варианте своего осуществления, относится к способу лечения субъекта, имеющего расстройство, ассоциированное с кровотечением, путем введения химерного полипептида фактора VIIa по настоящему изобретению, который включает каталитический домен, полученный из полипептида фактора VII, и один или несколько доменов, направленных на тромбоциты. Такие направленные на тромбоциты домены включают домены из белков, которые взаимодействуют или связываются с поверхностью тромбоцита. Такое взаимодействие или связывание с поверхностью тромбоцита может осуществляться через мембранные фосфолипиды тромбоцита или через белки и/или рецепторы клеточной поверхности тромбоцита. Неограничивающие примеры таких доменов включают Al домен фактора фон Виллебранда, который является основным сайтом связывания с тромбоцитарным гликопротеином lb (Emsley et al., JBC, 273:10396-10401 (1998)), и Fab фрагмент (домен) из антител, которые связываются с мембранными белками и/или рецепторами тромбоцита, таких как антитело, которое связывается с мембранными фосфолипидами тромбоцита (Out et al., Blood, 77:2655-2659(1991)).

Такое нацеливание коагулирующих белков на сайт сгустка с использованием домена, который связывается с тромбоцитами и имеет сниженную аффинность к тканевому фактору, обладает дополнительным и неожиданным преимуществом, а именно: снижением риска осложнений, ассоциированных с применяемой в настоящее время терапией фактором VII, такого как тромбогенность. Указанный подход может также использоваться для нацеливания других терапевтически полезных полипептидов или других молекул на тромбоциты или на сайт сгустка. Такие терапевтически полезные молекулы могут включать антикоагулянты и т.п.

Настоящее изобретение также относится к способу лечения расстройства, ассоциированного с кровотечением, у субъекта, имеющего такое расстройство, путем введения такому субъекту полипептида со сниженной тромбогенностью, в сравнении с тромбогенностью фактора VII (например, сниженной по меньшей мере примерно на 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 90%, и т.п. относительно тромбогенности нативного фактора VII). Указанная "сниженная тромбогенность" может быть определена разными способами по известным методикам, включающим, без ограничения, определение на основании выявления сниженного числа сгустков, сгустков меньшего размера, большего периода времени, необходимого для образования сгустков (тест in vivo или in vitro), по меньшему числу летальных исходов от образования тромбов и/или по более длительному периоду выживания, в сравнении с контролем. Полипептид, обладающий сниженной тромбогенностью в сравнении с фактором VII, может представлять собой, например, химерный полипептид фактора VII по настоящему изобретению или его активный фрагмент. Неограничивающие примеры таких полипептидов включают химерный FVIIa, включающий домены GLA и EGF-1 из FIX и EGF-2 и каталитические домены из FVII, и химерный FVIIa, включающий домен GLA белка S, домен EGF-1 из FIX и EGF-2 и каталитические домены из FVII.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

На фиг. 1 приведен схематический вид химерных молекул FVIIa, используемых в настоящем изобретении. FVII: Фактор VII; FIX: Фактор IX

На фиг. 2 проиллюстрировано образование тромбина (нМ) в нормальных условиях и в гемофильных условиях (с удаленным фактором IX и фактором VIII) в модельной клеточной системе гемофилии при разных концентрациях фактора VIIa дикого типа.

На фиг. 3 проиллюстрировано образование тромбина (нМ) в нормальных условиях и в гемофильных условиях (с удаленным фактором IX и фактором VIII) в модельной клеточной системе гемофилии при введении 50 нМ фактора VIIa дикого типа или 10 нМ химерного фактора VIIa.

На фиг. 4 показан пик тромбина, относительно контрольного значения, образуемого в модельной клеточной системе гемофилии при введении 50 нМ фактора VIIa дикого типа или 10 нМ химерного фактора VIIa.

На фиг. 5 проиллюстрировано отклонение показателя «остановка кровотечения» в анализе коагулирующей активности у мышей с гемофилией B без лечения, у мышей с гемофилией B при введении 2 мг/кг NovoSeven®, у мышей с гемофилией B при введении 2 мг/кг химерной молекулы FVIIa и у мышей дикого типа без лечения.

На фиг.6 показана последовательность репрезентативного химерного фактора VII по настоящему изобретению, включающая сигнальный участок, пропептид, домены GLA и EGF1 фактора IX (подчеркнуты) (SEQ ID NO: 1).

На фиг.7 показана последовательность репрезентативного химерного фактора VII по настоящему изобретению, включающая сигнальный участок, пропептид и EGF1 домен фактора IX (подчеркнуты), и домен GLA белка S (жирный шрифт) (SEQ ID NO: 2).

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Ниже приводится более подробное описание настоящего изобретения. При этом, настоящее изобретение может быть представлено в разных формах, однако, не ограничивается приведенными вариантами. Скорее, приведенные варианты даны для более полного представления настоящего изобретения и дополнительно иллюстрируют его для лучшего понимания специалистами в данной области.

Терминология, используемая в настоящем описании, дана для целей описания только конкретных вариантов и ее не следует трактовать в плане какого-либо ограничения настоящего изобретения. В тексте настоящего описания и в прилагаемой формуле изобретения, единственная форма артиклей ("a," "an" и "the") включает также множественную форму, если из контекста явно не следует обратное.

Если особо не указано иное, все используемые в настоящем описании термины (включая технические и научные термины) имеют те значения, которые являются стандартными для специалистов в той области, к которой относится настоящее изобретение. Следует также понимать, что термины, такие как термины, определяемые в обычно используемых словарях, следует рассматривать в контексте настоящей заявки согласно значению, которое соответствует данному контексту и релевантной области, и которое не следует трактовать в идеализированном или чересчур формализованном смысле, если особо не указано иное. Терминология, используемая в тексте настоящего изобретения, дана для целей описания только конкретных вариантов его осуществления и ее не следует трактовать в плане ограничения настоящего изобретения. Все публикации, патентные заявки, патенты и другие ссылки, процитированные в настоящем описании, включены в него полностью в качестве ссылок.

Кроме того, в тексте настоящего описания, форма «и/или» относится ко всем возможным сочетаниям соответствующих, одного или нескольких терминов, и включает эти сочетания, а когда их следует рассматривать в альтернативном смысле, обозначает отсутствие таких сочетаний («или»).

Если из контекста не следует иное, то следует особо отметить, что различные элементы настоящего изобретения, приведенные в настоящем описании, могут использоваться в любом сочетании.

Кроме того, согласно настоящему изобретению, в некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения, любой элемент или сочетание элементов, приведенное в данном тексте, может быть исключен/исключено или пропущен/пропущено. Для пояснения этого положения, следует отметить, что если в описании указано, что комплекс включает компоненты A, B и C, этим конкретно указывается, что любой из компонентов A, B или C, или их сочетание может быть пропущено и отклонено, в единственном виде или в любом сочетании.

В контексте настоящего описания, такую фразу, как "состоящий по существу из" (и ее грамматические варианты) следует интерпретировать как включающую все процитированные материалы и стадии, а также такие, которые явно не влияют на базовые и новые характеристики, одну или несколько, заявленного изобретения. См., In re Herz, 537 F.2d 549, 551-52, 190 U.S.P.Q. 461, 463 (CCPA 1976); см. также MPEP § 2111.03. Таким образом, фразу "состоящий по существу из" в тексте настоящего описания не следует понимать как эквивалентную термину "включающий".

Термин "примерно", используемый в тексте настоящего описания применительно к измеряемому значению, такому как количество или концентрация и т.п., следует понимать как включающий все вариации в 20%, 10%, 5%, 1%, 0,5% или даже 0,1% от указанного количества.

Термин "активность" в тексте настоящего описания обозначает способность полипептида фактора VII превращать свой субстрат, фактор X в активный фактор Xa.

Термин "собственная активность" также включает способность образовывать тромбин на поверхности активированных тромбоцитов в отсутствие тканевого фактора.

Термин "N-концевой домен GLA" включает аминокислотную последовательность от примерно 61 аминокислотного остатка до примерно 105 остатка в аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 18), аминокислотную последовательность от примерно 47 аминокислотного остатка до примерно 92 аминокислотного остатка в аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 19, любые пост-трансляционные модификации идентифицированных выше аминокислотных последовательностей, любые консервативные замещения аминокислот в идентифицированных аминокислотных последовательностях, добавление аминокислотных остатков к идентифицированным аминокислотным последовательностям, делеции аминокислотных остатков из идентифицированных аминокислотных последовательностей или любую другую аминокислотную последовательность из белка коагулирующей системы, который связывается с фосфолипидными мембранами.

Термин "EGF-1" обозначает участок из 30-40 аминокислот, содержащий шесть цистеинов, обнаруженных первоначально в EGF (эпидермальный фактор роста), а также в совокупности белков, вовлекаемых в клеточную сигнальную функцию, и коагулирующих белков, где практически все известные EGF-подобные домены содержат дисульфидные связи 1-3, 2-4 и 5-6. Домен EGF-1 в факторе VII охватывает участок от примерно 106 аминокислотного остатка до примерно 142 остатка в аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 18. Домен EGF-1 в факторе IX охватывает участок от примерно 93 аминокислотного остатка до примерно 129 аминокислотного остатка в аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 19. Домен EGF-1 в белке S охватывает участок от примерно 117 аминокислотного остатка до примерно 155 остатка в аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 20. Указанные аминокислотные последовательности могут включать любые пост-трансляционные модификации идентифицированных выше аминокислотных последовательностей, любые консервативные замещения аминокислот в идентифицированных аминокислотных последовательностях, любое добавление аминокислотных остатков к идентифицированным аминокислотным последовательностям и/или любые делеции аминокислотных остатков из идентифицированных аминокислотных последовательностей.

Термин "EGF-2" обозначает второй EGF-подобный домен в серии (из двух или более EGF-подобных доменов). Домен EGF-2 в факторе VII охватывает участок от примерно 147 аминокислотного остатка до примерно 188 остатка в аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 18. Домен EGF-2 в факторе IX охватывает участок от примерно 130 аминокислотного остатка до примерно 171 остатка в аминокислотной последовательности SEQ ED NO: 19. Домен EGF-2 в белке S охватывает участок от примерно 157 аминокислотного остатка до примерно 200 остатка в аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 20. Указанные аминокислотные последовательности могут включать любые пост-трансляционные модификации идентифицированных выше аминокислотных последовательностей, любые консервативные замещения аминокислот в идентифицированных аминокислотных последовательностях, любое добавление аминокислотных остатков к идентифицированным аминокислотным последовательностям и/или любые делеции аминокислотных остатков из идентифицированных аминокислотных последовательностей.

Термин "каталитический домен" в тексте настоящего описания обозначает домен в белке, который участвует в расщеплении пептидных связей. Каталитический домен в факторе VII охватывает участок от примерно 213 аминокислотного остатка до примерно 452 аминокислотного остатка в аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 18. Каталитический домен в факторе IX охватывает участок от примерно 227 аминокислотного остатка до примерно 459 аминокислотного остатка в аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 19. Указанные аминокислотные последовательности могут включать любые пост-трансляционные модификации идентифицированных выше аминокислотных последовательностей, любые консервативные замещения аминокислот в идентифицированных аминокислотных последовательностях, любое добавление аминокислотных остатков к идентифицированным аминокислотным последовательностям и/или любые делеции аминокислотных остатков из идентифицированных аминокислотных последовательностей.

Трехбуквенная аббревиатура "GLA" обозначает 4-карбоксиглютаминовую кислоту (γ- карбоксиглютамат).

Термин "протеазный домен" обозначает домен в белке, который вовлекается в расщепление пептидных связей и который, как считается, в основном локализован на участке от примерно 213 аминокислотного остатка до карбокси-концевого аминокислотного остатка в SEQ ID NO: 18. (тяжелая цепь фактора VIIa). Термин "полипептид фактора VII" в контексте настоящего описания обозначает любой белок, включающий аминокислотную последовательность 61-466 из нативного человеческого фактора VII (SEQ ID NO: 18) или ее варианты или фрагменты. Указанный термин включает, без ограничения, человеческий фактор VII, человеческий фактор VIIa и их варианты. Термин "фактор VII" в контексте настоящего описания включает молекулу неактивного одноцепочечного зимогена фактора VII, а также молекулу активированного двуцепочечного фактора VII (фактор VIIa). Этот термин включает белки с аминокислотной последовательностью 61-466 (SEQ ID NO: 18) из нативного человеческого фактора VII или фактора VIIa. Для любого специалиста в данной области очевидно, что минорные изменения в данной последовательности будут, как ожидается, действовать аналогичным образом и что вовлекаемые в процесс домены, полипептиды и фактор VII будут несколько сокращаться в размере или удлиняться или будут содержать изменения, не влияющие на суть настоящего изобретения. Таким образом, данное определение также охватывает белки и пептиды с несколько модифицированной аминокислотной последовательностью, например, с модифицированной N-частью, где указанные модификации включают делеции или добавления N-концевых аминокислот, так что, в некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения, рассматриваемые в нем белки по существу сохраняют активность фактора VIIa (например, сохраняют примерно 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% и т.п. от активности нативного фактора VIIa). Термин "фактор VIIa" или "FVIIa" в контексте настоящего описания обозначает продукт, состоящий из активированной формы (фактор VIIa). Термин "фактор VII" или "фактор VIIa" в указанном выше определении также включает природные аллельные вариации, которые могут существовать и которые встречаются от одного индивидуума к другому.

Кроме того, степень и локализация гликозилирования или других пост-трансляционных модификаций могут варьировать, в зависимости от экспрессии в выбранных клетках-хозяевах, ткани или виде животного и от природы организма-хозяина или от тканевой среды.

Термин "домен", в контексте настоящего описания, обозначает часть белковой последовательности и структуру, которая при этом может возникать, функционировать и существовать независимо от остальной части белковой цепи. Домен способен формировать компактную трехмерную структуру и зачастую она может, независимо от остальной части, демонстрировать стабильность и создавать складчатую организацию. Один домен может появляться в широком множестве эволюционно родственных белков. Домены могут варьировать по длине от примерно 25 аминокислот до примерно 500 аминокислот. Термин "домен" может также включать домен белка дикого типа, где указанный белок дикого типа содержал, один или несколько аминокислотных остатков, которые были изменены путем консервативного замещения. Поскольку они обладают автономной стабильностью в имеющейся белковой среде, то с использованием методов генетической инженерии такие домены могут быть «замещены» на участке между одним и другим белком с образованием химерных белков.

Термин "вариант" или "варианты" в контексте настоящего описания используется для обозначения фактора VII с аминокислотной последовательностью 61-466 (SEQ ID NO: 18) из нативного фактора VII или фактора VIIa, где одна или несколько аминокислот из родительского белка были замещены другой аминокислотой и/или где одна или несколько аминокислот из родительского белка были делетированы и/или где одна или несколько аминокислот были встроены в белок и/или где одна или несколько аминокислот были добавлены к родительскому белку и/или где домен GLA был замещен доменом GLA, взятым из другого белка (например, доменом GLA, который связывается с мембранами тромбоцитов или с фосфолипидными мембранами), и/или где домен GLA был замещен связывающимся с тромбоцитами доменом, взятым из другого белка (например, Al доменом фактора Виллебранда, который является главным сайтом связывания тромбоцитарного гликопротеина lb (Emsley et al., JBC, 273:10396-10401 (1998)), и Fab фрагментом (доменом) антител, который связывается с белками и/или рецепторами тромбоцитарной мембраны, как в случае антитела, которое связывается с фосфолипидами тромбоцитарной мембраны (Out et al., Blood, 77:2655-2659 (1991)), и/или где домен EGF-1 фактора VII был замещен доменом EGF-1 из другого белка (например, доменом EGF-1, который связывается с меньшей аффинностью с тканевым фактором, таким как домен EGF-1 фактора IX). Такое добавление может происходить либо на N-концевом участке, либо на C-концевом участке родительского белка, или на обоих указанных участках белка, а также на его внутренней части.

Таким образом, в некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения, рассматриваемый/ые в настоящем изобретении "вариант" или "варианты" может/могут все еще обладать коагулирующей активностью FVII, свойственной его активированной форме. Однако, в некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения, рассматриваемый/ые в настоящем изобретении "вариант" или "варианты" может/могут не обладать коагулирующей активностью.

Таким образом, в некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения, рассматриваемый в нем вариант по меньшей мере на 40%, 50%, 60% или 70% идентичен аминокислотной последовательности 61-466 (SEQ ID NO: 18) из нативного человеческого фактора VII или фактора VIIa. Например, домен EGF-1 из FVII характеризуется идентичностью на уровне 65,7% с доменом EGF-1 из FIX, и домен GLA из FVII характеризуется идентичностью на уровне 58,6% с доменом GLA из FIX и идентичностью на уровне 51% с доменом GLA белка S. В одном варианте осуществления настоящего изобретения, рассматриваемый в нем вариант по меньшей мере на 80% идентичен аминокислотной последовательности 61-466 (SEQ ID NO: 18) из нативного человеческого фактора VII или фактора VIIa. В другом варианте осуществления настоящего изобретения, рассматриваемый в нем вариант по меньшей мере на 90% идентичен аминокислотной