Композиции и способы получения изопрена, не содержащего с5-углеводородов в условиях нарушения взаимосвязи между продуцированием изопрена и ростом клеток и/или в условиях продуцирования изопрена на безопасных рабочих уровнях

Композиции и способы получения изопрена, не содержащего с5-углеводородов в условиях нарушения взаимосвязи между продуцированием изопрена и ростом клеток и/или в условиях продуцирования изопрена на безопасных рабочих уровнях

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Перекрестная ссылка на родственные заявки

В настоящей заявке испрашивается преимущество приоритета предварительной заявки США 61/134094, поданной 2 июля 2008 г., предварительной заявки США 61/133947, поданной 2 июля 2008 г., и предварительной заявки США 61/134011, поданной 2 июля 2008 г., содержание которых во всей своей полноте вводится в настоящее описание посредством ссылки.

Предшествующий уровень техники

Изопрен (2-метил-1,3-бутадиен) является ценным исходным материалом, используемым для получения различных синтетических полимеров, а чаще всего, для производства синтетических каучуков. В природе изопрен продуцируется различными микробами, растениями и животными. В частности, было выявлено два пути биосинтеза изопрена: мевалонатный путь (MVA) и не-мевалонатный путь (DXP) (фигура 19). Однако, с коммерческой точки зрения, выход изопрена, продуцируемого природными микроорганизмами, является недостаточным. Примерно 800000 тонн цис-полиизопрена в год продуцируется в результате полимеризации изопрена; причем, в большинстве случаев, этот полиизопрен применяется в производстве шин и в резиновой промышленности. Изопрен также подвергают сополимеризации для его использования в качестве синтетического эластомера в других продуктах, таких как обувь, механические изделия, медицинские препараты, спортивные товары и латекс.

В настоящее время, производство шин и резиновая промышленность базируются на применении природного и синтетического каучука. Природный каучук получают из млечного сока каучуковых деревьев, произрастающих в дождевых лесах Африки. Синтетический каучук получают, главным образом, на основе бутадиеновых полимеров. Для производства таких полимеров, бутадиен получают промышленным способом в виде продукта сополимеризации этилена и пропилена.

Изопрен может быть получен путем ректификации нефти, однако очистка этого материала является дорогостоящей и требует много времени. При нефтяном крекинге потока C5-углеводородов продуцируется примерно лишь 15% изопрена. А поэтому необходимо разработать более экономичный метод получения изопрена. В частности, желательно разработать методы продуцирования изопрена, которые обеспечивали бы скорость продуцирования, а также титры и частоту изопрена, отвечающие современным требованиям экономически выгодного промышленного производства. Было бы также желательно создать системы для продуцирования изопрена, которые состояли бы из недорогостоящих исходных материалов.

Описание сущности изобретения

В одном из своих аспектов, настоящее изобретение относится к клеточным культурам, продуцирующим изопрен. В некоторых своих вариантах, настоящее изобретение относится к культуре клеток, которая продуцирует более чем примерно 400 нмоль изопрена/грамм клеток в расчете на сырую массу клеток/час (нмоль/г_wcm/час). В некоторых вариантах изобретения, клетки имеют гетерологичную нуклеиновую кислоту, которая (i) кодирует полипептид изопренсинтазы и (ii) функционально присоединена к промотору. В некоторых вариантах изобретения, клетки культивируют в культуральной среде, которая включает источник углерода, такой как, но не ограничивающийся им, углевод, глицерол, глицерин, дигидроксиацетон, источник, содержащий один атом углерода, масло, животный жир, масло животного происхождения, жирная кислота, липид, фосфолипид, глицеролипид, моноглицерид, диглицерид, триглицерид, возобновляемый источник углерода, полипептид (например, белок или пептид микробного или растительного происхождения), дрожжевой экстракт, компонент дрожжевого экстракта или любая комбинация двух или более вышеуказанных соединений. В некоторых вариантах изобретения, клетки культивируют в условиях с ограниченным содержанием глюкозы.

В некоторых своих вариантах, настоящее изобретение относится к клеткам, которые, при их культивировании в среде для культивирования клеток, обладают способностью превращать примерно более чем 0,002% углерода в изопрен. В некоторых вариантах изобретения, клетки имеют гетерологичную нуклеиновую кислоту, которая (i) кодирует полипептид изопренсинтазы и (ii) функционально присоединена к промотору. В некоторых вариантах изобретения, клетки культивируют в культуральной среде, которая включает источник углерода, такой как, но не ограничивающийся им, углевод, глицерол, глицерин, дигидроксиацетон, источник, содержащий один атом углерода, масло, животный жир, масло животного происхождения, жирная кислота, липид, фосфолипид, глицеролипид, моноглицерид, диглицерид, триглицерид, возобновляемый источник углерода, полипептид (например, белок или пептид микробного или растительного происхождения), дрожжевой экстракт, компонент дрожжевого экстракта или любая комбинация двух или более вышеуказанных соединений. В некоторых вариантах изобретения, клетки культивируют в условиях с ограниченным содержанием глюкозы.

В некоторых своих вариантах, настоящее изобретение относится к клеточной культуре, которая содержит гетерологичную нуклеиновую кислоту, кодирующую полипептид изопренсинтазы. В некоторых вариантах изобретения, клетки имеют гетерологичную нуклеиновую кислоту, которая (i) кодирует полипептид изопренсинтазы и (ii) функционально присоединена к промотору. В некоторых вариантах изобретения, клетки культивируют в культуральной среде, которая включает источник углерода, такой как, но не ограничивающийся им, углевод, глицерол, глицерин, дигидроксиацетон, источник, содержащий один атом углерода, масло, животный жир, масло животного происхождения, жирная кислота, липид, фосфолипид, глицеролипид, моноглицерид, диглицерид, триглицерид, возобновляемый источник углерода, полипептид (например, белок или пептид микробного или растительного происхождения), дрожжевой экстракт, компонент дрожжевого экстракта или любая комбинация двух или более вышеуказанных соединений. В некоторых вариантах изобретения, клетки культивируют в условиях с ограниченным содержанием глюкозы.

В одном из своих аспектов, настоящее изобретение относится к способам продуцирования изопрена, таким как способы, осуществляемые с использованием любых описанных здесь клеток, продуцирующих изопрен. В некоторых вариантах изобретения, указанный способ включает культивирование клеток в условиях, достаточных для продуцирования более чем примерно 400 нмоль/г_wcm/час изопрена. В некоторых вариантах изобретения, указанный способ также включает регенерацию изопрена, продуцированного данными клетками. В некоторых вариантах изобретения, указанный способ включает очистку изопрена, продуцированного данными клетками. В некоторых вариантах изобретения, указанный способ включает полимеризацию изопрена. В некоторых вариантах изобретения, указанные клетки имеют гетерологичную нуклеиновую кислоту, которая (i) кодирует полипептид изопренсинтазы и (ii) функционально присоединена к промотору. В некоторых вариантах изобретения, клетки культивируют в культуральной среде, которая включает источник углерода, такой как, но не ограничивающийся ими, углевод, глицерол, глицерин, дигидроксиацетон, источник, содержащий один атом углерода, масло, животный жир, масло животного происхождения, жирная кислота, липид, фосфолипид, глицеролипид, моноглицерид, диглицерид, триглицерид, возобновляемый источник углерода, полипептид (например, белок или пептид микробного или растительного происхождения), дрожжевой экстракт, компонент дрожжевого экстракта или любая комбинация двух или более вышеуказанных соединений. В некоторых вариантах изобретения, клетки культивируют в условиях с ограниченным содержанием глюкозы. В различных вариантах изобретения, количество изопрена (такое как общее количество продуцируемого изопрена или количество изопрена, продуцируемое на литр бульона в час на OD₆₀₀), продуцируемое в стационарной фазе, более чем или примерно в 2 или более раз превышает количество изопрена, продуцируемого в фазе роста в течение того же самого периода времени. В некоторых вариантах изобретения, газовая фаза содержит более чем или примерно 9,5% (по объему) кислорода, а концентрация изопрена в этой газовой фазе меньше нижнего предела воспламеняемости или выше верхнего предела воспламеняемости. В конкретных вариантах изобретения, (i) концентрация изопрена в газовой фазе меньше нижнего предела воспламеняемости или выше верхнего предела воспламеняемости, и (ii) указанные клетки продуцируют более чем примерно 400 нмоль/г_wcm/час изопрена.

В некоторых вариантах изобретения, указанный способ включает культивирование клеток в условиях, достаточных для превращения более чем примерно 0,002% углерода (моль/моль) в среде для культивирования клеток в изопрен. В некоторых вариантах изобретения, указанный способ также включает регенерацию изопрена, продуцированного данными клетками. В некоторых вариантах изобретения, указанный способ включает очистку изопрена, продуцированного данными клетками. В некоторых вариантах изобретения, указанный способ включает полимеризацию изопрена. В некоторых вариантах изобретения, указанные клетки имеют гетерологичную нуклеиновую кислоту, которая (i) кодирует полипептид изопренсинтазы и (ii) функционально присоединена к промотору. В некоторых вариантах изобретения, клетки культивируют в культуральной среде, которая включает источник углерода, такой как, но не ограничивающийся им, углевод, глицерол, глицерин, дигидроксиацетон, источник, содержащий один атом углерода, масло, животный жир, масло животного происхождения, жирная кислота, липид, фосфолипид, глицеролипид, моноглицерид, диглицерид, триглицерид, возобновляемый источник углерода, полипептид (например, белок или пептид микробного или растительного происхождения), дрожжевой экстракт, компонент дрожжевого экстракта или любая комбинация двух или более вышеуказанных соединений. В некоторых вариантах изобретения, клетки культивируют в условиях с ограниченным содержанием глюкозы.

В некоторых вариантах изобретения, изопрен продуцируется лишь в стационарной фазе. В некоторых вариантах изобретения, изопрен продуцируется в фазе роста и в стационарной фазе. В различных вариантах изобретения, количество изопрена (такое как общее количество продуцируемого изопрена или количество изопрена, продуцируемое на литр бульона в час на OD₆₀₀), продуцируемое в стационарной фазе, более чем или примерно в 2, 3, 4, 5, 10, 20, 30, 40, 50 или более раз превышает количество изопрена, продуцируемое в фазе роста в течение того же самого периода времени.

В одном из своих аспектов, настоящее изобретение относится к композициям и системам, содержащим изопрен. В некоторых вариантах изобретения, указанная композиция включает более чем или примерно 2, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900 или 1000 мг изопрена. В некоторых вариантах изобретения, указанная композиция включает более чем или примерно 2, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100 г изопрена по массе летучей органической фракции данной композиции.

В некоторых вариантах изобретения, указанная композиция включает более чем или примерно 99,90; 99,92; 99,94; 99,96; 99,98 или 100% изопрена по общей массе всех C5-углеводородов в данной композиции. В некоторых вариантах изобретения, указанная композиция включает менее чем или примерно 0,12, 0,10, 0,08, 0,06, 0,04, 0,02, 0,01, 0,005, 0,001, 0,0005, 0,0001, 0,00005 или 0,00001% C5-углеводородов, не являющихся изопреном (таких как 1,3-циклопентадиен, цис-1,3-пентадиен, транс-1,3-пентадиен, 1-пентин, 2-пентин, 1-пентен, 2-метил-1-бутен, 3-метил-1-бутин, транс-пиперилен, цис-пиперилен, пент-4-ен-1-ин, транс-пент-3-ен-1-ин или цис-пент-3-ен-1-ин), по общей массе всех C5-углеводородов в указанной композиции. В некоторых вариантах изобретения, указанная композиция содержит менее чем или примерно 0,12, 0,10, 0,08, 0,06, 0,04, 0,02, 0,01, 0,005, 0,001, 0,0005, 0,0001, 0,00005 или 0,00001% 1,3-циклопентадиена, цис-1,3-пентадиена, транс-1,3-пентадиена, 1-пентина, 2-пентина, 1-пентена, 2-метил-1-бутена, 3-метил-1-бутина, транс-пиперилена, цис-пиперилена, пент-4-ен-1-ина, транс-пент-3-ен-1-ина или цис-пент-3-ен-1-ина по общей массе всех C5-углеводородов в указанной композиции. В конкретных вариантах изобретения, указанная композиция содержит более чем примерно 2 мг изопрена и более чем или примерно 99,90, 99,92, 99,94, 99,96, 99,98 или 100% изопрена по общей массе всех C5-углеводородов в указанной композиции.

В некоторых вариантах изобретения, указанная композиция содержит менее чем или примерно 50, 40, 30, 20, 10, 5, 1, 0,5, 0,1, 0,05, 0,01 или 0,005 мкг/л любого соединения, которое ингибирует полимеризацию изопрена. В конкретных вариантах изобретения, указанная композиция также содержит более чем примерно 2 мг изопрена.

В некоторых вариантах изобретения, указанная композиция содержит одно или более соединений, выбранных из группы, состоящей из этанола, ацетона, прениловых C5-спиртов и изопреноидных соединений, содержащих 10 или более атомов углерода. В некоторых вариантах изобретения, указанная композиция содержит более чем или примерно 0,005, 0,01, 0,05, 0,1, 0,5, 1, 5, 10, 20, 30, 40, 60, 80, 100 или 120 мкг/л этанола, ацетона, пренилового C5-спирта (такого как 3-метил-3-бутен-1-ол или 3-метил-2-бутен-1-ол), или любых двух или более вышеуказанных соединений. В конкретных вариантах изобретения, указанная композиция содержит более чем примерно 2 мг изопрена и одно или более соединений, выбранных из группы, состоящей из этанола, ацетона, прениловых C5-спиртов и изопреноидных соединений, содержащих 10 или более атомов углерода.

В некоторых вариантах изобретения, указанная композиция включает изопрен и одно или более вторых соединений, выбранных из группы, состоящей из 2-гептанона, 6-метил-5-гептен-2-она, 2,4,5-триметилпиридина, 2,3,5-триметилпиразина, цитронеллаля, ацетальдегида, метантиола, метилацетата, 1-пропанола, диацетила, 2-бутанона, 2-метил-3-бутен-2-ола, этилацетата, 2-метил-1-пропанола, 3-метил-1-бутаналя, 3-метил-2-бутанона, 1-бутанола, 2-пентанона, 3-метил-1-бутанола, этилизобутирата, 3-метил-2-бутенaла, бутилацетата, 3-метилбутилацетата, 3-метил-3-бут-1-енилацетата, 3-метил-2-бут-1-енилацетата, (E)-3,7-диметил-1,3,6-октатриена, (Z)-3,7-диметил-1,3,6-октатриена и 2,3-циклогептенолпиридина. В различных вариантах изобретения, количество одного из этих вторых компонентов по отношению к количеству изопрена, выраженное в процентах по массе (то есть масса компонента, деленная на массу изопрена × 100), превышает или составляет примерно 0,01, 0,02, 0,05, 0,1, 0,5, 1, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100 или 110% (масс/масс).

В некоторых вариантах изобретения, указанная композиция включает (i) газовую фазу, содержащую изопрен и (ii) клеточную культуру, продуцирующую более чем примерно 400 нмоль/г_wcm/час изопрена. В некоторых вариантах изобретения, указанная композиция включает закрытую систему, а газовая фаза включает более чем или примерно 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100 мкг/л изопрена, нормализованные на 1 мл культуры при OD₆₀₀=1, культивированной в течение 1 часа. В некоторых вариантах изобретения, указанная композиция включает открытую систему, а газовая фаза включает более чем или примерно 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100 мкг/л изопрена, барботированного при скорости 1 vvm (объем воздуха/объем бульона/минуту). В некоторых вариантах изобретения, летучая органическая фракция газовой фазы содержит более чем или примерно 99,90; 99,92; 99,94; 99,96; 99,98 или 100% изопрена по общей массе всех C5-углеводородов в данной летучей органической фракции. В некоторых вариантах изобретения, летучая органическая фракция газовой фазы содержит менее чем или примерно 0,12, 0,10, 0,08, 0,06, 0,04, 0,02, 0,01, 0,005, 0,001, 0,0005, 0,0001, 0,00005 или 0,00001% С5-углеводородов, не являющихся изопреном (таких как 1,3-циклопентадиен, цис-1,3-пентадиен, транс-1,3-пентадиен, 1-пентин, 2-пентин, 1-пентен, 2-метил-1-бутен, 3-метил-1-бутин, транс-пиперилен, цис-пиперилен, пент-4-ен-1-ин, транс-пент-3-ен-1-ин или цис-пент-3-ен-1-ин), по общей массе всех C5-углеводородов в указанной летучей органической фракции. В некоторых вариантах изобретения, летучая органическая фракция газовой фазы содержит менее чем или примерно 0,12, 0,10, 0,08, 0,06, 0,04, 0,02, 0,01, 0,005, 0,001, 0,0005, 0,0001, 0,00005 или 0,00001% 1,3-циклопентадиена, цис-1,3-пентадиена, транс-1,3-пентадиена, 1-пентина, 2-пентина, 1-пентена, 2-метил-1-бутена, 3-метил-1-бутина, транс-пиперилена, цис-пиперилена, пент-4-ен-1-ина, транс-пент-3-ен-1-ина или цис-пент-3-ен-1-ина по общей массе всех C5-углеводородов в указанной летучей органической фракции. В конкретных вариантах изобретения, указанная летучая органическая фракция газовой фазы содержит более чем примерно 2 мг изопрена и более чем или примерно 99,90, 99,92, 99,94, 99,96, 99,98 или 100% изопрена по общей массе всех C5-углеводородов в указанной летучей органической фракции.

В некоторых вариантах изобретения, указанная летучая органическая фракция газовой фазы содержит менее чем или примерно 50, 40, 30, 20, 10, 5, 1, 0,5, 0,1, 0,05, 0,01 или 0,005 мкг/л любого соединения в летучей органической фракции газовой фазы, которое ингибирует полимеризацию изопрена. В конкретных вариантах изобретения, указанная летучая органическая фракция газовой фазы также содержит более чем примерно 2 мг изопрена.

В некоторых вариантах изобретения, указанная летучая органическая фракция газовой фазы содержит одно или более соединений, выбранных из группы, состоящей из этанола, ацетона, прениловых C5-спиртов и изопреноидных соединений, содержащих 10 или более атомов углерода. В некоторых вариантах изобретения, указанная летучая органическая фракция газовой фазы содержит более чем или примерно 0,005, 0,01, 0,05, 0,1, 0,5, 1, 5, 10, 20, 30, 40, 60, 80, 100 или 120 мкг/л этанола, ацетона, пренилового C5-спирта (такого как 3-метил-3-бутен-1-ол или 3-метил-2-бутен-1-ол), или любых двух или более вышеуказанных соединений. В конкретных вариантах изобретения, указанная летучая органическая фракция газовой фазы содержит более чем примерно 2 мг изопрена и одно или более соединений, выбранных из группы, состоящей из этанола, ацетона, прениловых C5-спиртов и изопреноидных соединений, содержащих 10 или более атомов углерода.

В некоторых вариантах изобретения, указанная летучая органическая фракция газовой фазы включает изопрен и одно или более вторых соединений, выбранных из группы, состоящей из 2-гептанона, 6-метил-5-гептен-2-она, 2,4,5-триметилпиридина, 2,3,5-триметилпиразина, цитронеллаля, ацетальдегида, метантиола, метилацетата, 1-пропанола, диацетила, 2-бутанона, 2-метил-3-бутен-2-ола, этилацетата, 2-метил-1-пропанола, 3-метил-1-бутаналя, 3-метил-2-бутанона, 1-бутанола, 2-пентанона, 3-метил-1-бутанола, этилизобутирата, 3-метил-2-бутенaла, бутилацетата, 3-метилбутилацетата, 3-метил-3-бут-1-енилацетата, 3-метил-2-бут-1-енилацетата, (E)-3,7-диметил-1,3,6-октатриена, (Z)-3,7-диметил-1,3,6-октатриена и 2,3-циклогептенолпиридина. В различных вариантах изобретения, количество одного из этих вторых компонентов по отношению к количеству изопрена, выраженное в процентах по массе (то есть масса компонента, деленная на массу изопрена × 100), превышает или составляет примерно 0,01, 0,02, 0,05, 0,1, 0,5, 1, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, или 110% (масс/масс) в указанной летучей органической фракции газовой фазы.

В некоторых вариантах любой из композиций согласно изобретению, по меньшей мере часть изопрена присутствует в газовой фазе. В некоторых вариантах изобретения, по меньшей мере часть изопрена присутствует в жидкой фазе (такой как конденсат). В некоторых вариантах изобретения, по меньшей мере часть изопрена присутствует в твердой фазе. В некоторых вариантах изобретения, по меньшей мере часть изопрена адсорбируется на твердом носителе, таком как носитель, который включает двуокись кремния и/или активированный уголь. В некоторых вариантах изобретения, указанная композиция включает этанол. В некоторых вариантах изобретения, указанная композиция включает примерно от 75 до 90 масс.% этанола, например, примерно от 75 до 80%, примерно от 80 до 85%, или примерно от 85 до 90% масс.% этанола. В некоторых вариантах изобретения, указанная композиция включает примерно от 4 до 15 масс.% изопрена, например, примерно от 4 до 8%, примерно от 8 до 12%, или примерно от 12 до 15% масс.% изопрена.

В некоторых своих вариантах, настоящее изобретение относится к системам, которые включают любые клетки и/или композиции, описанные в настоящей заявке. В некоторых вариантах изобретения, указанная система также включает реактор, камера которого содержит клеточную культуру, продуцирующую более чем примерно 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1250, 1500, 1750, 2000, 2500, 3000, 4000, 5000 или более нмоль/г_wcm/час изопрена. В некоторых вариантах изобретения, указанная система не является закрытой системой. В некоторых вариантах изобретения, по меньшей мере часть изопрена удалена из этой системы. В некоторых вариантах изобретения, указанная система включает газовую фазу, содержащую изопрен. В различных вариантах изобретения, указанная газовая фаза содержит любую из описанных здесь композиций.

В одном из своих аспектов, настоящее изобретение относится к шинам, содержащим полиизопрен. В некоторых вариантах изобретения, полиизопрен получают путем (i) полимеризации изопрена в любой из описанных здесь композиций или (ii) полимеризации изопрена, регенерированного из любых описанных здесь композиций. В некоторых вариантах изобретения, полиизопрен включает цис-1,4-полиизопрен.

В некоторых вариантах любых композиций, систем и способов согласно изобретению изопрен продуцируется в газовой фазе в апирогенных концентрациях. В некоторых вариантах изобретения, газовая фаза содержит примерно менее чем 9,5% (по объему) кислорода. В некоторых вариантах изобретения, газовая фаза содержит более чем или примерно 9,5% (по объему) кислорода, а концентрация изопрена в газовой фазе ниже нижнего предела воспламеняемости или выше верхнего предела воспламеняемости. В некоторых вариантах изобретения, часть газовой фазы, не являющейся изопреном, содержит примерно от 0% до 100% (по объему) кислорода, например, примерно от 10% до 100% (по объему) кислорода. В некоторых вариантах изобретения, часть газовой фазы, не являющейся изопреном, содержит примерно от 0% до 99% (по объему) азота. В некоторых вариантах изобретения, часть газовой фазы, не являющейся изопреном, содержит примерно от 1% до 50% (по объему) CO₂.

В некоторых вариантах любого из аспектов изобретения, клеточные культуры продуцируют изопрен в количествах, превышающих или примерно составляющих 400 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1250, 1500, 1750, 2000, 2500, 3000, 4000, 5000 или более нмоль/г_wcm/час изопрена. В некоторых вариантах любого из аспектов изобретения, клеточные культуры превращают более чем или примерно 0,002, 0,005, 0,01, 0,02, 0,05, 0,1, 0,12, 0,14, 0,16, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1,0, 1,2, 1,4, 1,6% или более углерода в клеточной культуральной среде в изопрен. В некоторых вариантах любого из аспектов изобретения, клеточные культуры продуцируют изопрен в количествах, превышающих или примерно составляющих 1, 10, 25, 50, 100, 150, 200, 250, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1250, 1500, 1750, 2000, 2500, 3000, 4000, 5000, 10000, 100000 или более нг изопрена/грамм сырой массы клеток/час (нг/г_wcm/ч). В некоторых вариантах любого из аспектов изобретения, клеточные культуры продуцируют кумулятивный титр (общее количество) изопрена, превышающий или составляющий примерно 1, 10, 25, 50, 100, 150, 200, 250, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1250, 1500, 1750, 2000, 2500, 3000, 4000, 5000, 10000, 50000, 100000 или более мг изопрена/л бульона (мг/л_{бульона}, где объем бульона включает объем клеток и клеточной среды). Другие репрезентативные уровни продуцирования изопрена и общее количество продуцируемого изопрена описаны в настоящей заявке.

В некоторых вариантах любого из аспектов изобретения, клетки также содержат гетерологичную нуклеиновую кислоту, кодирующую полипептид IDI. В некоторых вариантах любого из аспектов изобретения, клетки также содержат встроенную копию эндогенной нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид IDI. В некоторых вариантах любого из аспектов изобретения, клетки также содержат гетерологичную нуклеиновую кислоту, кодирующую полипептид DXS. В некоторых вариантах любого из аспектов изобретения, клетки также содержат встроенную копию эндогенной нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид DXS. В некоторых вариантах любого из аспектов изобретения, клетки также содержат одну или более нуклеиновых кислот, кодирующих полипептид IDI и полипептид DXS. В некоторых вариантах любого из аспектов изобретения, одна нуклеиновая кислота кодирует полипептид изопренсинтазы, полипептид IDI и полипептид DXS. В некоторых вариантах любого из аспектов изобретения, один вектор кодирует полипептид изопренсинтазы, полипептид IDI и полипептид DXS. В некоторых вариантах изобретения, указанный вектор содержит селективный маркер, такой как нуклеиновая кислота, резистентная к антибиотикам.

В некоторых вариантах любого из аспектов изобретения, гетерологичная нуклеиновая кислота изопренсинтазы функционально присоединена к промотору T7, такому как промотор T7, содержащийся в среднекопийной или высококопийной плазмиде. В некоторых вариантах любого из аспектов изобретения, гетерологичная нуклеиновая кислота изопренсинтазы функционально присоединена к промотору Trc, такому как промотор Trc, содержащийся в среднекопийной или высококопийной плазмиде. В некоторых вариантах любого из аспектов изобретения, гетерологичная нуклеиновая кислота изопренсинтазы функционально присоединена к промотору Lac, такому как промотор Lac, содержащийся в низкокопийной плазмиде. В некоторых вариантах любого из аспектов изобретения, гетерологичная нуклеиновая кислота изопренсинтазы функционально присоединена к эндогенному промотору, такому как эндогенный промотор щелочной сериновой протеазы. В некоторых вариантах изобретения, гетерологичная нуклеиновая кислота изопренсинтазы интегрируется в хромосому клеток без селективного маркера.

В некоторых вариантах изобретения, одна или более нуклеиновых кислот пути MVA, а также нуклеиновых кислот IDI, DXP или изопренсинтазы находятся под контролем промотора или фактора, который является более активным в стационарной фазе, чем в фазе роста. Так, например, одна или более нуклеиновых кислот пути MVA, а также нуклеиновых кислот IDI, DXP или изопренсинтазы могут находиться под контролем фактора сигма в стационарной фазе, такого как RpoS. В некоторых вариантах изобретения, одна или более нуклеиновых кислот пути MVA, а также нуклеиновых кислот IDI, DXP или изопренсинтазы находятся под контролем промотора, который является индуцибельным в стационарной фазе, такого как промотор, индуцируемый регулятором ответа, который является активным в стационарной фазе.

В некоторых вариантах любого из аспектов изобретения, по меньшей мере часть клеток сохраняет гетерологичную нуклеиновую кислоту изопренсинтазы в процессах по меньшей мере или примерно 5, 10, 20, 40, 50, 60, 65 или более делений клеток в непрерывной культуре (такой как непрерывная культура без разведения). В некоторых вариантах любого из аспектов изобретения, нуклеиновая кислота, содержащая нуклеотидную последовательность изопренсинтазы, IDI или DXS, также включает селективный маркер, такой как нуклеиновая кислота, резистентная к антибиотикам.

В некоторых вариантах любого из аспектов изобретения, клетки также содержат гетерологичную нуклеиновую кислоту, кодирующую полипептид пути MVA (такой как полипептид пути MVA от Saccharomyces cerevisia или Enterococcus faecalis). В некоторых вариантах любого из аспектов изобретения, клетки содержат встроенную копию эндогенной нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид пути MVA (такой как полипептид пути MVA от Saccharomyces cerevisia или Enterococcus faecalis). В некоторых вариантах любого из аспектов изобретения, клетки также содержат нуклеиновую кислоту изопренсинтазы, DXS и пути MVA. В некоторых вариантах любого из аспектов изобретения, клетки содержат нуклеиновую кислоту изопренсинтазы, нуклеиновую кислоту DXS, нуклеиновую кислоту IDI и нуклеиновую кислоту пути MVA (в добавление к нуклеиновой кислоте IDI).

В некоторых вариантах любого из аспектов изобретения, полипептидом изопренсинтазы является природный полипептид, выделенный из растения, такого как пуэрария (например, Pueraria montana или Pueraria lobata).

В некоторых вариантах любого из аспектов изобретения, указанными клетками являются бактериальные клетки, такие как грам-положительные бактериальные клетки (например, клетки Bacillus, такие как клетки Bacillus subtilis или клетки Streptomyces, такие как клетки Streptomyces lividans, Streptomyces coelicolor или Streptomyces griseus). В некоторых вариантах любого из аспектов изобретения, указанными клетками являются грам-отрицательные бактериальные клетки, (например, клетки Escherichia, такие как клетки Escherichia coli или Pantoea, такие как Pantoea citrea). В некоторых вариантах любого из аспектов изобретения, указанными клетками являются клетки грибов, такие как клетки нитчатых грибов (например, клетки Trichoderma, такие как клетки Trichoderma reesei или клетки Aspergillus, такие как Aspergillus oryzae и Aspergillus niger) или дрожжевые клетки (например, клетки Yarrowia, такие как клетки Yarrowia lipolytica).

В некоторых вариантах любого из аспектов изобретения, источник углерода микробного полипептида включает один или более полипептидов, выделенных из дрожжей или бактерий. В некоторых вариантах любого из аспектов изобретения, источник углерода растительного полипептида включает один или более полипептидов, выделенных из сои, кукурузы, канолы, ятропы, пальмы, арахиса, подсолнечника, кокосового ореха, горчицы, рапса, семян хлопчатника, косточек плодов пальмы, маслин, сафлора, кунжута или семян льна.

В одном из своих аспектов, настоящее изобретение относится к продукту, продуцируемому с использованием любой из композиций или с применением любых способов согласно изобретению.

Краткое описание графического материала

На фигуре 1 представлена нуклеотидная последовательность гена изопренсинтазы пуэрарии, оптимизированная по кодонам для экспрессии в E.coli (SEQ ID NO:1). Старт-кодон показан курсивом, стоп-кодон выделен жирным шрифтом, а добавленный PstI-сайт подчеркнут.

На фигуре 2 представлена карта pTrcKudzu.

На фигуре 3 представлена нуклеотидная последовательность pTrcKudzu (SEQ ID NO:2). Сайт связывания с рибосомой (RBS) подчеркнут, старт-кодон изопренсинтазы пуэрарии показан заглавными буквами жирным шрифтом, а стоп-кодон показан заглавными буквами, выделенными жирным курсивом. Остовом этого вектора является pTrcHis2B.

На фигуре 4 представлена карта pETNHisKudzu.

На фигуре 5 представлена нуклеотидная последовательность pETNHisKudzu (SEQ ID NO:5).

На фигуре 6 представлена карта pCL-lac-Kudzu.

На фигуре 7 представлена нуклеотидная последовательность pCL-lac-Kudzu (SEQ ID NO:7).

На фигуре 8А представлен график, иллюстрирующий продуцирование изопрена в клетках E.coli BL21, не содержащих вектора.

На фигуре 8В представлен график, иллюстрирующий продуцирование изопрена в клетках E.coli BL21, содержащих вектор pCL-lac-Kudzu.

На фигуре 8С представлен график, иллюстрирующий продуцирование изопрена в клетках E.coli BL21, содержащих вектор pTrcKudzu.

На фигуре 8D представлен график, иллюстрирующий продуцирование изопрена в клетках E.coli BL21, содержащих вектор pETN-HisKudzu.

На фигуре 9А представлен график, иллюстрирующий OD в процессе ферментации E.coli BL21/pTrcKudzu в 14-литровом ферментере с периодической культурой с подпиткой.

На фигуре 9В представлен график, иллюстрирующий продуцирование изопрена в процессе ферментации E.coli BL21/pTrcKudzu в 14-литровом ферментере с периодической культурой с подпиткой.

На фигуре 10A представлен график, иллюстрирующий продуцирование изопрена в Panteoa citrea. Контрольные клетки не содержали рекомбинантной изопренсинтазы пуэрарии. Серые ромбы представляют синтез изопрена, а черные квадраты представляют OD₆₀₀.

На фигуре 10B представлен график, иллюстрирующий продуцирование изопрена в Panteoa citrea, экспрессирующей pCL-lac-Kudzu. Серые ромбы представляют синтез изопрена, а черные квадраты представляют OD₆₀₀.

На фигуре 10C представлен график, иллюстрирующий продуцирование изопрена в Panteoa citrea, экспрессирующей pTrcKudzu. Серые ромбы представляют синтез изопрена, а черные квадраты представляют OD₆₀₀.

На фигуре 11 представлен график, иллюстрирующий продуцирование изопрена в клетках Bacillus subtilis, экспрессирующих рекомбинантную изопренсинтазу. BG3594comK представляет собой штамм B. subtilis, не содержащий плазмиды (продуцирующий нативный изопрен). CF443-BG3594comK представляет собой штамм B. subtilis, содержащий pBSKudzu (продуцирующий рекомбинантный изопрен). IS на оси Y означает изопрен.

На фигуре 12 представлена нуклеотидная последовательность pBS Kudzu #2 (SEQ ID NO:57).

На фигуре 13 представлена нуклеотидная последовательность изопренсинтазы пуэрарии, оптимизированная по кодонам для экспрессии в Yarrowia (SEQ ID NO: 8).

На фигуре 14 представлена карта плазмиды pTrex3g, содержащей ген изопренсинтазы пуэрарии, оптимизированный по кодонам для экспрессии в Yarrowia.

На фигуре 15 представлена нуклеотидная последовательность вектора pSPZ1(MAP29Spb) (SEQ ID NO:11).

На фигуре 16 представлена нуклеотидная последовательность синтетического гена изопрена пуэрарии (Pueraria montana), оптимизированного по кодонам для экспрессии в Yarrowia (SEQ ID NO: 12).

На фигуре 17 представлена нуклеотидная последовательность синтетического гена изопренсинтазы гибридного тополя (Populus alba x Populus tremula) (SEQ ID NO: 13). Старт-кодон ATG выделен жирным шрифтом, а стоп-кодон подчеркнут.

На фигуре 18A схематически представлен план конструирования векторов pYLA1, pYL1 и pYL2.

На фигуре 18B схематически представлен план конструирования вектора pYLA(POP1).

На фигуре 18С схематически представлен план конструирования вектора pYLA(KZ1).

На фигуре 18D схематически представлен план конструирования вектора pYLI(KZ1).

На фигуре 18E схематически представлен план конструирования вектора pYLI(MAP29).

На фигуре 18F схематически представлен план конструирования вектора pYLA(MAP29).

На фигуре 19 представлены метаболические пути MVA и DXP для изопрена (на основе публикации F. Bouvier et al., Progress in Lipid Res. 44: 357-429, 2005). Нижеследующее описание включает альтернативные названия для каждого полипептида в путях метаболизма, и работы, в которых описан анализ для измерения активности указанного полипептида (каждая из этих работ во всей своей полноте вводится в настоящее описание посредством ссылки, в частности, в описание анализов на полипептидную активность полипептидов, участвующих в путях MVA и DXP). Мевалонатный путь: AACT; ацетил-CoA-ацетилтрансфераза, MvaE, EC 2.3.1.9. Анализ: J. Bacteriol., 184: 2116-2122, 2002; HMGS; гидроксиметилглутарил-CoA-синтаза, MvaS, EC 2.3.3.10. Анализ: J. Bacteriol., 184: 4065-4070, 2002; HMGR; 3-гидрокси-3-метилглутарил-CoA-редуктаза, MvaE, EC 1.1.1.34. Анализ: J. Bacteriol., 184: 2116-2122, 2002; MVK; мевалонат-киназа, ERG12, EC 2.7.1.36. Анализ: Curr Genet 19:9-14, 1991. PMK; фосфомевалонат-киназа, ERG8, EC 2.7.4.2, Анализ: Mol. Cell Biol, 11:620-631, 1991; DPMDC; дифосфомевалонат-декарбоксилаза, MVD1, EC 4.1.1.33. Анализ: Biochemistry, 33:13355-13362, 1994; IDI; изопентенилдифосфат-дельта-изомераза, IDI1, EC 5.3.3.2. Анализ: J. Biol. Chem. 264:19169-19175, 1989. Путь DXР: DXS; 1-дезоксиксилулозо-5-фосфатсинтаза, dxs, EC 2.2.1.7. Анализ: PNAS, 94:12857-62, 1997; DXR; 1-дезокси-D-ксилулозо-5-фосфатредуктоизомераза, dxr, EC 2.2.1.7. Анализ: Eur. J. Biochem. 269:4446-4457, 2002; MCT; 4-дифосфоцитидил-2C-метил-D-эритритолсинтаза, IspD, EC 2.7.7.60. Анализ: PNAS, 97: 6451-6456, 2000; CMK; 4-дифосфоцитидил-2-C-метил-D-эритритолкиназа, IspE, EC 2.7.1.148. Анализ: PNAS, 97:1062-1067, 2000; MCS; 2C-метил-D-эритритол-2,4-циклодифосфатсинтаза, IspF, EC 4.6.1.12. Анализ: PNAS, 96:11758-11763, 1999; HDS; 1-гидрокси-2-метил-2-(E)-бутенил-4-дифосфатсинтаза, ispG, EC 1.17.4.3. Анализ: J. Org. Chem., 70:9168-9174, 2005; HDR; 1-гидрокси-2-метил-2-(E)-бутенил-4-дифосфатредуктаза, IspH, EC 1.17.1.2. Анализ: JACS, 126:12847-12855, 2004.

На фигуре 20 представлен график, иллюстрирующий результаты ЖХ-МС-анализа продуцирования изопрена рекомбинантными штаммами Y. lipolytica в отсутствии (слева) или в присутствии (справа) гена изопренсинтазы пуэрарии. Стрелками показано время элюирования аутентичного стандартного изопрена.

На фигуре 21 представлена карта pTrcKudzu yIDI DXS Kan.

На фигуре 22 представлена нуклеотидная последовательность pTrcKudzu yIDI DXS Kan (SEQ ID NO:20).

На фигуре 23A представлен график, иллюстрирующий продуцирование изопрена из глюкозы в BL21/pTrcKudzukan. Время 0 представляет собой время IPTG-индуцирования (400 мкмоль). На оси Х представлено время после индуцирования, на оси Y представлена OD₆₀₀, а на оси Y2 представлена общая продуцируемость изопрена (мкг/л зоны «хэдспейс» или удельная продуцируемость (мкг/л зоны «хэдспейс»/OD)). Ромбы означают OD₆₀₀, кружки означают общую продуцируемость изопрена (мкг/л), а квадраты означают удельное продуцирование изопрена (мкг/л/OD).

На фигуре 23B представлен график, иллюстрирующий продуцирование изопрена из глюкозы в BL21/pTrcKudzu yIDI kan. Время 0 представляет собой время IPTG-