Способ неинвазивной экспресс-диагностики воспалительного процесса в органах дыхания у телят

Способ неинвазивной экспресс-диагностики воспалительного процесса в органах дыхания у телят

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Изобретение относится к ветеринарии и может быть использовано для неинвазивной экспресс-диагностики воспалительного процесса в органах дыхания у телят по составу равновесной газовой фазы над пробами конденсата выдыхаемого воздуха.

Для прижизненной диагностики воспалительного процесса в органах дыхания у телят в настоящее время используют комплекс клинических и лабораторных методов исследования [Шахов А.Г. Респираторные болезни телят / А.Г. Шахов, А.И. Ануфриев, С.М. Сулейманов, А.И. Золотарев, С.И. Першина // Комплексная экологически безопасная система ветеринарной защиты здоровья животных. - М.: ФГНУ «Росинформагротех», 2000. - С. 163-186]. Клинические методы направлены на выявление изменений физиологических параметров организма: температуры тела, частоты сердечных сокращений и дыхательных движений, минутного объема дыхания и дыхательного объема (глубины дыхания), наличия хрипов, одышки, кашля, истечений из носовой полости. Лабораторные исследования (гематологические, иммунологические, биохимические) показателей крови - лейкограммы, скорости оседания эритроцитов, классов иммуноглобулинов, концентрации С-реактивного белка, интерлейкинов, дефензинов, содержания кортизола, антиоксидантов, продуктов пероксидации и др. - направлены на выявление воспалительного процесса в организме телят, однако все они неспецифичны и изменяются при воспалении любой локализации (бронхолегочное воспаление, омфалит, энтерит, гепатит и т.д.). Окончательный диагноз на инфекционный характер респираторной патологии у телят ставят на основании результатов комплексных лабораторных исследований носовых и трахеальных смывов, мокроты и бронхоальвеолярного лаважа с использованием вирусологических, бактериологических и молекулярно-генетических методов исследований.

Недостатками способа являются: инвазивность (травматичность) получения биологического материала (кровь, носовые и трахеальные смывы, бронхо-альвеолярный лаваж), значительные материальные и временные затраты (до 72 часов) на проведение исследований, возможность получения ложных отрицательных результатов, поскольку воспаление дыхательных путей (бронхит, трахеобронхит) у телят часто имеет стертую клиническую картину и на ранних стадиях развития протекает бессимптомно, необходимость специального лабораторного оборудования и высококвалифицированного персонала.

Известен способ ранней диагностики трахеобронхита у телят, основанный на учете реакции животного на внутривенное введение 0,6% раствора перекиси водорода на 0,9% растворе хлорида натрия в дозе 0,4 мл на кг массы тела [RU 2372051 C1, A61D 99/00, А61К 33/14, 33/40. 10.11.2009, Бюл. №31]. В случае возникновения кашлевой реакции через 1-7 минут после введения указанного раствора диагностируют трахеобронхит. Способ позволяет выявлять повышение чувствительности слизистой оболочки трахеи и бронхов на ранних этапах течения болезни еще до развития ее клинических признаков.

Недостатком способа является его инвазивность, трудоемкость и невозможность использовать у телят в первые дни жизни из-за состояния оксидативного стресса.

Для оценки локализации воспалительного процесса и структурно-морфологических изменений в органах дыхания у телят предложены рентгенологические методы (рентгеноскопия, рентгенография, флюорография) и бронхоскопия [Бакаев О.А. Неспецифические бронхопневмонии телят в промышленном комплексе по выращиванию и откорму молодняка крупного рогатого скота и меры их профилактики: Дисс.…канд. вет.наук / О.А. Бакаев. - Душанбе, 1985. - 168 с.] и [Мустакимов, Р.Г. Флюорография в ветеринарии / Р.Г. Мустакимов. - 2-е изд., перераб. и доп. - М.: Агропромиздат, 1985. - 111 с.].

Недостатками их являются: значительная стоимость оборудования и расходных материалов, необходимость наличия высококвалифицированного персонала, трудоемкость процедуры исследования, радиационная нагрузка на животных, возможность получения ложных отрицательных результатов у новорожденных телят.

Для диагностики воспалительного процесса в органах дыхания у телят информативным является исследование конденсата выдыхаемого воздуха (КВВ) - органоспецифического биологического материала, получаемого неинвазивным путем [Золотарев А.И. Ранняя диагностика бронхита у новорожденных телят / А.И. Золотарев, А.Е. Черницкий, М.И. Рецкий, Л.И. Ефанова // Ветеринария. - 2013. - №3. - С.43-47].

Однако концентрация веществ, которые содержатся в КВВ и характеризуют различные параметры состояния бронхолегочной системы у телят, чрезвычайно мала и не всегда может быть выявлена традиционными лабораторными тестами. Поэтому для исследования КВВ необходима разработка принципиально новых аналитических подходов и методов, которые обладали бы значительно более высокой чувствительностью по сравнению с имеющимися в настоящее время, а также превосходили их по скорости анализа и доступности для практического применения в ветеринарии.

В качестве прототипа выбран способ диагностики воспалительного процесса в органах дыхания у телят по составу КВВ, включающий определение в КВВ уровня pH, концентрации малонового диальдегида, общего белка, активности гамма-глутамилтрансферазы, аланинаминотрансферазы и аспартатаминотрансферазы [Черницкий А. Е. Методическое пособие по прогнозированию и ранней диагностике респираторных болезней у телят / А.Е. Черницкий, Л.И. Ефанова, А.И. Золотарев, А.Г. Шахов, С.В. Шабунин, М.И. Рецкий. - Воронеж: Издательство «Истоки», 2013. - 48 с: ил. - 1000 экз. - ISBN 978-5-88242-993].

Недостатками способа являются: невозможность проведения исследований непосредственно по месту нахождения животного (в хозяйстве), длительное время от момента забора биоматериала до получения результатов исследований, необходимость специального помещения, лабораторного оборудования и высококвалифицированного персонала.

Техническая задача изобретения заключается в разработке способа неинвазивной экспресс-диагностики воспалительного процесса в органах дыхания у телят, позволяющего упростить диагностику воспалительного процесса в органах дыхания у телят, существенно снизить экономические и временные затраты на клинические и лабораторные исследования, анализ их результатов, сформировать базу данных.

Для решения технической задачи изобретения предложен способ неинвазивной экспресс-диагностики воспалительного процесса в органах дыхания у телят, включающий сбор конденсата выдыхаемого воздуха и анализ равновесной газовой фазы над ним с применением детектирующего устройства типа «электронный нос» на основе массива из трех пьезосенсоров с базовой частотой колебаний 10-15 МГц, на электроды которых нанесены пленки из ацетоновых растворов бромкрезолового синего (БКС), тритона Х-100 (ТХ-100) и хлороформной суспензии многослойных углеродных нанотрубок (МУНТ) с массой покрытия после удаления растворителя 4-10 мкг, регистрацию в программе «электронного носа» максимальных сигналов массива пьезосенсоров за 60 с и расчет показателя воспаления (ПВ) по формуле:

где ΔF_БKC - наибольшее изменение частоты колебания пьезосенсора с пленкой БКС,

ΔF_ТХ-100 - наибольшее изменение частоты колебания пьезосенсора с пленкой ТХ-100,

ΔF_МУНТ - наибольшее изменение частоты колебания пьезосенсора с пленкой МУНТ,

диагностирование в органах дыхания у телят воспалительного процесса при значении ПВ больше 1,2±0,1. Для сбора конденсата выдыхаемого воздуха используют устройство для сбора конденсата выдыхаемого воздуха у животных, состоящее из конденсатора, помещенного в холодильную камеру, снабженную теплоизоляционным кожухом и съемной крышкой с отверстием, маску дыхательную, снабженную клапанами вдоха и выдоха, и спирометр, а конденсатор выполнен в виде сменного контейнера-накопителя, установленного в холодильной камере, причем контейнер-накопитель соединен со спирометром и клапаном выдоха маски дыхательной помещенными в теплоизоляционный кожух трубками.

Способ неинвазивной экспресс-диагностики воспалительного процесса в органах дыхания у телят осуществляется следующим образом.

Для неинвазивной экспресс-диагностики воспалительного процесса в органах дыхания у телят используют устройство для сбора конденсата выдыхаемого воздуха у животных [RU 134772 U1, А61B 5/00, 27.11.2013, Бюл. №33] и детектирующее устройство типа «электронный нос» [Кучменко, Т.А. Инновационные решения в аналитическом контроле: учебное пособие / Т.А. Кучменко. - Воронеж: Воронежская государственная технологическая академия, 2009, ISBN 978-5-89448-596-6, с. 26-62] на основе массива из 3 пьезосенсоров с базовой частотой колебаний 10-15 МГц, на электроды которых наносят пленки из ацетоновых растворов бромкрезолового синего (БКС), тритона Х-100 (ТХ-100) и хлороформной суспензии многослойных углеродных нанотрубок (МУНТ) с массой покрытия после удаления растворителя 4-10 мкг (изменение массы покрытия на электродах пьезосенсоров, природы сорбентов, алгоритмов обработки аналитической информации ухудшает метрологические характеристики способа, способствует возрастанию доли ошибочных выводов). Подготовленное детектирующее устройство подключают к компьютеру и управляют программой, регистрирующей в режиме реального времени сигналы массива пьезосенсоров в виде хроночастотограмм, определяющей наибольшие изменения частоты колебания пьезосенсоров за время измерения (ΔF_i, Гц). При обследовании телят с помощью детектирующего устройства типа «электронный нос» на наличие воспалительного процесса в органах дыхания определяют условный показатель воспаления (ПВ), для чего собирают конденсат выдыхаемого воздуха объемом 0,5 см³ в стерильную пробирку объемом 5 см³ с притертой полистирольной крышкой и вкалывают в ячейку детектирующего устройства 3 см³ равновесной газовой фазы над пробой конденсата выдыхаемого воздуха, с помощью программы регистрируют максимальные сигналы массива пьезосенсоров за 60 с, после чего включают компрессор на 1-2 минуты для очистки ячейки детектирования и пьезосенсоров, затем рассчитывают условный показатель воспаления (ПВ) по максимальным сигналам пьезосенсоров, по формуле:

если значение условного показателя воспаления больше 1,2±0,1, то в органах дыхания у телят идет воспалительный процесс.

Способ неинвазивной экспресс-диагностики воспалительного процесса в органах дыхания у телят поясняется примерами.

Примеры конкретного выполнения

Пример №1. Теленок 8840, возраст 1 месяц, с диагнозом острая катаральная бронхопневмония. При клиническом исследовании: глухой кашель с выбросом мокроты, двустороннее катаральное носовое истечение, гиперемия видимых слизистых оболочек носовой и ротовой полости, носогубного зеркала, конъюнктивы; при аускультации грудной клетки прослушиваются влажные крупно- и мелкопузырчатые хрипы, при перкуссии - в местах поражения притупленный звук, повышенная чувствительность трахеи и межреберных промежутков при пальпации, смешанная одышка, дыхательный объем снижен до 271 мл, температура тела повышена до 40,5°C. Животное лежит с вытянутой шеей, аппетит отсутствует. Гематологические признаки воспаления: лейкоцитоз (12,6×10%), сдвиг лейкоцитарной формулы влево; биохимические - повышение концентрации С-реактивного белка в сыворотке крови (более 6 мг/л). При бактериологическом исследовании трахеальных смывов выделены Е. coli 09, 026, Staph, epidermidis, Ent. faecalis (умеренный рост), микроскопические грибы Penicillium spp., при молекулярно-генетических анализе методом ПЦР - геном патогенных микоплазм. Рассчитанный условный ПВ=1,4.

Пример №2. Теленок 8848, возраст 1 месяц, с диагнозом хроническая катаральная бронхопневмония. При клиническом исследовании: глухой кашель с выбросом мокроты, левостороннее катаральное носовое истечение, гиперемия слизистой оболочки носовой полости и конъюнктивы; при аускультации грудной клетки - жесткое везикулярное дыхание, влажные крупно- и мелкопузырчатые хрипы, при перкуссии поля легких - очаги притупления, чувствительность трахеи и межреберных промежутков при пальпации повышена, смешанная одышка, тахикардия (100 сердечных сокращений в минуту), дыхательный объем снижен до 296 мл, температура тела 39,0°C; истощение, угнетение, снижение аппетита. Гематологические признаки воспаления не выражены в связи с декомпенсацией гранулоцитарной системы; концентрация С-реактивного белка в сыворотке крови повышена (более 6 мг/л). При бактериологическом исследовании трахеальных смывов выделены Е. coli 08, 0115, Staph, epidermidis, Ent. faecalis (умеренный рост), микроскопические грибы Asp.fumigatus, Rhizopus nigricans, при молекулярно-генетических анализе методом ПЦР - геном патогенных микоплазм и вируса диареи-болезни слизистых крупного рогатого скота. Рассчитанный условный ПВ=1,8.

Пример №3. Теленок 8877, возраст 1 месяц, с диагнозом субклинический трахеобронхит. При клиническом исследовании: температура субфебрильная 39,6°C; частота сердечных сокращений и дыхательных движений - в физиологических пределах, дыхательный объем 633 мл. Видимые слизистые оболочки носовой и ротовой полости бледно-розовые, чистые. При пальпации гортани и трахеи изменения консистенции тканей, повышения температуры и чувствительности не выявлено. Носовых истечений и кашля нет. Дыхание свободное, физиологичное. Перкуторно-легочной звук, при аускультации легких - везикулярное дыхание, хрипов нет. Аппетит хороший. При провокационной пробе с внутривенным введением 0,6% раствора перекиси водорода на 0,9% растворе хлорида натрия в дозе 0,4 мл на кг массы тела - кашель на 3-й минуте после введения. Гематологические признаки воспаления не выражены в связи с декомпенсацией гранулоцитарной системы; концентрация С-реактивного белка в сыворотке крови повышена (более 6 мг/л). При бактериологическом исследовании трахеальных смывов выделены Е. coli O115 и Ent. faecalis (умеренный рост), при молекулярно-генетических анализе методом ПЦР - геном патогенных микоплазм и вируса диареи-болезни слизистых крупного рогатого скота. Рассчитанный условный ПВ=1,35.

Пример №4. Теленок 8826, возраст 1 месяц, здоров со стороны бронхолегочной системы. При клиническом исследовании: температура 38,9°C; частота сердечных сокращений и дыхательных движений - в физиологических пределах, дыхательный объем 624 мл. Видимые слизистые оболочки носовой и ротовой полости бледно-розовые, чистые. Носовых истечений и кашля нет. Дыхание свободное, физиологичное. При перкуссии легочной звук, при аускультации легких - везикулярное дыхание, хрипов нет. Аппетит хороший. Провокационная проба с внутривенным введением 0,6% раствора перекиси водорода на 0,9% растворе хлорида натрия в дозе 0,4 мл на кг массы тела отрицательная. Гематологические и биохимические признаки воспаления отсутствуют. При бактериологическом исследовании трахеальных смывов выделен Ent. faecium (скудный рост). Рассчитанный условный ПВ=1,0.

Пример №5. Теленок 8820, возраст 1 месяц, здоров со стороны бронхолегочной системы. При клиническом исследовании: температура 38,8°C; частота сердечных сокращений и дыхательных движений - в пределах в физиологических границ, дыхательный объем 587 мл. Видимые слизистые оболочки носовой и ротовой полости бледно-розовые, чистые. Носовых истечений и кашля нет. Дыхание свободное, физиологичное. При перкуссии легочной звук, при аускультации легких - везикулярное дыхание, хрипов нет. Аппетит хороший. Провокационная проба с внутривенным введением 0,6% раствора перекиси водорода на 0,9% растворе хлорида натрия в дозе 0,4 мл на кг массы тела [2] отрицательная. Гематологические и биохимические признаки воспаления отсутствуют. При бактериологическом исследовании трахеальных смывов выделены Ent. faecium и Staph, epidermidis (скудный рост). Рассчитанный условный ПВ=0,9.

Из представленных примеров видно, что предлагаемый способ неинвазивной экспресс-диагностики воспалительного процесса в органах дыхания у телят по составу равновесной газовой фазы над пробами конденсата выдыхаемого воздуха отличается высокой чувствительностью, простотой и надежностью, позволяет ускорить и упростить диагностику воспалительного процесса в органах дыхания у телят, существенно снизить себестоимость и временные затраты на клинические и лабораторные исследования.

1. Способ неинвазивной экспресс-диагностики воспалительного процесса в органах дыхания у телят, включающий сбор конденсата выдыхаемого воздуха и анализ равновесной газовой фазы над ним с применением детектирующего устройства типа «электронный нос» на основе массива из трех пьезосенсоров с базовой частотой колебаний 10-15 МГц, на электроды которых нанесены пленки из ацетоновых растворов бромкрезолового синего (БКС), тритона Х-100 (ТХ-100) и хлороформной суспензии многослойных углеродных нанотрубок (МУНТ) с массой покрытия после удаления растворителя 4-10 мкг, регистрацию в программе «электронного носа» максимальных сигналов массива пьезосенсоров за 60 с и расчет показателя воспаления (ПВ) по формуле: где ΔF_БKC - наибольшее изменение частоты колебания пьезосенсора с пленкой БКС,ΔF_ТХ-100 - наибольшее изменение частоты колебания пьезосенсора с пленкой ТХ-100,ΔF_МУНТ - наибольшее изменение частоты колебания пьезосенсора с пленкой МУНТ,диагностирование в органах дыхания у телят воспалительного процесса при значении ПВ больше 1,2±0,1.

2. Способ по п. 1, в котором для сбора конденсата выдыхаемого воздуха используют устройство для сбора конденсата выдыхаемого воздуха у животных, состоящее из конденсатора, помещенного в холодильную камеру, снабженную теплоизоляционным кожухом и съемной крышкой с отверстием, маску дыхательную, снабженную клапанами вдоха и выдоха, и спирометр, а конденсатор выполнен в виде сменного контейнера-накопителя, установленного в холодильной камере, причем контейнер-накопитель соединен со спирометром и клапаном выдоха маски дыхательной помещенными в теплоизоляционный кожух трубками.