Фармацевтическая композиция, составленная для локального нанесения на поверхность барьера эпителиальной ткани, содержащая антитела, которые проходят через этот барьер

Фармацевтическая композиция, составленная для локального нанесения на поверхность барьера эпителиальной ткани, содержащая антитела, которые проходят через этот барьер

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Область техники, к которой относится изобретение

Данное изобретение относится к фармацевтической композиции, содержащей scFv-антитело с улучшенными свойствами в отношении проникновения в ткань и ее местному применению в диагностике и лечении заболевания, зависимого от сверхэкспрессии выбранного антигена.

Уровень техники

Локальное лечение многих заболеваний может проводиться местным нанесением лекарственного средства, которое должно быть способно проникать внутрь эпителиальной ткани. Смежные эпителиальные клетки герметизированы плотными контактами, предотвращающими прохождение большинства растворенных молекул с одной стороны эпителиального слоя к другому (Alberts et al., Molecular Biology of the Cell, 2nd ed.). Плотные контакты являются решающими для образования и поддержания парацеллюлярного барьера и для полярности клеток в простых эпителиях и эндотелиях. Они также играют большую роль в гематоэнцефалическом барьере, где они контролируют вещества, которые покидают головной мозг или входят в головной мозг. Лекарственные средства с большой молекулярной массой должны проходить через эти тканевые барьеры для попадания к местам их действия. Обычно, антитела являются слишком большими для пересекания плотных контактов слоев эпителиальных клеток.

В качестве части нормальной активности организма, плотные контакты селективно открываются и закрываются в ответ на различные сигналы внутри и снаружи клеток. Это делает возможным прохождение больших молекул или даже целых клеток через барьер плотных контактов.

Введение через слизистую оболочку терапевтических соединений может представлять определенные преимущества в сравнении с инъекцией и другими способами введения, например, в отношении удобства и скорости доставки, а также из-за уменьшения или элиминирования проблем соблюдения пациентом режима и схемы лечения и побочных действий, которые сопутствуют доставке посредством инъекции. Однако доставка через слизистую оболочку биологически активных агентов является ограниченной функциями мукозного барьера и другими факторами. По этим причинам, введение лекарственного средства через слизистую оболочку обычно требует больших количеств лекарственного средства, чем введение посредством инъекции. Другие терапевтические соединения, в том числе лекарственные средства с большой молекулой, пептиды и белки часто не поддаются доставке через слизистую оболочку.

Способность лекарственных средств проникать через поверхности слизистой оболочки, без помощи усиливающих доставку агентов, связана, по-видимому, с рядом факторов, включающих в себя размер молекулы, растворимость в липидах и ионизацию. Малые молекулы, меньшие чем приблизительно 300-1000 дальтон, часто способны проникать внутрь мукозных барьеров, однако, по мере увеличения размера молекул проницаемость быстро уменьшается. Липидрастворимые соединения обычно лучше проникают через поверхность слизистой оболочки, чем нерастворимые в липидах молекулы. Пептиды и белки слаборастворимы в липидах и, следовательно, обнаруживают плохие свойства абсорбции через поверхности слизистых оболочек.

US2006062758 обеспечивает композиции и способы, которые включают в себя биологически активный агент и повышающий проницаемость пептид, эффективный для усиления доставки через слизистую оболочку этого биологически активного агента в субъекте-млекопитающем. Повышающий проницаемость пептид обратимо увеличивает мукозный эпителиальный парацеллюлярный транспорт, обычно посредством модуляции структуры эпителиальных плотных контактов и/или физиологии в эпителиальной поверхности слизистой оболочки в этом субъекте.

Пептиды, способные модулировать функцию эпителиальных плотных контактов, были описаны ранее (Johnson, P. H. and Quay, S.C., 2000). CA2379661 обеспечивает систему парацеллюлярно доставки лекарственного средства, содержащей произведенный из Клаудина-6 пептид. Клаудины представляют суперсемейство интегральных мембранных белков, локализованных в плотных контактах и обеспечивающих барьерную функцию.

Антитела являются мощными инструментами для биохимических и молекулярно-биологических исследований и широко применяются в медицинской диагностике и терапии вследствие их способности специфического высокоаффинного связывания с их антигеном. Обычно, антитела состоят из двух тяжелых и двух легкой цепи, которые ковалентно связаны друг с другом через дисульфидные связи. На N-конце каждой цепи расположен высоко вариабельный домен, содержащий три комплементарных района (CDR). Вместе, вариабельные области тяжелой и легкой цепи определяют антигенную специфичность антитела. Одноцепочечные антитела (scFv) были сконструированы связыванием ДНК-последовательностей, кодирующих вариабельные тяжелые (VH) и вариабельные легкие (VL) домены со спейсерной последовательностью, кодирующей гибкий аминокислотный линкер (Bird et al., 1988).

Этот формат имеет преимущества в сравнении с общепринятыми полноразмерными антителами, заключающиеся в том, что scFv кодируется единственным геном, могут легко вводиться мутации и полученный scFv может экспрессироваться в дрожжах и прокариотических системах, которые позволяют быстрый отбор специфических высокоаффинных связывающих веществ фактически к любому эпитопу простой молекулярной биологией. Вследствие отсутствия у них эффекторной функции, scFv-антитела не проявляют токсических действий через антителозависимую или комплементзависимую клеточно-опосредованную цитотоксичность (ADCC или CDCC, соответственно) и, в отличие от полноразмерных антител, scFv-антитела обнаруживают хорошие способности проникновения внутрь тканей.

Многие одноцепочечные антитела (scFv) были генерированы против множества различных антигенов, в частности, потому, что они могут быть легко отобраны на высокую связывающую способность с использованием таких способов, как фаговый дисплей или рибосомный дисплей. Кроме того, scFv-антителв могут продуцироваться в микробных системах, которые связаны с меньшими расходами в сравнении с получением терапевтических полноразмерных антител.

Кроме общих внеклеточных и in vitro применений, scFv были также успешно использованы для внутриклеточных применений (Worn et al. 2000; Auf der Maur et al. 2002; Stocks MR, 2004); таким образом, были разработаны scFv против внутриклеточных антигенов. Обычно, внутриклеточная экспрессия функциональных scFv ограничивается их нестабильностью, нерастворимостью и тенденцией к образованию агрегатов. По этой причине, были успешно разработаны системы скрининга in vivo на scFv-антитела, которые являются особенно растворимыми и стабильными в восстанавливающих условиях, типичных для внутриклеточного окружения (например, ядра, цитоплазмы), с использованием так называемого скрининга «контроль качества» (WO0148017; Auf der Maur et al. (2001); Auf der Maur et al., 2004) и привели к идентификации особенно стабильных и растворимых каркасных последовательностей scFv для таких целей (WO03097697). Кроме того, эти каркасы обнаруживают исключительно высокие уровни экспрессии и повышенные свойства стабильности и растворимости также при природных окисляющих условиях во внеклеточном окружении (внеклеточной среде). Таким образом, эти благоприятные биофизические и биохимические свойства претворяются в подходящие продукционные выходы и позволяют применять эти фрагменты антител, после нацеливания против специфических антигенов, местно и/или системно в качестве белковых терапевтических веществ в конкретных терапевтических областях.

Для применения антител во многих терапевтических применениях, в частности, местных применениях, важным фактором является способность антитела проникать внутрь тканей, в частности, проникать через барьеры эпителиальной ткани.

Локальное применение является особенно желательным для лечения нарушений, которые проявляются в конкретном местоположении и не требуют системного лечения, например, глазных болезней.

Увеит передний

Увеит является острым или хроническим воспалением сосудистой оболочки глазного яблока с встречаемостью 30-40 на 100000 (Lightman and Kok 2002). Увеит подразделяют по местоположению на увеит передний, промежуточный или задний. Увеит передний развивается в увеит задний с последующими осложнениями, такими как катаракта, ретинит и даже слепота, если не применяется лечение (Kok and Lightman 2004). В <65-летних имеются много легально слепых индивидуумов, ослепших в результате увеита в виде диабетической ретинопатии (Kok and Lightman 2004). В 50 из этих случаев, увеит передний, как наиболее частая форма внутриглазных болезней, связан с локусом А гистосовместимости аллеля В27 (HLA-B27) (Power et al. 1998). Из этих пациентов, только приблизительно половина страдает от дополнительного системного заболевания, такого как анкилозирующий спондилит или хроническое воспалительное заболевание пищеварительного тракта (El-Shabrawi and Hermann 2002). Лечение увеита первично направлено на контроль воспалительного процесса (Kok and Lightman 2004). В настоящее время, кортикостероиды являются главной поддержкой для терапии увеита (Kok and Lightman 2004). Важно, что местное или системное лечение кортикостероидами значительно увеличивает риск глаукомы и катаракты, ограничивая таким образом их повторное применение (El-Shabrawi and Hermann 2002). Другие лечения, включающие в себя метотрексат, циклоспорин или азатиоприн, требуют минимально 6 недель лечения для получения эффекта, оставляя пациентов с огромной напряженностью качества жизни в течение длительного периода (El-Shabrawi and Hermann 2002, Dick et al. 1997).

Из описанного выше очевидной является ясно определенная медицинская потребность. Местные кортикостероиды в качестве наиболее обычной терапевтической возможности имеют существенные вредные побочные реакции, которые фактически обостряют долгосрочный риск слепоты.

Недавно, во внутриглазной жидкости пациентов с увеитом были обнаружены концентрации TNFα 15 пг/мл, в то время как соответствующие уровни в здоровых индивидуумах были равны 0,56 пг/мл (Perez-Guijo et а1. 2004). Несколько малых клинических исследований, выполненных с системно вводимыми ингибиторами TNFa сообщали о «промежуточном улучшении» (El-Shabrawi and Hermann 2002) или "заметном клиническом улучшении в пределах дней» (Murphy et al. 2004) или "в пределах 2 недель" (Joseph 2003) или "значительном улучшении после первой дозы инфликсимаба" (Benitez Del Castillo et al. 2004).

Таким образом, концепция нацеливания на TNFα хорошо валидизирована клинически. Однако соображения безопасности, связанные с системным применением ингибиторов TNFα, остаются и не могут оправдать их применения в значительной части пациентов с увеитом, которые не имеют дополнительных проявлений системного заболевания.

Таким образом, локальный ингибитор TNFα будет восполнять хорошо определенную медицинскую потребность, особенно у пациентов с передним увеитом. Вследствие их большой молекулярной массы, продаваемые ингибиторы TNFα не применимы для местного введения (см. Thiel et al. 2002).

Болезнь Бехчета

Болезнь Бехчета является идиопатическим, мультисистемным, хроническим и рецидивирующим заболеванием, классически характеризующимся эпизодическими агрессивными приступами глазного воспаления, орогенитальными язвами и кожными повреждениями. Кроме того, изредка могут наблюдаться тяжелые случаи болезни Бехчета, с вовлечением суставов, аудио-вестибулярного аппарата, с торакальным, желудочно-кишечным, сердечнососудистым, почечным или ЦНС-вовлечением. Глаз является наиболее часто вовлеченным внутренним органом в болезни Бехчета и является главной причиной хронической болезненности у пациентов. Глазная болезнь состоит из одностороннего (20%) или двустороннего (8%) иридоциклита, причем нагноение передней камеры глаза или панувеит имеют хроническое рецидивирующее течение. Обычно, первоначальные обострения имеют тенденцию быть более передними и/или односторонними, в то время как последующие приступы имеют тенденцию включать в себя полость стекловидного тела и заднего сегмента глаза, становясь двусторонними (Evereklioglu 2005). Тяжелый увеит более часто наблюдается среди пациентов из эндемических районов, таких как японские и турецкие пациенты, охватывающие 70-90% этой популяции (Ozen 1999; Tursen et al., 2003; Tugal-Tutkun et al., 2004; Yurdakul et al., 2004; Evereklioglu 2005). Риск потери зрения увеличивается прогрессирующимся образом, достигая одной четвертой случаев при 10 годах. Кроме того, практическая слепота является значительной и, в конечном счете, наступает в более, чем 50% случаях, в странах с высокой распространенностью и тяжестью этого заболевания, таких как Япония (Boyd et al., 2001; Evereklioglu 2005).

Болезнь Бехчета обнаруживает разную географическую вариацию и является эндемически более высокой, в частности, в Японии, Корее, Саудовской Аравии, Иране и Турции, а также в странах вдоль древнего «шелкового пути», в том числе Китае и Израиле (Bonfioli and Orefice 2005; Evereklioglu 2005). Например, болезнь Бехчета ответственна за 20% случаев увеита в Японии и Турции в сравнении только с 0,2% в США. В странах, в которых это заболевание является эндемическим, оно является более тяжелым, с более высокой частотой глазных проявлений и осложнений, и является более частым в мужчинах, особенно молодых взрослых мужчинах (Evereklioglu 2005). Эта своеобразная эпидемиология, по-видимому, опосредована комбинацией генетических факторов (например, ассоциацией с аллелем HLA-B51 (Sakane et al., 1999; Verity et al., 1999; Evereklioglu 2005), инфекционных агентов (Direskeneli 2001; Evereklioglu 2005) и факторов окружающей среды. Приближенно оцененная распространенность болезни Бехчета находится между 1:10000 и 1:1000 в Средиземноморских странах, Среднем Востоке и Дальнем Востоке. В Японии и Азиатских странах вдоль «шелкового пути», распространенность равна 13-30 на 1000000 и является наивысшей в северных частях Японии; наивысшая общая распространенность до 400 на 100000 наблюдается в некоторых частях Турции. В США имеются приблизительно 15000 людей с болезнью Бехчета (Zierhut et al., 2003; Evereklioglu 2005).

Последствия офтальмических воспалительных приступов являются главной причиной хронической заболеваемости у пациентов с болезнью Бехчета (Evereklioglu 2005). Лечение болезни Бехчета является симптоматическим и эмпирическим. Как и при других формах увеита, периокулярные и системные кортикостероиды представляют основную поддержку терапии в глазной болезни Бехчета. Однако применение способов лечения на основе кортикостероидов у пациентов ограничено их значительным профилем побочных эффектов. Кроме того, кортикостероиды редко индуцируют полные ремиссии при глазной болезни Бехчета, и значительная часть пациентов развивает устойчивое к стероидам заболевание со временем (Evereklioglu 2005). В ходе этого заболевания, схемы лечения часто используют иммуносупрессивные агенты, такие как азатиоприн, метотрексат и циклоспорин А. Однако, поскольку эти агенты также ассоциированы с критическими проблемами безопасности, существует хорошо выраженная потребность в лекарственных средствах для эффективного и безопасного нового способа лечения в случае этого показания.

Наряду с недавними эпидемиологическими открытиями, которые предполагают, что полиморфные вариации в TNFα являются ассоциированными с тяжестью болезни Бехчета (Verity et al., 1999b), существует большое разнообразие отчетов об отдельных случаях и малых клинических испытаниях, описывающих применение инфликсимаба в глазной болезни Бехчета (Ohno et al., 2004; Wechsler et al., 2004; Giansanti et al., 2004; Lanthier et al., 2005; Tugal-Tutkun et al., 2005; Lindstedt et al., 2005). Фактически, все эти исследования сообщают о быстрой и полной ремиссии глазной болезни Бехчета, даже у пациентов, не поддающихся общепринятой терапии. (Tugal-Tutkun et al., 2005). Однако, встречаемость и тяжесть вредных побочных действий у лечившихся инфликсимабом пациентов с увеитом является в некоторых исследованиях неожиданно высокой, ограничивая тем самым потенциал системно применимых антагонистов TNFα для лечения этого заболевания (Rosenbaum 2004; Suhler et al., 2005).

Клиническая валидизация TNFα в качестве в высокой степени привлекательного лекарства-мишени при глазной болезни Бехчета (Ohno et al., 2004; Wechsler et al., 2004; Giansanti et al., 2004; Lanthier et al., 2005; Tugal-Tutkun et al., 2005; Lindstedt et al., 2005) и очевидные проблемы безопасности с системной супрессией TNFα у пациентов с увеитом (Rosenbaum 2004; Suhler et al., 2005), показывают, что имеется потребность в разработке местно применимого антагониста TNFα для глазной болезни Бехчета, особенно для пациентов с преобладающими глазными симптомами.

Вследствие их хороших способностей проникновения в ткань и их быстрого почечного клиренса, scFv-антитела являются предпочтительными для местных применений. Кроме заряда, гидрофобности и молекулярной массы, такие свойства, как растворимость, тенденция к агрегации и термостабильность, влияют на способность молекулы проникать через тканевые барьеры. Например, высокорастворимый фрагмент антитела может быть неспособен проникать в эпителиальные барьеры, если он образует агрегаты при физиологической температуре около 37°С. Мутация единственного аминокислотного каркасного остатка scFv может, с одной стороны, улучшать его растворимость при температуре окружающей среды, и эта мутация может изменять термостабильность и, следовательно, приводить к частичному развертыванию и агрегации при 37°С. Такие агрегаты, вследствие их более высокой молекулярной массы будут уже неспособны проходить через тканевые барьеры.

Поскольку проникновение внутрь ткани является важным фактором для эффективной доставки лекарственного средства, в частности, в локальных применениях, имеется потребность в терапевтических антителах, в частности, в scFv-антителах с улучшенными способностями проникновения в ткань, наряду с другими желаемыми свойствами высокой стабильности и низкой антигенности. WO0040262 описывает фрагменты антител, например, scFv, в качестве фармацевтических средств или диагностических инструментов для лечения или диагностики, соответственно, глазных нарушений. Эксперименты по проникновению в глаз выполняли при концентрациях 0,2-0,25 мг/мл scFv. Было показано, что scFv мог проникать в эпителиальный барьер роговицы при очень низкой скорости в отсутствие и при более высоких скоростях в присутствии усилителей проникновения. Поскольку усилители проникновения могут иметь цитотоксические действия или вызывать эпителиальные изменения, существует потребность в альтернативных и/или улучшенных способах для лечения глазных заболеваний посредством scFv и его фрагментов. В частности, для контролируемой терапии локальным введением с низкой степенью побочных действий необходимы антитела, которые могут вводиться при относительно высокой концентрации.

Все публикации и ссылки, цитируемые здесь, включены в качестве ссылки в их полном виде.

Раскрытие изобретения

Таким образом, общей целью этого изобретения является обеспечение антитела, предпочтительно антитела scFv, которое специфически связывает выбранный антиген и имеет улучшенную способность проникновения в ткань.

Теперь, для осуществления этих и дополнительных объектов этого изобретения, которое станет более легко очевидным по мере продолжения описания, указанное антитело проявляется признаком, заключающимся в том, что оно может быть получено по способу, предусматривающему

(i) отбор из пула растворимых и стабильных каркасов каркаса, соответствующего наилучшим образом каркасу антитела не человека выбранной антигенсвязывающей специфичности,

(ii) либо обеспечение указанного каркаса CDR, которые связывают указанный антиген, либо мутирование этого каркаса указанного антитела не человека в направлении последовательности указанного растворимого и стабильного каркаса;

(iii) тестирование генерированного антитела на растворимость и стабильность, и

(iv) тестирование генерированного антитела на связывание антигена.

Необязательно, между стадиями (ii) и (iii) добавляют следующую стадию:

- мутирование указанного scFv-антитела сайт-направленным или случайным мутагенезом одного или нескольких CDR и/или каркаса.

Это изобретение обеспечивает также композицию, содержащую растворимый антигенсвязывающий полипептид, где этот антигенсвязывающий полипептид способен пересекать один или несколько эпителиальных слоев, например, эндотелиальный слой или мезотелиальный слой, за менее чем приблизительно 8 часов. Например, этот антигенсвязывающий полипептид способен пересекать один или несколько эпителиальных слоев за менее чем приблизительно 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1 или менее часов. В одном варианте осуществления, этот антигенсвязывающий полипептид способен пересекать эпителиальный слой или слои за менее чем приблизительно 4 часа. Должно быть понятно, что предполагается, что все величины и диапазоны включены в объем данного изобретения.

В других вариантах осуществления, этот эпителиальный слой является эпителиальным слоем глаза, роговицы, например, эпителием и/или эндотелием роговицы. В одном варианте осуществления, этот эпителиальный слой является эпителиальным слоем кишечника. Еще в одном варианте осуществления, этот эпителиальный слой является эпителиальным слоем гематоэнцефалического барьера.

В других вариантах осуществления, этот антигенсвязывающий полипептид способен пересекать интактную роговицу млекопитающего за менее чем приблизительно 8 часов. Например, этот антигенсвязывающий полипептид способен пересекать интактную роговицу млекопитающего за менее чем 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1 или менее часов. В одном варианте осуществления, этот антигенсвязывающий полипептид способен пересекать интактную роговицу человека. В одном варианте осуществления, антигенсвязывающий полипептид способен пересекать интактную роговицу свиньи или кролика.

В других вариантах осуществления, эта композиция дополнительно содержит усилитель проникновения. В некоторых вариантах осуществления, усилитель проникновения выбран из группы, состоящей из Азона (Azone®), хлорида бензалкония (BzCl), BL-7, BL-9, Brij 35, Brij 78, Brij 98, Brij 99, Полиоксиэтилен-полиоксипропилен 1800, капрата натрия, каприловой кислоты, хлорида цетилпиридиния, хлоргексидина, холата, касторового масла, кукурузного масла, кремофора-EL, циклодекстринов, DMSO, бромида декаметония, дезоксихолата, декстрансульфата, ЭДТА, динатриевой соли ЭДТА, этанола, фузидата, гликохолата, лаурилсульфата, L-α-лизофосфатидилхолина, метазоламида, N-лауроилсаркозина, NMP, олеиновой кислоты, Pz-пептида, фосфолипидов, полиоксиэтилен-9-лаурилового эфира, сапонина, Твина 20, Твина 40, Твина 60, Твина 80, таурохолата и тауродезоксихолата. В другом варианте осуществления, усилителем проникновения является капрат натрия. Еще в одном варианте осуществления, усилитель проникновения включает в себя коллоидные системы, полиакрилаты и биоадгезивный полимер.

В некоторых вариантах осуществления, этот полипептид имеет аффинность связывания в отношении антигена-мишени с K_D, по меньшей мере, 10^-6 М или лучшую.

В некоторых аспектах, данное изобретение обеспечивает композицию, имеющую рН менее приблизительно 8, причем указанная композиция содержит антигенсвязывающий полипептид (например, одноцепочечное антитело), где этот полипептид является достаточно растворимым для прохождения через интактную роговицу. В некоторых вариантах осуществления, эта композиция имеет рН в диапазоне приблизительно 6 - приблизительно 8. В других вариантах осуществления, эта композиция имеет рН приблизительно 6, 6,5, 7,0, 7,5, 8,0 или эти величины с любыми их приращениями. Понятно, что любые величины и диапазоны между этими величинами включены в данное изобретение.

В некоторых аспектах, данное изобретение обеспечивает композицию, имеющую рН менее приблизительно 8, причем эта композиция содержит антигенсвязывающий полипептид (например, одноцепочечное антитело), причем этот полипептид является достаточно растворимым для прохождения через интактную роговицу. В некоторых аспектах, данное изобретение обеспечивает композицию, содержащую растворимый антигенсвязывающий полипептид, причем этот полипептид является достаточно растворимым для прохождения через интактную роговицу за менее чем приблизительно 8 часов, и приготовлен при приблизительно рН 8 или менее. В некоторых вариантах осуществления, этот полипептид является достаточно растворимым, чтобы проходить через интактную роговицу за менее чем приблизительно 4 часа. В других вариантах осуществления, эта композиция содержит дополнительно усиливающий проникновение агент. В некоторых вариантах осуществления, этот усиливающий проникновение агент выбран из группы, состоящей из Азона, хлорида бензалкония (BzCl), BL-7, BL-9, Brij 35, Brij 78, Brij 98, Brij 99, Полиоксиэтилен-полиоксипропилен 1800, капрата натрия, каприловой кислоты, хлорида цетилпиридиния, хлоргексидина, холата, касторового масла, кукурузного масла, кремофора-EL, циклодекстринов, DMSO, бромида декаметония, дезоксихолата, декстрансульфата, ЭДТА, динатриевой соли ЭДТА, этанола, фузидата, гликохолата, лаурилсульфата, L-α-лизофосфатидилхолина, N-лауроилсаркозина, NMP, олеиновой кислоты, фосфолипидов, полиоксиэтилен-9-лаурилового эфира, сапонина, Твина 20, Твина 40, Твина 60, Твина 80, таурохолата и тауродезоксихолата. В другом варианте осуществления, усилителем проникновения является капрат натрия. В некоторых вариантах осуществления, усиливающим проникновение агентом является хлоргексидин.

В некоторых аспектах, данное изобретение обеспечивает композицию, содержащую растворимый антигенсвязывающий полипептид, где этот антигенсвязывающий полипептид способен пересекать один или несколько слоев интактной роговицы за менее чем приблизительно 8 часов. В других аспектах, данное изобретение обеспечивает композицию, содержащую антигенсвязывающий полипептид (например, одноцепочечное антитело) при концентрации, большей чем приблизительно 2,5 мг/мл, причем этот полипептид является достаточно растворимым для прохождения через интактную роговицу за менее чем приблизительно 8 часов. Эта композиция может содержать антигенсвязывающий полипептид при концентрации в диапазоне от более чем приблизительно 2,5 мг/мл до более чем приблизительно 10,0 мг/мл. Например, эта композиция может содержать антигенсвязывающий полипептид при концентрации приблизительно 2,5 мг/мл, 3,0 мг/мл, 3,5 мг/мл, 4,0 мг/мл, 4,5 мг/мл, 5,0 мг/мл, 5,5 мг/мл, 6,0 мг/мл, 6,5 мг/мл, 7,0 мг/мл, 7,5 мг/мл, 8,0 мг/мл, 8,5 мг/мл, 9,0 мг/мл, 9,5 мг/мл до более чем приблизительно 10,0 мг/мл, или эти величины с любыми их приращениями. Понятно, что любые величины и диапазоны между этими величинами включены в данное изобретение. В некоторых вариантах осуществления, антигенсвязывающий полипептид находится при концентрации, большей чем приблизительно 4,0 мг/мл. В других вариантах осуществления, этот антигенсвязывающий полипептид находится при концентрации, большей чем приблизительно 10,0 мг/мл.

В других вариантах осуществления, этот полипептид является достаточно растворимым, чтобы проходить через интактную роговицу за менее чем приблизительно 4 часа. В других вариантах осуществления, эта композиция содержит дополнительно усиливающий проникновение агент. В некоторых вариантах осуществления, этот усиливающий проникновение агент выбран из группы, состоящей из Азона, хлорида бензалкония (BzCl), BL-7, BL-9, Brij 35, Brij 78, Brij 98, Brij 99, Полиоксиэтилен-полиоксипропилен 1800, капрата натрия, каприловой кислоты, хлорида цетилпиридиния, хлоргексидина, холата, касторового масла, кукурузного масла, кремофора-EL, DMSO, бромида декаметония, дезоксихолата, декстрансульфата, ЭДТА, динатриевой соли ЭДТА, этанола, фузидата, гликохолата, лаурилсульфата, L-α-лизофосфатидилхолина, N-лауроилсаркозина, NMP, олеиновой кислоты, фосфолипидов, полиоксиэтилен-9-лаурилового эфира, сапонина, Твина 20, Твина 40, Твина 60, Твина 80, таурохолата и тауродезоксихолата. В другом варианте осуществления, усилителем проникновения является капрат натрия. В некоторых вариантах осуществления, усиливающим проникновение агентом является хлоргексидин.

В некоторых аспектах, данное изобретение обеспечивает антигенсвязывающий полипептид (например, одноцепочечное антитела), имеющий аффинность связывания в отношении антигена-мишени с K_D, по меньшей мере, 10^-6 М, причем этот полипептид является достаточно растворимым, чтобы проходить через эпителиальный плотный контакт, и причем этот полипептид остается в мономерной форме при физиологических условиях.

В других аспектах, данное изобретение содержит композицию, содержащую антигенсвязывающий полипептид, причем этот антигенсвязывающий полипептид является стабильным при температуре приблизительно -80 градусов Цельсия -приблизительно 37 градусов Цельсия. Например, эта композиция может быть стабильной при температуре -80 градусов Цельсия, -70 градусов Цельсия, -60 градусов Цельсия, -50 градусов Цельсия, -40 градусов Цельсия, -30 градусов Цельсия, -20 градусов Цельсия, -10 градусов Цельсия, 0 градусов Цельсия, 10 градусов Цельсия, 20 градусов Цельсия или 30 градусов Цельсия или любой из этих величин с приращениями. Должно быть понятно, что предполагается, что все величины и диапазоны включены в данное изобретение. В некоторых вариантах осуществления, антигенсвязывающий полипептид остается стабильным в течение, по меньшей мере, приблизительно восьми часов. В других вариантах осуществления, этот антигенсвязывающий полипептид остается стабильным в течение, по меньшей мере, шести недель при 4 градусах Цельсия.

В некоторых аспектах, данное изобретение обеспечивает композицию, содержащую антигенсвязывающий полипептид, где этот антигенсвязывающий полипептид имеет фармакодинамические или фармакокинетические признаки, которые экспериментально показаны в любой из фигур, описанных здесь.

В других аспектах, данное изобретение обеспечивает антигенсвязывающий полипептид, имеющий аффинность связывания в отношении антигена-мишени с K_D, по меньшей мере, 10^-6 М, причем этот полипептид является достаточно растворимым, чтобы проходить через эпителиальный плотный контакт за менее чем приблизительно 8 часов. В некоторых вариантах осуществления этот полипептид является достаточно растворимым, чтобы проходить через эпителиальный плотный контакт за приблизительно 4 часа или менее.

В других аспектах, данное изобретение обеспечивает антигенсвязывающий полипептид, имеющий аффинность связывания в отношении антигена-мишени с Ко, по меньшей мере, 10^-6 М или лучшую, причем этот полипептид имеет величину 1/2 Vmax, соответствующую кинетике прохождения антигенсвязывающего полипептида, который может проходить через эпителиальный плотный контакт за менее чем приблизительно 8 часов.

В других аспектах, данное изобретение включает в себя антигенсвязывающий полипептид, достаточно растворимый, чтобы проходить через эпителиальный плотный контакт, как измерено в стандартном анализе с монослоем эпителиальных клеток Сасо-2 (аденокарциномы ободочной кишки человека), что делает его подходящим для применения в терапии. В различных аспектах, данное изобретение включает в себя антигенсвязывающий полипептид, достаточно растворимый, чтобы проходить через эпителиальный плотный контакт, как измерено в стандартном анализе проницаемости с тощей кишкой мыши, что делает его подходящим для применения в терапии. В других аспектах, данное изобретение включает в себя антигенсвязывающий полипептид, достаточно растворимый, чтобы проходить через эпителиальный плотный контакт, как предсказано с использованием стандартных внутриклеточных анализов растворимости с одним гибридом или двумя гибридами, что делает его подходящим для применения в терапии. В других аспектах, данное изобретение включает в себя антигенсвязывающий полипептид, достаточно растворимый, чтобы проходить через эпителиальный плотный контакт, как предсказано с использованием стандартного анализа ПЭГ-преципитации или анализа хроматографии само-взаимодействия (SIC), что делает его подходящим для применения в терапии.

В других аспектах данное изобретение обеспечивает способ идентификации антигенсвязывающего полипептида, имеющего величину 1/2 Vmax, соответствующую прохождению этого антигенсвязывающего полипептида через эпителиальный плотный контакт за менее чем приблизительно 8 часов. Этот способ включает в себя: экспрессию внутриклеточно кандидатных антигенсвязывающих полипептидов в клетках-хозяевах, имеющих индуцируемую систему репортерного гена, где эта система репортерного гена дает регистрируемый сигнал в присутствии антигенсвязывающего полипептида, имеющего указанную кинетику прохождения; и скрининг указанных клеток на регистрируемый сигнал, где присутствие указанного сигнала идентифицирует кандидатный полипептид как антигенсвязывающий полипептид, имеющий указанную кинетику прохождения. Данное изобретение, в некоторых аспектах, обеспечивает также антигенсвязывающий полипептид, идентифицированный этим способом. В некоторых аспектах, данное изобретение обеспечивает также набор для проведения этого способа.

В других аспектах, данное изобретение обеспечивает способ лечения пациента с глазным нарушением местным введением терапевтически эффективного количества антигенсвязывающего полипептида по любому из указанных здесь пунктов, так что достигается лечение. В некоторых вариантах осуществления, этим глазным нарушением является увеит. В других вариантах осуществления, этим глазным нарушением является связанная с возрастом дегенерация желтого пятна.

В некоторых аспектах, данное изобретение обеспечивает антигенсвязывающий полипептид, содержащий полипептидный район, имеющий, по меньшей мере, один антигенсвязывающий мотив, фланкированный, по меньшей мере, одним каркасным районом, где этот полипептид имеет кинетику прохождения, достаточную для прохождения через эпителиальный плотный контакт за менее чем приблизительно 8 часов. В некоторых вариантах осуществления, этот полипептид содержит один антигенсвязывающий мотив, фланкированный двумя каркасными районами, два антигенсвязывающих мотива, фланкированных тремя каркасными районами, три антигенсвязывающих мотива, фланкированных четырьмя каркасными районами, или шесть антигенсвязывающих мотивов, фланкированных восемью каркасными районами, с промежуточным линкерным районом между четвертым и пятым каркасными районами. В других вариантах осуществления, этот антигенсвязывающий мотив является CDR, а каркасный район является каркасным районом иммуноглобулина. В других вариантах осуществления, этот полипептид содержит три CDR и четыре вставленных каркасных района или шесть CDR и восемь каркасных районов и промежуточный линкерный район.

В некоторых аспектах, данное изобретение обеспечивает также антигенсвязывающий полипептид, способный специфически связывать антиген-мишень и имеющий кинетику прохождения, достаточную для прохождения через эпителиальный плотный контакт за менее чем 8 часов, причем этот полипептид представлен формулой:

Y; или

Z; или

Y-L-Z; или

Z-L-Y;

где Y обозначает [F1-CDR1-F2-CDR2-F3-CDR3-F4] и Z обозначает [F5-CDR1-F6-CDR2-F7-CDR3-F8]; где каркасные районы (F1-F4) Y произведены из одного или нескольких каркасов легкой цепи человека; каркасные районы (F5-F6) Z произведены из одного или нескольких каркасов легкой цепи человека; CDR (CDR1-3) Y произведены из одного или нескольких донорных CDR, способных связывать антиген-мишень; CDR (CDR4-6) Z произведены из одного или нескольких донорных CDR, способных связывать антиген-мишень; и L является гибким полипептидным линкером. В некоторых вариантах осуществления, Y и Z представлены любой из последовательностей, описанных здесь, или их консенсусной последовательностью.

Альтернативно, в другом варианте осуществления, вдоль всей или части кодирующей последовательности антигенсвязывающего полипептида могут быть введены случайным образом мутации, например, насыщающим мутагенезом. «Консенсусная последовательность» является последовательностью, образованной из наиболее часто встречающихся аминокислот (или нуклеотидов) в семействе родственных последовательностей (см., например, Winnaker, From Genes to Clones (Verlagsgesellschaft, Weinheim, Germany 1987). В семействе белков, каждое положение в этой консенсусной последовательности занято аминокислотой, наиболее часто встречающейся в этом положении в этом семействе. Если две аминокислоты встречаются с равной частотой, в консенсусную последовательность может быть включена любая из них.

В некоторых вариантах осуществления, данное изобретение обеспечивает антигенсвязывающий полипеп