Способ определения общей окислительно-восстановительной активности фагоцитов в тесте восстановления нитросинего тетразолия при лейкозе крупного рогатого скота

Способ определения общей окислительно-восстановительной активности фагоцитов в тесте восстановления нитросинего тетразолия при лейкозе крупного рогатого скота

Реферат

Изобретение относится к ветеринарной иммунологии, а именно к лабораторным методам исследований, и может быть использовано для выявления у крупного рогатого скота предрасположенности к лейкозу путем исследования кислородзависимого метаболизма нейтрофильных гранулоцитов.

Среди хронических инфекционных болезней сельскохозяйственных животных в последние годы удельный вес лейкоза крупного рогатого скота возрос до 60-63%.

Современная система борьбы с лейкозом базируется на выявлении и удалении из стада больных и инфицированных вирусом лейкоза крупного рогатого скота (ВЛКРС). Однако выявить инфицированных животных в инкубационной стадии не удается из-за уровня антител ниже пороговой чувствительности серологических реакций. Поэтому выявление повышенной чувствительности у крупного рогатого скота к инфекции ВЛКРС на основе методов оценки состояния иммунной системы является одним из важных элементов превентивных мер по управлению эпизоотическим процессом.

Среди интегральных показателей иммунобиологической защиты наиболее адекватным параметром является фагоцитарная активность нейтрофилов крови. Системой фагоцитоза фиксируются многочисленные изменения внутренней среды организма. Особенно показательны в этом отношении нейтрофилы. Обмениваясь в циркуляции каждые 4-5 часов, они как бы фотографируют сдвиги, происходящие в этот период, являясь зеркалом гомеостаза.

О функциональном состоянии ключевой клетки системы антимикробной резистентности организма, реагирующей на любые изменения гомеостаза, позволяет судить исследование кислородзависимого метаболизма нейтрофильных гранулоцитов. Одним из основных и наиболее объективных методов исследования кислородзависимого метаболизма нейтрофильных гранулоцитов является тест с нитросиним тетразолием (НСТ-тест), который основан на способности гранулоцитов фагоцитировать бесцветный краситель тетразолиевого ряда - НСТ и затем восстанавливать его в нерастворимый формазан темно-синего цвета с помощью НАД Н- и НАДФ Н-оксидаз.

НСТ-тест ставят в двух вариантах: спонтанном и индуцированном (с антигеном). Спонтанный НСТ-тест отражает степень функционального раздражения нейтрофилов in vivo, являясь своеобразным зеркалом гомеостаза. Индуцированный НСТ-тест характеризует потенциальную способность нейтрофилов ответить «респираторным взрывом» на адекватное раздражение. Отношение показателей индуцированного НСТ к спонтанному тесту рассматривают как биохимический критерий готовности нейтрофила к завершенному фагоцитозу (полному уничтожению объекта) и называют функциональным резервом (Я.А. Юцковская, Е.В. Маркелова и др. / Патент РФ №2216739, кл. G01N 33/52).

Известен способ определения функциональной активности нейтрофилов по реакции восстановления нитросинего тетразолия (патент РФ №2415423, кл. G01N 33/48), который основан на микроскопическом подсчете в камере Горяева нейтрофильных гранулоцитов, содержащих в цитоплазме диформазан. Недостатками данного способа являются отсутствие количественной регистрации кислородных радикалов, генерированных пулом нейтрофилов, и субъективность учета результатов реакции.

Перспективным в этом плане является исследование кислородзависимого метаболизма нейтрофильных гранулоцитов с помощью теста с нитросиним тетразолием (НСТ-тест), основанного на оптическом измерении экстрагированного диформазана, позволяющего вести автоматизированный учет реакции и, соответственно, объективнее оценить функциональную активность клеток.

Наиболее близким техническим решением к заявленному является методика определения общей окислительно-восстановительной активности фагоцитов в тесте восстановления нитросинего тетразолия [B.C. Власенко, М.А. Бажин, Т.С. Дудоладова и др. Оценка иммунного статуса у крупного рогатого скота при лейкозе: методические рекомендации / ГНУ ВНИИБТЖ Россельхозакадемии. - Омск, 2010]. Способ определения общей окислительно-восстановительной активности фагоцитов в тесте восстановления нитросинего тетразолия при лейкозе крупного рогатого скота включает выделение нейтрофильных гранулоцитов центрифугированием на градиенте плотности фиколл-урографина (плотностью 1,077 г/см³), внесение по 100 мкл клеточной взвеси в две параллельные лунки 96-луночного плоскодонного планшета для иммуноферментного анализа. В одну лунку планшета добавляют 50 мкл забуференного физиологического раствора (ЗФР) или физиологического раствора (спонтанный НСТ-тест), а в другую - 50 мкл стимулятора (ППД-туберкулина, БЦЖ) в оптимальном разведении в ЗФР или физиологическом растворе (индуцированный НСТ-тест). Затем в обе лунки планшета добавляют по 50 мкл 0,15% раствора нитросинего тетразолия и осторожно перемешивают содержимое лунок, после чего планшеты с ингредиентами инкубируют 20 минут при температуре 37°C. После инкубации планшет с пробами центрифугируют при 500 g 10 минут, отделяют надосадок, добавляют 200 мкл абсолютного этилового спирта и раствор центрифугируют 5 минут при 500 g. Отделяют надосадочную жидкость, в клеточный осадок добавляют 200 мкл физиологического раствора и центрифугируют 5 минут при 500 g. Для растворения образовавшегося диформазана добавляют в каждую лунку 130 мкл димексида и инкубируют при 60°C 20 минут. Для визуализации реакции после инкубации в лунки добавляют по 70 мкл 2 М раствора KOH, тщательно перемешивают. Результаты реакции фиксируют на иммуно-химическом анализатора при длине волны 630 нм и выражают в условных единицах оптической плотности. После учета реакции определяют коэффициент стимуляции (К ст. НСТ) по формуле: отношение оптической плотности в стимулированных лунках к оптической плотности в контрольных лунках.

Этот метод позволяет объективно оценивать различные состояния иммунной системы, в том числе выявлять иммунную недостаточность, вызванную вирусом лейкоза, но только в комплексе с другими иммунологическими параметрами после обработки полученных данных с помощью дискретно-динамического анализа. Отдельно взятый метод не позволяет достаточно эффективно выявить животных с предрасположенностью к лейкозу.

Техническим результатом заявленного способа является повышение точности и достоверности при выявлении животных с повышенной чувствительностью к инфекции ВЛКРС.

Технический результат достигается тем, что способ определения общей окислительно-восстановительной активности фагоцитов в тесте восстановления нитросинего тетразолия при лейкозе крупного рогатого скота включает выделение нейтрофильных гранулоцитов из венозной крови крупного рогатого скота путем центрифугирования в градиенте плотности фиколл-урографина (плотностью 1,077 г/см³), внесение по 100 мкл клеточной взвеси в две параллельные лунки 96-луночного плоскодонного планшета для иммуноферментного анализа, в одну лунку планшета добавляют 50 мкл забуференного физиологического раствора (ЗФР) или физиологического раствора (спонтанный НСТ-тест), а в другую - 50 мкл стимулятора (БЦЖ) в оптимальном разведении в ЗФР или физиологическом растворе (индуцированный НСТ-тест), затем в обе лунки планшета добавляют по 50 мкл 0,15% раствора нитросинего тетразолия, перемешивают, инкубируют 20 минут при температуре 37°C, центрифугируют при 500 g 10 минут, отделяют надосадок, добавляют 200 мкл абсолютного этилового спирта и раствор центрифугируют 5 минут при 500 g, отделяют надосадочную жидкость, в клеточный осадок добавляют 200 мкл физиологического раствора, центрифугируют 5 минут при 500 g, добавляют в каждую лунку 130 мкл димексида и инкубируют при 60°C 20 минут, добавляют по 70 мкл 2 М раствора KOH, тщательно перемешивают, результаты реакции фиксируют с помощью иммунохимического анализатора и выражают в условных единицах оптической плотности, после учета реакции определяют коэффициент стимуляции, при определении уровня индуцированной активности в лунку дополнительно вносят 50 мкл левамизола в конечной концентрации 0,5 мкг/мл, результаты реакции определяют по разнице экстинкций при длине волны 630 и 490 нм, коэффициент стимуляции (КС) определяется отношением индуцированного уровня клеточной активности к спонтанному уровню, при КС≤0,95 животное считают с повышенной чувствительностью к лейкозной инфекции крупного рогатого скота.

Отличительными признаками предложенного способа являются: при определении уровня индуцированной активности в лунку дополнительно вносят 50 мкл левамизола, а учет результатов реакции регистрируется по разнице экстинкций при длине волны 630 и 490 нм. Использование двухволнового метода измерения рекомендуется для уменьшения ошибок, вызванных присутствием в растворе посторонних окрашенных веществ или его мутностью [М.А. Годков, В.Ю. Зинкин / Патент РФ №2218567, кл. G01N 33/52 от 10.12.2003].

Левамизол - левовращающий оптический изомер тетрамизола, оказывающий влияние на механизмы иммунологической защиты организма. Основное его действие проявляется в усилении активности фагоцитов и Т-лимфоцитов в иммунологически дефектном организме, но не у здоровых [Последние достижения в клинической иммунологии / Под ред. Р.А. Томпсона. - М.: Медицина, 1983. - С.465-472].

Сущность изобретения поясняется на конкретных примерах выполнения способа.

Пример 1. В неблагополучном по лейкозу хозяйстве отбирают кровь от 5 коров, которых по результатам диагностических исследований признают носителями ВЛКРС (РИД-позитивные). Проводят исследование крови путем постановки реакции восстановления нитросинего тетразолия по предлагаемому способу для изучения влияния различных концентраций левамизола (0,01; 0,1; 0,5; 5 и 50 мкг/мл) на оптическую плотность раствора диформазана при определении уровня индуцированной вакциной БЦЖ активности. Результаты проведенных исследований представлены в таблице 1.

Таблица 1
Влияние различных концентрации левамизола на оптическую плотность раствора диформазана при определении уровня индуцированной активности, у.е. оп. пл.
Символы статистики	левамизол, мкг/мл
0,01	0,1	0,5	5,0	50,0
Мm±	221,0	271,0	296,60	293,60	246,0
12,23	14,15	16,17	13,83	14,8

Из таблицы 1 видно, что линейное увеличение плотности наблюдается при увеличении концентрации левамизола от 0,01 до 0,5 мкг/мл. Дальнейший подъем концентрации левамизола приводил к нелинейному изменению оптической плотности и даже ее уменьшению. Таким образом, для оценки восстановительно-окислительного метаболизма нейтрофилов у инфицированных ВЛКРС животных предпочтительно использовать левамизол в конечной концентрации 0,5 мкг/мл.

Пример 2. В неблагополучном по лейкозу хозяйстве исследуют 15 коров, которых по результатам диагностических исследований делят на 2 группы: 1-я группа - 5 здоровых (не реагирующих в РИД) коров и 2 группа - 10 животных вирусоносителей (РИД-положительные). Проводят исследование крови путем постановки реакции восстановления нитросинего тетразолия по известной методике и по предлагаемому способу с добавлением левамизола при определении уровня индуцированной активности.

С этой целью выделяют нейтрофильные гранулоциты из венозной крови крупного рогатого скота путем центрифугирования в градиенте плотности фиколл-урографина 1,077 г/см³, затем в три параллельные лунки 96-луночного плоскодонного планшета для иммуноферментного анализа вносят по 100 мкл клеточной взвеси. В одну лунку планшета добавляют 50 мкл, на пример физиологического раствора, (спонтанный НСТ-тест), в другую - 50 мкл предварительно растворенную, на пример, в физиологическом растворе (1000 мкг/мл) вакцину БЦЖ и 50 мкл левамизола в конечной концентрации, не превышающей 0,5 мкг/мл (индуцированный вариант по предлагаемому способу), а в третью - вакцину БЦЖ в физиологическом растворе (1000 мкг/мл) (индуцированный вариант по известному способу).

Затем в лунки планшета добавляют по 50 мкл 0,15%-ного раствора нитросинего тетразолия и осторожно перемешивают. После внесения всех ингредиентов планшет с пробами инкубируют 20 минут при 37°C. Затем для остановки реакции и осаждения клеток, содержащих диформазан, планшет центрифугируют при 500 g 10 минут (например, на центрифуге LU-418, приспособленной для центрифугирования планшетов). Для фиксации осажденных клеток и последующего отмывания фиксированных клеток сначала отделяют надосадок, добавляют 200 мкл абсолютного этилового спирта и центрифугируют раствор 5 минут при 500 g и затем добавляют 200 мкл физиологического раствора и вновь центрифугируют в том же режиме. Для растворения образовавшегося диформазана добавляют в каждую лунку 130 мкл димексида и инкубируют в его присутствии при 60°C 20 минут. Для визуализации реакции после инкубации в лунки добавляют по 70 мкл 2 М раствора КОН и тщательным перемешиванием добиваются равномерного окрашивания раствора, результаты реакции регистрируют на иммунохимическом анализаторе по разнице экстинкций при длине волны 630 нм и 490 нм и выражают в условных единицах оптической плотности. Затем определяют коэффициент стимуляции как отношение индуцированного уровня клеточной активности к спонтанному уровню.

В таблице 2 представлены результаты постановки реакции восстановления нитросинего тетразолия по известной методике (одно- и двухволновым методом) и по предлагаемому способу с добавлением левамизола при определении уровня индуцированной активности.

Из таблицы 2 видно, что у носителей ВЛКРС происходит усиление функциональной активности нейтрофилов в спонтанном и особенно в индуцированном варианте при постановке НСТ известным способом (259,12±9,59, 208,4±12,33 у.е. оп. пл.; Р<0,01).

Таблица 2
Результаты оценки функциональной активности нейтрофилов в тесте с нитросиним тетразолием у РИД-отридательных и инфицированных ВЛКРС животных, проведенном по известному и предлагаемому способу, М±m
Группа животных	вариант постановки НСТ
спонтанный	Индуцированный
известный способ	предлагаемый способ
у.е. оп. пл.	у.е. оп. пл.	КС	у.е. оп. пл.	КС
РИД-отрицательные	207,6±32,66	208,4±12,33	1,11±0,12	209,2±20,9	1,28±0,22
986,8±39,5*	1024±45,51*	1,04±0,04*
Носители ВЛКРС	268,33±9,84	259,12±9,59	1,0±0,04	236,37±9,07	0,77±0,06
882,75±44,0*	1017±38,08*	1,16±0,05*
Достоверность, Р	>0,05	<0,01	>0,05	>0,05	<0,05
>0,05*	>0,05*	>0,05*
* результаты постановки НСТ известным способом с использованием одноволнового метода (630 нм)

Несколько иная картина наблюдается при постановке НСТ известным способом с использованием длины волны 630 нм. Отмечено недостоверное снижение показателей в спонтанном варианте (882,75±44,0, 986,8±39,5 у.е. оп. пл.; Р>0,05) при отсутствии выраженных изменений при стимуляции БЦЖ.

При постановке предлагаемым способом у инфицированных животных также установлено увеличение количества активированных нейтрофилов, однако не достигало достоверной разницы (236,37±9,07, 209,2±20,09 у.е. оп. пл.; Р>0,05).

Следует отметить, что важным показателем НСТ-теста явилось не столько его повышение в спонтанном и индуцированных вариантах, сколько соотношение между стимулированным и спонтанным, т.е. коэффициент стимуляции (КС). Так, у носителей ВЛКРС при постановке НСТ известным способом при использовании как одно-, так и двухволнового метода этот показатель изменялся незначительно, тогда как при постановке предлагаемым способом с высокой степенью достоверности уменьшался (0,77±0,07, 1,11±0,12; Р<0,05).

Таким образом, исходно низкий показатель стимулированной реакции по отношению к спонтанной у животных, инфицированных ВЛКРС, при постановке предлагаемым методом, свидетельствует о снижении резистентности организма и низкой микробицидной активности нейтрофилов и, как следствие, высокой чувствительности к инфекции ВЛКРС.

Пример 3. Проводят исследование крови у 20 коров из благополучного по лейкозу хозяйства и у 20 из неблагополучного по лейкозу хозяйства путем постановки реакции восстановления нитросинего тетразолия по известному способу и по предлагаемому способу. Вычисляют коэффициент стимуляции, по результатам которого животных делят на 3 группы. В 1-ю группу включают коров с низкими значениями коэффициента (КС≤0,95); во 2-ю - с КС от 0,96 до 1,10 и 3-ю - с высокими (КС≥1,11).

Полученные данные были сопоставлены с результатами диагностических исследований на лейкоз (табл.3, 4). С этой целью ставили реакцию иммунодиффузии (РИД), основанную на обнаружении в сыворотке крови специфических антител к антигенам вируса лейкоза крупного рогатого скота. Животных, сыворотка крови которых дали положительный результат в РИД, признавали зараженными вирусом лейкоза и исследовали гематологическим методом, заключающимся в подсчете лейкоцитов в единице объема крови. При обнаружении повышенного их количества выводили лейкоцитарную формулу и оценивали статус животного по лейкозу согласно «лейкозному ключу» как здорового, подозрительного по заболеванию лейкозом или больного лейкозом [Методические указания по диагностике лейкоза крупного рогатого скота / Департамент ветеринарии, Минсельхоз России. - 2000. - №13-7-2/2130].

При исследовании сыворотки крови в РИД от коров из благополучного хозяйства носителей ВЛКРС не было выявлено.

Таблица 3
Значения коэффициента стимуляции у животных из благополучногохозяйства (n=20)
Группа животных	РИД (-)	% от общего числа
известный способ
1-я группа (КС≤0,95)	10	50
2-я группа (от 0,96 до 1,10)	4	20
3-я группа (КС≥1,11)	6	30
предлагаемый способ
1-я группа (КС≤0,95)	2	10
2-я группа (от 0,96 до 1,10)	-
3-я группа (КС≥1,11)	18	90

Из таблицы 3 видно, что у 90% животных из благополучного по лейкозу хозяйства при постановке НСТ-теста предлагаемым способом отмечена высокая микробицидная активность нейтрофилов (КС составил 1,11 и выше), тогда как при проведении НСТ-теста известным способом было установлено только 30% таких коров.

В неблагополучном хозяйстве при постановке известным способом (табл. 4) снижение коэффициента стимуляции ниже отметки 0,95 было отмечено у 12 из 20 животных (60%). При этом 8 животных являлись носителями ВЛКРС, а остальные 4 были РИД-отрицательными. В то же время при постановке предлагаемым способом со сниженным коэффициентом выявлено на 15% коров больше (75%), из них подавляющая часть была инфицирована ВЛКРС (11 из 15 голов), и только 4 животных были РИД-отрицательными.

Следует отметить, что среди 3-х животных с высоким значением коэффициента при постановке НСТ предлагаемым способом только у одного были обнаружены специфические антитела к антигенам ВЛКРС, при этом КС был резко повышен и составил 10,13. Дополнительным исследованием это животное было признано больным в гематологической стадии. Резкое повышение НСТ-положительных нейтрофилов и, как следствие, коэффициента стимуляции у больного лейкозом связано с развитием инфекционно-воспалительного осложнения. Об этом также могут свидетельствовать данные научной литературы [Тест восстановления нитросинего тетразолия у здоровых людей и больных острым лейкозом / В.Е. Логинский, В.В. Короткий // Лаб. дело. - 1978. - №1. - С.3-5].

Таблица 4
Значения коэффициента стимуляции у животныхиз неблагополучного хозяйства (п=20)
Группа животных	РИД (-)	Носители ВЛКРС	Итого (%)
всего	в т.ч. гембольные
известный способ
1-я группа (КС≤0,95)	4	8	-	12(60%)
2-я группа (от 0,96 до 1,10)	1	2	-	3(15%)
3-я группа (КС≥1,11)	2	3	1	5(25%)
предлагаемый способ
1-я группа (КС≤0,95)	4	11	-	15(75%)
2-я группа (от 0,96 до 1,10)	-	1	-	1(5%)
3-я группа (КС≥1,11)	3	1	1	4(20%)

Менее точные результаты получены при проведении НСТ известным способом. Так, с высокой активностью нейтрофилов (КС≥1,11) было установлено 5 коров, из них носителями ВЛКРС являлись 3, в том числе гембольная (КС=16,7), как и в случае постановки реакции предлагаемым способом.

Таким образом, результаты оценки окислительно-восстановительного метаболизма нейтрофилов в НСТ-тесте у коров из благополучного и неблагополучного по лейкозу крупного рогатого скота позволяют прийти к выводу о том, что высокая чувствительность к инфекции ВЛКРС отмечается при значениях КС≤0,95. При этом предлагаемый способ позволяет более точно и достоверно проводить оценку чувствительности к инфекции ВЛКРС и дает возможность диагностировать развитие инфекционно-воспалительных процессов у больных лейкозом животных.

Способ оценки повышенной чувствительности крупного рогатого скота к лейкозной инфекции, включающий выделение нейтрофильных гранулоцитов из венозной крови крупного рогатого скота путем центрифугирования в градиенте плотности фиколл-урографина (плотностью 1,077 г/см³), внесение по 100 мкл клеточной взвеси в две параллельные лунки 96-луночного плоскодонного планшета для иммуноферментного анализа, в одну лунку планшета добавляют 50 мкл забуференного физиологического раствора или физиологического раствора (спонтанный НСТ-тест), а в другую - 50 мкл стимулятора (БЦЖ) в оптимальном разведении в забуференном физиологическом растворе или физиологическом растворе (индуцированный НСТ-тест), затем в обе лунки планшета добавляют по 50 мкл 0,15% раствора нитросинего тетразолия, перемешивают, инкубируют 20 минут при температуре 37°С, центрифугируют при 500 g 10 минут, отделяют надосадок, добавляют 200 мкл абсолютного этилового спирта и раствор центрифугируют 5 минут при 500 g, отделяют надосадочную жидкость, в клеточный осадок добавляют 200 мкл физиологического раствора, центрифугируют 5 минут при 500 g, добавляют в каждую лунку 130 мкл димексида и инкубируют при 60°С 20 минут, добавляют по 70 мкл 2 М раствора КОН, тщательно перемешивают, результаты реакции фиксируют с помощью иммунохимического анализатора и выражают в условных единицах оптической плотности, после учета реакции определяют коэффициент стимуляции, при этом при определении уровня индуцированной активности в лунку дополнительно вносят 50 мкл левамизола в конечной концентрации 0,5 мкг/мл, результаты реакции определяют по разнице экстинкций при длине волны 630 и 490 нм, коэффициент стимуляции (КС) определяется отношением индуцированного уровня клеточной активности к спонтанному уровню, при КС ≤0,95 животное считают с повышенной чувствительностью к лейкозной инфекции крупного рогатого скота.