Способы лечения воспаления в нейронной ткани с применением моноклонального антитела или его связывающего фрагмента

Способы лечения воспаления в нейронной ткани с применением моноклонального антитела или его связывающего фрагмента

Иллюстрации

Показать все

Реферат

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Воспалительный процесс активирует нервную систему, вызывая боль при воспалении и нарушение моторной функции. Раздражение чувствительных нервов становится причиной расширения кровеносных сосудов и экстравазации плазмы, приводящих к нейрогенному воспалению и раздражению, вызывающему сенсорное возбуждение, гиперчувствительность и боль.

Нейрогенное воспаление вызывается активацией ноцицептивных и термочувствительных окончаний в тканях и может вызываться врожденными состояниями, такими как аутоиммунные заболевания, включающими в себя аллергию, вирусную инфекцию, а также и травмой. Нейрогенное воспаление при данных состояниях может влиять на соматосенсорную систему, которая состоит из различных сенсорных рецепторов, ответственных за ощущения, такие как давление, прикосновение, температура, боль, зуд, щекотка, покалывание и онемение. Активированные нервы могут бесконечно поддерживать хроническое воспаление, индуцируя выделение цитокинов, активируя моноциты и хемотаксис.

Белки, активные при нейрогенном воспалении, могут служить мишенями для терапевтических подходов в диагностике и лечении заболеваний.

Примером лекарственного средства, применяемого для лечения боли, является нейронтин (габапентин), который применяют для лечения диабетической периферийной невропатии, а также постгерпетической невралгии. Таким образом, существует потребность в дополнительном лекарственном препарате для лечения невропатической боли.

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Следующие ниже определения предназначены для того, чтобы облегчить понимание описанных в настоящем описании изобретений.

Термин «антитело» или «пептид(ы) антитела» означают интактное антитело или его связывающий фрагмент, который конкурирует с интактным антителом за специфическое связывание и включает в себя химерные, гуманизированные, полностью человеческие и биспецифические антитела. В определенных вариантах осуществления связывающие фрагменты получены технологиями рекомбинантных ДНК. В дополнительных вариантах осуществления связывающие фрагменты получены ферментативным или химическим расщеплением интактных антител. Связывающие фрагменты включают в себя, в качестве неограничивающих примеров, Fab, Fab', F(ab').sub.2, Fv и одноцепочечные антитела.

Термин «выделенное антитело» означает антитело, которое идентифицировали и отделили и/или извлекли из компонента его естественного окружения. Загрязняющие компоненты его естественного окружения представляют собой вещества, которые могли бы помешать диагностическому или терапевтическому применению антитела и которые могут включать в себя ферменты, гормоны и другие белковые или небелковые растворы. В вариантах осуществления антитело будет очищено (1) до более 95% по массе антитела, как определено по способу Лоури, и включая более 99% по массе, (2) до степени, достаточной для получения по меньшей мере 15 остатков N-концевой или внутренней аминокислотной последовательности при помощи секвенатора с вращающимся стаканом, или (3) до однородности при SDS-PAGE в восстанавливающих и невосстанавливающих условиях, применяя окрашивание кумасси голубым или, предпочтительно, серебром. Выделенное антитело включает в себя антитело in situ в рекомбинантных клетках, поскольку не будет присутствовать по меньшей мере один компонент естественного окружения антитела. Как правило, тем не менее, выделенное антитело получают посредством по меньшей мере одной стадии очистки.

«Вариант» антитела против IL-31 означает в настоящем описании молекулу, которая отличается по аминокислотной последовательности от «исходной» аминокислотной последовательности антитела против IL-31 вследствие добавления, удаления и/или замены одного или более аминокислотных остатков в исходной последовательности антитела. При осуществлении вариант содержит одну или более аминокислотных замен в одном или более гипервариабельных участках исходного антитела. Например, вариант может содержать по меньшей мере одну, например, от приблизительно одной до приблизительно десяти и от приблизительно двух до приблизительно пяти замен в одном или более гипервариабельных участках исходного антитела. Как правило, вариант будет содержать аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере 75% идентичности аминокислотной последовательности с последовательностями вариабельных доменов тяжелой или легкой цепи исходного антитела, более предпочтительно по меньшей мере 80%, более предпочтительно по меньшей мере 85%, более предпочтительно по меньшей мере 90% и наиболее предпочтительно по меньшей мере 95%. Идентичность или гомология в отношении данной последовательности определена в настоящем описании в качестве процента аминокислотных остатков в последовательности-кандидате, которые идентичны остаткам исходного антитела, после выравнивания последовательностей и внесения пропусков, если это необходимо, для достижения максимального процента идентичности последовательности. Ни одно из N-концевых, C-концевых или внутренних удлинений, делеций или вставок в последовательность антитела не следует рассматривать в качестве влияющих на идентичность последовательности или гомологию. Вариант сохраняет способность связывать IL-31 человека и предпочтительно обладает свойствами, которые превосходят свойства исходного антитела. Например, вариант может обладать более высокой аффинностью связывания, повышенной способностью ингибировать вызванную IL-31 стимуляцию иммунных клеток. Для анализа таких свойств следует сравнивать Fab-форму варианта с Fab-формой исходного антитела или полноразмерную форму варианта с полноразмерной формой исходного антитела, например, поскольку было обнаружено, что структура антитела против IL-31 воздействует на его активность в описанных в настоящем описании тестах на биологическую активность. Особенно интересный в настоящем описании вариант антитела представляет собой вариант, который демонстрирует увеличение биологической активности при сравнении с исходным антителом по меньшей мере приблизительно в 10 раз, предпочтительно по меньшей мере приблизительно в 20 раз и наиболее предпочтительно по меньшей мере приблизительно в 50 раз.

Применяемый в настоящем описании термин «исходное антитело» означает антитело, которое кодируется аминокислотной последовательностью, применяемой для получения варианта. Предпочтительно, исходное антитело содержит человеческий каркасный участок и, если присутствует, содержит константную область антитела человека. Например, исходное антитело может представлять собой гуманизированное или человеческое антитело.

Термин «агонист» означает любое соединение, включающее в себя белок, полипептид, пептид, антитело, фрагмент антитела, большую молекулу или небольшую молекулу (менее 10 кДа), которое увеличивает активность, активацию или функцию другой молекулы. Агонисты IL-31 вызывают, например: стимуляцию NK-клеток, субпопуляции T-клеток и субпопуляции B-клеток и дендритных клеток.

Термин «антагонист» означает любое соединение, включающее в себя белок, полипептид, пептид, антитело, фрагмент антитела, большую молекулу или небольшую молекулу (менее 10 кДа), которое снижает активность, активацию или функцию другой молекулы. Антагонисты IL-31 вызывают: снижение иммунной функции NK-клеток, субпопуляции T-клеток и субпопуляции B-клеток и дендритных клеток; связывание IL-31 такое, что взаимодействие белка IL-31 блокируется, ингибируется, снижается, оказывается обратное действие или нейтрализуется.

«Бивалентное антитело», отличающееся от «мультиспецифического» или «мультифункционального» антитела, в определенных вариантах осуществления, как предполагают, содержит участки связывания, обладающие идентичной антигенной специфичностью.

«Биспецифическое» или «бифункциональное» антитело представляет собой гибридное антитело, содержащее две различные пары тяжелой/легкой цепи и два различных участка связывания. Биспецифические антитела можно получить различными способами, включающими в себя в качестве неограничивающих примеров слияние гибридом или сшивки Fab'-фрагментов. Смотрите, например, Songsivilai & Lachmann, Clin. Exp. Immunol. 79: 315-321 (1990); Kostelny et al., J. Immunol. 148: 1547-1553 (1992).

Термин «химерное антитело» или «химерные антитела» означает антитела, чьи гены легких и тяжелый цепей сконструированы, обычно посредством генной инженерии, из генов вариабельной и константной областей иммуноглобулина, принадлежащих к различным видам. Например, вариабельные сегменты генов из моноклонального антитела мыши можно объединить с человеческими константными сегментами, такими как гамма 1 и гамма 3. Типичное терапевтическое химерное антитело, таким образом, представляет собой гибридный белок, составленный из вариабельного или антигенсвязывающего домена из антитела мыши и константный домен из антитела человека, хотя могут применяться и другие виды млекопитающих.

Термин «эпитоп» включает в себя любую белковую детерминанту, способную к специфическому связыванию с иммуноглобулином или рецептором T-клетки. Эпитопные детерминанты обычно состоят из химически активных поверхностных группировок молекул, таких как аминокислоты или боковые цепи сахаров и обычно обладают определенными трехмерными структурными характеристиками, а также и определенными зарядными характеристиками. Конкретнее, применяемый в настоящем описании термин «эпитоп IL-31» означает части полипептида IL-31, обладающие антигенной или иммуногенной активностью у животного, предпочтительно у млекопитающего и наиболее предпочтительно у мыши или человека. Эпитоп, обладающий иммуногенной активностью, представляет собой часть полипептида IL-31, которая вызывает иммунный ответ у животного. Эпитоп, обладающий антигенной активностью, представляет собой часть полипептида IL-31, с которой антитело связывается иммуноспецифически, как определено любым способом, хорошо известным в данной области, например, иммуноанализами. Антигенные эпитопы не обязательно должны быть иммуногенными.

Применяемый в настоящем описании термин «меченый эпитоп» означает антитело против IL-31, соединенное с «меткой эпитопа». Полипептид метки эпитопа содержит достаточное количество остатков, чтобы обеспечить присутствие эпитопа, против которого можно получить антитело, все же достаточно короткий такой, что он не влияет на активность антитела к IL-31. Метка эпитопа предпочтительно достаточно уникальна так, чтобы антитело по существу не реагировало перекрестно с другими эпитопами. Подходящие полипептиды метки в общем случае содержат по меньшей мере 6 аминокислотных остатков и обычно в диапазоне приблизительно 8-50 аминокислотных остатков (предпочтительно в диапазоне приблизительно 9-30 остатков). Примеры включают в себя полипептид метки НА гриппа и его антитело 12CA5 (Field et al. Mol. Cell. Biol. 8: 2159-2165 (1988)); метку c-myc и ее антитела 8F9, 3C7, 6E10, G4, B7 и 9E10 (Evan et al., Mol. Cell. Biol. 5(12): 3610-3616 (1985)); и метку гликопротеина D (gD) вируса простого герпеса и ее антитело (Paborsky et al., Protein Engineering 3(6): 547-553 (1990)). В определенных вариантах осуществления метка эпитопа представляет собой «сохраняющий связывающийся с рецептором эпитоп». Применяемый в настоящем описании термин «сохраняющий связывающийся с рецептором эпитоп» означает эпитоп Fc-области молекулы IgG (например, IgG₁, IgG₂, IgG₃ или IgG₄), которая ответственна за увеличение периода полувыведения молекулы IgG из сыворотки крови in vivo.

Применяемый в настоящем описании термин «фрагмент» означает пептид или полипептид, содержащий аминокислотную последовательность по меньшей мере из 5 следующих друг за другом аминокислотных остатков, по меньшей мере из 10 следующих друг за другом аминокислотных остатков, по меньшей мере из 15 следующих друг за другом аминокислотных остатков, по меньшей мере из 20 следующих друг за другом аминокислотных остатков, по меньшей мере из 25 следующих друг за другом аминокислотных остатков, по меньшей мере из 40 следующих друг за другом аминокислотных остатков, по меньшей мере из 50 следующих друг за другом аминокислотных остатков, по меньшей мере из 60 следующих друг за другом аминокислотных остатков, по меньшей мере из 70 следующих друг за другом аминокислотных остатков, по меньшей мере из 80 следующих друг за другом аминокислотных остатков, по меньшей мере из 90 следующих друг за другом аминокислотных остатков, по меньшей мере из 100 следующих друг за другом аминокислотных остатков, по меньшей мере из 125 следующих друг за другом аминокислотных остатков, по меньшей мере из 150 следующих друг за другом аминокислотных остатков аминокислотной последовательно полипептида IL-31 или антитела, которое иммуноспецифически связывается с полипептидом IL-31.

Применяемый в настоящем описании термин «иммуноглобулин» означает белок, состоящий из одного или более полипептидов, по существу кодируемых генами иммуноглобулина. Одна конфигурация иммуноглобулина составляет основную структурную единицу антитела. Данная конфигурация представляет собой тетрамер и состоит из двух идентичных пар цепей иммуноглобулина, причем каждая пара содержит одну легкую и одну тяжелую цепь. В каждой паре, вариабельные области легкой и тяжелой цепей совместно ответственны за связывание антигена и константные области ответственны за эффекторные функции антитела.

Полноразмерные «легкие цепи» иммуноглобулина кодируются геном вариабельной области на NH₂-конце и геном каппа или лямбда константной области на COOH-конце. Полноразмерные «тяжелые цепи» иммуноглобулина сходным образом кодируются геном вариабельной области и одним из других упомянутых выше генов константной области (приблизительно 330 аминокислот). Тяжелые цепи классифицируются как гамма, мю, альфа, дельта или эпсилон и определяют изотип антитела как IgG (включающего в себя IgG₁, IgG₄), IgM, IgA, IgD и IgE, соответственно. В легких и тяжелых цепях вариабельные и константные области соединяются с областью «J» из приблизительно 12 или более аминокислот, с тяжелой цепью, также включающей область «D» приблизительно из 10 дополнительных аминокислот. (В общем смотрите Fundamental Immunology (Paul, W., ed., 2nd ed. Raven Press, N. Y., 1989), Ch. 7 (полностью включенную в качестве ссылки).

Вариабельная область легкой или тяжелой цепи иммуноглобулина состоит из «каркасного участка», прерываемого тремя гипервариабельными участками. Таким образом, термин «гипервариабельный участок» означает аминокислотные остатки антитела, которые ответственны за связывание антигена. Гипервариабельный участок содержит аминокислотные остатки из «определяющей комплементарность области» или «CDR» (смотрите Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991) и Chothia and Lesk, 1987, J. Mol. Biol. 196: 901-917) (обе из которых включены в настоящее описание в качестве ссылки). Остатки «каркасного участка» или «FR» представляют собой такие остатки вариабельного домена, за исключением остатков гипервариабельного участка, как определено в настоящем описании. Последовательности каркасных участков различных легких или тяжелых цепей относительно консервативны среди видов. Таким образом, «человеческий каркасный участок» представляет собой каркасный участок, который по существу идентичен (приблизительно на 85% или более, обычно на 90-95% или более) каркасному участку встречающегося в природе иммуноглобулина человека. Каркасный участок антитела, который объединен с каркасными участками составляющих легких и тяжелых цепей, служит для позиционирования и выравнивания CDR. CDR прежде всего ответственны за связывание с эпитопом антигена.

Соответственно, термин «гуманизированный» иммуноглобулин означает иммуноглобулин, содержащий человеческий каркасный участок и одну или более CDR из нечеловеческого (обычно мышиного или крысиного) иммуноглобулина. Нечеловеческий иммуноглобулин, дающий CDR, называют «донором», и иммуноглобулин человека, дающий каркас, называют «акцептором». Константные области не должны присутствовать, но если есть, они должны быть по существу идентичны константным областям иммуноглобулина человека, то есть идентичными по меньшей мере приблизительно на 85-90%, предпочтительно приблизительно на 95% или более. Следовательно, все части гуманизированного иммуноглобулина, кроме возможно CDR, по существу идентичны соответствующим частям природных последовательностей иммуноглобулина человека. «Гуманизированное антитело» представляет собой антитело, содержащее гуманизированную легкую цепь и гуманизированную тяжелую цепь иммуноглобулина. Например, гуманизированное антитело не охватывало бы типичное химерное антитело, как определено выше, например, поскольку вся вариабельная область химерного антитела является нечеловеческой.

Применяемый в настоящем описании термин «человеческое антитело» включает в себя и антитело, которое содержит аминокислотную последовательность иммуноглобулина человека и включает в себя антитела, выделенные из библиотек иммуноглобулинов человека или из животных, трансгенных в отношении одного или более иммуноглобулинов человека, и которые не экспрессируют эндогенных иммуноглобулинов, как описано, например, Kucherlapati et al. в патенте США № 5939598.

Термин «генетически измененные антитела» означает антитела, в которых аминокислотные последовательности отличаются от последовательности нативного антитела. Из-за применимости технологий рекомбинантных ДНК при получении антител, не следует ограничиваться аминокислотными последовательностями, обнаруженными в природных антителах; антитела можно переконструировать, чтобы получить необходимые характеристики. Возможные изменения представляют собой множество изменений и находятся в диапазоне от изменения только одной или нескольких аминокислот до полной реконструкции, например, вариабельной или константной области. Изменения в константной области будут, в общем случае, предприняты для того, чтобы улучшить или изменить характеристики, такие как фиксация, взаимодействие с мембранами и другие эффекторные функции. Изменения в вариабельной области будут предприняты для того, чтобы улучшить характеристики связывания антигена.

В добавление к антителам иммуноглобулины могут присутствовать во множестве других конфигураций, включающих в себя, например, одноцепоченые или Fv, Fab и (Fab')₂, а также и диатела, линейные антитела, мультивалентные или мультиспецифические антитела (как описано выше и более подробно в: Lanzavecchia et al., Eur. J. Immunol. 17, 105 (1987)) и в одноцепочечных формах (например, Huston et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85 5879-5883 (1988) и Bird et al., Science. 242: 423-426 (1988), которые включены в настоящее описание в качестве ссылки). (Смотрите, в общем, Hood et al., "Immunology", Benjamin, N.Y., 2nd ed. (1984) и Hunkapiller and Hood, Nature, 323: 15-16 (1986), которые включены в настоящее описание в качестве ссылки).

Применяемые в настоящем описании термины «одноцепочечный Fv», «одноцепочечное антитело», «Fv» или «scFv» означает фрагменты антител, которые содержат области как из тяжелых, так и из легких цепей, но не содержат константные области, но в одной единственной полипептидной цепи. В общем случае, одноцепочечное антитело дополнительно содержит полипептидный линкер между V_H и V_L доменами, который позволяет ему сформировать необходимую структуру, которая позволила бы осуществлять связывание антигена. Одноцепочечные антитела подробно обсуждаются Pluckthun в The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds. Springer-Verlag, New York, pp. 269-315 (1994); смотрите также публикацию заявки на международный патент № WO 88/01649 и патенты США №№ 4946778 и 5260203, описания которых включены в качестве ссылок с любой целью. В определенных вариантах осуществления одноцепочечные антитела могут также быть биспецифическими или гуманизированными.

«Fab-фрагмент» состоит из одной легкой цепи и C_H1 и вариаблельных областей одной тяжелой цепи. Тяжелая цепь Fab-молекулы не может образовать дисульфидную связь с другой молекулой тяжелой цепи.

«Fab'-фрагмент» содержит одну легкую цепь и одну тяжелую цепь, которая содержит большую константную область, между доменами C_H1 и C_H2, таким образом, что межцепочечная дисульфидная связь может образоваться между двумя тяжелыми цепями с получением F(ab')₂-молекулы.

«F(ab')₂-фрагмент» содержат две легкие цепи и две тяжелые цепи, содержащие часть константной области между доменами C_H1 и C_H2, таким образом, что межцепочечная дисульфидная связь образуется между двумя тяжелыми цепями.

Термин «диатела» означает небольшие фрагменты антител с двумя антигенсвязывающими участками, в которых фрагменты содержат вариабельный домен тяжелой цепи (V_H), связанный с вариабельным доменом легкой цепи (V_L) в одной и той же полипептидной цепи (V_H-V_L). Применяя линкер, который является слишком коротким, чтобы осуществить объединение двух доменов в одной и той же цепи, домены принуждают к объединению с комплементарными доменами другой цепи и созданию двух антигенсвязывающих участков. Более полно диатела описаны, например, в ЕР 404097; WO 93/11161 и Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 6444-6448 (1993).

Термин «линейные антитела» означает антитела, описанные Zapata et al. Protein Eng. 8(10): 1057-1062 (1995). Вкратце, данные антитела содержат пару тандемных Fd-сегментов (V_H-C_H1-V_H-C_H1), которые образуют пару антигенсвязывающих участков. Линейные антитела могут быть биспецифическими или моноспецифическими.

Применяемый в настоящем описании термин «иммунологически функциональный фрагмент иммуноглобулина» означает фрагмент полипептида, который содержит по меньшей мере вариабельные домены тяжелых и легких цепей иммуноглобулина. Иммунологически функциональный фрагмент иммуноглобулина по изобретению способен связывать лиганд, предотвращать связывание лиганда с его рецептором, прерывать биологический ответ, являющийся результатом связывания лиганда с рецептором, или осуществлять любую их комбинацию.

Термин «моноклональное антитело» означает антитело, которое происходит из одного клона, включающего в себя эукариотический, прокариотический или фаговый клон, а не способ, которым оно получено.

Настоящее изобретение частично базируется на открытии, что субъединицы гетеродимерного рецептора, который связывает IL-31, например, IL-31Ra и OSMRb, экспрессируются в нервных клетках, таких как клетки ганглия заднего корешка. Таким образом, настоящее изобретение охватывает применение антагонистов IL-31 при ингибировании боли и воспаления и симптомов воспалительных заболеваний кишечника, болезни Крона, зуда и нейрогенной боли и повышенной чувствительности. Настоящее изобретение также охватывает применение агонистов IL-31 для улучшения чувствительности посредством стимуляции клеток ганглия заднего корешка.

IL-31 представляет собой наименование в HUGO для цитокина, который ранее был описан как Zcytor17lig в опубликованной заявке на патент США (смотрите опубликованную заявку на патент США номер 20030224487, заявку на патент США порядковый номер 10/352554, поданную 21 января 2003 г., в настоящее время выданный патент США номер 7064186; Sprecher, Cindy et al., 2003, включенные в настоящее описание в качестве ссылок). Гетеродимерный рецептор IL-31 содержит гетеродимер, образованный IL-31Ra и рецептором онкостатина M бета (OSMRb). IL-31Ra представляет собой наименование в HUGO для белка, называемого zcytorl7 в находящейся в общедоступной опубликованной заявке на патент США номер 20030215838, в заявке на патент США порядковый номер 10/351157, поданной 21 января 2003 г., включенных в настоящее описание в качестве ссылки. Полинуклеотидная и полипептидная последовательности IL-31 человека указаны в SEQ ID NO: 1 и 2, соответственно. Полинуклеотидная и полипептидная последовательности мышиного IL-31 указаны в SEQ ID NO: 3 и 4, соответственно. Применяемый в настоящем описании термин IL-31 означает zcytor17lig, как применяется в публикации патента США номер 20030224487, как указано выше. IL-31Ra ранее был описан в находящейся в общедоступной заявке на патент США порядковый номер 09/892949, поданной 26 июня 2001 г., которая включена в настоящее описание в качестве ссылки.

Аминокислотная последовательность рецепторов OSMR и IL-31RA указывает, что кодируемые рецепторы принадлежат к подсемейству рецепторов цитокинов класса I, которые включают в себя в качестве неограничивающих примеров рецепторы IL-2, IL-4, IL-7, Lif, IL-12, IL-15, EPO, TPO, GM-CSF и G-CSF (для обзора смотрите, Cosman, "The Hematopoietin Receptor Superfamily" in Cytokine 5(2): 95-106, 1993). Рецептор zcytorl7 подробно описан в находящейся в общественной заявке на патент PCT № US01/20484 (публикация WIPO № WO 02/00721; включенной в настоящее описание в качестве ссылки).

Настоящее изобретение включает в себя применение агентов против IL-31, включающих в себя антагонисты, антитела, связывающие белки, варианты и фрагменты, обладающие активностью против IL-31. Изобретение включает в себя введение субъекту молекулы против IL-31 и предполагает терапевтическое применение и для человека, и в ветеринарии. Иллюстративные ветеринарные субъекты включают в себя субъекты млекопитающих, такие как сельскохозяйственные животные и домашние животные.

Нативные полинуклеотидные и полипептидные последовательности для «длинной» формы IL-31RA указаны в SEQ ID NO: 5 и 6, соответственно. Нативные полинуклеотидные и полипептидные последовательности для «короткой» формы IL-31RA указаны в SEQ ID NO: 7 и 8, соответственно. Дополнительные укороченные формы полипептида IL-31RA, по-видимому, экспрессируются естественным образом. Обе формы кодируют растворимые рецепторы IL-31RA. «Длинные» полинуклеотидные и полипептидные последовательности растворимого IL-31RA указаны в SEQ ID NO: 9 и 10, соответственно. «Короткие» полинуклеотидные и полипептидные последовательности растворимого IL-31RA указаны в SEQ ID NO: 11 и 12, соответственно. Нативные полинуклеотидные и полипептидные последовательности для IL-31RA мыши указаны в SEQ ID NO: 13 и 14, соответственно. Нативные полинуклеотидные и полипептидные последовательности для OSMR-бета человека указаны в SEQ ID NO: 15 и 16, соответственно. Смотрите заявки PCT WO 02/00721 и WO 04/003140, которые обе включены в настоящее описание в качестве ссылок.

Антагонисты IL-31 включают в себя молекулы против IL-31, такие как антитела, которые связываются с IL-31, включающие в себя их варианты, фрагменты или производные, и которые ингибируют, ограничивают, уменьшают, сводят к минимуму, предотвращают или нейтрализуют действие IL-31, которое он оказывает при связывании с его родственным рецептором.

Анализ экспрессии in situ выявил, что IL-31RA и OSMR-бета экспрессируются в спинном мозге и клетках ганглия заднего корешка у людей. Смотрите пример 1. Следовательно, молекулы IL-31, их агонисты или антагонисты играют роль в обеспечении жизнедеятельности нейронов и в нейрогенном воспалении и возбуждении. Это указывает на то, что агонисты, антагонисты IL-31 можно применять для лечения различных нейродегенеративных заболеваний, таких как боковой амиотрофический склероз (ALS), болезнь Альцгеймера, болезнь Хантингтона, болезнь Паркинсона, периферические невропатии и демиелинизирующие заболевания, включающие в себя множественный склероз. Тканевая специфичность IL-31RA и OSMRb предполагает, что IL-31 может быть фактором роста и/или обеспечения жизнедеятельности в спинном мозге и головном мозге, который можно применять для лечения спинного мозга, головного мозга или повреждений периферической нервной системы.

Способы измерения способности IL-31 стимулировать боль известны специалистам в данной области. Например, клетки ганглия заднего корешка можно выделить и культивировать. Смотрите Voilley, N. et al., J. Neurosci. 27(20): 8026-8033. 2001. Например, клетки ганглия заднего корешка получали из самцов взрослых крыс Wistar (5-7 недель) и новорожденных крыс диссоциацией в 0,1% коллагеназе и помещая на покрытые коллагеном чашки P35 в DMEM с добавлением 5% фетальной телячьей сыворотки. Похожие способы выделения клеток ганглия заднего корешка описаны Steinhoff, M. et al. (Смотрите Steinhoff, M. et al., Nature Medicine. 6(2): 151-157. 2000). Вкратце, клетки ганглия заднего корешка измельчают в холодной модифицированной по способу Дульбекко среде Игла (DMEM) и инкубируют в DMEM, содержащей 0,05 мг/мл трипсина, 1 мг/мл коллагеназы и 0,01 мг/мл ДНКазы I в течение 45-60 минут при 37 градусах C. SBTI добавляют для того, чтобы нейтрализовать трипсин, и суспензию центрифугируют приблизительно при 1000 g в течение 1 мин. Нейроны в осадке суспендируют в DMEM, содержащей 10% фетальной бычьей сыворотки, 5 нг/мл фактора роста нервов, 2 мМ глутамина, 1 мг/мл смеси пенициллин/стрептомицин и ДНКазу I, и помещают на покровное стекло, покрытое Matrigel. Нейроны культивируют в течение 3-5 дней перед применением. Экспрессию IL-31RA в цитоплазматических мембранах подтверждают иммунофлюоресценцией с применением антитела.

Для того, чтобы определить воздействие IL-31 на стимуляцию ганглия заднего корешка, внутриклеточную концентрацию ионов кальция измеряют в культивируемых нейронах, как описано выше Steinhoff et al. Нейроны инкубируют в сбалансированном солевом растворе Хенкса, 20 мМ HEPES, pH 7,4, содержащей 5 мкМ Fura-2/AM (Molecular Probes, Юджин, Штат Орегон) в течение 1 ч при 37 градусах C. Покровные стекла моют, устанавливают в камеру (объемом 1 мл) инвертированного микроскопа Zeiss 100 TV и рассматривают, применяя объектив Fluar Zeiss x40. Флуоресценцию измеряют при 340 нм и 380 нм, чтобы осуществить определение кальция. Клетки подвергали воздействию IL-31 с применением и без применения других повышающих чувствительность веществ и определяли ингибирование в присутствии антагонистов IL-31.

Для того, чтобы определить способность антагониста IL-31 влиять на связывание IL-31 с его родственным гетеродимерным рецептором в ганглии заднего корешка, или вообще нервных клетках, на боль, можно измерять несколько медиаторов боли, таких как, например, в качестве неограничивающих примеров простагландины, вещество P, CGRP, галанин, нейропептид Y, гистамин, брадикинин, каннабиноиды и медиаторы пути метаболизма арахидоновой кислоты.

В дополнение к указанным выше способам определения способности антагонистов IL-31 действовать в отношении вызывающего боль воздействия IL-31 на нервные клетки, можно также применять некоторые модели in vivo. Смотрите, например, Honore, P. et al., Neuroscience, 98(3): 585-598, 2000. В данной статье описаны некоторые модели боли при воспалении, невропатической боли и боли при раке. Например, в одной модели определяют эффект антагониста IL-31, такой как подкожная инъекция IL-31 в подошвенную поверхность задней лапы мыши с применением и без молекулы антагониста. Мышь подвергали эвтаназии через 3 дня после инъекции и измеряли периферический отек. Определяли ингибирующее, ограничивающее, сводящее к минимуму, уменьшающее, предотвращающее или нейтрализующее отек действие антагониста IL-31. Дополнительные модели in vivo представляют собой лигирование спинномозговых нервов, рассечение седалищного нерва, вызванную саркомой раковую опухоль кости, анализ поведения и эффекты морфина.

Другая мышиная модель боли представляет собой механическую аллодинию. Смотрите, например, Sweitzer, S. M. et al., J. Neuroimm., 125: 82-93. 2002. Вкратце, крыс или мышей тестируют в отношении механической аллодинии с применением 2- и/или 12-g волокон Фрея. Сначала животные привыкают к процедуре, и предпринимают измерение исходного уровня. IL-31 вводят в различных количествах. Аллодинию описывают в качестве интенсивности отдергивания лапы на не являющиеся вредоносными стимулами в ответ на введение IL-31. Сравнение проводят при введении и без введения молекул антагонистов IL-31.

Провоспалительный нейропептид, вещество P (SP), продуцируется спинными ганглиями и затем передается на периферию ноцицептивными нервами А и С (15). SP может вызывать зуд при высвобождении гистамина из гранул тучных клеток. На коже SP может также вызывать эритему, отек и нейрогенное воспаление, высвобождающее гистамин, IL-1, простагландины и лизосомальные ферменты, но он быстро деградирует в дерме (16). Предшествующее пероральное введение антигистаминовых средств ингибирует зуд, вызванный SP. Капсаицин, получаемый из острого перца, применяемый местно, уменьшает количество SP в кожных нервах и, таким образом, уменьшает зуд. Поскольку субъединицы рецептора для IL-31 экспрессируются в клетках ганглия заднего корешка, введение молекул антагонистов IL-31 может уменьшить стимуляцию данных клеток и может снизить количество вещества P, появление которого может индуцироваться введением IL-31.

Связывание IL-31 с его рецептором, то есть с IL-31RA и OSMR-бета, в клетках ганглия заднего корешка может стимулировать соматосенсорную систему, которая состоит из различных сенсорных рецепторов, ответственных за ощущения, такие как давление, прикосновение, температура, боль, зуд, щекотка, покалывание и онемение. Связывание IL-31 с его родственным рецептором может привести к нейрогенному воспалению и стимуляции, которая может привести к высвобождению дополнительных факторов, которые индуцируют нейрогенный стимул. Одна группа факторов, которые опосредуют возникновение боли, представляет собой простагландины, которые также способствуют локальному воспалению. Таким образом, антагонист IL-31 может оказать полезное воздействие на боль при остром воспалении, которое обычно лечат НПВС, таком как миалгия, головная боль, сочетанные боли при острых повреждениях и на хроническую боль, такую как боль, вызываемую остеоартритом. Такой нейрогенный стимул может представлять собой результат воспаления, вызванного, например, аутоиммунными реакциями, такими как аллергия, вирусной инфекцией, такой как ветряная оспа, и повреждением, таким как ожог или травма. Таким образом, антагонисты, которые влияют на трансдукцию сигнала, вызванную связыванием лиганда IL-31 с его родственным рецептором, можно применять для уменьшения, ограничения, предотвращения или снижения до минимума нейрогенного воспаления и стимуляции соматосенсорной системы. Как таковые, антагонисты вызванной IL-31 трансдукции сигнала в клетках ганглия заднего корешка можно применять для лечения боли, зуда, покалывания, вызванного аутоиммунными заболеваниями, вирусной инфекцией и травмой. Более того, поскольку нейрогенное воспаление может приводить к повышенной чувствительности нерва после первичного кровоизлияния, антагонисты IL-31 могут представлять собой эффективное лечение симптомов. Например, некоторые пациенты с опоясывающим лишаем испытывают сенсорные симптомы боли и/или зуда намного позже после того, как вирусная инфекция прошла или уменьшилась до минимума. Невралгия, которая сопровождает острый опоясывающий лишай, и постгерпетическая невралгия, происходит, вероятно, вследствие воспаления ганглиев заднего корешка и ганглиев тройничного нерва, где вирусные антигены притягивают T-клетки и другие клетки воспаления. Длительная боль может происходить в результате постоянного воспаления дерматома после сильной противовирусной реакции. Следовательно, уровень или стадия вирусной инфекции, возможно, не являются показательными для сенсорного восприятия у субъекта. Таким образом, благоприятное воздействие противодействия вызванной IL-31 трансдукции сигнала может выходить за пределы текущего состояния вирусной инфекции или травмы.

Нейропатия и сенсорная недостаточность влечет за собой боль и потерю чувствительности, и могут быть связаны с такими заболеваниями, как атопия, диабет, рассеянный склероз и гипертония, например. Поскольку IL-31RA и OSBR-бета представляют собой белки, которые экспрессируются в спинном мозге и клетках ганглия заднего корешка, антагонисты IL-31 можно применять при лечении боли и сенсорных недостаточностей. Например, антагонисты IL-31 можно предоставлять местно, подкожно, центрально или систематично для лечения диабетической периферийной невропатии, постгерпетической периферийной невропатии, а также и боли, в общем случае, включающей в себя боль в качестве симптома у пациентов с ожогом.

Ожоговые повреждения вызывают интенсивную и длительную боль, которая усиливается, когда меняют раневую повязку. Частые замены повязки необходимы для предотвращения инфицирования и способствуют заживлению. Количество боли, испытываемой пациентами во время обработки раны, остается международной проблемой для жертв ожогов, а также и множества других популяций пациентов. Когда пациенты находятся в состоянии покоя, боль, связанную с ожогом, можно лечить опиатами, которые обладают некоторыми нежелательными эффектами. Тем не менее, во время обработки раны, такой как ежедневная смена повязки, очищение раны, удаления волокон