Выделение вируса, родственного парвовирусу-2 собак, от енота

Выделение вируса, родственного парвовирусу-2 собак, от енота

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Эта заявка включает в качестве Списка последовательностей полное содержание сопроводительного текстового файла «PCT Sequence Listing_ST25.txt», созданного 14 октября 2010, включающего 18268 байтов, которое тем самым включено посредством ссылки.

ПРЕДПОСЫЛКИ СОЗДАНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Область техники

Настоящее изобретение в целом относится к улучшенным вакцинам против вирусов вроде парвовируса собак. В частности, настоящим изобретением обеспечиваются вакцины, подходящие для щенков, которые основаны на новом парвовирусе, выделенном от енота.

Предпосылки создания изобретения

Парвовирус собак (CPV) является в основном энтеральным патогеном, который инфицирует собак, особенно молодых собак. Парвовирусное инфекционное заболевание характеризуется острой диарей, лихорадкой и лейкопенией у собак и щенков возрастом старше 4-5 недель и заболеванием миокарда у щенков более младшего возраста. Коэффициент смертности в результате этого заболевания у невакцинированных собак является очень высоким. Хотя существуют вакцины против CPV, из-за того, что CPV является содержащим одноцепочечную ДНК вирусом и обладает чрезвычайной способностью к мутированию, вирус демонстрирует поразительную способность варьировать в антигенном отношении (Parrish and Kawaoka 2005) и, тем самым, уходить от иммунной защиты, которую дают вакцины. Поэтому необходим постоянный контроль антигенного типа и гепотипа циркулирующих вирусов, и корректировка вакцинных компонентов соответственно.

Новорожденные щенки приобретают иммунитеты против таких заболеваний, как CPV инфекционное заболевание, при грудном вскармливании от своей матери, особенно во время первых двух дней жизни. Вскармливаемый грудью щенок получает молозиво в молоке, которое выделяется сначала, и щенку передаются антитела в молозиве. В случае собак, а также многих других млекопитающих, иммунитет, который придает молозиво, иногда утрачивает свое действие в возрасте приблизительно пяти недель.

Особенно сложной задачей при вакцинировании щенков является введение вакцин в соответствии с периодом времени, который обеспечивает защиту, накладываемую на обеспечиваемую материнскими антителами защиту, и начинается, когда материнские антитела идут на убыль. В настоящее время схемы вакцинации щенков обычно начинаются в возрасте приблизительно 6 недель, и бустер-инъекции назначают приблизительно каждые 3 недели, например, в 9, 12 и 15 недель, после этого. Однако, чтобы эта схема обеспечила полную защиту, первая доза вакцины должна сразу вызывать протективный иммунный ответ. Это является совершенно нереальным вследствие недоразвития иммунной системы у щенков и периода времени, требуемого для установки иммунного ответа. Полная защита обычно не развивается до прохождения всего курса вакцинаций. Смертность вследствие CPV в зависимости от возраста представлена на фиг. 1, которая показывает, что максимальное значение смертности вследствие CPV наблюдается до того, как могут быть завершены протоколы вакцинирования.

Простым решением могло бы быть начинать программу вакцинации даже раньше, например, в 2-3 недель. Однако это будет бесполезно, поскольку в случае щенков, матери которых были вакцинированы штаммом вируса с теми же антигенными детерминантами или иначе подвергнуты воздействию такого штамма, материнские антитела, переданные щенку, будут нейтрализовать вирусы в вакцине, тем самым не позволяя собственной иммунной системе щенка отвечать на этот вирус.

Другой сложной задачей в ветеринарии является лечение рака, например, у собак. Существует множество недостатков в существующих средствах для лечения рака, особенно в случае старых собак. Введение онколитических парвовирусов для уничтожения раковых клеток является очень перспективным в качестве эффективного лечения рака (Rommelaere et al, Cytokine & Growth Factor Reviews 21: 185-195, 2010; и патент США с № 7179456, выданный Rommelaere и др., полное содержание которых включено сюда посредством ссылки) и могло бы применяться для собак. Однако наличие уже существующих антител против парвовирусов (например, в результате вакцинации) будет делать этот способ неэффективным, поскольку парвовирус будет нейтрализоваться существующими антителами. Кроме того, генная терапия для собак редко предпринимается в настоящее время, но могла бы быть многообещающим способом лечения нескольких нарушений в случае идентификации подходящих векторов, являющихся нуклеиновыми кислотами.

До сих пор известный уровень техники не решил эти задачи.

КРАТКОЕ ИЗЛОЖЕНИЕ СУЩНОСТИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение основывается на обнаружении новых парвовирусов (выделенных от енотов в США). Анализы нуклеотидных и аминокислотных последовательностей показали, что эти вирусы представляют собой уникальный вариант парвовируса типа 2 собак (CPV-2). Этот новый CPV-2, названный «AR08071304» (и упоминаемый здесь как парвовирус энотов, «RPV», «08071304» и «парвовирус-2 (от енота)» и т.д.), применим в качестве компонента вакцин против парвовируса собак. В частности, этот вариант применим в качестве компонента вакцин для очень молодых собак, например, щенков, все еще вскармливаемых молоком матери, или тех, кто находится в процессе прекращения естественного вскармливания, и, следовательно, решает задачи, как обеспечить соответствующие протоколы вакцинирования щенков. Этот парвовирус енотов не будет полностью нейтрализоваться существующими у собак антителами против парвовируса-2 собак. Кроме того, этот парвовирус енотов можно использовать в качестве онколитического агента и в качестве вектора (носителя, переносчика) для генной терапии, благодаря отсутствию нейтрализации с помощью уже существующих антител у реципиента или в организме хозяина, например, собаки.

Вариант вируса имеет близкую гомологию с численно преобладающими вирусами CPV-2, циркулирующими в настоящее время. Поэтому введение вакцины, содержащей новый вариант, вероятно, вызовет иммунный ответ, который также даст защиту от известных циркулирующих вирусов CPV-2. Однако существует некоторые антигенные различия между новым изолятом и известными вирусами CPV-2, воздействию которых ощенившаяся собака, вероятно, подвергалась (например, через посредство приготовления вакцины или предшествующего воздействия CPV). В частности, аминокислотным остатком в положении 232 вариантного капсидного белка, VP-2, является Thr (кодируемый ACA), а его аминокислотным остатком в положении 300 является Asp (кодируемый GAT). Эти различия в последовательности являются достаточными, чтобы дать в результате уникальный иммунореактивный профиль для варианта. Поэтому, маловероятно, что материнские антитела, переданные щенку (например, от ранее вакцинированной/подвергнутой воздействию матери), будут полностью инактивировать новый вирус, когда его введут щенку в качестве вакцины. В результате, иммунный ответ будет вызываться собственной иммунной системой щенка при подвергании воздействию RPV настоящего изобретения через посредство вакцинации, и иммунный ответ, вероятно, обеспечит широкую защиту от циркулирующих в настоящее время CPV вообще. Более того, этот парвовирус енотов, как представляется, является природной химерой парвовирусов плотоядных животных. Хотя нуклеотидная последовательность, кодирующая белок VP-2 RPV, имеет наибольший показатель общей гомологии (3309) с парвовирусом-2a собак (CPV-15), она также имеет высокую степень гомологии с вирусом панлейкопении у кошек, ранее выделенными парвовирусами енотов и вирусом энтерита у норок. Этот тип химерной последовательности не отмечался ранее в последовательностях парвовирусов собак или кошек, хотя схожие парвовирусы, как представляется в настоящее время, циркулируют в популяциях енотов в США (смотрите раздел «Примеры» ниже). Этот RPV обеспечит широкую иммунную защиту у нескольких видов плотоядных животных и, следовательно, подходит для применения в качестве вакцины против широкого круга парвовирусов. В редких, необычных случаях собака или кошка может умереть от инфицирования гетерологичным живым, не аттенуированным парвовирусом плотоядных животных; однако преимущества применения RPV настоящего изобретения, описываемого здесь, значительно перевешивают этот минимальный риск.

Хотя настоящее изобретение не основывается на какой-либо эволюционной модели или теории, одной интересной интерпретацией раскрытых здесь генетических данных является то, что RPV настоящего изобретения может являться предком нынешних парвовирусов собак и кошек. В вирусологическом сообществе ведутся дебаты в отношении происхождения парвовируса-2 собак, и RPV настоящего изобретения мог бы быть, в пределах границ этой теории, «живым ископаемым» парвовируса-2 собак. В любом случае описываемый здесь RPV кодирует уникальный белок VP-2, который включает мозаику из аминокислотных последовательностей парвовирусов кошек и собак. Таким образом, RPV настоящего изобретения является кандидатом на то, чтобы быть «предком» парвовирусов как кошек, так и собак, т.е. этих более новых парвовирусов плотоядных животных, произошедших от этого RPV. Альтернативно, RPV настоящего изобретения может представлять собой химерное промежуточное звено на «перекрестке» эволюции парвовирусов. В любом случае этот RPV обеспечивает средство для перекрестной иммунизации против гетерологичных парвовирусов, которого нет в распоряжении в настоящее время в противном случае при использовании любого из более специализированных для видов парвовирусов собак и кошек. Кроме того, RPV настоящего изобретения слабо агглютинирует свиные эритроциты (трансферрин); не разделяет некоторые важные эпитопы (например, аминокислотный остаток в положении 300 последовательности белка VP-2); и плохо растет в линиях клеток почки кошек (смотрите раздел «Примеры» ниже). В своей совокупности эти признаки соответствуют вирусу, который либо предшествует, либо является ранним промежуточным звеном в эволюционном каскаде парвовирусов собак и кошек.

Настоящим изобретением обеспечивается парвовирус, включающий характеристики парвовируса-2 (от енота) с № депонирования в ATCC.

Кроме того, настоящим изобретением обеспечиваются вакцины, включающие парвовирус, включающий характеристики парвовируса-2 (от енота) с № депонирования в ATCC. В одном варианте осуществления вакцина, кроме того, включает, один или более антигенных компонентов, выбираемых из группы, состоящей из вируса собачьей чумы (CDV), собачьего аденовируса типа 2, вируса парагриппа у собак, коронавируса собак, герпесвируса собак, ротавируса собак, одного или нескольких сероваров Leptospira и парвовируса-2 собак, в котором аминокислотой в положении 232 белка VP-2 не является Thr, а аминокислотой в положении 300 белка VP-2 не является Asp. В некоторых вариантах осуществления один или более сероваров Leptospira выбирают из группы, состоящей из Leptospira interrogans серовара canicolar, Leptospira interrogans серовара icterohaemorrhagiae, Leptospira interrogans серовара pomona и Leptospira kirschneri серовара grippotyphosa.

Настоящим изобретением также обеспечиваются выделенные нуклеиновые кислоты, включающие нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 1 или часть SEQ ID NO: 1; причем часть SEQ ID NO: 1 кодирует антигенную область белка VP-2, включающую аминокислотный остаток 232 SEQ ID NO: 3, аминокислотный остаток 300 SEQ ID NO: 3 или как аминокислотный остаток 232, так и аминокислотный остаток 300 SEQ ID NO: 3. В других вариантах осуществления настоящим изобретением обеспечиваются иммуногенные композиции, включающие эту нуклеиновую кислоту, причем нуклеиновая кислота присутствует в вирионе убитого или аттенуированного парвовируса или парвовирусе енотов низкократного пассирования (RPV). В некоторых вариантах осуществления вирион убитого парвовируса включает характеристики парвовируса-2 (от енота) с № депонирования в ATCC. В других вариантах осуществления вирион аттенуированного парвовируса присутствует в твердом носителе, подходящем для супралингвального растворения. В еще одних вариантах осуществления иммуногенная композиция подходит для подкожного введения.

Настоящее изобретение также относится к способу вызова у животного иммунного ответа против парвовирусной инфекции. Способ включает стадию введения животному иммуногенной композиции, включающей нуклеиновую кислоту, включающую нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 1 или часть SEQ ID NO: 1; причем указанная часть SEQ ID NO: 1 кодирует антигенную область белка VP-2, включающую аминокислотный остаток 232 SEQ ID NO: 3, аминокислотный остаток 300 SEQ ID NO: 3 или как аминокислотный остаток 232, так и аминокислотный остаток 300 SEQ ID NO: 3. В некоторых вариантах осуществления нуклеиновая кислота присутствует в вирионе убитого или аттенуированного парвовируса или RPV низкократного пассирования. В некоторых вариантах осуществления вирион убитого парвовируса включает характеристики парвовируса-2 (от енота) с № депонирования в ATCC. В некоторых вариантах осуществления вирион аттенуированного парвовируса присутствует в твердом носителе, подходящем для супралингвального растворения, и в некоторых вариантах осуществления животным является щенок. В еще одних вариантах осуществления иммуногенная композиция подходит для подкожного введения.

Настоящее изобретение, кроме того, относится к в значительной степени очищенному белку VP-2 парвовируса, который имеет остаток треонина в аминокислотном положении 232 и остаток аспарагиновой кислоты в аминокислотном положении 300; или его антигенный фрагмент, причем указанный антигенный фрагмент включает по меньшей мере часть указанного белка VP-2, которая имеет остаток треонина в аминокислотном положении 232 или остаток аспарагиновой кислоты в аминокислотном положении 300; или как остаток треонина в аминокислотном положении 232, так и остаток аспарагиновой кислоты в аминокислотном положении 300. В некоторых вариантах осуществления в значительной степени очищенный белок VP-2 парвовируса включает аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 3.

Настоящим изобретением также обеспечиваются экспрессионные векторы, включающие нуклеотидную последовательность, кодирующую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 3 или часть SEQ ID NO: 3; причем указанная часть SEQ ID NO: 3 является антигенной областью белка VP-2, включающей аминокислотный остаток 232 SEQ ID NO: 3, аминокислотный остаток 300 SEQ ID NO: 3 или как аминокислотный остаток 232, так и аминокислотный остаток 300 SEQ ID NO: 3. В некоторых вариантах осуществления экспрессионным вектором является рекомбинантный вирусный экспрессионный вектор. В других вариантах осуществления рекомбинантным вирусным экспрессионным вектором является экспрессионный вектор на основе поксвируса канареек.

Настоящим изобретением также обеспечивается способ уничтожения опухолевых клеток у млекопитающего. Способы включают стадию введения млекопитающему композиции, включающей парвовирус, включающий характеристики парвовируса-2 (от енота) с № депонирования в ATCC, в количестве, достаточном для инфицирования и уничтожения указанных опухолевых клеток у млекопитающего. В некоторых вариантах осуществления млекопитающим является собака, которая является серопозитивной по парвовирусу-2 собак. В других вариантах осуществления способ выполняют с использованием способа введения, выбираемого из группы, состоящей из внутривенного и внутриопухолевого введений. В еще одних вариантах осуществления парвовирусом является парвовирус низкократного пассирования.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

Фиг. 1. Распределение генотипов CPV-2 и числа летальных исходов CPV инфекционного заболевания относительно возраста собаки.

Фиг. 2A и B. Последовательности нуклеиновых кислот, кодирующие белки VP-2 нового варианта CPV-2 - AR08071304. A, более длинный вариант нуклеотидной последовательности (SEQ ID NO: 1), который кодирует белок из 599 аминокислот. Внутренний стоп-кодон, расположенный в положениях нуклеотидов 1753-1755, выделен полужирным шрифтом и подчеркнут. B, более короткий вариант нуклеотидной последовательности (SEQ ID NO: 2), который кодирует белок из 584 аминокислот. И в A, и в B подчеркнуты нуклеотиды, кодирующие Thr в положении 232 (нуклеотиды 694-696), и нуклеотиды, кодирующие Asp в положении 300 (нуклеотиды 898-900).

Фиг. 3A и B. Аминокислотная последовательность белка VP-2 нового варианта CPV-2 - AR08071304. A, (SEQ ID NO: 3), является более длинным вариантом белка в случае трансляции всех 599 кодируемых аминокислот; B, (SEQ ID NO: 4), является более коротким вариантом белка в случае возникновения терминации в стоп-кодоне. Положения 232 и 300 аминокислот, которыми являются Thr и Asp, соответственно в обоих белках, заключены в рамку.

Фиг. 4A-C. Схематические изображения: A, ДНК парвовируса енота (RPV); B, расположение открытых рамок считывания (ORF) RPV; C, связывание RPV с эукариотическими клетками.

Фиг. 5A и B. A, Схематическое изображение связывания парвовируса енота с рецептором трансферрина на клеточной поверхности (TFR); B, схема общей стратегии для приготовления автономных парвовирусных векторов.

Фиг. 6. Родство только что выделенного парвовируса енота с другими схожими вирусами.

Фиг. 7. Аминокислоты в важных эпитопах белка VP-2 только что выделенного парвовируса енота.

Фиг. 8. Филогенетическое дерево, сравнивающее белок VP-2 только что выделенного парвовируса енота с таковыми других парвовирусов плотоядных животных. CPV = парвовирус собак; RPV = парвовирус енота; FPV = парвовирус кошек; PV = парвовирус; MEV = вирус энтерита у норок; FPL = вирус панлейкопении у кошек; Aleu = парвовирус Алеутской болезни у норок; MVC = «минут-вирус» собак.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ НАСТОЯЩЕГО ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение относится к вакцине и виротерапевтическим препаратам, включающим аттенуированные формы нового варианта парвовируса, выделенного от инфицированного енота. В то время как вакцинные препараты подходят для введения широкому ряду плотоядных животных (например, собакам, кошкам, норке, еноту, членам семейств Canidae (собачьи), Procyonidea, Mustelidae и Viveridae, и т.д.), они, в частности, применимы для введения очень молодым собакам (щенкам). Это обусловлено тем, что новый вариант отличается от используемых в современных вакцинах вариантов CPV в степени, достаточной для того, чтобы сделать маловероятным распознавание и инактивацию вируса материнскими антителами (выработанными в ответ на введение вакцины и переданными щенкам при вскармливании грудью). Так же, в случае других применений для собак, в том числе взрослых собак, (например, в качестве терапии рака и в качестве вектора для генной терапии), RPV будет обходить уже существующие антитела, образованные в результате предшествующих вакцинаций, и, следовательно, ускользать от немедленного иммуноклиренса. А именно, в белке VP-2 изолята от енота аминокислотным остатком в положении 232 является Thr (кодируемый ACA), а остатком в положении 300 является Asp (кодируемый GAT). Таким образом, эти два аминокислотных остатка в RPV отличны от таковых белков VP-2 всех других известных изолятов CPV и могут быть ответственны за уникальные свойства (например, реактивность с антителами, смотрите раздел «Примеры» ниже) этого RPV. Вследствие аттенуации вирус не будет вызывать заболевание у реципиентов вакцины. С другой стороны, новый изолят схож с циркулирующими в настоящее время вирусами (например, идентичность аминокислотной последовательности составляет ~99% для белка VP-2) в степени, достаточной для того, чтобы после введения вируса молодому животному был вероятен вызов выработки антител, по меньшей мере некоторые из которых будут обладать перекрестной реактивностью с известными циркулирующими вирусами, и, следовательно, обеспечение защиты от этих вирусов вакцинированного молодого животного.

Описываемая здесь последовательность нуклеиновой кислоты (SEQ ID NO: 1) содержит внутренний стоп-кодон в положениях 1753-1755 нуклеотидов (смотрите фиг. 2A). Поэтому транслируемый с нее белок VP-2 имеет две различные формы. Одна форма, представленная на фиг. 3A (SEQ ID NO 3), является результатом сквозного прочитывания («протечки») стоп-кодона и поэтому является длиннее (599 аминокислот) второй формы, которая представлена на фиг. 3B и которая заканчивается в стоп-кодоне. Вторая форма белка содержит лишь 584 аминокислот (SEQ ID NO: 4). В первой, более длинной форме VP-2 стоп-кодон не транслируется, а «пропускается», что приводит к белку из 599 аминокислот. Используемый здесь термин «белок VP-2» включает как первую, более длинную форму VP-2, так и вторую, более короткую форму VP-2, и обе формы белка могут использоваться при осуществлении на практике настоящего изобретения. Эти две формы белка можно выявить, используя Вестерн-блоттинги. К тому же при осуществлении на практике настоящего изобретения могут использоваться обе последовательности нуклеиновых кислот (SEQ ID NO: 1 и 2), например, любая из двух или обе последовательности могут использоваться при приготовлении вакцины, в векторе и т.д. В некоторых вариантах осуществления аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 3 кодирует нуклеотидная последовательность SEQ ID NO: 1. В других вариантах осуществления аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 4 кодирует SEQ ID NO: 2. В еще одних вариантах осуществления настоящего изобретения SEQ ID NO: 1 может быть модифицирована в результате элиминации (делеции) стоп-кодона (например, с помощью генетической инженерии), чтобы с нее транслировалась аминокислотная последовательность SEQ ID NO: 3.

Этот новый RPV также служит в качестве модели правильной бустер-иммунизации в случае других животных и инфекционных заболеваний человека. Например, при гриппе у людей (H1N1) на основе имеющейся информации ответная реакция на вакцину варьирует в зависимости от наличия уже существующих антител. Если у человека уже существуют антитела, титр не повышается, но аффинность антител действительно увеличивается. Если у человека нет уже существующего титра, то у человека нет ответной реакции с развитием нейтрализующего протективного иммунитета.

Новый изолят был депонирован в Американскую коллекцию типовых культур (АТСС) в Manassas, VA, 7 октября 2010, как Parvovirus-2 (Raccoon), от имени Oklahoma State University, (расписка от ATCC в получении была получена 12 октября 2010), и ему присвоен № депонирования в ATCC. Настоящим изобретением также обеспечивается выделенный парвовирус, включающий характеристики № депонирования в ATCC, и его потомство. Настоящее изобретение, кроме того, включает убитые или аттенуированные парвовирусы, включающие характеристики № депонирования в ATCC, депонированные 7 октября 2010, и потомство аттенуированных парвовирусов, а также включающие их вакцины и иммуногенные композиции.

Настоящее изобретение также относится к другим RPV, выделенным в Illinois и размноженные в CRFK, (10071199-A и 10071199-C), частичные последовательности которых представлены в разделе «Примеры». Таким образом, настоящее изобретение также включает парвовирусы енотов, которые циркулируют в США (например, в Arkansas и Illinois), общей особенностью которых является то, что они не реагируют с моноклональным антителом против парвовируса собак (MoAb) 3B10, MoAb, которое чаще всего используется для диагностики. 3B10 является специфичным для аминокислоты в положении 300 VP-2, которая обычно является глицином. Таким образом, эти RPV имеют мутацию в положении 300 аминокислоты VP-2, которая включена в посадочное место этого MoAb и мешает ему распознавать белки. Иначе, эти вирусы имеют составляющую приблизительно 98% гомологию с VP-2 других парвовирусов-2 плотоядных животных. Однако хорошо известно, что даже небольшое число мутаций в важных местах может оказывать большое влияние на свойства вируса (например, смотрите Qu et al, 2005, где описываются мутации в двух важных аминокислотных остатках шипообразного белка коронавирусов, которые изменяли его тропизм).

Филогенетические исследования этого вируса (например, смотрите примеры 1 и 5) показали, что этот RPV [парвовирус-2 (от енота)] является близкородственным CPV-2 собак и, в сущности, может быть вариантом этого вируса. Как таковые, домашние взрослые собаки могут быть восприимчивыми к этому вирусу, и им, вероятно, принесет пользу введение вакцин, которые включают этот вариант.

Передача только что выделенного парвовируса от енотов любимым домашним животным, таким как собаки, а также другим диким животным, вероятно, будет происходить вследствие особенностей поведения енотов. Например, еноты являются весьма умными и очень быстро адаптируются к новым источникам пищи. Они являются всеядными, поедая широкий ряд растений и животных, в зависимости от времени года и наличия. Из-за их легкой интеграции в городские территории и адаптации к ним еноты обычно взаимодействуют с домашними собаками и кошками и близко контактируют с ними. Еноты обладают отличными способностями схватывания и легко учатся, например, открывать контейнеры, определять местонахождение и открывать консервы для животных, и т.д. Вследствие этого поведения они потенциально способны к передаче парвовируса домашним плотоядным животным. Еноты также взаимодействуют с другими дикими животными, такими как скунсы, и, следовательно, также существует возможность межвидового взаимодействия и передачи парвовирусов. Поэтому взрослым собакам и другим домашним любимым животным могло бы принести пользу введение вакцин, которые включают описываемый здесь вирус енота, даже если они были ранее вакцинированы вакциной против другого парвовируса; и введение таких вакцин могло бы принести пользу другим видам, либо одомашненным, либо нет. Польза могла бы быть двойной: 1) вакцинация могла бы обеспечить иммунитет к инфицированию этим конкретным CPV; и 2) этот CPV достаточно схож с другими парвовирусами (например, гомологичен на приблизительно 99% другим парвовирусам плотоядных животных), чтобы он с долей вероятности также вызвал и повысил бы по меньшей мере какой-либо иммунитет против них.

В некоторых вариантах осуществления вакцины и имммуногенные композиции согласно настоящему изобретению являются моновалентными по природе, т.е. содержащими единственным агент, которым является описываемый здесь изолят парвовируса (например, с характеристиками парвовируса-2 (от енота), с № депонирования в ATCC, депонированного 7 октября 2010), или аттенуированная или убитая форма изолята, описываемого здесь, или потомство любого из них. В других вариантах осуществления вакцины и иммуногенные композиции являются поливалентными, т.е. они содержат множество антигенных агентов, одним из которых является изолят настоящего изобретения. Приводимые в качестве примеров дополнительные компоненты поливалентных композиций включают, но без ограничения, один или несколько из вирусов собачьей чумы (CDV), собачьего аденовируса типа 2, вируса парагриппа у собак, коронавируса собак, герпесвируса собак, ротавируса собак, одного или нескольких сероваров Leptospira и парвовируса-2 собак, который отличается по последовательности гена VP-2, т.е. в котором аминокислотой в положении 232 белка VP-2 не является Thr, и/или аминокислотой в положении 300 белка VP-2 не является Asp, или в котором кодоном, кодирующим Thr в аминокислотном положении 232 белка VP-2, не является ACA, и/или кодоном, кодирующим Asp в аминокислотном положении 300 VP-2, не является GAT. Приводимые в качестве примеров CDV включают, но без ограничения, вирусы собачьей чумы, описанные в заявке на патент США 12/696983 (Kapil), опубликованной как US2010/0196420, полное содержание которой тем самым включено посредством ссылки. Приводимые в качестве примеров серовары Leptospira включают, но без ограничения, Leptospira interrogans серовар canicolar, Leptospira interrogans серовар icterohaemorrhagiae, Leptospira interrogans серовар pomona и Leptospira kirschneri серовар grippotyphosa. Кроме того, изолят настоящего изобретения можно объединить со множеством различных антигенов, например, с антигенами известных поливалентных вакцин, таких как Galaxy® DA2PPV или Nobivac DA2PPv + L4, и т.д.

В конкретном варианте осуществления реципиентом вакцины согласно настоящему изобретению является молодое животное (например, щенок), а способом введения является введение через посредство «леденца для щенков»». Леденцы для щенков для применения при введении вакцинных композиций молодым собакам (или молодым животным других видов) подробно описываются в находящейся одновременно на рассмотрении патентного ведомства PCT-заявке на патент с № PCT/US2010/042142 Kapil и др., поданной 15 июля 2010, полное содержание которой тем самым включено посредством ссылки. Вкратце, леденец для щенков и схожая уловка используется для доставки вакцины на верхнюю сторону языка, т.е. супралингвально. В частности, вакцинный препарат вводят способом, который доставляет вакцину к базальным клеткам языка или близко к ним. Базальные клетки инфицируются аттенуированным парвовирусом в вакцине, и создается антигенное депо (например, резервуар вируса), которое постепенно, со временем и с очень раннего возраста, высвобождает аттенуированный парвовирус внутри щенка. В этом способе используется тот факт, что язык является иммунологически относительно привилегированным (свободным от иммунного ответа). Вакцина может быть, например, включена в удерживаемый рукой в каком-либо положении «леденец для щенков», который вводит супралингвально тот, кто ухаживает за щенком, например, посредством удерживания палочки, веревочки или другого средства доставки, прикрепленной к твердому вакцинному препарату, который помещают в рот щенка. Твердый препарат включает твердый, инертный носитель; при этом парвовирус рассредоточен или распределен по всему твердому носителю, и врожденный сосательный рефлекс, демонстрируемый щенком, позволяет постепенно растворить носитель, и на язык высвобождается парвовирус.

В одном варианте осуществления настоящее изобретение включает нуклеиновые кислоты с нуклеотидной последовательностью, кодирующей белок VP-2 RPV, такой как та, которая определена в SEQ ID NO: 1, или альтернативно SEQ ID NO: 2 (смотрите фиг. 2A и B), или частями такой нуклеотидной последовательности, которые кодируют антигенные области или эпитопы, достаточные для вызова иммунного ответа на RPV у реципиента вакцины, и включающие их вакцины. В частности, такие последовательности нуклеиновых кислот будут включать один из кодонов или оба кодона, которые кодируют аминокислоты в положениях 232 и 300 белка VP-2. Этими кодонами являются ACA и GAT, соответственно, кодирующие Thr и Asp, соответственно. В другом варианте осуществления настоящее изобретение включает нуклеиновые кислоты с нуклеотидной последовательностью, кодирующей белок VP-2, включающий аминокислотную последовательность, которая определена в SEQ ID NO: 3 (или альтернативно, SEQ ID NO: 4, которую охватывает SEQ ID NO: 3, смотрите фиг. 3A и B), или части аминокислотной последовательности, определенной в SEQ ID NO: 3, которые включают антигенные области или эпитопы, достаточные для вызова иммунного ответа на антигенные области или эпитопы у реципиента вакцины, и включающие их вакцины. В частности, такие белки или их части будут включать один или оба из аминокислотных остатков 232 и 300 белка VP-2 RPV, которыми являются Thr и Asp, соответственно. Настоящим изобретением также охватываются описываемые здесь варианты и/или производные таких последовательностей, и вакцинные препараты, которые включают варианты и/или производные. Например, квалифицированным в данной области техники специалистам будет понятно, что, вследствие избыточности генетического кода, отличные от SEQ ID NO: 1 последовательности могут использоваться для кодирования аминокислотной последовательности, определенной в SEQ ID NO: 3. К тому же, хотя нуклеотидная последовательность, определенная в SEQ ID NO: 1, представляет собой одноцепочечную (оц) ДНК, настоящее изобретение также включает соответствующую двухцепочечную (дц) ДНК, комплементарную ДНК и РНК любой формы (например, мРНК, гибриды РНК/ДНК, и т.д.), которая основа на этих последовательностях, происходит из них или которая служит их комплементом. Такие последовательности могут быть либо смысловыми, либо антисмысловыми последовательностями. Кроме того, для применения в вакцинах также предусматриваются последовательности, которые гомологичны SEQ ID NO: 1 на по меньшей мере приблизительно 50%, предпочтительно приблизительно 60%, более предпочтительно приблизительно 70, 80 или 90%, или даже приблизительно 95, 96, 97, 98 или 99% или более, при условии, что эти последовательности кодируют один или оба из аминокислотных остатков 232 и 300 в виде Thr и Asp, соответственно. Такие последовательности могут отличаться, например, в результате содержания альтернативных кодонов, которые кодируют одну и ту же аминокислоту, в одном или нескольких положениях.

К тому же, также предусматриваются части этих последовательностей, которые кодируют антигенные области или эпитопы белка VP-2 AR08071304. Предусматриваются, в частности, нуклеотидные последовательности, включающие кодоны, которые кодируют один или оба из аминокислотных остатков 232 и 300 в виде Thr и Asp, соответственно. В одном варианте осуществления кодоном, кодирующим аминокислотный остаток 232 в виде Thr, является ACA, а кодоном, кодирующим аминокислотный остаток 300 в виде Asp, является GAT. К тому же, также включены последовательности, которые кодируют аминокислотные последовательности, идентичные SEQ ID NO: 3 на 70%, или более предпочтительно приблизительно 80, 90 или 95% или даже более (например, 96, 97, 98 или 99%), при условии, что эти последовательности кодируют один или оба из аминокислотных остатков 232 и 300 в виде Thr и Asp, соответственно, или их варианты и/или производные, включающие более короткие антигенные области или эпитопы. Такие варианты и/или производные SEQ ID NO: 3 и/или ее антигенных областей или эпитопов могут варьировать, например, в результате содержания консервативных или неконсервативных аминокислотных замен или делеций (особенно делеций с амино-конца или карбоксильного конца), или различных вставок, и т.д., при условии, что результирующий белок/пептид является антигенным и вызывает иммунный ответ у реципиента вакцины. Длина таких антигенных областей или эпитопов предпочтительно составляет по меньшей мере приблизительно 10 аминокислот, и они включают одну или более из аминокислот в положениях 232 и 300, с привязкой к нумерации аминокислотных остатков белка VP-2, представленной на фиг. 3, которыми являются Thr и Asp, соответственно. Антигенная область может, однако, включать весь ген/белок VP-2 AR08071304.

Кроме того, изобретение также относится к последовательностям нуклеиновых кислот, которые гибридизуются с раскрытыми здесь последовательностями (или частями этих последовательностей) в жестких условиях (особенно условиях высокой жесткости), при условии, что эти последовательности кодируют один или оба из аминокислотных остатков 232 и 300 в виде Thr и Asp, соответственно. Жесткие условия относятся к условиям гибридизации, которые позволяют последовательности нуклеиновой кислоты гибридизоваться с конкретной последовательностью. Как правило, условия высокой жесткости относятся к условиям гибридизации, которые позволяют последовательности нуклеиновой кислоты длиной по меньшей мере 50 нуклеотидов и предпочтительно приблизительно 200 или более нуклеотидов гибридизоваться с конкретной последовательностью при приблизительно 65°C в растворе, включающем приблизительно 1 M соль, предпочтительно 6 × SSC или любом другом растворе, имеющем соизмеримую ионную силу, и промывке при 65°C в растворе, включающем приблизительно 0,1 M соль, или меньше, предпочтительно 0,2 × SSC или любом другом растворе, имеющем соизмеримую ионную силу. Эти условия позволяют выявлять последовательности, идентичные на приблизительно 90% или более. Как правило, условия низкой жесткости относятся к условиям гибридизации, которые позволяют последовательности нуклеиновой кислоты длиной по меньшей мере 50 нуклеотидов и предпочтительно приблизительно 200 или более нуклеотидов гибридизоваться с конкретной последовательностью при приблизительно 45°C в растворе, включающем приблизительно 1 M соль, предпочтительно 6 × SSC или любом другом растворе, имеющем соизмеримую ионную силу, и промывке при комнатной температуре в растворе, включающем приблизительно 1 M соль, предпочтительно 6 × SSC или любом другом растворе, имеющем соизмеримую ионную силу. Эти условия позволяют выявлять последовательности, идентичные на вплоть до 50%. Квалифицированный в данной области техники специалист будет способен модифицировать эти условия гибридизации, чтобы идентифицировать последовательности со степенью идентичности, варьирующей между 50% и 90%.

Настоящее изобретение также относится к различным типам рекомбинантных и/ил