Водная композиция, содержащая биологический антиген и полимер акриловой кислоты

Водная композиция, содержащая биологический антиген и полимер акриловой кислоты

Реферат

Настоящее изобретение относится к водной композиции, содержащей биологический антиген и полимер акриловой кислоты. Настоящее изобретение также относится к полимеру акриловой кислоты для применения в однократно вводимой вакцине против цирковируса свиней второго типа (PCV2) и бактерий Mycoplasma hyopneumoniae и в водной композиции для снижения повышенной температуры, вызываемой биологическими антигенами, присутствующими в водной композиции, когда композицию вводят животному.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Известно, например, из международной заявки на патент WO 2010/025469, получение водной композиции (т.е. композиции на основе воды или другой гидрофильной жидкости, которая способствует образованию водородных связей), содержащей биологический антиген и полимер акриловой кислоты (биологический антиген представляет собой антиген, произведенный живым организмом, таким как, например, бактерия, вирус, животное, одноклеточный организм, гриб и т.д., как правило, живой или погибший микроорганизм, или биологическая молекула, предпочтительно белок или полисахарид, произведенный живым организмом; термин «произведенный» означает, что организм производит саму биологическую молекулу или ее предшественника). Полимер акриловой кислоты согласно этому источнику из предшествующего уровня техники используется как вспомогательное вещество, т.е. неспецифическое иммуностимулирующее вещество, включаемое в композицию, чтобы оказывать содействие или усиливать определенный процесс в каскаде иммунологических событий, в конечном счете, приводя к улучшению иммунологической реакции. Полимеры акриловой кислоты уже давно признаны как безопасные и благоприятные вспомогательные вещества, способные улучшать иммунологические реакции по отношению к разнообразным типам антигенов, таких как живые или погибшие микроорганизмы, субъединицы этих организмов или рекомбинантно произведенные субъединицы, такие как белки, полисахариды и другие типы молекул. Например, в патенте США № 3178350 уже описано применение полимера акриловой кислоты в качестве вспомогательного вещества. Такие вспомогательные вещества выпускают под товарным знаком Carbopol™.

Замечательное свойство полимеров акриловой кислоты заключается в том, что они в значительной степени повышают вязкость водной композиции, поскольку им свойственно образование сшитых полимерных цепей в таких композициях. То есть кислотные остатки полимерных цепей могут взаимодействовать посредством образования водородных связей. Хотя водородные связи являются значительно менее прочными, чем ковалентные связи, это взаимодействие между полимерными цепями может производить значительное влияние на вязкость водного раствора. Это характерное свойство полимеров акриловой кислоты, которое в высокой степени зависит от длины полимерной цепи и типа боковых цепей/групп, широко используется, например, в кремах или лосьонах, где полимеры акриловой кислоты применяются в качестве загустителей. Когда сшитые полимеры образуют действительную сеть полимерных цепей во всем объеме композиции (выше определенной концентрации полимера, как правило, выше уровня от 0,2 до 0,5 мас.%), и промежуточные пространства данной сети заполнены непрерывной фазой, композиция называется термином «гель». В случае водных композиций для топического нанесения (таких как кремы для рук, лосьоны для загара) это состояние композиции является предпочтительным. В случае содержащих биологические антигены композиций, которые, как правило, вводят путем инъекций, увеличение вязкости представляет собой существенный недостаток. Даже, когда вязкость композиции повышается от уровня, составляющего приблизительно от 5 до 70 мПа·с (который является типичным для водных композиций, содержащих антигены), до уровня, составляющего приблизительно 200 мПа·с, это является весьма заметным при введении композиции путем инъекции (вручную) животному (термин «животное» в настоящем описании и прилагаемой формуле изобретения включает человека). Как правило, всегда следует избегать образования геля из композиции, потому что превратившиеся в гель композиции трудно вводить путем инъекции. Таким образом, на практике, как правило, применяются композиции, содержащие биологические антигены с добавкой от 0,1 до не более чем 0,2 мас.% полимера акриловой кислоты. Действительно, в международной заявке на патент WO 2010/025469, в которой описаны вакцины предшествующего уровня техники, добавляют 0,1 мас.% полимера акриловой кислоты. Пример имеющиеся в продаже вакцины, содержащей полимер акриловой кислоты, представляет собой вакцина Suvaxyn™ M. Hyo - Parasuis, которую поставляет компания Pfizer Animal Health, и которая содержит 0,2 мас.% Carbopol™941.

В предшествующем уровне техники (патент США № 3920811) описано добавление физиологически приемлемых электролитов (т.е. соединений, которые ионизируются при растворении или плавлении, образуя электропроводящую среду, таких как электролиты, упомянутые на строках 28-42 страницы 4 патента США № 3920811) в композицию для инъекций в целях снижения вязкости композиции до такой степени, чтобы ее можно было использовать на практике в промышленных масштабах, при одновременном сохранении полезных свойств вспомогательных веществ. Однако, как четко указано на строках 3-6 страницы 7 патента США № 3920811, концентрация электролита может достигать уровня, при котором создается изотоничность в конечном растворе для инъекций, представляющем собой смешанный раствор вспомогательных веществ и биологического антигена. В частности, фактические композиции для инъекций, как правило, являются приблизительно полуизотоническими. Причина этого заключается в том общеизвестном факте, что гипертонические растворы могут вызывать повреждения тканей при инъекции. Даже когда композиция является гипертонической лишь в незначительной степени, и, таким образом, конечное повреждение может быть пренебрежимо малым, результат инъекции заключается в том, что животное может испытывать неприятное ощущение в месте инъекции, которая может вызывать, например, стресс, зуд, острую боль и т.д. Таким образом, в целях соблюдения общих обязательных стандартов безопасности в отношении композиций для введения животным, каждая имеющаяся в продаже композиция, содержащая биологические антигены и полимер акриловой кислоты, должна быть не более чем изотонической по отношению к нормальному состоянию текучей среды организма (например, сыворотки крови), т.е. иметь осмолярность водного раствора 0,9 мас./об.% хлорида натрия (приблизительно 300 мОсмоль/л).

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Задача настоящего изобретения заключается в том, чтобы предложить, согласно преамбуле, новые композиции, которые имеют более широкую область применения.

Неожиданно было обнаружено, что в композиции, содержащей полимер акриловой кислоты, использование электролита в количестве, при котором образуется гипертонический раствор, по-прежнему приводит к композиции, которая соответствует общепринятым стандартам безопасности. Очевидно, что при отсутствии четкой технической причины для безопасности композиции, даже в том случае, когда она является в значительной степени гипертонической, в присутствии полимера акриловой кислоты образуется композиция, в которой присутствие избытка электролита не вызывает проблемы, даже при инъекции композиции в ткань животного. Не ограничиваясь теорией, заявитель считает, что присутствие полимера в форме сетки из сшитых полимерных цепей может привести к композиции, в которой регулируемое, но быстрое разбавление избытка электролита происходит без повреждения окружающей ткани. По существу, это противоречит описанию патента США № 3920811, которое представляло собой общепринятое мнение с тех пор, как был опубликован этот патент. Одно из основных преимуществ настоящего обнаружения того, что можно использовать избыток электролита, заключается в том, что вязкость композиции, содержащей полимер акриловой кислоты, можно дополнительно уменьшать, и в результате этого обеспечивается более простое практическое применение композиции. Кроме того, настоящее изобретение допускает использование значительно большего количества полимера акриловой кислоты, даже превышающего 0,5 мас.%, при одновременном сохранении очень низкой вязкости. Использование полимера в таких количествах открывает путь к композициям, обеспечивающим (очень) медленное высвобождение биологических антигенов. Учитывая очевидный факт, заключающийся в том, что электролит быстро разбавляется в результате введения композиции в ткань животного, немедленно после введения вязкость композиции будет увеличиваться в значительной степени, и на месте введения возможно даже образование геля из композиции. По существу, биологические антигены будут высвобождаться медленнее из такого геля по сравнению с их высвобождением из водной композиции, имеющей низкую вязкость, в зависимости, помимо прочего, от свойств геля. Как правило, чем выше вязкость, тем меньше ожидаемая скорость высвобождения антигенов.

В частности, было обнаружено, что полимер акриловой кислоты в водной композиции, содержащей биологические антигены, можно использовать для снижения повышенной температуры, вызываемой этими биологическими антигенами, когда композицию вводят животному. Хотя повышение температуры на 2°C в течение первых 24 часов после инъекции является общепринятым и считается безопасным, как правило, благоприятным является повышение температуры менее чем на 1°C. Используя композиции согласно настоящему изобретению, можно обеспечивать повышение температуры, составляющее менее чем 1°C или даже менее чем 0,5°C. Причина этого остается неясной, но она может быть связана с тем, что гипертонический раствор, имеющий низкую вязкость, почти немедленно после введения приобретает повышенную вязкость, и, таким образом, образуется композиция, обеспечивающая в большей или меньшей степени медленное высвобождение. Медленное высвобождение может вызывать иммунную реакцию, которая является менее интенсивной, но более продолжительной. Хотя можно было бы также ожидать по меньшей мере некоторое уменьшение титра, весьма неожиданно было обнаружено, что по-прежнему можно получать высокие титры, даже когда повышенная температура снижается в значительной степени. Это открывает путь к получению более безопасных вакцин на основе антигенов, которые, как правило, вызывают повышенную температуру, такие как, например, антигены, содержащие липополисахариды (LPS), которые присутствуют во многих вакцинах, содержащих грамотрицательные бактерии, такие как, например, кишечная палочка (Escherichia coli или E. coli), виды сальмонеллы (Salmonella), виды шигеллы (Shigella) и другие энтеробактерии (Enterobacteriaceae), псевдомонады (Pseudomonas), моракселлы (Moraxella), хеликобактерии (Helicobacter), Stenotrophomonas, Bdellovibrio, уксуснокислые бактерии, легионеллы (Legionella) и альфа-протеобактерии, такие как, вольбахии (Wolbachia), цианобактерии, спирохеты, зеленые серные и зеленые несерные бактерии, гонококки (Neisseria gonorrhoeae), менингококки (Neisseria meningitides), Moraxella catarrhalis, виды гемоглобинофильных бактерий (Haemophilus), такие как Haemophilus influenzae, Klebsiella pneumoniae, Legionella pneumophila, Pseudomonas aeruginosa, Proteus mirabilis, Enterobacter cloacae, Serratia marcescens, Helicobacter pylori и Acinetobacter baumannii.

Помимо вышеизложенного, было также обнаружено, что настоящее изобретение можно преимущественно использовать в композиции, содержащей антиген цирковируса свиней второго типа (PCV2) и необязательно антиген Mycoplasma hyopneumoniae, для создания вакцины, которая после однократного введения обеспечивает достаточную иммунную реакцию против заражения цирковирусом свиней второго типа и бактериями Mycoplasma hypneumoniae.

Следует отметить, что настоящее изобретение также относится к композиции для инъекций (в частности, к композиции, у которой вязкость составляет менее чем 200 мПа·с, предпочтительно менее чем 100 мПа·с), включающей вышеупомянутую водную композицию.

ВАРИАНТЫ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Согласно варианту осуществления, осмолярность композиции является по меньшей мере на 30% более высокой, чем осмолярность раствора 0,9 мас./об.% хлорида натрия (т.е. составляет приблизительно 400 мОсмоль/л или более). Было обнаружено, что даже такую высокую осмолярность можно использовать без неблагоприятных побочных эффектов на месте введения. Это значительно повышает степень свободы в использовании полимера акриловой кислоты. Теперь его можно использовать даже в количествах, значительно превышающих обычный уровень, составляющий 0,2%, сохраняя при этом очень низкую вязкость.

Согласно варианту осуществления, осмолярность композиции является по меньшей мере на 50% более высокой, чем осмолярность раствора 0,9 мас./об.% хлорида натрия (т.е. составляет приблизительно 450 мОсмоль/л или более). Было обнаружено, что даже такую высокую осмолярность можно использовать без неблагоприятных побочных эффектов на месте введения. Это значительно повышает степень свободы в использовании полимера акриловой кислоты. Теперь его можно использовать даже в количествах, значительно превышающих обычный уровень, составляющий 0,2%, сохраняя при этом очень низкую вязкость.

Согласно предпочтительному варианту осуществления, композиция содержит более чем 0,2 мас.% полимера акриловой кислоты или даже более чем 0,5 мас.% полимера акриловой кислоты. Содержащая такие количества полимера акриловой кислоты композиция может присутствовать в форме вязкого геля. Путем добавления избытка электролита к гелю, образовавшемуся из композиции, вязкость можно уменьшать до уровня, составляющего от 10 до 70 мПа·с. Таким образом, композицию можно будет легко вводить, используя стандартный ручной шприц, и после инъекции, за счет разбавления избытка электролита, она снова превратится в высоковязкий гель. Было обнаружено, что для получения высоких титров антител против антигенов, которые, как правило, вызывают повышенную температуру, такой гель полимера акриловой кислоты гель является особенно подходящим, поскольку он уменьшает возникающую повышенную температуру. Композиция, которая содержит от 0,8 до 1,6 мас.% полимера акриловой кислоты, является особенно предпочтительной. Согласно этому варианту осуществления, избыточный электролит предпочтительно обеспечивает осмолярность, которая, как правило, превышает в 2-3 раза осмолярность нормальной тканевой текучей среды (раствор 0,9% хлорида натрия), таким образом, составляя более чем приблизительно от 600 до 900 мОсмоль/л. Таким образом, вязкость перед введением можно поддерживать на достаточно низком уровне, чтобы обеспечивать инъекцию. После инъекции электролит будет разбавляться, и композиция превратиться в гель.

Согласно варианту осуществления, полимер акриловой кислоты представляет собой сшитый полимер, который сшивают, используя предпочтительно полиалкенилэфир, многоатомный спирт и/или дивинилгликоль в качестве сшивателя. Сшивание полимера делает образование сетки из полимерных цепей в композиции менее зависимым, например, от температуры и значения pH, по той простой причине, что часть образующейся сетки уже присутствует в форме ковалентных сшивок.

Согласно еще одному варианту осуществления, композиция содержит электролит, включающий многозарядные катионы (то есть катионы, у которых заряд превышает 1+ и составляет, как правило, 2+ или 3+). Было обнаружено, что за счет использования многозарядных катионов, можно более эффективно снижать вязкость, даже когда осмолярность является такой же, как в случае использования однозарядных катионов (1+). Согласно предпочтительному варианту осуществления, катион присутствует в концентрации, составляющей вплоть до 0,05 М, предпочтительно вплоть до приблизительно 0,03 М. Количество катионов, которое можно использовать, зависит от количества карбоксилатных групп в растворе полимера акриловой кислоты. Чрезмерно большое количество катионов вызывает осаждение. Было обнаружено, что когда используют многозарядные катионы вплоть до таких количеств, вязкость можно снижать весьма эффективно, сохраняя при этом безопасность после введения композиции.

Согласно варианту осуществления, биологический антиген представляет собой антиген, который после введения вызывает повышенную температуру, т.е. увеличенную более чем на 0,5°C, в частности, более чем на 1,0°C, более чем на 1,5°C или даже более чем на 2,0°C. На практике многие антигены после введения вызывают некоторое повышение температуры. Максимально допустимое повышение температуры, которое может быть вызвано, часто устанавливают компетентные органы управления. Чтобы соблюдать такой установленный максимальный уровень, в некоторых случаях оказывается необходимым снижение количества антигена до уровня, ниже оптимального, и в результате этого приходится получать неоптимальную иммунную реакцию. Для эффективной профилактики заболевания, защиту против которого должна обеспечивать вакцина, такая ситуация является неудовлетворительной. Неожиданно было обнаружено, что за счет использования композиции согласно настоящему изобретению можно снижать повышенную температуру, вызываемую антигенами, одновременно сохраняя иммунную реакцию. Медленное высвобождение антигенов не может служить единственной причиной этого эффекта, поскольку следовало ожидать, что если повышенная температура уменьшается вследствие медленного высвобождения, иммунная реакция должна быть также менее интенсивной. Однако заявителем обнаружено, что за счет использования настоящего изобретения повышенную температуру можно снижать, сохраняя при этом достаточную иммунную реакцию.

Согласно варианту осуществления антиген выбран из группы, которую составляют антиген грамотрицательной бактерии и антиген цирковируса. Согласно конкретному варианту осуществления, антиген выбирают из группы, которую составляют антиген актинобациллярной плевропневмонии (Actinobacillus pleuropneumoniae), антиген гемофильных бактерий Haemophilus parasuis и антиген цирковируса свиней второго типа (PCV2). Эти антигены являются особенно известными тем, что они вызывают повышенную температуру после введения. За счет использования настоящего изобретения, повышение температуру можно в значительной степени снижать, одновременно сохраняя иммунологическую активность композиции на достаточном уровне.

Далее настоящее изобретение будет подробно проиллюстрировано с использованием следующих примеров.

Пример 1 представляет влияние полимера акриловой кислоты на вязкость.

Пример 2 иллюстрирует физические свойства композиции согласно настоящему изобретению и ее безопасность.

Пример 3 описывает состав композиций согласно настоящему изобретению.

Пример 4 представляет эксперимент по вакцинации композицией согласно настоящему изобретению.

Пример 5 представляет второй эксперимент по вакцинации композицией согласно настоящему изобретению.

Пример 6 представляет третий эксперимент по вакцинации композицией согласно настоящему изобретению.

Пример 7 описывает дополнительные композиции согласно настоящему изобретению и способ получения этих композиций.

Пример 1

Получали различные водные изотонические композиции, используя сшитый полимер акриловой кислоты, чтобы оценивать влияние полимера на вязкость композиции. В этих композициях не содержались антигены (которые, как правило, увеличивают вязкость). Кроме того, исследовали влияние добавления избыточного количества двухзарядного электролита.

Все композиции содержали сшитый полимер акриловой кислоты Carbopol 974P, который поставляет компания BFGoodrich Specialty Chemicals (Кливленд, штат Огайо). Различные количества полимера (от 0,1 до 1,6 мас.%) растворяли в водном растворе 0,9 мас./об.% хлорида натрия. Значения вязкости композиций измеряли, используя лабораторный вискозиметр Брукфильда (Brookfield). Были получены следующие результаты:

Таблица 1
Вязкость различных изотонических растворов полимера акриловой кислоты
Номер образца	Carbopol 974 P, мас.%	Вязкость мПа·с
1	0,1	3,8
2	0,2	5,0
3	0,5	70,0
4	0,8	214
5	1,6	4600

Следует отметить, что водную композицию согласно настоящему изобретению можно использовать для изготовления эмульсии с масляной фазой, причем, как правило, получается эмульсия воды в масле, эмульсия масла в воде или эмульсия воды в масле в воде. Таким образом, такая эмульсия включает водную композицию согласно настоящему изобретению. Образование эмульсии, разумеется, будет влиять на вязкость, как правило, приводя к ее значительному увеличению. Например, когда масло (например, 10 мас./об.%) эмульгируют в водном растворе, у которого вязкость составляет приблизительно 3 мПа·с, причем вязкость может увеличиваться приблизительно до 25 мПа·с или даже более высокого уровня.

В следующем эксперименте влияние избытка электролита на вязкость исследовали, используя композицию, содержащую 0,8% Carbopol. В эту композицию добавляли различные количества хлорида натрия и хлорида кальция, чтобы продемонстрировать влияние на вязкость. Результаты представлены в таблице 2.

Таблица 2
Вязкость различных растворов полимер акриловой кислоты
Номер образца	NaCl, мас./об.	CaCl2·2H2O, мас./об.	Вязкость мПа·с	Осмолярность мОсмоль/л
1	0,45%	0,16%	748	190
2	0,9%	0,16%	221	340
3	1,5%	0,16%	71	530
4	2,5%	0,16%	12	850

Как можно понять, добавление избыточного количества электролита в значительной степени уменьшает вязкость содержащей полимера акриловой кислоты композиции. Было обнаружено (см. пример 2), что после инъекции этот избыток будет выходить из композиции в окружающую ткань, и в результате этого увеличивается вязкость композиции, которая превращается в однородный гель. Такой гель будет оставаться на месте инъекции, после чего следует медленная диффузия и разложение ее компонентов.

Пример 2

Этот пример демонстрирует физические свойства композиции согласно настоящему изобретению, в частности, ее превращение в гель после инъекция и высвобождение ее диспергированного содержимого, а также ее безопасность при инъекции в ткань животного.

В этом эксперименте были использованы четыре свиньи. Каждая свинья получала 1 мл композиции, содержащей 1,6% Carbopol 974P, 2,5% хлорида натрия и 0,48% хлорида кальция (осмолярность составляла приблизительный 925 мОсмоль/л) путем внутримышечной инъекции. Для диагностических целей композиция дополнительно содержала 0,075% патентованного голубого красителя. Свинью номер 1 подвергали эвтаназии через 2 часа после инъекция композиции, и немедленно мышечную ткань открывали для исследования места введения. Было четко заметно пятно, содержащее гелеобразное синее вещество. С помощью ложки пятно можно было извлекать в форме геля. Гель не был текучим. Свинью номер 2 подвергали эвтаназии через 24 часа после введения такой же композиции, и ее мышечную ткань также открывали для исследования места введения. Прозрачный бесцветный гель образовывал пятно на месте введения, что является показателем диффузии патентованного голубого красителя в организм свиньи. Свинью номер 3 подвергали эвтаназии через 48 часов, и свинью номер 4 подвергали эвтаназии через одну неделю. Гель невозможно было выделить ни у одной из данных свиней. Синий цвет полностью исчезал.

Эти результаты показывают, что гель присутствует вплоть до двух суток после инъекции. Низкомолекулярные соединения диффундируют из геля в течение 24 часов. Предполагается, что высвобождение высокомолекулярных соединений, таких как белки, замедляется и продолжается в течение приблизительно двух суток для этого конкретного состава.

Местные реакции (т.е. пятна, включающие отклонения в нормальной ткани) также оценивали в различные моменты времени. Результаты, а именно размеры точек с отклонениями, представлены ниже в таблице 3. Следует отметить, что отклонения через два часа ограничивались, главным образом, только гелеобразными точками. Через 24 часа наблюдались некоторые отклонения тканей, занимающие большие объемы (5 см³), но они оставались на безопасном (приемлемом) уровне. Через одну неделю оставшаяся точка с отклонениями фактически исчезала. У живых свиней отсутствовали какие-либо признаки местных реакций (таких как стресс, зуд, острая боль и т.д.). На основе этих результатов можно сделать вывод, что композицию можно считать безопасной, несмотря на то, что ее осмолярность приблизительно в три раза превышала осмолярность раствора 0,9% хлорида натрия.

Таблица 3
Размер местной реакции после внутримышечной инъекции
Время после вакцинации (час)	Размер (длина*ширина*высота, см)	Объем (см3)
2	4*1*1	4
24	5*2*0,5	5
48	3*2*0,5	1,5
168	1*0,2*0,3*	0,6

Пример 3

Получали различные композиции, содержащие различные биологические антигены и различные типы и количества полимеров акриловой кислоты. Количество полимера акриловой кислоты в каждом случае составляло по меньшей мере 0,8 мас.% для обеспечения высокой вязкости после инъекции. Общий состав каждой композиции представлен в таблице 4. Следует отметить, что указанная вязкость представляет собой вязкость перед инъекцией. После инъекции электролит из композиции быстро разбавляется, и в результате этого композиция приобретает высокую вязкость и может оставаться в форме устойчивого геля в месте введения.

Таблица 4
Общий состав композиций, содержащих биологические антигены, в расчете на 1000 г композиции
1000 граммов композиции
Компонент	тип «0,8» (вязкость±40 сП)	тип «1,6» (вязкость±70 сП)
Полимер акриловой кислоты	8,0 гр	16 гр
CaCl2·2H2O	1,6 гр	4,8 гр
NaCl	9,0 гр	25 гр
Антиген	x единиц (в зависимости от антигена)	x единиц (в зависимости от антигена)
Вода	добавка до 1000 г	добавка до 1000 г

Как правило, получали два типа содержащих полимер акриловой кислоты составов, в том числе тип 0,8, содержащий 0,8% полимера акриловой кислоты, и тип 1,6 тип, содержащий 1,6% полимера акриловой кислоты. Чтобы сохранить вязкость композиций на достаточно низком уровне, позволяющем осуществлять инъекции композиции стандартным шприцом для подкожных инъекций, добавляли электролит в таком количестве, как указано выше в таблице 4. Получали два различных типа сшитого полимера акриловой кислоты, а именно Carbopol 974P и Carbopol 971P (оба поставляет компания BFGoodrich). Использовали различные типы антигенов, которые производят бактерии Actinobacillus pleuropneumoniae, Haemophilis parasuis, Mycoplasma hyopneumoniae и цирковирус свиней второго типа (PCV2). Используя эти антигены, получали следующие композиции:

1. Композиция Mhyo/PCV2

Первая композиция (обозначенная буквой «A») содержала полимер акриловой кислоты Carbopol 974P в концентрации, составляющей 0,8%. Эта композиция содержала инактивированные антигены Mycoplasma hyopneumoniaes (такие же антигены, которые содержит имеющаяся в продаже вакцина Porcilis Mhyo, которую поставляет компания Intervet Schering-Plough Animal Health (Боксмеер, Нидерланды) в такой же концентрации) и антигены PCV (такие же антигены, которые содержит имеющаяся в продаже вакцина Porcilis PCV, которую поставляет компания Intervet Schering-Plough Animal Health (Боксмеер, Нидерланды) в такой же концентрации).

Вторая композиция (обозначенная буквой «B») содержала полимер акриловой кислоты Carbopol 971P в концентрации, составляющей 0,8%. Эта композиция содержала инактивированные антигены Mycoplasma hyopneumoniaes (такие же антигены, которые содержит имеющаяся в продаже вакцина Porcilis Mhyo, которую поставляет компания Intervet Schering-Plough Animal Health (Боксмеер, Нидерланды) в такой же концентрации) и антигены PCV (такие же антигены, которые содержит имеющаяся в продаже вакцина Porcilis PCV, которую поставляет компания Intervet Schering-Plough Animal Health (Боксмеер, Нидерланды) в такой же концентрации).

В качестве первой сравнительной композиции получали композицию, обозначенную буквой «C», которая содержала такие же антигены в такой же концентрации, но они образовывали эмульсию со вспомогательным веществом Emunade, используемым в имеющийся в продаже вакцине M+Pac, которую поставляет компания Intervet Schering-Plough Animal Health (Саммит, штат Нью-Джерси, США). В качестве строгого контроля получали композицию «D», которая представляла собой просто фосфатно-солевой буферный раствор (PBS).

2. Композиция APP

Первая композиция (обозначенная буквой «E») содержала полимер акриловой кислоты Carbopol 974P в концентрации, составляющей 0,8%. Эта композиция содержала такие же антигены Actinobacillus hyopneumoniae (а именно, APXI, APX II, APXIII и OMP) в таком же количестве, как содержит имеющаяся в продаже вакцина Porcilis APP, которую поставляет компания Intervet Schering-Plough Animal Health (Боксмеер, Нидерланды).

В качестве сравнительной композиции использовали имеющуюся в продаже вакцину Porcilis APP (обозначенную буквой «F»).

3. Композиция Haemophilus parasuis

Первая композиция (обозначенная буквой «G») содержала полимер акриловой кислоты Carbopol 974P в концентрации, составляющей 0,8%. Эта композиция содержала такие же антигены Haemophilus parasuis (а именно, инактивированные клетки бактерий Haemophilus parasuis) в таком же количестве, как содержит имеющаяся в продаже вакцина Porcilis Glasser, которую поставляет компания Intervet Schering-Plough Animal Health (Боксмеер, Нидерланды).

В качестве сравнительной композиции использовали имеющуюся в продаже вакцину Porcilis Glasser (обозначенную буквой «H»).

Композиции A, B, E и G получали, получая сначала растворы электролитов, содержащие приблизительно 70% требуемого количества воды. После этого полимер акриловой кислоты добавляли и перемешивали до тех пор, пока полимер не гидратировался полностью. Затем pH раствора доводили до 7,2, добавляя каплями раствор 4 М NaOH. Полученный продукт обрабатывали в автоклаве в течение 20 минут при 121°C. После этого продукт охлаждали приблизительно до 20°C при охлаждении, а затем значение pH измеряли и исправляли в случае необходимости. Затем антигены добавляли при перемешивании, и после этого значение pH снова измеряли и исправляли в случае необходимости. Добавляли оставшееся количество воды. Продукт перемешивали в течение ночи перед помещением в контейнеры, а затем продукт содержали в контейнере в атмосфере газообразного азота при температуре от 2 до 8°C.

Пример 4

В эксперименте по вакцинации исследовали четыре группы по 10 поросят в каждой. Композиции A, B, C и D вводили внутримышечно в дозах по 2 мл в трехнедельном возрасте. Ректальную температуру измеряли непосредственно перед вакцинацией (t=0 час) и через 4 часа после вакцинации (ожидаемое время максимального повышения температуры).

Были получены следующие результаты. Не были обнаружены никакие клинические признаки заболевания ни в одной из групп, и это означает, что все композиции можно считать безопасными. Средние измеренные температуры представлены в таблице 5.

Таблица 5
Средняя температура после однократного введения вакцин Mhyp/PCV
Композиция	Средняя температура (Tav) при t=0 час, °C	Средняя температура (Tav) при t=4 час, °C	Разность температур (ΔT), °C
А	39,8	39,6	-0,2
В	39,8	39,9	+0,1
С	39,6	40,3	+0,7
D (строгий контроль	39,7	39,5	-0,2

Как можно видеть, используемые антигены могут вызывать значительное повышение температуры у вакцинированных животных (см. результаты для композиции C). Однако при использовании композиций согласно настоящему изобретению повышение температуры можно снижать и даже полностью подавлять.

Кроме повышения температуры измеряли титры антител против антигенов через 6 недель после введения композиции. Результаты представлены в таблице 6.

Таблица 6
Средние титры через 6 недель после однократного введения вакцин Mhyp/PCV
Композиция	Средний титр Mhyo	Средний титр PCV
А	0,21	10,1
В	0,12	9,2
С	0,06	7,0
D (строгий контроль	0,02	<3,4

Следует отметить, что композиция C представляет собой вакцину, которая обеспечивает защиту от Mhyo, поскольку часть Mhyo является такой же, как имеющаяся в продаже однократно применяемая вакцина M+Pac. Таким образом, предполагается, что композиции A и B также обеспечивают защиту от патогенных бактерий Mycoplasma hyopneumoniae. Что касается PCV2, известно, что имеющаяся в продаже вакцина Porcilis PCV обеспечивает защиту, когда титр превышает 9 приблизительно через 6 недель после введения (см., помимо прочего, результаты примера европейского патента № 2291195).

Пример 5

Исследовали 20 свиней в возрасте от 5½ до 6 недель. Их распределяли случайным образом по двум исследуемым группам по 10 свиней в каждой. Свиньи получали композиции E и F, соответственно, в возрасте 6 и 10 недель. У животных наблюдали системные показатели, в частности ректальные температуры и клинические признаки, а также местные реакции после обеих вакцинаций. Анализы крови осуществляли в возрасте 6, 10, 13 и 23 недель для определения серологических реакций на вакцины. В возрасте 23 недель животных подвергали посмертному исследованию в отношении местных реакций в точках инъекций.

Что касается последнего, при забое никакие неприемлемые местные реакции не наблюдались в точках инъекций. Среднее повышение температуры определяли через 4, 6 и 8 часов после введения композиций. Результаты представлены в таблице 7.

Таблица 7
Среднее повышение температуры после введение вакцин APP
Компо-зиция	Первая вакцинация (первичная)	Вторая вакцинация (дополнительная)
ΔTav, t=4	ΔTav, t=6	ΔTav, t=8	ΔTav, t=4	ΔTav, t=6	ΔTav, t=8
E	0,8	0,8	0,6	0,5	0,5	0,1
F	0,8	0,7	0,7	0,7	1,0	1,1

Как можно видеть, используемые антигены могут вызывать значительное повышение температуры у вакцинированных животных (см. результаты дополнительной вакцинации композицией F). Однако при использовании композиций согласно настоящему изобретению повышение температуры можно снижать и даже полностью подавлять (см., в частности, результаты через 8 часов после дополнительной вакцинации).

Кроме повышения температуры измеряли титры антител против антигенов через 13 недель после введения композиции. Результаты представлены в таблице 8.

Таблица 8
Средние титры через 13 недель после введение вакцин APP
Композиция	APXI	APXII	APXIII	OMP
E	9,7	11,0	9,7	9,5
F	8,5	10,0	8,5	8,3

Принимая во внимание тот факт, что композиция согласно настоящему изобретению (композиция E) вызывает еще более высокие титры, чем имеющаяся в продаже общепризнанная эффективная вакцина Porcilis APP (композиция F), видно, что новая композиция представляет собой эффективную вакцину для защиты животных против заражения патогенными бактериями Actinobacillus pleuropneumoniae.

Пример 6

В эксперименте по вакцинации исследовали две группы по шесть свиней в каждой. Композиции G и H вводили внутримышечно в дозах по 2 мл в возрасте одной недели (первичная вакцинация) и четырех недель (дополнительная вакцинация). Ректальную температуру измеряли непосредственно перед вакцинацией (t=0 час) и через 6 часов после вакцинации (ожидаемое время максимального повышения температуры).

Ни в одной из групп не были обнаружены какие-либо клинические признаки заболевания, и это означает, что все композиции можно рассматривать как безопасные. Среднее повышение температуры (разность температур через 6 часов и в нулевой момент времени) представлено в таблице 9.

Таблица 9
Среднее повышение температуры после введениевакцин H. parasuis
Композиция	Первая вакцинация (первичная), ΔTav, t=6 час	Вторая вакцинация (дополнительная), ΔTav, t=6 час
G	0,6	0,9
H	0,8	1,7

Как можно видеть, используемые антигены могут вызывать значительное повышение температуры у вакцинированных животных (см., в частности, результаты допо