Анализ для количественного определения клостридиального нейротоксина

Анализ для количественного определения клостридиального нейротоксина

Реферат

Область техники, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение относится к способу ex vivo определения неизвестной концентрации клостридиального нейротоксина в пробе по отношению к известной концентрации клостридиального токсина в стандартном образце. Способ может включать электрическую стимуляцию мышечных тканей, которые подвергались контакту с указанными образцами, и сравнение соответствующих эффектов, вызванных в указанных мышечных тканях, с определением, таким образом, указанной неизвестной концентрации. Способ также может применяться для оценки относительной активности клостридиального нейротоксина в пробе по отношению к стандартному образцу.

Уровень техники

В последние годы ботулинические нейротоксины стали стандартным средством при лечении фокальных дистоний и спазматических симптомов. Лекарственные препараты выпускаются такими компаниями, как например, Ipsen Ltd. (Dysport^®) или Allergan Inc. (Botox^®). Высокоочищенный нейротоксин, не содержащий других клостридиальных белков, например, выпускает Merz Pharmaceuticals (Xeomin^®). Другой препарат был зарегистрирован компанией Solstice Neurosciences, Inc (Myobloc^®). Еще один препарат был зарегистрирован Mentor Corporation (PurTox^®). Перечисленные препараты либо отличаются по типу используемого ботулинического токсина, либо по биологической эффективности или активности.

Лечение пациентов обычно включает инъекцию нейротоксина в пораженную мышечную ткань с введением средства вблизи нейромышечной концевой пластинки, то есть рядом с клеточным рецептором, который опосредует его поглощение нервной клеткой, контролирующей указанную пораженную мышцу. Наблюдались различные степени распространения нейротоксина. Предполагается, что подобное распространение коррелирует с вводимыми количествами и в частности с вводимым препаратом нейротоксина. В результате распространения могут наблюдаться системные побочные эффекты, вызванные ингибированием секреции ацетилхолина в близкорасположенной мышечной ткани. Случаи непредусмотренной парализации нормальных мышц можно в значительной степени избегать путем уменьшения вводимых доз до терапевтически релевантного уровня. Превышение дозирования также может быть проблемой в отношении иммунной системы пациентов, поскольку введенный нейротоксин может вызывать образование нейтрализующих антител. Если это произойдет, то токсин будет инактивирован с потерей способности к уменьшению непроизвольных сокращений мышц.

Несоответствие эквивалентов дозы или различия в определяемой активности препаратов, таких как коммерческие продукты или партии, произведенные в ходе производственного процесса, создают повышенный риск для пациентов, связанный с возможными побочными эффектами и развитием иммунитета. Таким образом, достоверное (то есть без значимого расхождения) и максимально точное определение концентрации клостридиального нейротоксина, содержащегося в указанных коммерческих продуктах или партиях продуктов, имеет критическое значение при доведении концентрации токсина до подтвержденной эффективной дозы с пользой для пациента. Это также может послужить стимулом для производителей, чтобы они предложили лекарственные формы, обеспечивающие оптимальное использование биологической активности в различных терапевтических целях.

В EP 1597584 B1 предложен способ ex vivo определения количества вещества, блокирующего пресинаптическую нейромышечную передачу, в образце, таком как образец, содержащий ботулинический нейротоксин. Способ включает электрическую стимуляцию мышечной ткани, предпочтительно реберной мышцы мыши, в присутствии образца, содержащего вещество, блокирующее пресинаптическую нейромышечную передачу, и сравнение эффекта, вызванного образцом, с эффектом, вызываемым стандартным веществом, с определением, таким образом, количества вещества, блокирующего пресинаптическую нейромышечную передачу, в образце.

В GB 2416849 A и GB 2398636 A предложен способ ex vivo определения количества вещества, блокирующего пресинаптическую нейромышечную передачу, в образце, таком как образец, содержащий ботулинический нейротоксин. Способ включает электрическую стимуляцию гладкомышечной ткани, предпочтительно реберной мышцы мыши или крысы, в присутствии образца, содержащего вещество, блокирующее пресинаптическую нейромышечную передачу, и сравнение эффекта, вызванного образцом, с эффектом, вызываемым стандартным веществом, с определением, таким образом, количества вещества, блокирующего пресинаптическую нейромышечную передачу, в образце.

В US 2003/0032891 A1 предложен способ in vivo измерения активности вещества, такого как клостридиальный токсин, где указанное вещество вводят млекопитающему, млекопитающее подвергают стимуляции и контролируют рефлекторную реакцию уха указанного млекопитающего на указанную стимуляцию.

В EP 2015065 A1 предложен способ определения количества эффективности нейротоксина, такого как нейротоксин Clostridium, где указанный токсин вводят в заднюю ногу не относящегося к человеку млекопитающего, прикладывают к указанному не относящемуся к человеку млекопитающему электрический стимул, измеряют сокращение указанной задней ноги и сравнивают с сокращением другой задней ноги.

В статье Pearce et al., Toxicon, Vol. 35, No. 9, pp. 1373-1412, 1997, описана пригодность диафрагмального нерва-гемидиафрагмы крысы/мыши для связывания ботулинического нейротоксина.

В статье Wohlfahrt et al., Naunyn-Schmiedeberg's Arch Pharmacol 355, 335-340 (1997) сравнивается эффективность двух коммерческих препаратов ботулинического токсина с применением кривых зависимости эффекта от дозы при использовании диафрагмы мыши.

В статье Chang et al., Naunyn-Schmiedeberg's Arch. Pharmacol. 282, 129-142 (1974) сравниваются пресинаптические действия ботулинического токсина типа A и β-бунгаротоксина на выделенные нервно-мышечные препараты, такие как диафрагмы мыши и крысы.

В статье Sheridan et al., J. Appl. Toxicol. 19, S29-S33 (1999) описывается определение эффективности ботулинических антагонистов на основе классических биоанализов концентрации токсина.

В статье James et al., Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. 285, G291-G297 (2003) описываются ингибирующие эффекты ботулинического токсина в отношении привратниковой и антральной гладкой мускулатуры.

В статье Goschel et al., Exp. Neurol., vol. 147, 1, 1997 описаны кривые зависимости эффекта от концентрации для определения относительной активности ботулинического токсина в образце по отношению к активности образца, содержащего известное количество токсина. Различные препараты ботулинического токсина тестировали на гемидиафрагмах мыши.

Вышеуказанные способы количественного анализа из предшествующего уровня техники, впрочем, обладают недостаточной точностью, требуемой для сертификации регулирующими органами. Таким образом, способы, раскрытые в вышеуказанных источниках, не могут применяться в нормативных целях, и вместо этого все еще приходится выполнять устаревший анализ на мышах с их умерщвлением.

Цели изобретения

Одна цель изобретения заключается в улучшении способов предшествующего уровня техники и в разработке надежного и точного способа определения активности или, соответственно, концентрации клостридиального нейротоксина в пробе, дающей указанную активность, который также мог бы применяться в целях контроля. Такой улучшенный способ также мог бы служить для удовлетворения высокой потребности в безопасном и эффективном введении.

Сущность изобретения

В одном аспекте изобретение относится к способу измерения эффекта, вызванного в мышечной ткани клостридиальным нейротоксином, включающему:

(a) контакт мышечной ткани с образцом, включающим указанный клостридиальный нейротоксин;

(c) измерение указанного эффекта, вызванного в указанной мышечной ткани указанным клостридиальныйм нейротоксином;

где этап (c) выполняют в отсутствии указанного образца.

В одном варианте осуществления указанную мышечную ткань подвергают электрической стимуляции.

В одном варианте осуществления способ после этапа (a) включает этап (b):

(b) электрическая стимуляция указанной мышечной ткани, полученной в этапе (a).

В другом варианте осуществления этап (b) выполняют в отсутствии указанного образца.

В другом аспекте изобретение относится к способу определения неизвестной концентрации клостридиального нейротоксина в первом образце по отношению к известной концентрации клостридиального нейротоксина во втором образце, включающему:

(a) контакт мышечной ткани с указанным вторым образцом;

(c) измерение второго эффекта, вызванного в указанной мышечной ткани указанным нейротоксином;

(d) повтор этапов (a)-(c) при различных концентрациях указанного клостридиального нейротоксина;

(e) регистрацию указанного измеренного второго эффекта этапа (d) в зависимости от концентрации, с регистрацией, таким образом, второго набора данных;

(f) контакт мышечной ткани с указанным первым образцом;

(h) измерение первого эффекта, вызванного в указанной мышечной ткани;

(k) определение концентрации, при которой указанный первый и указанный второй эффекты идентичны;

(l) приравнивание указанной концентрации в (k) к указанной неизвестной концентрации.

где этап (c) и/или этап (h) выполняют в отсутствии указанного второго и/или первого образца.

В одном варианте осуществления указанную мышечную ткань подвергают электрической стимуляции.

В одном варианте осуществления способ после этапа (a) включает этап (b), а после этапа (f) - этап (g):

(b) электрическая стимуляция указанной мышечной ткани, полученной в этапе (a);

(g) электрическая стимуляция указанной мышечной ткани, полученной в этапе (f).

В другом аспекте изобретение относится к способу определения относительной активности клостридиального нейротоксина в первом образце по отношению к активности клостридиального нейротоксина во втором образце, включающему:

(a) контакт мышечной ткани с указанным вторым образцом;

(c) измерение второго эффекта, вызванного в указанной мышечной ткани указанным нейротоксином;

(d) повтор этапов (a)-(c) при различных концентрациях указанного клостридиального нейротоксина;

(e) регистрацию указанного измеренного второго эффекта этапа (d) в зависимости от концентрации, с регистрацией, таким образом, второго набора данных;

(f) контакт мышечной ткани с указанным первым образцом;

(h) измерение первого эффекта, вызванного в указанной мышечной ткани;

(i) повтор этапов (f)-(h) при различных концентрациях указанного клостридиального нейротоксина;

(j) регистрацию указанного измеренного первого эффекта этапа (i) в зависимости от концентрации, с регистрацией, таким образом, первого набора данных;

где этап (c) и/или этап (h) выполняют в отсутствии указанного второго и/или первого образца.

В одном варианте осуществления указанную мышечную ткань подвергают электрической стимуляции.

В одном варианте осуществления способ после этапа (a) включает этап (b), а после этапа (f) - этап (g):

(b) электрическая стимуляция указанной мышечной ткани, полученной в этапе (a);

(g) электрическая стимуляция указанной мышечной ткани, полученной в этапе (f).

В одном варианте осуществления способ дополнительно включает этапы (m) и (n):

(m) выбор указанных различных концентраций из диапазона концентраций, который лучше всего соответствует первому и второму набору данных;

(n) определение указанного наилучшего соответствия с помощью статистического критерия, включающего следующие подэтапы (α) - (δ):

(α) представление диапазона значений второго набора данных, полученного в этапе (e), в виде эмпирической кривой;

(β) представление диапазона значений первого набора данных, полученного в этапе (j), в виде эмпирической кривой;

(γ) линеаризация эмпирических кривых, соответственно;

(δ) параллелизация линеаризованных эмпирических кривых.

В одном варианте осуществления статистическим критерием является F-критерий или χ²-критерий, или t-критерий.

В одном варианте осуществления вероятность ложного отклонения для каждого подэтапа (a)-(δ) равна ≤5 (выражена в %).

В одном варианте осуществления способ дополнительно включает этап (ε):

(ε) вычисление на основе смещения линеаризованных и параллелизованных эмпирических кривых относительно друг друга относительной активности первого образца по отношению ко второму образцу.

В одном варианте осуществления изобретения, согласно способам второго и третьего аспекта, этапы (b) или (g) выполняют в отсутствии второго или первого образца, или этапы (b) и (g) выполняют в отсутствии второго и первого образца.

В одном варианте осуществления, в соответствии с любым из способов трех аспектов согласно изобретению, продолжительность периода экспозиции мышечной ткани указанному клостридиальному нейротоксину, то есть периода контакта мышечной ткани с образцом или, соответственно, первым или вторым образцом, включающим клостридиальный нейротоксин, согласно этапу (a) до отсутствия указанного образца или, соответственно, первого или второго образца, или, соответственно, измерения указанного эффекта согласно этапу (c) или этапу (h), или этапу (c) и этапу (h), составляет от 1 до 60 мин.

В одном варианте осуществления, в соответствии с любым из способов трех аспектов согласно изобретению, до указанного измерения в этапе (c) или этапе (h), или этапе (c) и этапе (h) указанную мышечную ткань подвергают контакту с указанным клостридиальным токсином в течение от 5 до 30 мин.

В другом варианте осуществления, в соответствии с любым из способов трех аспектов согласно изобретению, продолжительность периода экспозиции указанной мышечной ткани указанному нейротоксину составляет приблизительно 15 минут.

В одном варианте осуществления, в соответствии с любым из способов трех аспектов согласно изобретению, указанная мышечная ткань уже подвергнута электрической стимуляции до этапа (a) и/или этапа (f).

В другом варианте осуществления указанная мышечная ткань уже подвергнута электрической стимуляции в течение этапа (a) и/или этапа (f).

В другом варианте осуществления указанная мышечная ткань уже подвергнута электрической стимуляции до этапа (a) и в течение этапа (a) и/или до этапа (f) и в течение этапа (f).

В одном варианте осуществления указанную регистрацию указанного измеренного второго эффекта выполняют путем построения кривой зависимости указанного второго эффекта от концентрации, и указанную регистрацию указанного второго набора данных выполняют посредством регистрации калибровочной кривой.

В одном варианте осуществления указанный второй эффект определяют по меньшей мере при одной концентрации, выраженной в мышиных LD₅₀ единицах/мл, равной по меньшей мере 10.

В другом варианте осуществления указанная концентрация составляет от 10 до 1000 или от 10 до 70, или от 15 до 60, или от 20 до 45.

В другом варианте осуществления указанная концентрация составляет от 20 до 400 или от 100 до 800.

В одном варианте осуществления указанные мышиные LD₅₀ единицы являются единицами Xeomin^®.

В одном варианте осуществления указанный эффект или, соответственно, указанный первый и второй эффект, выбран из группы, состоящей из времени до наступления паралича указанной мышечной ткани, изменения частоты сокращений указанной мышечной ткани, изменения расстояния сокращения указанной мышечной ткани, изменения силы сокращения указанной мышечной ткани, изменения потенциала концевой пластинки или миниатюрного потенциала концевой пластинки указанной мышечной ткани.

В одном варианте осуществления указанный эффект или, соответственно, указанный первый и второй эффект, является временем до наступления паралича.

В одном варианте осуществления указанная мышечная ткань выбрана из межреберной мышцы, мышцы задней конечности и длинной разгибающей мышцы пальца задней конечности, подошвенных мышц задней лапы, диафрагмального нерва-гемидиафрагмы, длинной поднимающей мышцы уха, нейромышечного соединения лягушки, двубрюшной мышцы шеи цыпленка, реберных мышц, ткани мозга или электрического органа морского ската.

В одном варианте осуществления указанный диафрагмальный нерв-гемидиафрагма является крысиным или мышиным.

В одном варианте осуществления указанный клостридиальный нейротоксин является ботулиническим токсином.

В другом варианте осуществления серотип указанного ботулинического нейротоксина выбран из группы, состоящей из A, B, C, D, E, F и G; или ботулинический нейротоксин является химически или генетически модифицированным производным ботулинического нейротоксина, серотип которого выбран из группы, состоящей из A, B, C, D, E, F и G.

В одном варианте осуществления нейротоксин не содержит комплексообразующих белков.

В другом варианте осуществления указанный нейротоксин имеет серотип A или B.

В одном варианте осуществления указанную электрическую стимуляцию проводят в буфере, включающем противовспенивающее вещество.

В одном варианте осуществления указанное противовспенивающее вещество выбрано из кремнийсодержащих соединений.

В одном варианте осуществления указанный буфер продувают кислородом.

В другом аспекте изобретение относится к компьютерному программному продукту, включающему компьютерную программу, включающую программные средства для осуществления способа согласно изобретению.

В другом аспекте изобретение относится к набору, включающему:

(A) - устройство для стимуляции мышечной ткани, которая была подвергнута воздействию клостридиального нейротоксина, для выбора эффекта, вызванного указанным нейротоксином в указанной мышечной ткани;

- устройство для измерения и регистрации указанного эффекта; и

(B) компьютерный программный продукт, включающий компьютерную программу, включающую программные средства для осуществления способа согласно изобретению.

В другом аспекте изобретение относится к применению мышечной ткани в любом из способов изобретения.

В другом аспекте изобретение относится к применению способа изобретения согласно любому из трех аспектов изобретения для контроля активности образца, включающего клостридиальный нейротоксин.

В одном варианте осуществления образец представляет собой хранящийся образец.

В одном варианте осуществления образец представляет собой лиофилизированный образец или восстановленный образец.

В одном аспекте изобретение относится к применению способа согласно первому аспекту изобретения для определения неизвестной концентрации клостридиального нейротоксина в первом образце по отношению к известной концентрации клостридиального нейротоксина во втором образце; или для определения относительной активности клостридиального нейротоксина в первом образце по отношению к активности клостридиального нейротоксина во втором образце, например, в ходе контроля качества в процессе производства клостридиального нейротоксина.

Подробное описание изобретения

Было установлено, что непостоянство, наблюдаемое в отношении способов количественного анализа предшествующего уровня техники, может быть сильно уменьшено до незначительной степени с применением способов, раскрытых в настоящей заявке.

Согласно первому аспекту изобретение относится к способу измерения эффекта, вызванного в мышечной ткани клостридиальным нейротоксином, включающему:

(a) контакт мышечной ткани с образцом, включающим указанный клостридиальный нейротоксин;

(c) измерение эффекта, вызванного в указанной мышечной ткани указанным нейротоксином;

где этап (c) выполняют в отсутствии указанного образца.

Термин "контакт мышечной ткани с указанным образцом (который может быть первым или вторым образцом согласно способам в соответствии с другими аспектами изобретения)" означает, что, по меньшей мере, часть указанного нейротоксина указанного образца принимается указанной мышечной тканью в течение указанного контакта, то есть, по меньшей мере, часть нейротоксина, содержавшегося в указанном образце, связывается соответствующими рецепторами, содержащимися в указанной мышечной ткани.

Термин "отсутствие образца" означает, что измерение эффекта в этапе (c) выполняют в среде, как правило, в подходящем буфере, который содержит 10% по весу или меньше, например, совсем не содержит, образца или, другими словами, нейротоксина образца.

В одном варианте осуществления указанная мышечная ткань не подвергается постоянному контакту с образцом (который может быть первым или вторым образцом согласно способам в соответствии с другими аспектами изобретения), включающим клостридиальный нейротоксин, а только временному.

Это означает, что после заданного периода экспозиции указанной мышечной ткани нейротоксину, то есть контакта в этапе (a) для получения реакции указанной мышечной ткани на воздействие, соответствующее измерение эффекта (или, соответственно, первого или второго эффекта согласно способам в соответствии с другими аспектами изобретения), где, например, указанную мышечную ткань подвергают электрической стимуляции, выполняют в отсутствии указанного образца (который может быть указанным первым или указанным вторым образцом согласно способам в соответствии с другими аспектами изобретения) с применением способов, описанных ниже.

В одном варианте осуществления, до указанного измерения, указанную мышечную ткань, например, извлекают из камеры для органов, содержащей указанный образец, и переносят в камеру для органов, содержащей компоненты без нейротоксина, как описано ниже. Затем проводят электрическую стимуляцию и измерение величины эффекта (который может быть первым или вторым эффектом, когда образец является первым или вторым образцом). Это означает, что электрическая стимуляция и реакция на указанную стимуляцию выполняются с мышечной тканью, содержащей полученный нейротоксин.

В другом варианте осуществления содержащие нейротоксин компоненты, то есть образец (который может быть первым или вторым образцом), заменяют компонентами, не содержащими нейротоксин. После замены выполняют измерение величины эффекта (который может быть первым или вторым эффектом, когда образец является первым или вторым образцом).

Термин "клостридиальный нейротоксин (или клостридиальный токсин)" охватывает комплексы клостридиального токсина, а также нейротоксин высокой чистоты, то есть препарат нейротоксина, не содержащий каких-либо других клостридиальных белков.

В одном варианте осуществления указанный клостридиальный нейротоксин является ботулиническим нейротоксином.

В другом варианте осуществления серотип указанного ботулинического нейротоксина выбран из группы, состоящей из A, B, C, D, E, F и G.

Термин "комплекс ботулинического токсина" охватывает ботулинический токсин, связанный, по меньшей мере, с другим нетоксичным белком. Как очевидно, термин комплекс ботулинического токсина, используемый в настоящей заявке, включает 450 кДа и 900 кДа комплекс ботулинического токсина, который, например, может быть получен из культур C. botulinum. Такие препараты на основе комплекса ботулинического токсина типа A производятся коммерчески, например, Ipsen Ltd. (Dysport^®) или Allergan Inc. (Botox^®). Другой препарат на основе ботулинического комплекса типа B производится компанией Solstice Neurosciences, Inc. (Myobloc^®). Высокоочищенный нейротоксин типа A, не содержащий других клостридиальных белков, выпускает Merz Pharmaceuticals (Xeomin^®). Это лекарственное средство выбора, предназначенное для улучшения при некоторых формах фокальной дистонии.

В другом варианте осуществления указанный ботулинический нейротоксин является химически или генетически модифицированным производным серотипа, выбранного из группы, состоящей из A, B, C, D, E, F и G.

Химически модифицированное производное указанного нейротоксина может быть производным, которое модифицировано пируватированием, фосфорилированием, сульфатированием, липидированием и/или гликозилированием.

Генетически модифицированное производное указанного нейротоксина является таким производным, которое было модифицировано делецией, присоединением или заменой одной или более аминокислот, содержащихся в белках указанного серотипа.

Такой модифицированный токсин предпочтительно является биологически активным.

Биологически активный токсин является токсином, который способен к поглощению клеткой и производит при этом протеолитическое расщепление одного или нескольких полипептидов, входящих в комплекс SNARE.

В одном варианте осуществления указанную мышечную ткань подвергают электрической стимуляции.

В одном варианте осуществления способ дополнительно включает:

(b) электрическую стимуляцию указанной мышечной ткани, полученной в этапе (a).

В одном варианте осуществления этап (b) выполняют в отсутствии указанного образца.

Неожиданно было обнаружено, что электрическая стимуляция и измерение указанного эффекта в отсутствии указанного образца, после контакта указанной мышечной ткани с нейротоксином, смещает соответствующие кривые зависимости эффекта от дозы так, что чувствительность способа согласно изобретению значительно возрастает. Чувствительность особенно повышается при низких концентрациях, выраженных в мышиных LD₅₀ единицах/мл указанного клостридиального нейротоксина, в указанном образце.

Например, если в качестве эффекта или, соответственно, реакции, установлено время до наступления паралича, указанное время до наступления паралича увеличивается по сравнению со способом, в котором указанный эффект измеряют в присутствии образца. Это приводит к выгодному повышению чувствительности способа, который в особенности применяется в области более низких концентраций нейротоксина. Если активность определяют при более низкой концентрации, нейротоксины обычно могут показывать наибольшую разницу, тогда как при довольно высоких концентрациях активности сходятся друг к другу.

Такое увеличение чувствительности позволяет проводить более точный и более достоверный анализ соответствующих кривых зависимости эффекта от дозы. Это в свою очередь позволяет значительно снизить количество лабораторных животных, например, мышей, которых в противном случае пришлось бы умертвить, чтобы выполнить любой из способов согласно изобретению. Таким образом, данный вариант осуществления изобретения прогрессивен не только в рамках технических аспектов, но также и в рамках этических аспектов.

Термин "чувствительность" используется в настоящем описании в стандартном значении, в каком он обычно используется в физиологии, то есть чувствительность определяет способность мышечной ткани реагировать на внешние стимулы. В данном случае внешние стимулы производятся при контакте мышечной ткани с клостридиальным нейротоксином. В рамках изобретения находится выбор некоторого диапазона концентраций, например, диапазона концентраций при относительно низкой концентрации клостридиального нейротоксина, где указанная чувствительность повышается, то есть реакцию можно определить, что в иных условиях сделать либо невозможно, либо, соответственно, можно определить только в пределах недопустимого отклонения.

Согласно второму аспекту изобретение относится к способу определения неизвестной концентрации клостридиального нейротоксина в первом образце по отношению к известной концентрации клостридиального нейротоксина во втором образце, включающему:

(a) контакт мышечной ткани с указанным вторым образцом;

(c) измерение второго эффекта, вызванного в указанной мышечной ткани указанным нейротоксином;

(d) повтор этапов (a)-(c) при различных концентрациях указанного клостридиального нейротоксина;

(e) регистрацию указанного измеренного второго эффекта этапа (d) в зависимости от концентрации, с регистрацией, таким образом, второго набора данных;

(f) контакт мышечной ткани с указанным первым образцом;

(h) измерение первого эффекта, вызванного в указанной мышечной ткани;

(k) определение концентрации, при которой указанный первый и указанный второй эффекты идентичны;

(l) приравнивание указанной концентрации в (k) к указанной неизвестной концентрации.

где этап (c) и/или этап (h) выполняют в отсутствии указанного второго и/или первого образца.

В одном варианте осуществления указанную мышечную ткань подвергают электрической стимуляции.

В одном варианте осуществления способ после этапа (a) включает этап (b), или этап (b) после этапа (a) и этап (g) после этапа (f):

(b) электрическая стимуляция указанной мышечной ткани, полученной в этапе (a);

(g) электрическая стимуляция указанной мышечной ткани, полученной в этапе (f).

В другом варианте осуществления этапы (b) или (g) выполняют в отсутствии второго или первого образца, или этапы (b) и (g) выполняют в отсутствии второго и первого образца.

Таким образом, в одном варианте осуществления определение второго и/или первого эффекта выполняют в отсутствии указанного второго и/или первого образца.

В другом варианте осуществления электрическую стимуляцию указанной мышечной ткани выполняют в отсутствии указанного второго и/или первого образца. Это означает, что после этапа (a) и до этапа (b), и/или после этапа (f) и до этапа (g) указанную мышечную ткань отделяют от второго и/или первого образца, как описано выше.

Термин "определение концентрации, при которой указанный первый и указанный второй эффекты идентичны" (этапы (k) и (l)) означает, что указанный первый и второй эффект качественно и количественно идентичны, то есть индуцированным эффектом является, например, время до наступления паралича, и что указанные эффекты имеют одну и ту же измеренную величину.

В одном варианте осуществления, для получения результатов, которые можно достоверно сравнить, время экспозиции мышечной ткани нейротоксину, содержащемуся во втором или, соответственно, первом образце, должно быть сопоставимым.

В одном варианте осуществления указанные периоды экспозиции идентичны.

В одном варианте осуществления указанную регистрацию указанного измеренного второго эффекта в этапе (e) выполняют путем измерения указанного второго эффекта при различных концентрациях указанного клостридиального нейротоксина в указанном втором образце и построения графика зависимости указанного измеренного второго эффекта от концентрации, регистрируя, таким образом, калибровочную кривую.

Если эффект, вызванный указанным вторым образцом в указанной мышечной ткани, определяется на основе различных концентраций, выраженных в мышиных LD₅₀ единицах/мл, может быть получена калибровочная кривая, как описано выше.

Например, можно определить указанный эффект, вызванный в этапах от десяти LD₅₀ единиц/мл или от пяти LD₅₀ единиц/мл в пределах выбранного диапазона концентраций.

Соответственно, с помощью второго набора данных, зарегистрированного в этапе (e), строят калибровочную кривую, при помощи которой определяют неизвестную концентрацию указанного клостридиального нейротоксина в указанном первом образце согласно этапам (k) и последующему этапу (l).

В одном варианте осуществления строят калибровочную кривую и указанные этапы определения и приравнивания согласно этапам (k) - (l) выполняют с помощью графического анализа.

Указанная неизвестная концентрация первого образца может быть определена путем определения из калибровочной кривой концентрации, при которой указанный первый и указанный второй эффекты имеют одно и то же значение, например, одинаковое время до наступления паралича, и приравнивания указанной концентрации к указанной неизвестной концентрации согласно этапу (l).

Предварительным условием для указанного определения служит то, что неизвестная концентрация клостридиального токсина в первом образце вызывает в мышечной ткани эффект, который может быть определен количественно с помощью указанной калибровочной кривой. Специалист, квалифицированный в данной области, осведомлен, что может потребоваться разбавить или сконцентрировать первый образец с неизвестной концентрацией один или несколько раз, при необходимости, чтобы получить диапазон концентраций, в котором можно провести сравнение со вторым образцом, то есть получить идентичные первый и второй эффекты. Затем, с учетом фактора разведения или концентрации, может быть вычислена концентрация нейротоксина, первоначально присутствующая в неразведенном или неконцентрированном первом образце.

В другом варианте осуществления указанное определение и приравнивание не проводят с помощью измерения по одной точке только одной концентрации в этапе (h) и последующих этапах (k) и (l), а с помощью измерения при множестве различных концентраций. Это особенно важно с учетом нормативных требований.

Согласно другому аспекту изобретения желательно оптимизировать диапазон концентраций, в котором возможно достоверное сравнение указанного второго и первого образца. Это относится не только к возможности сравнения касательно биологической эффективности известных на настоящий момент и коммерческих препаратов клостридиальных нейротоксинов, но также и к препаратам, которые могли бы быть разработаны в будущем или уже находятся в процессе разработки.

В одном варианте осуществления, для оптимизации диапазона концентраций, выраженных в мышиных LD₅₀ единицах/мл, в котором возможно достоверное сравнение указанного второго и первого образца, желательно, во-первых, определить стандартное отклонение калибровочной кривой, регистрируемой в этапе (e) и/или в этапе (h). При использовании подходящего ступенчатого регрессионного анализа можно создать регрессионную модель для предсказания активности неизвестного образца токсина на основе кривой зависимости эффекта от дозы.

С помощью такого способа можно идентифицировать диапазон концентраций для первого и второго образца, представляющего две различные совокупности данных, в которых корреляция между соответствующими кривыми зависимости эффекта от дозы достигает максимума, то есть, устанавливается наилучшее соответствие.

В одном варианте осуществления критерий может быть дополнительно скорректирован путем представления диапазона значений соответствующих наборов данных первого и второго образца эмпирическими кривыми согласно заданной регрессионной модели, соответственно, а также линеаризации и параллелизации указанных эмпирических кривых в пределах установленного доверительного интервала.

Таким образом, согласно третьему аспекту изобретение относится к способу определения относительной активности клостридиального нейротоксина в первом образце по отношению к активности клостридиального нейротоксина во втором образце, включающему:

(a) контакт мышечной ткани с указанным вторым образцом;

(b) электрическую стимуляцию указанной мышечной ткани, полученной в этапе (a);

(c) измерение второго эффекта, вызванного в указанной мышечной ткани указанным нейротоксином;

(d) повтор этапов (a)-(c) при различных концентрациях указанного клостридиального нейротоксина;

(e) регистрацию указанного измеренного второго эффекта этапа (d) в зависимости от концентрации, с регистрацией, таким образом, второго набора данных;

(f) контакт мышечной ткани с указанным первым образцом;

(g) электрическую стимуляцию указанной мышечной ткани, полученной в этапе (f);

(h) измерение первого эффекта, вызванного в указанной мышечной ткани, полученной в этапе (g);

(i) повтор этапов (f)-(h) при различных концентрациях указанного клостридиального нейротоксина;

(j) регистрацию указанного измеренного первого эффекта этапа (i) в зависимости от концентрации, с регистрацией, таким образом, первого набора данных;

где этап (c) и/или этап (h) выполняют в отсутствии указанного второго и/или первого образца.

В одном варианте осуществления способ дополнительно включает этапы (m) и (n):

(m) подбор указанных различных концентраций из диапазона концентраций, который лучше всего соответствует первому и второму набору данных;

(n) определение указанного наилучшего соответствия с помощью статистического критерия, включающего следующее подэтапы (α)-(δ):

(α) представление диапазона значений второго набора данных, полученного