Способ получения белка

Способ получения белка

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Область техники изобретения

Данное изобретение относится к способу получения представляющего интерес белка, включающему введение вектора экспрессии белка, который включает генный фрагмент, содержащий ДНК, кодирующую представляющий интерес белок, и ген селектируемого маркера, а также транспозонные последовательности на обоих концах генного фрагмента, в суспензионную клетку млекопитающего; интегрирование генного фрагмента, вставленного между парой транспозонных последовательностей, в хромосому клетки млекопитающего для получения клетки млекопитающего, способной экспрессировать представляющий интерес белок; и суспензионное культивирование клетки млекопитающего; при этом суспензионная клетка млекопитающего способна экспрессировать представляющий интерес белок.

Уровень техники изобретения

Получение экзогенных белков методами рекомбинантной ДНК используется в различных отраслях промышленности, таких как фармацевтическая и пищевая промышленность. В большинстве случаев получение рекомбинантных белков осуществляют путем введения вектора экспрессии, содержащего нуклеотидную последовательность, кодирующую представляющий интерес белок, в хозяина, такого как Escherichia coli, дрожжи, клетка насекомого, растительная клетка и животная клетка, отбора трансформанта, в котором вектор экспрессии интегрирован в хромосому, с последующим культивированием клеточной линии в соответствующих условиях культивирования.

Однако для создания хозяина, способного эффективно продуцировать экзогенный белок, необходимо выбрать клетку-хозяина, обладающую хорошей производительностью для каждого представляющего интерес белка, вследствие этого необходимы дальнейшие технические инновации в области методов производства экзогенных белков в отдельных хозяевах.

В бактериальных системах, таких как Escherichia coli, и дрожжевых системах, отличающихся от животных клеток, во многих случаях трудно добиться пост-трансляционных модификаций, таких как модификация сахарных цепей, в результате чего возникает проблема с получением белка, обладающего активностью.

Поскольку в системе клеток насекомых полученный белок подвергается пост-трансляционной модификации, такой как фосфорилирование и добавление сахарных цепей, такая система имеет то преимущество, что может экспрессироваться белок, обладающий присущей ему физиологической активностью. Однако, поскольку структура сахарной цепи секретируемого белка отличается от таковой в клетках млекопитающих, антигенность и тому подобное становится проблемой, если белок используют в фармацевтических целях.

Кроме того, поскольку при введении экзогенного гена в системе клеток насекомых используют рекомбинантный вирус, существует проблема его инактивации, и сдерживание вируса необходимо с точки зрения безопасности.

В системе животных клеток пост-трансляционные модификации, такие как фосфорилирование, добавление сахарных цепей и сворачивание, можно осуществлять с белками, происходящими из высших животных, включая человека, более простым способом, чем при их продукции в живом организме. Такие точные пост-трансляционные изменения необходимы для воссоздания в этом рекомбинантном белке физиологической активности, изначально присущей белку, и система продукции белка, в которой используют клетку млекопитающего в качестве хозяина, обычно применяется для фармацевтической продукции и тому подобного, где необходима такая физиологическая активность.

Однако система экспрессии белков, в которой используют в качестве хозяина клетку млекопитающего, как правило, отличается низкой производительностью, и во многих случаях существует проблема стабильности введенных генов. Повышение уровня продукции белка при использовании культуры клеток млекопитающих в качестве хозяев не только имеет большую важность для производства лекарственных средств, диагностических реагентов и тому подобного, но также вносит значительный вклад в их исследование и разработку. Таким образом, необходимо в срочном порядке разработать систему экспрессии генов, которая легко позволяет получать клеточную линию с высокой продуктивностью при использовании культуры клеток млекопитающего, в частности, клеток яичника китайского хомячка (клетки CHO), в качестве хозяина.

Транспозон представляет собой мобильный генетический элемент, который может перемещаться из одного локуса в другой локус на хромосоме. Транспозон является мощным инструментом исследования в области молекулярной биологии и генетики и используется для таких целей, как мутагенез, захват генов и получение трансгенных организмов, у насекомых или нематод (например, Drosophila melanogaster или Caenorhabditis elegans) и растений. Однако разработка такой методики для позвоночных животных, включая клетки млекопитающих, отстает.

Тем не менее, в последнее время сообщали о транспозонах, обладающих активностью также у позвоночных животных, и, как показано, некоторые из них обладают активностью в клетках млекопитающих, например, в клетках мыши и человека. Типичные примеры включают транспозоны Tol1 (патентная ссылка 1) и Tol2 (непатентная ссылка 1), клонированные из оризии (рыба семейства карпозубых), транспозон «спящая красавица», восстановленный из неавтономного транспозона, существующего в геноме рыбы Onchorhynchus (непатентная ссылка 2), искусственный транспозон «лягушачий принц» (непатентная ссылка 3) из лягушки и транспозон piggyBac (непатентная ссылка 4) из насекомых.

Эти ДНК-транспозоны использовали для мутагенеза, захвата генов, получения трансгенных организмов, экспрессии белков устойчивости к лекарственным средствам, и тому подобного, в качестве инструмента переноса генов для привнесения нового фенотипа в геном клетки млекопитающего (непатентные ссылки 5-12).

В случае насекомых изучен метод, в котором экзогенный ген вводят в хромосому шелкопряда при помощи транспозона piggyBac из чешуекрылого насекомого для экспрессии белка, кодируемого указанным экзогенным геном, и описан способ продукции белка с использованием вышеуказанного метода (патентная ссылка 2).

Однако, поскольку уровень экспрессии экспрессируемого представляющего интерес белка недостаточен и он продуцируется во всем организме шелкопряда, возникает экономическая проблема из-за необходимости передовой технологии очистки для извлечения экспрессированного экзогенного белка в высокоочищенном виде из жидкости организма, содержащей большое количество посторонних белков.

Кроме того, известен пример, когда белок, связанный с устойчивостью к G418, экспрессировали в клетке млекопитающего при помощи транспозона Tol2 из оризии (непатентная ссылка 12).

Список литературы

Патентная литература

Патентная литература 1 WO2008/072540

Патентная литература 2 Японская опубликованная нерассмотренная патентная заявка № 2001-532188

Непатентная литература

Непатентная литература 1 Nature, 383, 30 (1996)

Непатентная литература 2 Cell, 91, 501-510 (1997)

Непатентная литература 3 Nucleic Acids Res, 31, 6873-6881 (2003)

Непатентная литература 4 Insect Mol. Biol., 5, 141-151 (1996)

Непатентная литература 5 Genetics, 166, 895-899 (2004)

Непатентная литература 6 PLoS Genet, 2, e169 (2006)

Непатентная литература 7 Proc. Natl Acad. Sci. USA 95, 10769-10773 (1998)

Непатентная литература 8 Proc. Natl. Acad Sci. USA 98, 6759-6764 (2001)

Непатентная литература 9 Nature 436, 221-226 (2005)

Непатентная литература 10 Nucleic Acids Res., 31, 6873-6881 (2003)

Непатентная литература 11 Nucleic Acids Res., 35, e87 (2007)

Непатентная литература 12 Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 103, 15008-15013 (2006).

Сущность изобретения

Техническая проблема

Для получения и анализа представляющего интерес белка необходимо выбрать клеточную линию, которая стабильно и на высоком уровне экспрессирует представляющий интерес белок, используя культуру клеток млекопитающего, однако получение и культивирование клетки, продуцирующей представляющий интерес белок, потребует значительных затрат труда и времени.

Кроме того, хотя известно, что представляющий интерес белок экспрессируется в клетке млекопитающего при помощи транспозонной последовательности, получение клетки, которая способна на высоком уровне экспрессировать представляющий интерес белок и, следовательно, может быть использована в качестве системы продукции белка при помощи транспозонной последовательности; способ получения клетки млекопитающего, которая способна на высоком уровне продуцировать представляющий интерес белок при помощи транспозонной последовательности; а также способ получения белка при помощи такой клетки остаются неизвестными.

Как описано выше, существует потребность в экспрессии представляющего интерес белка в больших количествах путем создания системы продукции белка, способной эффективно и за короткое время продуцировать на высоком уровне представляющий интерес белок с использованием культуры клеток млекопитающего. Таким образом, целью изобретения является получение клетки, способной на высоком уровне экспрессировать представляющий интерес белок, которую можно эффективно переводить в культуру, а также способ получения представляющего интерес белка с помощью такой клетки.

Способ решения проблем

Для решения вышеуказанных проблем авторы настоящего изобретения провели интенсивные исследования и в результате обнаружили, что клетку млекопитающего, способную на высоком уровне экспрессировать представляющий интерес белок, можно эффективно получать путем введения вектора экспрессии белка, включающего генный фрагмент, содержащий ДНК, кодирующую представляющий интерес белок, и ген селектируемого маркера, а также транспозонные последовательности на обоих концах генного фрагмента, в суспензионную клетку млекопитающего; и интегрирования генного фрагмента, вставленного между парой (двумя) транспозонных последовательностей, в хромосому клетки млекопитающего. Кроме того, было установлено, что представляющий интерес белок можно эффективно продуцировать при помощи такой клетки, и, таким образом, было совершено изобретение.

Подробное описание изобретения

В частности, изобретение состоит в следующем:

1. Способ получения представляющего интерес белка, включающий введение вектора экспрессии белка, который включает генный фрагмент, содержащий ДНК, кодирующую представляющий интерес белок, и ген селектируемого маркера, а также транспозонные последовательности на обоих концах генного фрагмента, в суспензионную клетку млекопитающего; интегрирование генного фрагмента, вставленного между парой транспозонных последовательностей, в хромосому клетки млекопитающего для получения клетки млекопитающего, способной экспрессировать представляющий интерес белок; и суспензионное культивирование клетки млекопитающего;

2. Способ получения представляющего интерес белка, включающий следующие этапы от (A) до (C):

(A) этап одновременного введения следующих векторов экспрессии (a) и (b) в суспензионную клетку млекопитающего:

(a) вектор экспрессии, включающий генный фрагмент, содержащий ДНК, кодирующую представляющий интерес белок, и транспозонные последовательности на обоих концах генного фрагмента,

(b) вектор экспрессии, содержащий ДНК, кодирующую транспозазу, которая распознает транспозонные последовательности и обладает активностью переноса генного фрагмента, вставленного между парой транспозонных последовательностей, в хромосому,

(B) этап временной экспрессии транспозазы с вектора экспрессии, введенного на этапе (A), для интегрирования генного фрагмента, вставленного между парой транспозонных последовательностей, в хромосому клетки млекопитающего для получения суспензионной клетки млекопитающего, способной экспрессировать представляющий интерес белок, и

(C) этап суспензионного культивирования суспензионной клетки млекопитающего, способной экспрессировать представляющий интерес белок, полученной на этапе (B), для получения представляющего интерес белка;

3. Способ получения суспензионной клетки млекопитающего, способной экспрессировать представляющий интерес белок, включающий введение вектора экспрессии белка, который включает генный фрагмент, содержащий ДНК, кодирующую представляющий интерес белок, и ген селектируемого маркера, а также транспозонные последовательности на обоих концах генного фрагмента, в суспензионную клетку млекопитающего; и интегрирование генного фрагмента, вставленного между парой транспозонных последовательностей, в хромосому клетки млекопитающего;

4. Способ, описанный в любом из вышеуказанных пунктов 1-3, в котором суспензионная клетка млекопитающего представляет собой клетку, способную выживать и пролиферировать в бессывороточной среде;

5. Способ, описанный в любом из вышеуказанных пунктов 1-4, в котором суспензионная клетка млекопитающего представляет собой по меньшей мере одну клетку, выбранную из суспензионной клетки CHO, адаптированной к суспензионному культивированию, клетки PER.C6, клетки крысиной миеломы YB2/3HL.P2.G11.16Ag.20 (или также называемой YB2/0) и суспензионной клетки мышиной миеломы NS0, адаптированной к суспензионному культивированию;

6. Способ, описанный в вышеуказанном пункте 5, в котором клетка CHO представляет собой по меньшей мере одну клетку, выбранную из CHO-K1, CHO-K1SV, DUKXB11, CHO/DG44, Pro-3 и CHO-S;

7. Способ, описанный в любом из вышеуказанных пунктов 1-6, в котором ген селектируемого маркера представляет собой ген устойчивости к циклогексимиду;

8. Способ, описанный в вышеуказанном пункте 7, в котором ген устойчивости к циклогексимиду представляет собой ген, кодирующий мутант человеческого рибосомного белка L36a;

9. Способ, описанный в вышеуказанном пункте 8, в котором мутант представляет собой мутант, в котором пролин в положении 54 человеческого рибосомного белка L36a заменен на другую аминокислоту;

10. Способ, описанный в вышеуказанном пункте 9, в котором другая аминокислота представляет собой глутамин;

11. Способ, описанный в любом из вышеуказанных пунктов 1-10, в котором пара транспозонных последовательностей представляет собой нуклеотидные последовательности, происходящие из пары транспозонов ДНК-типа, функционирующих в клетке млекопитающего;

12. Способ, описанный в вышеуказанном пункте 11, в котором нуклеотидные последовательности, происходящие из пары транспозонов ДНК-типа, представляют собой нуклеотидные последовательности, происходящие из пары транспозонов Tol1, или нуклеотидные последовательности, происходящие из пары транспозонов Tol2;

13. Способ, описанный в вышеуказанном пункте 12, в котором нуклеотидные последовательности, происходящие из пары транспозонов Tol2, представляют собой нуклеотидную последовательность, содержащую нуклеотидную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 2, и нуклеотидную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 3;

14. Способ, описанный в вышеуказанном пункте 12, в котором нуклеотидные последовательности, происходящие из пары транспозонов Tol1, представляют собой нуклеотидную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 14, и нуклеотидную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 15;

15. Суспензионная клетка млекопитающего, способная продуцировать представляющий интерес белок, в которую введен вектор экспрессии белка, включающий генный фрагмент, содержащий ДНК, кодирующую представляющий интерес белок, и ген селектируемого маркера, а также транспозонные последовательности на обоих концах генного фрагмента, для интегрирования генного фрагмента, вставленного между парой транспозонных последовательностей, в хромосому;

16. Суспензионная клетка млекопитающего, способная продуцировать представляющий интерес белок, в которую введен вектор экспрессии (a), включающий генный фрагмент, содержащий ДНК, кодирующую представляющий интерес белок, и ген селектируемого маркера, а также транспозонные последовательности на обоих концах генного фрагмента, и вектор экспрессии (b), содержащий ДНК, кодирующую транспозазу (трансферазу), которая распознает транспозонные последовательности и обладает активностью переноса генного фрагмента, вставленного между парой транспозонных последовательностей, в хромосому для интегрирования генного фрагмента, вставленного между парой транспозонных последовательностей, в хромосому;

17. Клетка, описанная в вышеуказанном пункте 15 или 16, способная выживать и пролиферировать в бессывороточной среде;

18. Клетка, описанная в любом из вышеуказанных пунктов 15-17, представляющая собой по меньшей мере одну суспензионную клетку млекопитающего, выбранную из суспензионной клетки CHO, при этом клетка CHO адаптирована к суспензионному культивированию, клетки PER.C6, клетки крысиной миеломы YB2/3HL.P2.G11.16Ag.20 (или также называемой YB2/0) и суспензионной клетки мышиной миеломы NS0, адаптированной к суспензионному культивированию;

19. Клетка, описанная в вышеуказанном пункте 18, где клетка СНО представляет собой по меньшей мере одну клетку, выбранную из CHO-K1, CHO-K1SV, DUKXB11, CHO/DG44, Pro-3 и CHO-S;

20. Клетка, описанная в любом из вышеуказанных пунктов 15-19, в которой ген селектируемого маркера представляет собой ген устойчивости к циклогексимиду;

21. Клетка, описанная в вышеуказанном пункте 20, в которой ген устойчивости к циклогексимиду представляет собой ген, кодирующий мутант человеческого рибосомного белка L36a;

22. Клетка, описанная в вышеуказанном пункте 21, в которой мутант представляет собой мутант, в котором пролин в положении 54 человеческого рибосомного белка L36a заменен на другую аминокислоту;

23. Клетка, описанная в вышеуказанном пункте 22, в которой другая аминокислота представляет собой глутамин;

24. Клетка, описанная в любом из вышеуказанных пунктов 15-23, в которой пара транспозонных последовательностей представляет собой нуклеотидные последовательности, происходящие из пары транспозонов ДНК-типа, функционирующих в клетке млекопитающего;

25. Клетка, описанная в вышеуказанном пункте 24, в которой нуклеотидные последовательности, происходящие из пары транспозонов ДНК-типа, представляют собой нуклеотидные последовательности, происходящие из пары транспозонов Tol1, или нуклеотидные последовательности, происходящие из пары транспозонов Tol2;

26. Клетка, описанная в вышеуказанном пункте 25, в которой нуклеотидные последовательности, происходящие из пары транспозонов Tol2, представляют собой нуклеотидную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 2, и нуклеотидную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 3;

27. Клетка, описанная в вышеуказанном пункте 25, в которой нуклеотидные последовательности, происходящие из пары транспозонов Tol1, представляют собой нуклеотидную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 14, и нуклеотидную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 15;

28. Вектор экспрессии белка, включающий генный фрагмент, содержащий ДНК, кодирующую представляющий интерес белок, и ген селектируемого маркера, а также транспозонные последовательности на обоих концах генного фрагмента;

29. Вектор экспрессии белка, описанный в вышеуказанном пункте 28, в котором пара транспозонных последовательностей представляет собой нуклеотидные последовательности, происходящие из пары транспозонов Tol1, или нуклеотидные последовательности, происходящие из пары транспозонов Tol2;

30. Вектор экспрессии белка, описанный в вышеуказанном пункте 29, в котором нуклеотидные последовательности, происходящие из пары транспозонов Tol2, представляют собой нуклеотидную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 2, и нуклеотидную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 3; и

31. Вектор экспрессии белка, описанный в вышеуказанном пункте 29, в котором нуклеотидные последовательности, происходящие из пары транспозонов Tol1, представляют собой нуклеотидную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 14, и нуклеотидную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 15.

Полезные эффекты изобретения

В соответствии со способом получения белка по изобретению можно эффективно продуцировать представляющий интерес белок, используя клетку млекопитающего. Кроме того, клетку по изобретению можно использовать в качестве продуцирующей белок клетки для производства рекомбинантного белка с высокой эффективностью.

Краткое описание чертежей

На фигуре 1 представлено схематическое изображение транспозонного вектора для экспрессии антитела против белка M2 вируса гриппа человека. Tol2-L представляет собой левый конец транспозона Tol2 (SEQ ID NO: 2), Tol2-R представляет собой правый конец транспозона Tol2 (SEQ ID NO: 3), CMV представляет собой промотор CMV, поли-A представляет собой сайт полиаденилирования, Hc представляет собой кДНК H-цепи антитела человека, Lc представляет собой кДНК L-цепи антитела человека, и CHX-r представляет собой ген устойчивости к циклогексимиду.

На фигуре 2 представлено схематическое изображение вектора экспрессии антитела против белка M2 вируса гриппа человека. CMV представляет собой промотор CMV, поли-A представляет собой сайт полиаденилирования, Hc представляет собой кДНК H-цепи антитела человека, Lc представляет собой кДНК L-цепи антитела человека, и CHX-r представляет собой ген устойчивости к циклогексимиду.

На фигуре 3 представлено схематическое изображение вектора экспрессии транспозазы Tol2. CAGGS представляет собой промотор CAGGS, поли-A представляет собой сайт полиаденилирования, и кДНК TPазы представляет собой кДНК транспозазы Tol2.

На фигуре 4A представлен результат изучения уровня экспрессии антитела против белка M2 вируса гриппа человека в суспензионной клетке CHO-K1 при использовании транспозонного вектора Tol2 для экспрессии антитела против белка M2 вируса гриппа человека. Ось ординат показывает уровень продукции антитела (мкг/мл), а ось абсцисс показывает число трансгенных клонов суспензионной клетки CHO-K1.

На фигуре 4B представлен результат изучения уровня экспрессии антитела против белка M2 вируса гриппа человека в прикрепляющейся клетке CHO-K1 при использовании транспозонного вектора Tol2 для экспрессии антитела против белка M2 вируса гриппа человека. Ось ординат показывает уровень продукции антитела (мкг/мл), а ось абсцисс показывает число трансгенных клонов прикрепляющейся клетки CHO-K1.

На фигуре 5 представлено схематическое изображение транспозонного вектора Tol1 для экспрессии антитела против белка M2 вируса гриппа человека. Tol1-L представляет собой левый конец транспозона Tol1 (SEQ ID NO: 14), Tol1-R представляет собой правый конец транспозона Tol1 (SEQ ID NO: 15), CMV представляет собой промотор CMV, поли-A представляет собой сайт полиаденилирования, Hc представляет собой кДНК H-цепи антитела человека, Lc представляет собой кДНК L-цепи антитела человека, и CHX-r представляет собой ген устойчивости к циклогексимиду.

На фигуре 6 представлено схематическое изображение вектора экспрессии транспозазы Tol1. CAGGS представляет собой промотор CAGGS, поли-A представляет собой сайт полиаденилирования, и кДНК TPазы представляет собой кДНК транспозазы Tol1.

На фигуре 7 представлен результат изучения уровня экспрессии антитела против белка M2 вируса гриппа человека в суспензионной клетке CHO-K1 при использовании транспозонного вектора Tol1 для экспрессии антитела против белка M2 вируса гриппа человека. Ось ординат показывает уровень продукции антитела (мкг/мл), а ось абсцисс показывает число трансгенных клонов суспензионной клетки CHO-K1.

Данное изобретение относится к способу получения представляющего интерес белка, включающему введение вектора экспрессии белка, который включает генный фрагмент, содержащий ДНК, кодирующую представляющий интерес белок, и ген селектируемого маркера, а также транспозонные последовательности на обоих концах генного фрагмента, в суспензионную клетку млекопитающего; интегрирование генного фрагмента, вставленного между парой (двумя) транспозонных последовательностей, в хромосому клетки млекопитающего для получения клетки млекопитающего, способной экспрессировать указанный представляющий интерес белок; и суспензионное культивирование клетки млекопитающего.

Примеры способа получения представляющего интерес белка по настоящему изобретению включают способ, включающий следующие этапы от (A) до (C):

(A) этап одновременного введения следующих векторов экспрессии (a) и (b) в суспензионную клетку млекопитающего:

(a) вектор экспрессии, включающий генный фрагмент, содержащий ДНК, кодирующую представляющий интерес белок, и транспозонные последовательности на обоих концах генного фрагмента,

(b) вектор экспрессии, содержащий ДНК, кодирующую транспозазу, которая распознает транспозонные последовательности и обладает активностью переноса генного фрагмента, вставленного между парой транспозонных последовательностей, в хромосому,

(B) этап временной экспрессии транспозазы с вектора экспрессии, введенного на этапе (A), для интегрирования генного фрагмента, вставленного между парой транспозонных последовательностей, в хромосому клетки млекопитающего для получения суспензионной клетки млекопитающего, способной экспрессировать представляющий интерес белок, и

(C) этап суспензионного культивирования суспензионной клетки млекопитающего, способной экспрессировать представляющий интерес белок, полученной на этапе (B), для получения представляющего интерес белка.

Кроме того, настоящее изобретение относится к суспензионной клетке млекопитающего, способной продуцировать представляющий интерес белок, в которую введен вектор экспрессии белка, включающий генный фрагмент, содержащий ДНК, кодирующую представляющий интерес белок, и ген селектируемого маркера, а также транспозонные последовательности на обоих концах генного фрагмента, для интегрирования генного фрагмента, вставленного между парой транспозонных последовательностей, в хромосому.

Кроме того, настоящее изобретение относится к суспензионной клетке млекопитающего, способной продуцировать представляющий интерес белок, в которую введен вектор экспрессии (a), включающий генный фрагмент, содержащий ДНК, кодирующую представляющий интерес белок, и ген селектируемого маркера, а также транспозонные последовательности на обоих концах генного фрагмента, и вектор экспрессии (b), содержащий ДНК, кодирующую транспозазу (трансферазу), которая распознает транспозонные последовательности и обладает активностью переноса генного фрагмента, вставленного между парой транспозонных последовательностей, в хромосому для интегрирования генного фрагмента, вставленного между парой транспозонных последовательностей, в хромосому.

Термин «транспозон» в настоящем описании относится к мобильному генетическому элементу и означает генетический фрагмент, который перемещается на хромосоме или из одной хромосомы в другую хромосому (транспозиция), сохраняя при этом определенную структуру.

Транспозон включает генетический фрагмент из повторяющихся транспозонных последовательностей (также называемых последовательностью инвертированного повтора (IR-последовательностью) или последовательностью концевого инвертированного повтора (TIR-последовательностью)), расположенных в прямом или обратном направлении на обоих концах генетического фрагмента, и нуклеотидную последовательность, кодирующую транспозазу, которая распознает транспозонную последовательность, для переноса гена, находящегося между транспозонными последовательностями.

Транспозаза, транслируемая с транспозона, может переносить ДНК путем распознавания транспозонных последовательностей на обоих концах транспозона, вырезания фрагмента ДНК, вставленного между парой транспозонных последовательностей, и встраивания фрагмента в сайт переноса.

Термин «транспозонная последовательность» в данном описании означает нуклеотидную последовательность транспозона, распознаваемую транспозазой, и имеет то же значение, что и IR-последовательность или TIR-последовательность. ДНК, содержащая нуклеотидную последовательность, может содержать несовершенный повторяющийся фрагмент при условии, что он может быть перенесен (встроен в другой участок генома) благодаря активности транспозазы, и включает транспозонную последовательность, специфическую для транспозазы.

Что касается транспозонной последовательности, используемой по изобретению, предпочтительной является нуклеотидная последовательность, происходящая из транспозона ДНК-типа, и более предпочтительной является нуклеотидная последовательность, происходящая из пары природных или искусственных транспозонов ДНК-типа, которые могут распознаваться транспозазой и переноситься в клетках млекопитающих.

Примеры нуклеотидной последовательности, происходящей из транспозона ДНК-типа, включают нуклеотидные последовательности, происходящие из транспозона Tol1 и транспозона Tol2 рыбы оризии, транспозона «спящая красавица», восстановленного из неавтономного транспозона, существующего в геноме рыбы Onchorhynchus, искусственного транспозона «лягушачий принц» из лягушки и транспозона PiggyBac из насекомого.

В частности, среди них предпочтительными являются нуклеотидные последовательности, происходящие из транспозона Tol2 рыбы оризии, содержащие нуклеотидную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 6, и транспозона Tol2 рыбы оризии, содержащие нуклеотидную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 13.

Примеры нуклеотидной последовательности, происходящей из пары транспозонов Tol2, включают нуклеотидную последовательность в положениях 1-2229 и нуклеотидную последовательность в положениях 4148-4682 в нуклеотидной последовательности транспозона Tol2, приведенной в SEQ ID NO: 6 в списке последовательностей.

В качестве нуклеотидной последовательности, происходящей из пары транспозонов Tol2, более предпочтительными являются нуклеотидная последовательность в положениях 1-200 (SEQ ID NO: 2) (далее в данном документе называемая «последовательность Tol2-L») и нуклеотидная последовательность в положениях 2285-2788 (SEQ ID NO: 3) (далее в данном документе называемая «последовательность Tol2-R») в нуклеотидной последовательности транспозона Tol2, приведенной в SEQ ID NO: 1 в списке последовательностей.

Примеры нуклеотидной последовательности, происходящей из пары транспозонов Tol1, включают нуклеотидную последовательность, содержащую нуклеотидную последовательность в положениях 1-157 и нуклеотидную последовательность в положениях 1748-1855 в нуклеотидной последовательности транспозона Tol1, приведенной в SEQ ID NO: 13 в списке последовательностей.

В качестве нуклеотидной последовательности, происходящей из пары транспозонов Tol1, более предпочтительными являются нуклеотидная последовательность в положениях 1-200 (SEQ ID NO: 14) (далее в данном документе называемая «последовательность Tol1-L») и нуклеотидная последовательность в положениях 1351-1855 (SEQ ID NO: 15) (далее в данном документе называемая «последовательность Tol1-R») в нуклеотидной последовательности транспозона Tol2, приведенной в SEQ ID NO: 1 в списке последовательностей.

Примеры транспозонной последовательности для использования по изобретению включают транспозонные последовательности, в случае которых реакции переноса контролируются путем использования частичной последовательности из транспозонной последовательности, происходящей из вышеуказанного транспозона, посредством регулирования длины нуклеотидной последовательности и посредством модификации нуклеотидной последовательности за счет добавления, делеции или замены.

Что касается контроля реакции переноса транспозона, реакция переноса может быть ускорена или замедлена путем ускорения или замедления распознавания транспозонной последовательности транспозазой, соответственно.

Термин «транспозаза» в настоящем описании означает фермент, который распознает нуклеотидные последовательности, имеющие транспозонные последовательности, и переносит ДНК, находящуюся между нуклеотидными последовательностями, в хромосому или из хромосомы в другую хромосому.

Примеры транспозазы включают Tol1 и Tol2 из рыбы оризии, транспозон «спящая красавица», восстановленный из неавтономного транспозона, существующего в геноме рыбы Onchorhynchus, искусственный транспозон «лягушачий принц» из лягушки и транспозон PiggyBac из насекомых.

Что касается транспозазы, можно использовать природный фермент, и можно использовать любую транспозазу, в которой часть аминокислот заменены, делетированы, вставлены и/или добавлены, при условии сохранения такой же способности к переносу, что и у транпозазы. Контролируя ферментативную активность транспозазы, можно контролировать реакцию переноса ДНК, находящейся между транспозонными последовательностями.

Для анализа того, обладает ли фермент активностью переноса, подобной активности транспозазы, ее можно измерять при помощи 2-компонентной аналитической системы, раскрытой в японской опубликованной нерассмотренной патентной заявке № 235575/2003.

Для иллюстрации, может ли неавтономный элемент Tol2 быть перенесен и вставлен в хромосому клетки млекопитающего вследствие активности транспозазы, можно анализировать, используя отдельно плазмиду, содержащую транспозон Tol2, лишенный транспозазы Tol2 (производный от Tol2 неавтономный транспозон), и плазмиду, содержащую транспозазу Tol2.

В настоящем описании термин «неавтономный транспозон» означает транспозон, который утратил транспозазу, находящуюся внутри транспозона, и вследствие этого не способен автономно осуществлять свой перенос. Неавтономный транспозон может переносить ДНК, вставленную между транспозонными последовательностями неавтономного транспозона, в хромосому клетки-хозяина в случае одновременного присутствия в клетке белка транспозазы, мРНК, кодирующей белок транспозазу, или ДНК, кодирующей белок транспозазу.

Ген транспозазы означает ген, кодирующий транспозазу. В целях повышения эффективности его экспрессии в клетке млекопитающего последовательность, которая регулирует пространство между консенсусной последовательностью Козака (Kozak M., Nucleic Acids Res., 12, 857-872 (1984)) или последовательностью связывания рибосомы, последовательностью Шайна-Дальгарно, и инициирующим кодоном до соответствующего расстояния (например, от 6 до 18 оснований), можно присоединять выше по ходу транскрипции от кодона инициации трансляции ATG гена.

В соответствии со способом по изобретению, для того чтобы интегрировать генный фрагмент, содержащий ДНК, кодирующую представляющий интерес белок, и ген селектируемого маркера в векторе экспрессии, в хромосому клетки-хозяина, вектор экспрессии, включающий генный фрагмент, содержащий ДНК, кодирующую представляющий интерес белок, и ген селектируемого маркера, а также транспозонные последовательности на обоих концах генного фрагмента, вводят в клетку-хозяина, и транспозаза получает возможность проявлять активность с вовлечением транспозонных последовательностей, находящихся в векторе экспрессии, введенном в клетку.

Чтобы дать возможность транспозазе проявлять активность с вовлечением транспозонных последовательностей, находящихся в векторе экспрессии, введенном в клетку, транспозазу можно вводить в клетку инъекцией, либо вектор экспрессии, содержащий ДНК, кодирующую транспозазу, можно вводить в клетку-хозяина совместно с вектором экспрессии, содержащим ДНК, кодирующую представляющий интерес белок, и ген селектируемого маркера. Кроме того, транспозаза может экспрессироваться в клетке в результате введения РНК, кодирующей ген транспозазы, в клетку-хозяина.

Вектор экспрессии не имеет конкретных ограничений. Можно использовать любой вектор экспрессии, по желанию выбирая из векторов экспрессии, известных специалистам в данной области, в зависимости от клетки-хозяина, в которую вводят вектор экспрессии, содержащий ген транспозазы, от применения и тому подобного.

Для того чтобы с помощью способа по изобретению получать белок, составленный из двух или более полипептидов, ДНК можно интегрировать в хромосому клетки путем интегрирования ДНК, кодирующей два или более полипептидов, в один и тот же или в разные векторы экспрессии, а затем вводить векторы экспрессии в клетку-хозяина.

Транспозазу можно встраивать в вектор экспрессии для экспрессии совместно с представляющим интерес белком, либо можно встраивать в вектор, отличный от вектора экспрессии. Можно обеспечивать временное проявление активност