Антитела к человеческому nkg2d и их применения

Антитела к человеческому nkg2d и их применения

Иллюстрации

Показать все

Реферат

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ

Данное изобретение относится к антителам к NKG2D человека (hNKG2D) и их применению в лечении или предупреждении заболеваний и нарушений у пациентов.

ПРЕДШЕСТВУЮЩИЙ УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Иммунорецептор NKG2D обычно экспрессируется на CD8⁺ Т клетках и NK клетках человека. На преактивированных CD8⁺ клетках рецептор NKG2D человека (hNKG2D), представляющий собой гомодимер, при связывании с DAP10 выполняет функции ко-стимулятора передачи сигналов TCR и CD28+TCR, тогда как в NK клетках он выполняет функцию непосредственного активатора. Были идентифицированы и охарактеризованы различные лиганды hNKG2D, включая лиганды MICA и MICB, относящиеся к I классу главного комплекса гистосовметсимости (МНС), семейство UL16-связывающих белков (ULBP) и семейство раннего транскрипта-1 ретиноевой кислоты (RAET1).

При хронических аутоиммунных заболеваниях, таких как ревматоидный артрит, hNKG2D экспрессируется на субпопуляции CD4⁺ CD28^- T клеток и участвует в стимуляции их пролиферации и выработке IFNγ, что сопровождается повышением экспрессии MIC (Groh et al., PNAS 2003:100:9452). Также было продемонстрировано, что CD4+ hNKG2D-экспрессирующие Т клетки при болезни Крона опосредуют воспалительные и цитотоксические ответы через взаимодействие с MICA (Allez et al., Gastroenterology 2007; 132:2346-2358). Первоначальное предположение о том, что NKG2D играет важную роль в аутоиммунных воспалительных процессах, основывалось на том, на модели диабета у мышей (мыши NOD) моноклональное антитело (mAb), связывающее и блокирующее мышиный NKG2D (СХ5) позволяло предупреждать и лечить воспалительные процессы, ведущие к развитию диабета (Ogasawara et al., Immunity 2004; 20:757-767), что позволило предположить возможность терапевтического применения антител к NKG2D. Такие применения были описаны, например, в US20050158307, WO2005097160, WO2005115517 и WO2006024367.

Однако, mAbs мыши к NKG2D человека, которые описаны (см, например, Pende et al., Eur J Immunol 2001; 31:1076-86, WO02068615; Bauer et al., Science 1999:285:727-9; Castriconi et al., PNAS 2003; 100:4120-25; и Andre et al., Eur J Immunol 2004:34:1-11) или имеются в продаже (например, антитело 149810 компании R&D Systems, MN, USA, или ON72 компании Beckman Coulter Inc.), являются иммуногенными. По имеющимся данным, единственное полностью человеческое mAb к NKG2D, описанное в литературе, проявляло как стимулирующий, так и ингибирующий эффект на передачу сигналов NKG2D (Kwong et al., J Mol Biol 2008; 384:1143-1156), что делает его менее пригодным в качестве терапевтического агента при воспалительных и/или аутоиммунных нарушениях.

Соответственно, существует необходимость в получении mAbs к hNKG2D с оптимальными свойствами для терапевтического применения в воспалительных и/или аутоиммунных заболеваниях и нарушениях. Данное изобретение направлено на решение этих и других потребностей и предусматривает ряд дополнительных полезных эффектов, которые будут описаны ниже в данном документе.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Данное изобретение описывает выделенные моноклональные анти-hNKG2D антитела, пригодные для терапевтического использования у человека. Как правило, антитела являются полностью человеческими или гуманизированными для минимизации риска развития иммунного ответа на антитела при их введении пациенту. Согласно данному описанию, на основе таких антител могут быть сконструированы или произведены другие антиген-связываюшие молекулы, такие как, например, антиген-связывающие фрагменты антител, производные антител и мультиспецифичные молекулы.

В одном аспекте антитела характеризуются одним или более функциональными свойствами, или комбинацией функциональных свойств. Приводимые в качестве примера свойства включают, например, предупреждение hNKG2D-опосредованной активации hNKG2D-экспрессирующих NK или Т клеток; конкурирование по меньшей мере с одним естественным лигандом hNKG2D или с несколькими лигандами за связывание с hNKG2D; снижение количества hNKG2D на поверхности hNKG2D-экспрессирующих NK или Т клеток; связывание также NKG2D яванского макака и/или макаки-резус; связывание только одной молекулы антитела на каждый димер hNKG2D; сшивание не более чем 2 димеров hNKG2D при добавлении к hNKG2D-экспрессирующим NK и/или Т клеткам; незначимый агонистический эффект на передачу сигналов hNKG2D при связывании; и/или связывание с hNKG2D с константой диссоциации (KD) 1 нМ или ниже. Определенные антитела к hNKG2D по данному изобретению могут также или в альтернативном случае конкурировать, связываться по существу с теми же эпитопами, или связываться с такой же или более высокой аффинностью, как одно или несколько конкретных антител человека к hNKG2D, описанных здесь, включая антитела MS и 21F2. Например, в одном воплощении антитела также или в альтернативном случае способны лучше конкурировать с hNKG2D за связывание с MS и/или 21F2 или блокировать его, чем известные мышиные антитела к hNKG2D (например, те, что описаны выше). В одном воплощении антитела связываются с тем же эпитопом hNKG2D, что и MS и/или 21F2. В другом воплощении антитела также или в альтернативном случае связываются с тем же эпитопом, что и MS. В другом воплощении антитела также или в альтернативном случае связываются с тем же эпитопом, что и 21F2. Специалистам очевидно, что антитела, описываемые и/или применяемые в воплощениях по данному изобретению, могут проявлять три, четыре или более описанных выше характеристик.

В другом аспекте антитела также или в альтернативном случае содержат один или более паратоп и/или антиген-связывающих последовательностей, идентичных или схожих с паратопами MS или 21F2 и/или антиген-связывающими последовательностями, описанными здесь.

В других аспектах изобретение описывает нуклеиновые кислоты, кодирующие антитела по изобретению, векторы экспрессии, содержащие такие нуклеиновые кислоты, клетки-хозяева, содержащие такие нуклеиновые кислоты, клетки-хозяева, продуцирующие антитела по изобретению и способы получения антител к hNKG2D путем культивирования таких клеток-хозяев в соответствующих условиях.

Антиген-связывающие фрагменты таких антител, а также молекулы, содержащие такие антиген-связывающие фрагменты, включая фрагменты антител, полученные посредством инженерии, производные антител, биспецифичные антитела и другие мультиспецифичные молекулы, также охватываются изобретением.

Фармацевтические композиции и наборы или другие изделия, включающие такие антитела или другие молекулы, также охватываются изобретением.

Ниже рассматриваются способы снижения или ингибирования активации hNKG2D, передачи сигнала hNKG2D или активации hNKG2D-экспрессирующих NK или Т клеток, способы уменьшения воспаления и способы лечения или предупреждения аутоиммунных и/или воспалительных заболеваний или нарушений, включая но не ограничиваясь ревматоидным артритом, воспалительными заболеваниями кишечника (ВЗК), включая болезнь Крона и язвенный колит, системной красной волчанкой (СКВ), псориазом, псориатическим артритом, рассеянным склерозом, целиакией, вирусными заболеваниями (такими как, например, вирусным гепатитом) и отторжением трансплантата различных органов и тканей (включая сердце и костный мозг, но не ограничиваясь ими) с применением таких антител, молекул и композиций.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ

На фигуре 1 показан анализ образцов сыворотки мышей линии KM mouse™, иммунизированных hNKG2D. Анализ при помощи проточной цитометрии NKG2D-экспрессирующих BAF/3 клеток или контрольных клеток (BAF/3 клетки) на различных отрезках времени демонстрирует повышение титров антитела с селективным связыванием NKG2D в 1 мкл сыворотки (А). Предварительная инкубация с сывороткой (1 мкл), взятой после 6 иммунизации, содержащей антитело, способное предотвращать связывание MICA-Fc с NKG2D (Б).

На фигуре 2 показан пример человеческого антитела в форме супернатанта гибридомы, специфически связывающегося с клетками, экспрессирующими NKG2D (А), но не с клетками той же линии, не экспрессирующими NKG2D (Б). Антитело добавляли к клеткам в форме супернатанта гибридомы. Также показано непосредственное связывание меченного положительного контроля, анти-NKG2D антитела грызунов 149810 с клетками, экспрессирующими NKG2D (В) и клетками, не экспрессирующими его (Г). Черный контур представляет фоновое окрашивание, а сплошные пики представляют специфическое окрашивание.

На фигуре 3 показано дозозависимое связывание NKG2D клеток, экспрессирующих NKG2D, с рекомбинантными и очищенными полностью человеческими антителами lgG4 (16F16, 16F31, MS и 21F2) в сравнении с коммерческими антителами грызунов (ON72 и 149810).

На фигуре 4 показаны аминокислотные последовательности тяжелых (Н) и легких (L) цепей человеческих анти-hNKG2D антител 16F16 и 16F31 (А), и MS и 21F2 (Б) с изотипом lgG4, на которых выделены вариабельные участки (жирным) и участки CDR (подчеркнуты). Соответствующие кодовые обозначения для аминокислотных последовательностей и различные выделенные фрагменты приведены в Таблице 1.

На фигуре 5 показано выравнивание последовательностей VH и VL с соответствующими рекомбинированными зародышевыми последовательностями. Участки CDR обозначены жирным и пронумерованы по Kabat, а соматические гипермутации обозначены жирным подчеркнутым текстом. (А) 16F16 lgG4 цепь Н; (Б) 16F16 lgG4 цепь L; (В) 16F31 lgG4 цепь Н; (Г) 16F31 lgG4 цепь L; (Д) MS lgG4 цепь Н; (Е) MS lgG4 цепь L; (Ж) 21 F2 lgG4 цепь Н; (3) 21 F2 lgG4 цепь L. SEQ ID NOS:27-30 соответствуют рекомбинированным VH3_21/D3-9/JH4, VKI_L15/JK2, VH3 20/D3- 10/JH6 и VKIII_A27/JK3, соответственно, a SEQ ID NOS 60-63 соответствуют рекомбинированным VH4_59//JH3, VKIII_A27/JK1, VH5_51/D3_10_R3/JH4 и VKIII_L6/JK1, соответственно.

На фигуре 6 показано блокирование связывания лиганда (MICA-) приведенным в качестве примера человеческим антителом к NKG2D, изображенное в виде блокирования связывания лиганда при предварительной инкубации с антителом в супернатанте гибридомы. Контур обозначает фон, серым обозначено связывание лиганда без предварительной инкубации, а черным с точками обозначено связывании е лиганда после предварительной инкубации.

На фигуре 7 показана кривая доза-ответ, полученная при анализе различных концентраций рекомбинантных очищенных полностью человеческих антител к hNKG2D (16F16, 16F31, MS и 21 F2; изотип lgG4), отображающая IC50 и дозу, необходимую для полной блокады связывания 1 мкг MICA-mFc.

На фигуре 8 показано, что связывание ON72 с NKG2D полностью предотвращалось при предварительной инкубации с супернатантом гибридомы, содержащим 16F16. Контур обозначает фон, серым обозначено связывание ON72 без предварительной инкубации, а черным с точками обозначено связывание ON72 после предварительной инкубации.

На фигуре 9 показана способность полностью человеческих антител к hNKG2D блокировать последующее связывание анти-hNKG2D антител грызунов, или наоборот.(А) 16F16: Предварительная инкубация с рекомбинантным и очищенным 16F16 (0,3 мкг; изотип lgG4) предотвращала связывание ON72 (0,3 мкг) с NKG2D. Инкубация в обратном порядке показала, что предварительная инкубация с ON72 (0,3 мкг) только на 85% сокращала связывание рекомбинантного и очищенного 16F16 с изотипом lgG4 (0,3 мкг), указывая на то, что какая-то фракция NKG2D оставалась доступной для связывания полностью человеческим антителом, что предполагало существование эпитопа, по меньшей мере частично отличающегося от того, который связывался с ON72. Антитело 149810 демонстрировало только 50% перекрестное ингибирование рекомбинантного и очищенного 16F16 (изотип lgG4), при тестировании антител 149810 и 16F16 в соотношении 1:1 (0,3 мкг, 0,3 мкг) и в соотношении 3:1 (1 мкг, 0,3 мкг), соответственно, что вновь с большой вероятностью указывало на различия в связывании с эпитопом на NKG2D. Использовали следующие комбинации инкубации и детекции: детекция ON72 без (а) или с (б) предварительной инкубацией с 16F16; детекция 16F16 без (в) или с (г) предварительной инкубацией с ON72; детекция 149810 (0,3 мкг) без (д) или с (е) предварительной инкубацией с 16F16 (0,3 мкг); детекция 16F16 без (ж) или с (з) предварительной инкубацией с 149810 (0,3 мкг); детекция 149810 (1 мкг) без (и) или с (к) предварительной инкубацией с 16F16 (0,3 мкг); детекция 16F16 (0,3 мкг) без (л) или с (м) предварительной инкубацией с 149810 (1 мкг); детекция 16F16 (0,3 мкг). (Б) MS: 0,1 мкг анти-hNKG2D антитела грызунов инкубировали с или без предварительной инкубации с 0,1 мкг антитела MS, с последующей детекцией с анти-мышиным антителом при помощи проточной цитометрии. Инкубация с 0,1 мкг ON72, 1D11 или 149810 без предварительной инкубации с MS, нормализованная к 100%, показана в (а), (в) и (д), соответственно. Инкубация с 0,1 мкг MS в течение 30 минут с последующей инкубацией и детекцией ON72, 1D11 или 149810 показана в (б), (г) и (е), соответственно. Предварительная инкубация с MS ингибировала связывание NKG2D с ON72, 1D11 и 149810 на 98%, 88% и 96,5%, соответственно, что предполагало существование одинаковых эпитопов по меньшей мере у некоторых из антител. (В) 21F2: детекция связывания ON72 с (а) или без (б) предварительной инкубации с 21F2; детекция связывания 1D11 с (в) или без (г) предварительной инкубации с 21F2; и детекция связывания 149810 с (д) или без (е) 21F2 (все антитела в количестве 0,1 мкг).

На фигуре 10 показано окрашивание клеток макаки резус или яванского макака с антителом ON72 и 16F16, очищенным из исходной гибридомы. (A) NK клетки яванского макака, (Б) CD8+ Т клетки яванского макака, (В) NK клетки макаки-резус и (Г) CD8+ Т клетки макаки-резус. Приведенные значения представляют собой среднюю интенсивность флуоресценции (MFI) связывания после вычитания MFI связывания только вторичного антитела. Ни у одного вида не наблюдалось связывания с CD4+ Т клетками.

На фигуре 11 показано связывание человеческого антитела MS с CD8-положительной фракцией мононуклеарных клеток периферической крови (МКПК) человека или яванского макака при различных концентрациях антител, демонстрирующее одинаковую аффинность NKG2D к клеткам человека и яванского макака.

На фигуре 12 показано, что добавление антител, блокирующих лиганд (ON72 или рекомбинантного и очищенного 16F16 (изотип lgG4)), блокировало NK-опосредованную гибель клеток-мишеней, экспрессирующих MICA в дозозависимым образом в радионукпеидном тесте с ⁵¹Cr.

На фигуре 13 показано, что рекомбинантные и очищенные антитела 16F16 и 16F31 (оба с изотипом lgG4) были способны дозозависимым образом подавлять гибель клеток-мишеней (BaF/3), несущих как MICA (А), так и ULBP3 (Б), под воздействием клеток NK-92, с почти полным блокированием 16F16 в концентрации 0,8 мкг/мл для обоих лигандов и с частичным блокированием 16F31 в максимальной исследованной концентрации 20 мкг/мл для обоих лигандов.

На фигуре 14 показано, что рекомбинантные и очищенные антитела MS, 21F2, и 16F16 (все с изотипом lgG4) были способны подавлять NK-опосредованную гибель клеток-мишеней, экспрессирующих лиганды. (А) ингибирование киллерного действия клеток NK-92 на клетки ULBP3-BaF/3 в присутствии MS или 21F2. (Б) ингибирование киллерного действия клеток NKL на клетки BaF/3-MICA в присутствии MS или 16F16.

На фигуре 15 показано снижение поверхностной экспрессии NKG2D в ответ на антитело на модели клеток BaF/3, трансфецированных NKG2D и DAP10. На фигуре показано процентное содержание рецепторов NKG2D, оставшихся на поверхности клеток после инкубации в течение ночи с ON72 (1 мкг) или с рекомбинантными и очищенными антителами человека 16F16 (1 мкг; изотип lgG4) или 16F31 (3 мкг; изотип lgG4), в сравнении с контролем (поверхностная экспрессия рецептора NKG2D после инкубации в течение ночи без антитела к NKG2D=100%).

На фигуре 16 показано снижение поверхностной экспрессии NKG2D в ответ на антитело MS на модели клеток BaF/3, трансфецированных NKG2D и DAP10 (выполнено как на фигуре 15) (А) или свежевыделенных из периферической крови NK клеток человека (Б). На панели (Б) NK клетки человека инкубировали в течение ночи в присутствии человеческой сыворотки для имитации присутствия IgG в крови и с различными концентрациями антитела MS. Максимальное ингибирование достигалось даже при самой низкой концентрации, что соответствовало приблизительно 60% насыщению рецепторов, определенному в тесте связывания с использованием NKG2D+ NK клеток в аналогичных условиях.

На фигуре 17 показано снижение в процентах поверхностного NKG2D на NK клетках человека после инкубации в течение ночи с указанными концентрациями антитела 21F2.

На фигуре 18 показан эффект ON72, MS и 21F2 на представленнный на поверхности различных клеток NKG2D в образцах крови человека через указанные промежутки времени. Концентрация каждого антитела составляла 0,1 мкг/мл. Не ограничиваясь какой-либо теорией, снижение поверхностной экспрессии NKG2D в экспериментах вероятно представляет интернализацию NKG2D. Панели с (А) по (В) отображают интернализацию NKG2D в ответ на антитело в экспрессирующих NKG2D клетках NK, CD8+ Т клетках и δγ Т клетках, соответственно. MS и 21F2 вызывают менее выраженное снижение экспрессии связанного с поверхностью NKG2D, по сравнению с ON72.

На фигуре 19 показаны результаты исследования активирующего эффекта иммобилизованных MS и ON72 на пролиферацию Т клеток с применением 2 различных субоптимальных концентраций CD3 для обеспечения возможной ко-стимуляции. (А) [CD3]=0,1 нг/мл; (Б) [CD3]=0,3 нг/мл. Пролиферацию Т клеток оцениивали при помощи разведения CFSE в популяции МКПК, стимулированных иммобилизованным антителом, как указано, в течение 3 дней с последующей стимуляцией IL-2 в течение 4 дней. Стимуляция CD28 приведена в качестве положительного контроля ко-стимуляции. Для MS не было выявлено значимого активирующего эффекта, тогда как ON72 оказывал слабый, но значимый эффект на пролиферацию Т клеток.

На фигуре 20 изображена 3-мерная суперпозиционная модель, изображающая димер hNKG2D в комплексе с Fab-фрагментом (фрагментами) анти-NKG2D антитела (MS или hzON72) или с лигандом MICA. Гомодимер hNKG2D ('NKG2D') изображен в стиле «поверхность» с одним из мономеров, имеющим более темный цвет по сравнению с другим. Fab-фрагменты ('MS' и 'hzON72', соответственно) изображены в стиле «черная труба», а изображение MICA ('MICA') представлено в стиле «схемы вторичной структуры светлого цвета». (А), (Б) Совмещение кристаллических структур комплексов hNKG2D/MS Fab и hNKG2D/MICA (Li et al, Nat Immunol 2001; 2:443-451; PDB-code 1HYR, с использованием в качестве матрицы альфа-атомов углерода общей молекулы hNKG2D). Поскольку и MICA, и MS связываются с димером NKG2D асимметрично, на панелях (А) и (Б) показаны два возможных способа относительной ориентации двух молекул лигандов при связывании с димером NKG2D. Существует значительное перекрывание между MICA и MS Fab при расчетах суперпозиции hNKG2D в обеих ориентациях, что указывает на способность MS Fab блокировать связывание MICA с рецептором hNKG2D. См. Пример 11. (В) Совмещение кристаллических структур комплексов hNKG2D/hzON72 Fab и hNKG2D/MICA. Каждый мономер hNKG2D связан с hzON72 Fab. При расчетах суперпозиции hNKG2D, антитело hzON72 также демонстрировало существенное перекрывание с сайтом связывания MICA, что указывало на способность hzON72 блокировать связывание MICA с hNKG2D. См. Пример 12.

На фигуре 21 показаны остатки в последовательности эпитопа (SEQ ID NO:2) каждой единицы мономера NKG2D в димере hNKG2D для MS Fab (A), hzON72 Fab (Б) и молекулы MICA (В) в последовательностях (SEQ ID NO:2) двух единиц мономеров hNKG2D. Остатки NKG2D на расстоянии в пределах 4.0 Å от атомов лигандов кристаллической структуры считали частью связывающего эпитопа, они подчеркнуты. Остатки, подчеркнутые двойной линией, вовлечены в образование водородных связей с лигандом. (А) Связывающий эпитоп для одного MS Fab в 1 и 2 единицах мономера hNKG2D в составе димера hNKG2D. Кристаллографические мономеры N и С объединили в 1 единице мономера NKG2D, а кристаллографические мономеры М and D объединили во 2 единице мономера NKG2D. Во 2 единице мономера атом Nζ боковой цепи Lys 150 был задействован только в образовании водородной связи с в одном из двух кристаллографически независимых комплексов. См. также Таблицы 9-12. (Б) Соответствующие связывающие эпитопы для 2 hzON72 Fabs одновременно были связаны с 1 и 2 единицами мономера hNKG2D. Trp 166 был задействован в образовании водородных связей в одной из кристаллографически независимых молекулярных комплексов (одна молекула hzON72 Fab в комплексе с одним мономером hNKG2D), но расстояние было слишком большим для образования водородных связей в составе другого. См. Таблицы 14-15. (В) Связывающий эпитоп для молекулы MICA в 1 и 2 единицах мономера hNKG2D. Отмечалось асимметричное связывание MICA с димером hNKG2D и, следовательно, существовала возможность связывания в двух ориентациях относительно MS-Fab. Вторая ориентация MICA может быть получена при простой перестановке изображений 2 единицы мономера.

На фигуре 22 показаны молекулы hNKG2D, представленные в стиле «поверхность» с одним из мономеров, имеющим более темный цвет по сравнению с другим. Атомы NKG2D на расстоянии в пределах 4.0 Å от их соответствующих кристаллических структур атомов MS/hzON72/MICA Fab окрашены в черный цвет и указаны для MS Fab (A), 2 hzON72 Fabs (Б) и для MICA, (В) и (Г). Поскольку и MICA, и MS Fab связываются с димером NKG2D асимметрично, относительная ориентация при связывании с NKG2D может отличаться. Это показано на фигуре, изображающей две возможных ориентации при связывании с MICA на панели (В) и с MS на панели (Г). См. также Таблицы 9-12 и 14-15.

ОПРЕДЕЛЕНИЯ

В данном описании "hNKG2D" и, если не утверждается иначе или не противоречит контексту, термины "NKG2D," а также "NKG2-D," "CD314," "D12S2489E," "KLRK1," " 1 член подсемейства К пектин-подобных рецепторов киллерных клеток" и "KLRK1," означают ген активирующего рецептора киллерных клеток человека, его мРНК (например, NCBI RefSeq NM_007360; SEQ ID NO:1) и его генный продукт (NCBI RefSeq NP_031386; SEQ ID NO:2), или их естественные варианты. В NK и Т клетках лиганд-связывающая форма рецептора hNKG2D представляет собой гомодимер (Li et al,, Nat Immunol 2001; 2:443-451). Рецептор hNKG2D обычно представлен на поверхности в комплексе с DAP10 (Wu et al, J Exp Med 2000:192:1059 et seq.; NCBI Accession No. AAG29425, AAD50293) и предположительно также формирует комплексы более высокого порядка. Любая активность, относящаяся здесь к hNKG2D, например, клеточная активация, распознавание антителами и т.д., может также быть отнесена на счет hNKG2D в форме комплекса или комплексов более высокого порядка с DAP10 и/или другими компонентами.

Термин "антитело" здесь используется в самом широком смысле и, в частности, включает моноклональные полноразмерные антитела, поликлональные антитела и, если не утверждается иначе или не противоречит контексту, антиген-связывающие фрагменты, варианты антител и их мультиспецифичные молекулы, когда они проявляют желаемую биологическую активность. В общем, полноразмерное антитело представляет собой гликопротеин, содержащий по меньшей мере две тяжелые (Н) цепи и две легкие (L) цепи, связанные между собой дисульфидными связями, или их антиген-связывающие участки. Каждая тяжелая цепь состоит из вариабельного участка тяжелой цепи (сокращенно обозначаемого VH) и константного участка тяжелой цепи. Константный участок тяжелой цепи состоит из трех доменов, СН1, СН2 и СНЗ. Каждая легкая цепь состоит из вариабельного участка легкой цепи (сокращенно обозначаемого VL) и константного участка легкой цепи. Константный участок легкой цепи состоит из одного домена, CL. Участки VH и VL могут дальше подразделяться на гипервариабельные участки, называемые участками, определяющими комплементарность (от англ. complementarily determining regions, CDR), чередующимися с более консервативными участками, называемыми каркасными участками (FR). Каждый VH и VL состоит из трех CDRs и четырех FRs, расположенных от амино-конца к карбокси-концу в следующем порядке: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. Вариабельные участки тяжелых и легких цепей содержат связывающий домен, взаимодействующий с антигеном. Основные принципы построения молекулы антитела и разнообразные методики, относящиеся к продукции антител, описаны, например, в Harlow and Lane, ANTIBODIES: A LABORATORY MANUAL, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., (1988).

"Антиген-связывающий фрагмент" антитела представляет собой молекулу, содержащую часть полноразмерного антитела, которое способно детектируемо связываться с антигеном, обычно содержащую одну или несколько частей по меньшей мере участка VH. Антиген-связывающие фрагменты включают мультивалентные молекулы, содержащие один, два, три или более антиген- связывающих участков антитела, а также одноцепочечные конструкции, в которых участки VL и VH или их отдельные фрагменты соединены между собой искусственными линкерами или с использованием рекомбинантных методов, таким образом, что они образуют функциональную антиген-связывающую молекулу. Несмотря на то, что некоторые антиген-связывающие фрагменты антитела могут быть получены путем настоящей фрагментации более крупной молекулы антитела (например, ферментативного расщепления), большинство из них обычно продуцируют при помощи рекомбинантных технологий.

Термины "производное антител" и "иммуноконъюгат" используются здесь как взаимозаменяемые для обозначения молекул, содержащих полноразмерное антитело или его антиген-связывающий фрагмент, в котором одна или более иминокислот химически модифицированы, например, путем алкилирования, пегилирования, ацилирования, образования эфиров или образования амидов или тому подобного, например, для связывания антитела со второй молекулой. Примеры модификаций включают пегилирование (например, пегилирование цистеина), биотинилирование, радиоактивное мечение и конъюгирование со вторым агентом (таким как цитотоксический агент).

"Мультиспецифическая молекула" включает антитело или его антиген-связывающий фрагмент, который ассоциирован с или связан по меньшей мере с одной иной функциональной молекулой (например, другим пептидом или белком, таким как другое антитело или лиганд рецептора), таким образом образуя молекулу, связывающуюся по меньшей мере с двумя различными сайтами связывания или молекулами-мишенями. Примеры мультиспецифических молекул включают биспецифичные антитела и антитела, связанные с растворимыми фрагментами рецептора или лигандами.

Термин "антитело человека" используемый здесь, предназначен для определения антител с вариабельными участками, в которых как каркасные, так и гипервариабельные участки получены на основе последовательностей зародышевой линии (т.е. неперестроенных) иммуноглобулинов человека (т.е., являются идентичными или практически идентичными им). Более того, если антитело содержит константный участок, то константный участок также "получен на основе" последовательностей зародышевой линии иммуноглобулинов человека. Антитела человека по изобретению могут включать аминокислотные остатки, не кодируемые последовательностями зародышевой линии иммуноглобулинов человека (например, мутации, введенные в ходе случайного или сайт-специфического мутагенеза in vitro или соматические мутации in viva). Однако, термин "антитело человека", используемый здесь, не предназначен для определения антител, в которых последовательности CDR, полученные на основе зародышевых линий других видов млекопитающих, таких как мышь, были пересажены на последовательности каркасных участков человека.

"Гуманизированное" антитело представляет собой химерное антитело человеческого/не-человеческого происхождения, содержащее минимальную последовательность, произведенную на основе иммуноглобулина не-человеческого происхождения. Главным образом, гуманизированные антитела представляют собой иммуноглобулины человека (антитело-реципиент), в которых остатки гипервариабельных участков реципиента заменены на остатки гипервариабельных участков видов, не имеющих человеческое происхождение (антитело-донор), таких как мышь, крыса, кролик или приматов, кроме человека, имеющих желаемую специфичность, аффинность и связывающую способность. В некоторых случаях остатки FR иммуноглобулина человека заменены на соответствующие остатки нечеловеческого происхождения. Более того, гуманизированные антитела могут содержть остатки, которые не обнаруживаются в антителе-реципиенте или в антителе-доноре. Такие модификации производятся для дальнейшего улучшения свойств антитела. В общем, гуманизированное антитело включает практически все из по меньшей мере одного, а обычно двух вариабельных доменов, в которых все или практически все из гипервариабельных петель соответствуют таковым иммуноглобулинов, не имеющих человеческое происхождение, и все или практически все из остатков FR относятся к последовательности иммуноглобулина человека. Гуманизированное антитело может, как вариант, также включать по меньшей мере часть константного участка иммуноглобулина (Fc), обычно принадлежащего иммуноглобулину человека. Более подробно см., например, в Jones et al., Nature 321:522-525 (1986); Riechmann et al., Nature 332:323-329 (1988); и Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596 (1992), WO 92/02190, предварительной заявки США 20060073137 и патентов США 6750325, 6632927, 6639055, 6548640, 6407213, 6180370, 6054297, 5929212, 5895205, 5886152, 5877293, 5869619, 5821337, 5821123, 5770196, 5777085, 5766886, 5714350, 5693762, 5693761, 5530101, 5585089 и 5225539.

Термин "гипервариабельный участок", используемый здесь, означает аминокислотные остатки антитела, отвечающие за связывание антигена. Гипервариабельный участок обычно содержит аминокислотные остатки, определяющие комплементарность или "CDR" (остатки 24-34 (L1), 50-56 (L2) и 89-97 (L3) в вариабельном домене легкой цепи и 31-35 (H1), 50-65 (Н2) и 95-102 (Н3) в вариабельном домене тяжелой цепи; (Kabat et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242) и/или эти остатки из гипервариабельной петли (остатки 26-32 (L1), 50-52 (L2) и 91-96 (L3) в вариабельном домене легкой цепи и 26-32 (Н1), 53-55 (Н2) и 96-101 (Н3) в вариабельном домене тяжелой цепи; Chothia and Lesk, J. Mol. Biol 1987; 196:901-917). Как правило, нумерация аминокислотных остатков в этих участках производится способом, описанным Kabat et al., supra. Словосочетания "позиция по Kabat", "нумерация остатков в вариабельном домене по Kabat" и "согласно Kabat" здесь означают данную систему нумерации для вариабельных доменов тяжелой цепи или вариабельных доменов легкой цепи. При применении системы нумерации Kabat истинная линейная аминокислотная последовательность пептида может содержать меньше или больше аминокислот, что соответствует укорочению или инсерции в FR или CDR вариабельного домена. Например, вариабельный домен тяжелой цепи может содержать инсерцию единственной аминокислоты (остаток 52а согласно Kabat) после остатка 52 в CDR H2 и инсерцию нескольких остатков (например, остатков 82а, 82b и 82c, и т.д., согласно Kabat) после остатка 82 в FR тяжелой цепи. Нумерация остатков по Kabat может быть определена для данного антитела при выравнивании по гомологичным участкам последовательности антитела со «стандартной» последовательностью, пронумерованной по Kabat.

Аминокислотные остатки "каркасного участка" или "FR" представляют собой остатки VH или VL, отличные от таковых CDR, согласно данному описанию.

"Эпитоп" или "сайт связывания" представляет собой область или участок на поверхности антигена, с которыми специфически связывается антиген-связывающий пептид (такой, как антитело). Эпитоп белка может включать аминокислотные остатки, непосредственно задействованные в связывании (также называемые иммунодоминантными компонентами эпитопа) и другие аминокислотные остатки, которые не являются непосредственно задействованными в связывании, такие, как аминокислотные остатки, которые успешно блокируются пептидом, специфически связывающим антиген (другими словами, аминокислотный остаток находится в составе поверхности, недоступной растворителю, и/или «отпечатка» пептида, специфически связывающего антиген). Термин эпитоп здесь включает оба типа сайтов связывания аминокислот в любом конкретном участке hNKG2D, который специфически связывается с анти-hNKG2D антителом или любым другим специфичным к hNKG2D агентом согласно изобретению, если не утверждается иначе (например, в некотором контексте изобретение относится к антителам которые непосредственно связываются с определенными аминокислотными остатками). NKG2Ds может включать ряд различных эпитопов, которые могут включать (1) линейные антигенные детерминанты пептидов, (2) конформационные антигенные детерминанты, состоящие из одной или более аминокислот, не являющихся смежными, расположенных вблизи друг от друга в активной конформации NKG2D; и (3) антигенные детерминанты, прошедшие посттрансляционную модификацию, состоящие полностью или частично из молекулярных структур, ковалентно связанных с NKG2D, таких как углеводные группировки, не ограничиваясь ими. Если не утверждается иначе или не противоречит контексту, конформационные антигенные детерминанты включают аминокислотные остатки NKG2D на расстоянии в пределах 4 Å от атома антиген-связывающего пептида.

"Поверхность, недоступная растворителю" представляет собой область молекулы, которая, согласно компьютерным расчетам, является недоступной для молекул воды, например, из-за связывания молекулы с лигандом (Lee and Richards, J Mol Biol 1971; 55:379-400, включено сюда путем ссылки).

Словосочетание "связывается практически с тем же эпитопом или детерминантой, что и антитело, представляющее интерес" (например, MS или 21F2) означает, что антитело "конкурирует" с антителом, представляющим интерес, за молекулы NKG2D, с которыми специфически связывается антитело, представляющее интерес.

"Паратоп" представляет собой область или участок антиген-связывающей части антитела, которая специфически связывается с антигеном. Если не утверждается иначе или явно не противоречит контексту, паратоп может содержать аминокислотные остатки, непосредственно задействованные в связывании с эпитопами, несколько из которых обычно принадлежат CDR, а также другие аминокислотные остатки, которые не являются непосредственно задействованными в связывании, такие как аминокислотные остатки, которые успешно блокируются специфически связанным антигеном (иными словами, аминокислотный остаток находится внутри "поверхности, недоступной растворителю" и/или "отпечатка" специфически связанного антигена).

Способность антитела к NKG2D "блокировать" связывание молекулы NKG2D с естественным лигандом NKG2D (например, MICA), означает, что антитело в тесте с применением растворимого или поверхностно-связанного NKG2D и молекул лигандов, может детектируемо снижать связывание молекулы NKG2D с лигандом дозозависимым образом, когда молекула NKG2D детектируемо связывается с лигандом в отсутствие антитела. Пример теста на определение способности анти-NKG2D антитела блокировать связывание MICA приводится в Примере 3. Этот же тест можно применять для тестирования блокирования других лигандов NKG2D, опосредованного антителами.

"Вариант" полипептида означает полипептид, имеющий аминокислотную последовательность, по существу идентичную референсному полипептиду, как правило, нативному или "материнскому" полипептиду. Вариант полипептида может иметь одну или более аминокислотных замен, делеций, и/или инсерций в определенных положениях в составе нативной аминокислотной последовательности и/или вставки на одном или обоих концах.

Термин "по существу идентичный" в контексте двух аминокислотных последовательностей означает, что последовательности, при их оптимальном выравнивании, например, с помощью программ GAP или BEST-FIT с применением веса разрыва, используемого по умолчанию, имеют по меньшей мере около 50 процентов идентичности. Как правило, по существу идентичные последовательности имеют по меньшей мере приблизительно 60, по меньшей мере приблизительно 70, по меньшей мере приблизительно 80, по меньшей мере приблизительно 90, по меньшей мере приблизительно 95, по меньшей мере приблизительно 98, или по меньшей мере приблизительно 99 процентов идентичности.

"Соответствующие" положения аминокислот у двух по существу идентичных аминокислотных последовательностей являются теми, которые получены при выравнивании с помощью любого программного обеспечения для анализа белков, на которое здесь имеется ссылка.

Последовательность нуклеиновой кислоты (или элемент) является "оперативно связанной" с другой последовательностью нуклеиновой кислоты (или элементом), если она находится в функциональной взаимосвязи с последовательностью другой аминокислоты. Например, ДНК пре-последовательности или последовательности секреторного лидерного пептида является оперативно связанной с ДНК (например, кодирующей экспрессию) полипептида, если она экспрессируется в виде пропептида, участвующего в секреции полипептида; промотор или энхансер оперативно связан с кодирующей последовательностью, если он влияет на транскрипцию последовательности; либо сайт связывания рибосомы является оперативно связанным с кодирующей последовательностью, если он располагается таким образом, что способствует трансляции. Как правило, "оперативно связанный" означает, что связанные последовательности ДНК являются смежными, и, в случае секреторного лидерного пептида, смежными и считывающимися в одной рамке. Однако, некоторые элементы, такие как энхансеры, не обязательно должны быть смежными с кодирующей последовательностью, чтобы считаться оперативно связанными. Связывание обычно осуществляется за счет лигирования по подходящим р