Способ производства раствора сахара и устройство для его производства

Способ производства раствора сахара и устройство для его производства

Иллюстрации

Показать все

Реферат

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ

Настоящее изобретение относится к способу получения жидкого сахара из целлюлозы и к устройству для осуществления такого способа.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Способы проведения ферментации химических продуктов с использованием сахаров в качестве сырья применяли для получения различных промышленных материалов. В настоящее время в качестве сахаров, используемых в качестве сырья для ферментации, в промышленности используют такие сахара, которые получают из пищевых материалов, таких как сахарный тростник и сахарная свекла. Однако с точки зрения того факта, что ожидается повышение цен на пищевые материалы из-за увеличения населения мира, или с этической точки зрения на основании того факта, что сахара для промышленных материалов могут конкурировать с сахарами для питания, в будущем необходима разработка способа эффективного получения жидкого сахара из возобновляемого непищевого источника, то есть из содержащей целлюлозу биомассы, или способа применения получаемого жидкого сахара в качестве сырья для ферментации, чтобы эффективно превратить жидкий сахар в промышленный материал.

Примеры раскрытых способов получения жидкого сахара из содержащей целлюлозу биомассы включают способы получения жидких сахаров в результате кислотного гидролиза целлюлозы и гемицеллюлозы с использованием концентрированной серной кислоты (патентные документы 1 и 2) и способ, в котором содержащую целлюлозу биомассу подвергают гидролизной обработке, используя разбавленную серную кислоту, и затем подвергают ферментативной обработке целлюлазой или подобным ферментом, чтобы получить жидкий сахар (непатентный документ 1). Кроме того, примеры раскрытых способов без применения кислоты включают способ, в котором содержащую целлюлозу биомассу гидролизуют, используя воду в субкритическом состоянии примерно при 250°C-500°C, получая жидкий сахар (патентный документ 3), способ, в котором содержащую целлюлозу биомассу подвергают обработке водой в субкритическом состоянии и затем обрабатывают ферментативно, получая жидкий сахар (патентный документ 4), и способ, в котором содержащую целлюлозу биомассу подвергают гидролизной обработке горячей водой под давлением при 240°C-280°C и затем обрабатывают ферментативно, получая жидкий сахар (патентный документ 5).

В последние годы широко исследованы способы гидролиза биомассы, в которых используют меньше энергии и которые дают меньшую нагрузку на окружающую среду, но обеспечивают получение сахара с высоким выходом. Однако такие способы, в которых применяют ферменты, имеют недостаток, который заключается в высокой стоимости ферментов.

Для решения указанных технических проблем предложены способы регенерации и повторного применения ферментов, используемых при гидролизе. Примеры таких раскрытых способов включают способ, в котором осуществляют непрерывное разделение твердого вещества и жидкости с помощью центробежного фильтра и полученный жидкий сахар фильтруют через ультрафильтрационную мембрану, чтобы извлечь ферменты (патентный документ 6), способ, в котором поверхностно-активное вещество подают на стадии ферментативного осахаривания, чтобы уменьшить адсорбцию фермента и таким образом повысить эффективность регенерации (патентный документ 7), способ, в котором остаток, получаемый в результате ферментативного осахаривания, подвергают электрической обработке, чтобы извлечь ферментный компонент (патентный документ 8), и способ, в котором остаток, получаемый в результате ферментативного осахаривания снова загружают в другую партию биомассы и таким образом повторно используют ферменты (патентный документ 9).

ДОКУМЕНТЫ ИЗВЕСТНОГО УРОВНЯ ТЕХНИКИ

[Патентные документы]

Патентный документ 1: переведенная на японский язык выложенная заявка на выдачу патента PCT No. 11-506934

Патентный документ 2: JP 2005-229821 A

Патентный документ 3: JP 2003-212888 A

Патентный документ 4: JP 2001-95597 A

Патентный документ 5: JP 3041380 B

Патентный документ 6: JP 2006-87319 A

Патентный документ 7: JP 63-87994 A

Патентный документ 8: JP 2008-206484 A

Патентный документ 9: JP 55-144885 A

Непатентные документы

Непатентный документ 1: A. Aden et al. "Lignocellulosic Biomass to Ethanol Process Design and Economics Utilizing Co-Current Dilute Acid Prehydrolysis and Enzymatic Hydrolysis for Corn Stover" NREL Technical Report (2002).

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

ПРОБЛЕМЫ, РЕШАЕМЫЕ ИЗОБРЕТЕНИЕМ

Были разработаны способы ферментативного гидролиза целлюлозы, которые описаны выше, но эффекты таких способов были недостаточны с точки зрения уменьшения количества используемого фермента. Поэтому настоящее изобретение нацелено на развитие способа, в котором достигается эффект уменьшения количества фермента более высокий, чем в случае обычных способов.

СПОСОБЫ РЕШЕНИЯ ПРОБЛЕМЫ

Настоящее изобретение имеет структуру, состоящую из пунктов [1]-[11], указанных ниже.

[1] Способ получения жидкого сахара в результате повторения способа получения жидкого сахара, включающего в себя стадии (1)-(3), указанные ниже:

(1) стадию добавления выделенной из нитчатого гриба целлюлазы к целлюлозе для осуществления первичного гидролиза;

(2) стадию добавления свежей выделенной из нитчатого гриба целлюлазы к гидролизату со стадии (1) для осуществления вторичного гидролиза; и

(3) стадию, на которой гидролизат со стадии (2) подвергают разделению твердого вещества и жидкости с получением жидкого сахара, из которого получают регенерированный фермент;

при этом регенерированный фермент, получаемый на стадии (3), используют на стадии (1) следующего и дальнейших процессов получения жидкого сахара.

[2] Способ получения жидкого сахара по п. [1], в котором в качестве выделенной из нитчатого гриба целлюлазы на стадии (1) способа получения жидкого сахара используют ферментный компонент, регенерированный из гидролизата целлюлозы, образуемого под действием выделенной из нитчатого гриба целлюлазы.

[3] Способ получения жидкого сахара по п. [1] или [2], в котором выделенная из нитчатого гриба целлюлаза на стадии (1) или (2) содержит компонент, выделенный из культуральной жидкости микроорганизма, относящегося к роду Trichoderma.

[4] Способ получения жидкого сахара по любому из п.п. [1]-[3], в котором регенерированный фермент содержит ксиланазу и/или ксилозидазу.

[5] Способ получения жидкого сахара по любому из п.п. [1]-[4], в котором регенерированный фермент содержит не растворимую в воде целлюлазу, выделенную из нитчатого гриба.

[6] Способ получения жидкого сахара по любому из п.п. [1]-[5], в котором целлюлоза является подвергаемым обработке продуктом, полученным в результате подвергания содержащей целлюлозу биомассы щелочной обработке, гидротермальной обработке или обработке разбавленной серной кислотой.

[7] Способ получения жидкого сахара по любому из п.п. [1]-[6], в котором количества фермента, добавляемого при первичном гидролизе и вторичном гидролизе, удовлетворяют следующему соотношению: количество регенерированного фермента, добавляемого на стадии (1) > количества свежего фермента, добавляемого на стадии (2).

[8] Способ получения жидкого сахара по любому из п.п. [1]-[7], в котором регенерацию выделенной из нитчатого гриба целлюлазы на стадии (3) осуществляют фильтрованием жидкого сахара через ультрафильтрационную мембрану и извлечением целлюлазы со стороны подачи.

[9] Устройство для осуществления способа получения жидкого сахара, при этом способ включает в себя стадию гидролиза целлюлозы, и устройство содержит в качестве составляющих: резервуар для гидролиза, с которым соединены труба для подачи регенерированного фермента, и труба для подачи свежего фермента; устройство для разделения твердого вещества и жидкости гидролизата; резервуар для жидкого сахара, имеющий трубу подачи воды для промывки ультрафильтрационной мембраны и/или для удаления регенерированного фермента, оставшегося в циркуляционной трубе; и устройство с ультрафильтрационной мембраной для разделения фермента и жидкого сахара.

[10] Устройство для осуществления способа получения жидкого сахара, при этом способ включает в себя стадию гидролиза целлюлозы и устройство содержит в качестве составляющих: устройство смешивания целлюлозы/регенерированного фермента для смешивания регенерированного фермента и целлюлозы для осуществления первичного гидролиза; резервуар для гидролиза, с которым соединены труба для подачи смеси целлюлозы/регенерированного фермента и труба для подачи свежего фермента; устройство для разделения твердого вещества и жидкости гидролизата; резервуар для жидкого сахара, имеющий трубу подачи воды для промывки ультрафильтрационной мембраны и/или для удаления регенерированного фермента, оставшегося в циркуляционной трубе; и устройство с ультрафильтрационной мембраной для разделения фермента и жидкого сахара.

[11] Устройство, содержащее в качестве составляющего (составляющих) в дополнение к составляющим устройства, перечисленным в п. [9] или [10], устройство (устройства) с обратноосмотической мембраной и/или нанофильтрационной мембраной для концентрирования жидкого сахара.

ЭФФЕКТ ИЗОБРЕТЕНИЯ

В способе гидролиза, в котором целлюлазу регенерируют и используют повторно, количество фермента, используемого для гидролиза, может быть значительно уменьшено, и эффективность получения сахара из содержащей целлюлозу биомассы может быть значительно повышена посредством добавления регенерированного фермента перед добавлением свежего фермента для осуществления первичного гидролиза и затем добавления свежего фермента для осуществления вторичного гидролиза.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

Фиг. 1 является схематичной диаграммой, показывающей методику осуществления способа гидролиза согласно настоящему изобретению.

Фиг. 2 является схематичной диаграммой, показывающей устройство, применяемой в настоящем изобретении.

Фиг. 3 является схематичной диаграммой, показывающей устройство, применяемой в настоящем изобретении.

Фиг. 4 является схематичной диаграммой, показывающей устройство, применяемой в настоящем изобретении.

Фиг. 5 является схематичной диаграммой, показывающей устройство, применяемой в настоящем изобретении.

Фиг. 6 является схематичной диаграммой, показывающей устройство, применяемой в настоящем изобретении.

Фиг. 7 является схематичной диаграммой, показывающей устройство, применяемой в настоящем изобретении.

Фиг. 8 является схематичной диаграммой, показывающей устройство, применяемой в настоящем изобретении.

Фиг. 9 является схематичной диаграммой, показывающей устройство, применяемой в настоящем изобретении.

Фиг. 10 является схематичной диаграммой, показывающей устройство, применяемой в настоящем изобретении.

Фиг. 11 является диаграммой, показывающей результат SDS-ПААГ не растворимого в воде целлюлазного компонента, выделенного из Trichoderma.

НАИЛУЧШИЙ СПОСОБ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Большие количества целлюлозы содержатся в травянистой биомассе, такой как багасса, просо прутьевидное, пеннисетум красный, Erianthus, кукурузная солома, рисовая солома и пшеничная солома; и древесной биомассе, такой как деревья и отходы строительных материалов. Такие содержащие целлюлозу биомассы предпочтительно могут быть использованы в качестве сырья в настоящем изобретении.

Содержащая целлюлозу биомасса содержит кроме целлюлозы и гемицеллюлозы (далее называемых «целлюлозой» в качестве общего термина для целлюлозы и гемицеллюлозы), лигнин и тому подобное, которые являются ароматическими макромолекулами. Поэтому в случаях, когда целлюлозу, полученную из биомассы, используют в качестве сырья для жидкого сахара в способе согласно настоящему изобретению для получения жидкого сахара, эффективность ферментативного гидролиза может быть повышена в результате предварительной обработки. Примеры способа предварительной обработки содержащей целлюлозу биомассы включают обработку кислотой, обработку серной кислотой, обработку разбавленной серной кислотой, щелочную обработку, обработку каустической содой, гидротермальную обработку, обработку водой в субкритическом состоянии, обработку тонким измельчением и обработку паром. В настоящем изобретении способом предварительной обработки предпочтительно является щелочная обработка, гидротермальная обработка или обработка разбавленной серной кислотой.

Примеры щелочной обработки включают способы использования щелочи, такой как гидроксид натрия, гидроксид кальция или аммиак, и особенно предпочтительно может быть использован аммиак. Такая обработка аммиаком может быть осуществлена способами, описанными в JP 2008-161125 A и JP 2008-535664 A. Например, аммиак добавляют к биомассе в концентрации в диапазоне от 0,1 до 15% масс., и обработку осуществляют при 4-200°C, предпочтительно 90-150°C. Добавляемый аммиак может быть либо в состоянии жидкости, либо в газовом состоянии. Кроме того, добавляемый аммиак может быть в форме либо чистого аммиака, либо водного раствора аммиака. Количество обработок не ограничено, и может быть осуществлена одна или большее количество обработок. В частности, в тех случаях, когда обработку осуществляют два или большее количество раз, условия для первой обработки могут отличаться от условий для второй и последующих обработок. Обработанный продукт, получаемый при обработке аммиаком, необходимо подвергать нейтрализации аммиак или необходимо удалять аммиак, чтобы далее осуществить реакцию ферментативного гидролиза. Нейтрализацию аммиака можно осуществить либо после удаления твердых веществ из гидролизата в результате разделения твердого вещества и жидкости, либо в состоянии, когда содержатся твердые вещества. Кислый реагент, используемый для нейтрализации, не ограничен. Аммиак можно удалить, выдерживая обработанный аммиаком продукт при пониженном давлении, чтобы обеспечить возможность для испарения аммиака и его перехода в состояние газа. Удаленный аммиак может быть регенерирован и использован повторно.

В случае гидротермальной обработки добавляют воду так, чтобы концентрация содержащей целлюлозу биомассы составляла от 0,1 до 50% масс., и полученную смесь обрабатывают при температуре от 100 до 400°C в течение периода времени от 1 секунды до 60 минут. При обработке в таких температурных условиях происходит гидролиз целлюлозы. Количество обработок не ограничено, и обработку можно осуществлять один или несколько раз. В частности, в случае, когда обработку осуществляют два или более раз, условия для первой обработки могут отличаться от условий для второй и последующих обработок.

В случае обработки разбавленной серной кислотой концентрация серной кислоты предпочтительно составляет от 0,1 до 15% масс., более предпочтительно от 0,5 до 5% масс. Температура реакции может быть установлена в диапазоне от 100 до 300°C, и предпочтительно может быть установлена в диапазоне от 120 до 250°C. Время реакции может быть установлено в диапазоне от 1 секунды до 60 минут. Количество обработок не ограничено, и обработку можно осуществлять один или несколько раз. В частности, в случае, когда обработку осуществляют два или более раз, условия для первой обработки могут отличаться от условий для второй и последующих обработок. Так как гидролизат, получаемый при обработке разбавленной серной кислотой, содержит кислоту, то необходима нейтрализация, чтобы далее осуществить реакцию гидролиза с использованием целлюлазы или чтобы использовать гидролизат в качестве сырья для ферментации.

Настоящее изобретение отличается тем, что целлюлозу гидролизуют выделенной из нитчатого гриба целлюлазой. Гидролиз целлюлозы означает, что целлюлозу превращают в низкомолекулярные фрагменты под действием целлюлазы, получая моносахариды и/или олигосахариды. Условия реакции для гидролиза не ограничены, при условии что реакцию осуществляют в условиях, предпочтительных для целлюлазы, и в общем, температура реакции предпочтительно находится в диапазоне от 15°C до 100°C, более предпочтительно от 40°C до 60°C, еще более предпочтительно 50°C. pH для гидролиза предпочтительно находится в диапазоне от 3 до 9, более предпочтительно от 4 до 5,5, еще более предпочтительно 5. pH можно корректировать добавлением кислоты или щелочи так, чтобы достичь требуемого значения pH. Кроме того, в зависимости от ситуации может быть добавлен буфер. При гидролизе предпочтительно перемешивание смеси, способствующее осуществлению контакта целлюлозы с ферментом и для получения однородной концентрации сахара в гидролизате. Предпочтительно добавление воды так, чтобы концентрация твердых веществ целлюлозы была в диапазоне от 1 до 25% масс., и более предпочтительно концентрация твердых веществ находится в диапазоне от 8 до 20% масс.

Примеры выделенной из нитчатого гриба целлюлазы включают целлюлазы, выделенные из Trichoderma, Aspergillus, Cellulomonas, Clostridium, Streptomyces, Humicola, Acremonium, Irpex, Mucor, Talaromyces, Phanerochaete, грибов белой гнили и грибов бурой гнили. Из них предпочтительно используют выделенные из нитчатых грибов целлюлазы, выделенную из Trichoderma целлюлазу, которая обладает высокой разрушающей целлюлозу активностью.

Выделенная из Trichoderma целлюлаза представляет собой композицию ферментов, содержащую целлюлазу, выделенную из микроорганизма, относящегося к роду Trichoderma, в качестве основного компонента. Микроорганизм, относящийся к роду Trichoderma, не ограничен и предпочтительным микроорганизмом является Trichoderma reesei. Конкретные примеры Trichoderma reesei включают Trichoderma reesei QM9414, Trichoderma reesei QM9123, Trichoderma reesei Rut C-30, Trichoderma reesei ATCC68589, Trichoderma reesei PC3-7, Trichoderma reesei CL-847, Trichoderma reesei MCG77, Trichoderma reesei MCG80 и Trichoderma viride QM9123 (Trichoderma viride QM9123). Целлюлаза также может быть выделена из мутантного штамма, происходящего от микроорганизма, относящегося к роду Trichoderma, и такой мутантный штамм получают мутагенезом, используя мутаген, УФ-излучение или тому подобное, для повышения продуктивности в отношении целлюлазы.

Выделенная из нитчатого гриба целлюлаза, используемая в настоящем изобретении, представляет собой композицию ферментов, содержащую множество ферментных компонентов, таких как целлобиогидролаза, эндоглюканаза, экзоглюканаза, β-глюкозидаза, ксиланаза и ксилозидаза, и такая ферментная композиция обладает активностью, вызывающей гидролиз и осахаривание целлюлозы. В случаях, когда выделенную из нитчатого гриба целлюлазу используют для разрушения целлюлозы, согласованное действие или комплементарное действие множества ферментных компонентов обеспечивает эффективный гидролиз целлюлозы.

Термин «целлобиогидролаза» является общим термином для целлюлаз, которые гидролизуют целлюлозу, действуя на концевые части. Группа ферментов, относящихся к целлобиогидролазе, описана под номером EC: EC 3.2.1.91.

Термин «эндоглюканаза» является общим термином для целлюлаз, которые гидролизуют молекулярные цепи целлюлозы, начиная с их центральных частей. Группа ферментов, относящихся к эндоглюканазе, описана под номерами EC: EC 3.2.1.4, EC 3.2.1.6, EC 3.2.1.39 и EC 3.2.1.73.

Термин «экзоглюканаза» является общим термином для целлюлаз, которые гидролизуют молекулярные цепи целлюлозы с концов. Группа ферментов, относящихся к экзоглюканазе, описана под номерами EC: EC 3.2.1.74 и EC 3.2.1.58.

Термин «β-глюкозидаза» является общим термином для целлюлаз, которые действуют на целлоолигосахариды или целлобиозу. Группа ферментов, относящихся к β-глюкозидазе, описана под номером EC: EC 3.2.1.21.

Термин «ксиланаза» является общим термином для целлюлаз, которые действуют на гемицеллюлозу или особенно на ксилан. Группа ферментов, относящихся к ксиланазе, описана под номером: EC 3.2.1.8.

Термин «ксилозидаза» является общим термином для целлюлаз, которые действуют на ксилоолигосахариды. Группа ферментов, относящихся к ксилозидазе, описана под номером EC: EC 3.2.1.37.

В качестве выдеденной из Trichoderma целлюлазы предпочтительно используют целлюлазу, содержащую компонент(ты), выделенный из культуральной жидкости микроорганизма, относящегося к роду Trichoderma. Примеры компонента(ов), выделенного из культуральной жидкости Trichoderma, включают все другие компоненты, отличные от целлюлазы, находящейся в культуральной жидкости, полученной при культивирования микроорганизма, относящегося к роду Trichoderma, в среде, приготовленной так, что микроорганизм продуцирует целлюлазу. То есть, примеры компонента(ов) включают другие ферментные компоненты, отличные от целлюлазы, клетки микроорганизма, относящегося к роду Trichoderma, и компоненты среды для культивирования. Конкретные примеры компонентов среды, используемых для культивирования, включают моносахариды, такие как глюкоза и ксилоза; индукторы продуцирования целлюлазы, такие как жидкий кукурузный экстракт, дрожжевой экстракт и целлюлоза; минералы; и витаминные компоненты. Клетки микроорганизма, относящегося к роду Trichoderma, могут содержаться в виде компонента, выделенного из культуральной жидкости микроорганизма, относящегося к роду Trichoderma. Ведь включение клеток микроорганизма, относящегося к роду Trichoderma, в качестве компонента выделенной из Trichoderma целлюлазы согласно настоящему изобретению может повышать активность регенерированного фермента.

Массовые доли ферментных компонентов в выделенной из Trichoderma целлюлазе не ограничены, и культуральная жидкость, полученная от Trichoderma reesei, содержит, например, 50-95% масс. целлобиогидролазы, а также содержит другие компоненты эндоглюканазу, β-глюкозидазу, экзо-1,4-β-D-глюкозамидазу, ксиланазу, ксилозидазу, эндо-1,4-маннозидазу, 1,2-α-маннозидазу, α-глюкуронидазу, хиназаназу, хитиназу, 1,4-α-глюкозидазу, α-галактозидазу, β-галактозидазу, арабинофуранозидазу, ксиланэстеразу, сволленин, гидрофобин и/или тому подобные. Микроорганизмы, относящиеся к Trichoderma продуцируют высокоактивные целлюлазные компоненты, выделяемые в культуральную жидкость, хотя β-глюкозидазная активность в культуральной жидкости низкая, так как β-глюкозидаза сохраняется в клетках или на поверхности клеток. Поэтому кроме компонентов, присущих выделенной из Trichoderma целлюлазе, может быть добавлена β-глюкозидаза из другого вида или того же самого вида. В качестве β-глюкозидазы из другого вида предпочтительно можно использовать β-глюкозидазу, выделенную из Aspergillus. Примеры β-глюкозидазы, выделенной из Aspergillus, включают новозим 188, который коммерчески доступнее из Novozyme. Способ добавления β-глюкозидазы из другого вида или из того же самого вида может представлять собой способ, посредством которого ген вводят в микроорганизм, относящийся к Trichoderma, чтобы осуществить генетическую рекомбинацию микроорганизма, так чтобы он продуцировал и выделял в культуральную жидкость β-глюкозидазу, и затем клонируют микроорганизм, относящийся к Trichoderma, с последующим выделением культуральной жидкости.

В настоящем изобретении гидролиз целлюлозы с использованием выделенной из нитчатого гриба целлюлазы осуществляют в ходе двух отдельных стадий, то есть в ходе первичного гидролиза и вторичного гидролиза. Стадии описаны ниже в указанном порядке.

Первичный гидролиз в настоящем изобретении означает, что выделенную из нитчатого гриба целлюлазу добавляют к целлюлозе, которая не была подвергнута ферментативной обработке, чтобы осуществить гидролиз. Ферментом, используемым для первичного гидролиза, может быть либо далее описанный свежий фермент, либо регенерированный фермент, и регенерированный фермент используют предпочтительно, так как использование регенерированного фермента может повысить эффективность продукции сахара. Механизмы, посредством которых эффективность продукции сахара повышается при использовании регенерированного фермента в первичном гидролизе, представляют собой следующие механизмы. В регенерированном ферменте содержаться ферментные компоненты, структуры которых были частично денатурированы вследствие теплового воздействия во время гидролиза, и такие ферментные компоненты особенно сильно адсорбируются на участках адсорбции, существующих на поверхности целлюлозы. В результате ферментные компоненты неспецифично адсорбируются на адсорбирующих частях поверхности целлюлозы, например, лигнина. Поэтому неспецифичная адсорбция свежего ферментного компонента, который подают позже, может быть подавлена. В общем, удельная активность (ферментативная активность на массу белка) в разрушении целлюлазой выше у регенерированного фермента, чем у свежего фермента. То есть, в результате подавления неспецифичной адсорбции свежего ферментного компонента, который обладает более высокой удельной активностью, выход продукции сахара и эффективность регенерации фермента может быть повышена. Другая причина состоит в том, что поскольку количество раз извлечения регенерированного фермента согласно настоящему изобретению увеличивается, можно получить более высокую разрушающую ксилан активность. Разрушающая ксилан активность, имеющаяся у регенерированного фермента, может быть измерена с использованием в качестве разрушаемого субстрата реагента ксилана, такого как ксилан древесины березы. Примеры выделенных из нитчатого гриба целлюлазных компонентов, вовлеченных в разрушающую ксилан активность, включают ксиланазу и ксилозидазу. Примеры генов ксиланазы включают xyn1(GH11), xyn2(GH11), xyn3(GH10), xyn4(GH5), xyn5b(GH5) и xyn11(GH11). Примеры генов ксилозидазы включают bx11/bx13a(GH3), bx1l3b(GH3) и bx13c(GH3). Каждый из указанных выше генов кодирует ксиланазу или ксилозидазу и содержится в виде выделенного из нитчатого гриба целлюлазного компонента. Примеры разрушающих ксилан ферментов, активности которых в регенерированном ферменте могут быть повышены, включают ксиланазу 3 (молекулярная масса 38 кД; xyn3), эндо-β-1,4-ксиланаза (молекулярная масса 25 кД; xyn1) и β-ксилозидаза (молекулярная масса 88 кД; bx11/bx13a). При добавлении для первичного гидролиза регенерированного фермента, разрушающая ксилан активность которого была повышена, как описано выше, преимущественно гидролизуются компоненты ксилана, окружающие целлюлозу, и поэтому продуктивность сахара при первичном и вторичном гидролизе может быть повышена.

Время реакции при первичном гидролизе предпочтительно находится в диапазоне от 15 минут до 6 часов. В случаях, когда время реакции составляет менее 15 минут, степень повышения эффективности продукции сахара может быть низкой, тогда как в случаях, когда время реакции составляет не менее 6 часов, эффективность продукции сахара на единицу времени может быть низкой. Концентрация целлюлозы, температура реакции и pH не ограничены и могут быть такими, как в случае указанных выше условий гидролиза.

Фермент для первичного гидролиза предпочтительно добавляют в массовой доле от 1/1000 до 1/50 по отношению к массу предварительно обработанной целлюлозы. Масса предварительно обработанной целлюлозы может быть вычислена посредством измерения массы твердого вещества, содержащегося в предварительной обработанной целлюлозе. Массу твердых веществ можно вычислить, подвергая предварительно обработанный продукт разделению твердого вещества и жидкости с использованием центрифугирования, мембранного разделения или тому подобного и промывке полученного вещества водой, чтобы отделить и удалить водорастворимые компоненты, с последующей сушкой содержащих воду твердых веществ вплоть до момента, когда масса достигает постоянной величины, и измерения массы твердых веществ. Количество добавляемого фермента можно вычислить, измеряя концентрацию белка в растворе, содержащем свежий фермент, и умножая концентрацию белка на количество добавляемого раствора свежего фермента.

В первичном гидролизате, полученном в результате первичного гидролиза, накапливаются моносахаридные компоненты, получаемые при гидролизе. Разрушающая ксилан активность имеет тенденцию к высоким значениям, особенно в случаях, когда используют регенерированный фермент для первичного гидролиза. То есть, в первичном гидролизате, полученном с использованием регенерированного фермента в ходе первичного гидролиза, образуется большое количество ксилозы. Первичный гидролизат, получаемый в результате первичного гидролиза согласно настоящему изобретению, может быть подвергнут описанному далее вторичному гидролизу как таковой или после осуществления такой операции, как разделения твердого вещества и жидкости, чтобы повысить концентрацию не разрушенных твердых веществ. Кроме того, в случаях, когда осуществляют разделение твердого вещества и жидкости после первичного гидролиза, компонент, получаемый при разделении в виде раствора, может быть использован в качестве жидкого сахара.

Вторичный гидролиз в настоящем изобретении означает, что свежий фермент дополнительно добавляют к гидролизату, получаемому в результате описанного выше первичного гидролиза, чтобы осуществить гидролиз. Для первичного гидролизата не требуется осуществления разделения твердого вещества и жидкости. Кроме того, в случае необходимости можно добавить воду, но добавление воды не является обязательным.

В настоящем изобретении подают и используют для вторичного гидролиза свежий фермент. Это осуществляют в силу следующих причин: 1) так как достаточная эффективность разрушения целлюлозы не может быть получена с использованием количества фермента, подаваемого при первичном гидролизе (свежий фермент или регенерированный фермент), свежий фермент необходимо подавать дополнительно, чтобы получить достаточную эффективность разрушения целлюлозы; и 2) эффективность получения сахара и эффективность регенерации фермента может быть повышена посредством подачи свежего фермента на двух отдельных стадиях, то есть, при первичном гидролизе и вторичном гидролизе. Кроме того, особенно в случаях, когда осуществляют только первичный гидролиз, используя регенерированный фермент, выход сахара во втором и последующих процессах снижается, что не является предпочтительным. Поэтому, при подаче свежего фермента в дополнение к регенерированному ферменту для вторичного гидролиза выход сахара может быть эквивалентен выходу в первом процессе или предыдущем процессе. То есть, в настоящем способе получения жидкого сахара можно повторять получение сахара в концентрации не меньше предварительно определяемого значения.

Добавление свежего фермента для вторичного гидролиза можно осуществлять дробно множество раз (дробная подача). Например, после первичного гидролиза половина свежего фермента, добавляемого для вторичного гидролиза, может быть подана для осуществления гидролиза в течение нескольких часов, с последующей подачей остальной половины свежего фермента. В настоящем изобретении даже в случаях, когда свежий фермент подают дробно несколько раз при вторичном гидролизе, такие операции также включены во вторичный гидролиз.

Время реакции вторичного гидролиза предпочтительно более длительное, чем время реакции первичного гидролиза. Более конкретно, время реакции вторичного гидролиза предпочтительно находится в диапазоне от 1 до 200 часов, более предпочтительно в диапазоне от 6 до 72 часов, еще более предпочтительно в диапазоне от 12 до 24 часов. Хотя время реакции необходимо контролировать в зависимости от количества используемого фермента, температуры реакции, представляющей интерес концентрации сахара и тому подобного, время реакции более 200 часов может вызывать тепловую инактивацию целлюлазы, которая не является предпочтительной с точки зрения регенерации и повторного использования целлюлазы. С другой стороны, в случаях, когда время реакции составляет менее 1 часа, концентрация сахара в получаемом гидролизате может быть недостаточной.

Фермент для вторичного гидролиза предпочтительно добавляют при соотношении масс от 1/1000 до 1/50 по отношению к массе предварительной обработанной целлюлозы. Масса предварительно обработанной целлюлозы может быть рассчитана на основании массы сухого остатка предварительно обработанной целлюлозы перед первичным гидролизом.

Количества добавляемого фермента в ходе первичного гидролиза и вторичного гидролиза предпочтительно удовлетворяет следующему соотношению: количество фермента, добавляемого для первичного гидролиза > количества фермента, добавляемого для вторичного гидролиза. Добавленное количество в данном случае вычисляют, умножая концентрацию белка свежего фермента или регенерированного фермента на количество подаваемого раствора фермента. Что касается измерения концентрации белка, то концентрацию белка регенерированного фермента и свежего фермента можно рассчитать описанным выше известным способом. Концентрация белка в данном случае просто означает концентрацию белка, независимо от того является ли белок полученным из целлюлазы компонентом или другим компонентом. В настоящем изобретении, когда добавленное количество удовлетворяет указанному соотношению, может быть достигнута более высокая продукция сахара, и эффективность регенерации фермента также может быть повышена.

Настоящее изобретение предусматривает стадию, на которой вторичный гидролизат подвергают разделению твердого вещества и жидкости с получением жидкого сахара, из которого выделенную из нитчатого гриба целлюлазу затем извлекают; и стадию повторного использования в первичном гидролизе регенерированной выделенной из нитчатого гриба целлюлазы. Стадии описаны ниже в указанном порядке.

Разделение твердого вещества и жидкости вторичного гидролизата осуществляют с целью разделения жидкого сахара и гидролизного остатка, получаемого при вторичном гидролизе. «Жидкий сахар» означает раствор сахара, получаемый в результате описанного выше гидролиза целлюлозы. Сахара обычно классифицируют на основе степени полимеризации моносахаридов, и делят на моносахариды, такие как глюкоза и ксилоза; олигосахариды, получаемые в результате сопровождаемой дегидратацией конденсации от 2 до 9 моносахаридов; и полисахариды, образуемые в результате сопровождаемой дегидратацией конденсации не менее чем 10 моносахаридов. Жидкий сахар, получаемый с применением настоящего изобретения, содержит глюкозу и ксилозу в качестве основных компонентов и, хотя и в небольших количествах, олигосахариды, такие как целлобиоза; и моносахариды, такие как арабиноза и манноза. Более конкретно, способ анализа моносахаридов, олигосахаридов и полисахаридов, растворенных в воде, может представлять собой ВЭЖХ, с помощью которой может быть осуществлено определение количества на основе сравнения со стандартным образцом. Способ разделения твердого вещества и жидкости не ограничен, и примеры способа разделения твердого вещества и жидкости включают центрифугирование с использованием шнекового декантера или тому подобного, фильтрование с использованием фильтр-пресса или тому подобного, и мембранное разделение с использованием мембраны для микрофильтрации или тому подобного.

Во вторичном гидролизате выделенная из нитчатого гриба целлюлаза существует в растворенном в жидком сахаре состоянии или адсорбирована на твердом остатке в виде неразрушенного материала. Такая выделенная из нитчатого гриба целлюлаза может быть регенерирована посредством разделения твердого вещества и жидкости и извлечения со стороны жидкого сахара. Предпочтительные примеры регенерации выделенной из нитчатого гриба целлюлазы из жидкого сахара включают способ, в котором жидкий сахар фильтруют через ультрафильтрационную мембрану и целлюлазу извлекают со стороны подачи. Примеры ультрафильтрационной мембраны, которую можно использовать, включают мембраны, изготовленные из таких материалов, как полиэфирсульфон (PES), поливинилиденфторид (PVDF) и регенерированная целлюлоза, предпочтительно используют ультрафильтрационную мембрану, изготовленную из синтетического полимерного материала, такого как PES или PVDF. Предел отсечения молекулярной массы ультрафильтрационной мембраны не ограничен, при условии, что используемая целлюлаза может быть эффективно регенерирована, и ультрафильтрационная мембрана предпочтительно имеет предел отсечения молекулярной массы в диапазоне от 1000 до 50000. Количество регенерированного фермента варьирует в зависимости от количества свежего фермент, добавляемого для вторичного гидролиза, и поэтому не ограничено.

В некоторых случаях в ходе осуществления повторения регенерации и повторного использования в настоящем изобретении и, особенно, в процессе отделения регенерируемого фермента с использованием ультр