Антитела, нейтрализующие интегрин ανβ8

Антитела, нейтрализующие интегрин ανβ8

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Перекрестные ссылки на родственные заявки

В настоящей заявке испрашивается приоритет по предварительной заявке США №61/305,749, поданной 18 февраля 2010 г., и приоритет по предварительной заявке США №61/428,814, поданной 30 декабря 2010 г., раскрытие которых включено в данный документ в полном объеме в виде ссылки.

Заявление относительно прав на изобретения, сделанные в соответствии с финансируемыми федеральным правительством исследованиями и разработками

Настоящее изобретение было сделано при поддержке Правительства США по грантам №HL63993, NS-44155, U01 AI075443, выданным Национальным Институтом Здравоохранения. Правительство США имеет прямые права на настоящее изобретение.

Уровень техники

Трансформирующий фактор роста-β (TGF-β) - многофункциональный цитокин, играющий важные роли в биологии иммунных, эндотелиальных, эпителиальных и мезенхимальных клеток при развитии и во взрослой жизни у беспозвоночных и позвоночных видов. У млекопитающих эти функции опосредованы тремя изоформами TGF-β1, 2, и 3, каждая из которых широко представлена. Все три изоформы взаимодействуют с одними и теми же рецепторами клеточной поверхности (TGFBR2 и ALK5) и передают сигнал через одни и те же внутриклеточные сигнальные пути, которые включают в себя либо канонические (т.е. SMADS) или неканонические (т.е., МАРК, JUN, PI3K, РР2А, Rho, Par6) сигнальные эффекторы. Наиболее интенсивно изучались канонические сигнальные пути TGF-β, в которых сигнализация TGF-β передается от рецепторного аппарата TGF-β посредством фосфорилирования цитоплазматических SMAD-2/3, образования комплекса с SMAD-4, ядерной транслокации комплекса SMAD-2/3/4, и связывания с элементами ответа SMAD, которые расположенным в промоторных регионах многих генов, вовлеченных в фиброгенный ответ.

Однако, несмотря на наличие сходных партнеров передачи сигналов, каждая изоформа служит для индивидуальной биологической функции, возможно, из-за различий в аффинности связывания с рецепторами TGF-β, в механизме активации, в интенсивности или продолжительности передачи сигнала, или в пространственном и/или временном распределении.

Модели нокаута и модели условного удаления изоформ TGF-β, рецепторов, и сигнальных медиаторов, а также направленные на все изоформы TGF-β реагенты, блокирующие их функции, выявили существенную роль TGF-β в Т-клетках и в клетках сердца, легких, сосудов, и развития неба. Например, мыши, дефицитные по TGF-β1 либо умирают внутриутробно вследствие дефектов васкулогенеза в желточном мешке или рождаются и выживают до взрослого состояния, но у них развивается тяжелые полиорганные аутоиммунные заболевания. Генетическое удаление сигнальных медиаторов TGF-R показало существенную роль SMAD2 в раннем формировании и образовании мезодермы, и мыши, лишенные SMAD3, оказываются жизнеспособными и фертильными, но демонстрируют наличие пороков развития конечностей, нарушение иммунной регуляции, колиты, рак толстой кишки, и расширение альвеол. В тканях взрослого организма путь TGF-β, как полагают, регулирует динамическое взаимодействие между иммунными, мезенхимальными и эпителиальными клетками для поддержания гомеостаза в ответ на экологический стресс.

Нормальные гомеостатические пути опосредованные TGF-β, нарушаются в ответ на хронические повторяющиеся повреждения. В случаях повреждения, TGF-β становится основным профиброгенным цитокином, задерживая эпителиальное заживление раны путем ингибирования пролиферации эпителия и миграции и стимуляции апоптоза и расширения мезенхимного компартмента, индуцируя рекрутинг фибробластов, сократительную способность фибробластов, и отложение внеклеточного матрикса. Действительно, интратрахеальное введение рекомбинантного TGF-β1 в составе аденовируса в легкие грызунов резко увеличивает накопление фибробластов и экспрессию коллагена I типа и III типа вокруг дыхательных путей и в легочном интерстиции, а нейтрализующие анти-TGF-β антитела могут блокировать экспериментально вызванный блеомицином или радиацией фиброз легких.

Возросшая активность пути TGF-β также вовлечена в фиброзные заболевания легких, гломерулосклероз, и рестеноз сосудов сердца. Большинство патологических изменений опосредованных TGFβ, как представляется, связаны с изоформой TGF-β1. Сложность функционирования TGF-β1 в организме человека объясняется наличием наследственных заболеваний с генерализованным или клеточно-специфичным повышением или недостатком непосредственно TGF-β1 или его сигнальных эффекторов. Мутации, повышающие активность путей TGF-β, приводят к дефектам костного метаболизма (напр. болезни Камурати-Энгельмана) и соединительной ткани (т.е. синдром Марфана), и к аневризме аорты (т.е. синдроме Лойе-Дитца), в то время как мутации, которые приводят к снижению активности пути TGF-β коррелируют с возникновением рака и его прогнозом. Роль TGF-β, как подавителя раковой опухоли не является однозначной, поскольку TGF-β может также увеличить рост опухоли и вызвать метастазирование, возможно, посредством его участия в подавлении иммунитета, клеточной инвазии, эпителиально-мезенхимального перехода, или ангиогенеза.

Несмотря на многочисленные важные функции TGF-β, одноразовое введение или краткосрочное назначение нейтрализующих антител пан-TGF-β, как сообщается, хорошо переносится в дозах, которые препятствуют фиброзу органа или экспериментальному росту раковых клеток и метастазов, без возникновения побочных эффектов у взрослых мышей и крыс. Данное лечение показало терапевтическую эффективность в подавлении экспериментального фиброза. Ввиду этих многообещающих результатов, проводятся клинические испытания I и II фазы разовых доз нейтрализующих пан-TGF-β антител для метастатической почечно-клеточной карциномы, меланомы, фокального сегментарного гломерулосклероза, и идиопатического легочного фиброза (Genzyme Corporation, genzymeclinicalresearch.com, последнее обращение 27 августа 2009 г.). Для минимизации системных эффектов весьма желательной целью является направленное воздействие на путь TGF-β.

Краткое описание сущности изобретения

Настоящее изобретение относится к способу уменьшения активации TGF-β, у индивида, например, человека или не человека, путем введения антагониста интегрина ανβ8 нуждающемуся в нем индивиду, тем самым, снижая активацию TGF-β у индивида. В некоторых вариантах осуществления антагонист уменьшает активацию TGF-β (например, рекрутинг протеазы, расщепляющей латентный TGF-β, тем самым освобождая зрелые, активные пептиды TGF-β), но практически не ингибируют адгезию ανβ8 к TGF-β (например, адгезию ανβ8, который экспрессируется на клеточной поверхности, к латентному TGF-β, который связан с клеточным матриксом).

В некоторых вариантах осуществления антагонист представляет собой антитело. Таким образом, изобретение предоставляет изолированные антитела, которые ингибируют высвобождение активного, зрелого пептида TGFβ (активацию TGF-β), но практически не ингибируют адгезию TGFβ к ανβ8 на ανβ8-экспрессирующей клетке. В некоторых вариантах осуществления антитело специфически связывается с ανβ8, например, специфично с β8. В некоторых вариантах осуществления антитело связывается с эпитопом на β8, в пределах SEQ ID NO:11. В некоторых вариантах осуществления эпитоп содержит, по меньшей мере, одну аминокислоту, выбранную из аминокислот I125, R128, R175, F179 и F180 человеческого β8. В некоторых вариантах осуществления антитело связывается, по меньшей мере, с одной аминокислотой, выбранной из аминокислот, R79, I85, S95, Р100, I108, Р109, R128, Н140 и F179 человеческого β8. В некоторых вариантах осуществления антитело связывает, по меньшей мере, одну аминокислоту, выбранную из аминокислот I74, N88, I107, T110, I125, R175 и F180 человеческого β8. В некоторых вариантах осуществления антитело связывает человеческий β8, но не связывает мышиный β8. В некоторых вариантах осуществления антитело уменьшает активацию TGFβ, но практически не ингибирует ανβ8 - опосредованную адгезию клеток к TGFβ.

В некоторых вариантах осуществления антитело конкурирует за связывание с ανβ8 с антителом, имеющим вариабельную область тяжелой цепи, содержащую три CDR легкой цепи с SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, и вариабельную область легкой цепи, содержащую три CDR тяжелой цепи с SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10. В некоторых вариантах осуществления антитело имеет вариабельную область тяжелой цепи, содержащую три CDR тяжелой цепи с SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, и вариабельную область легкой цепи, содержащую три CDR легкой цепи с SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10. Например, в некоторых вариантах осуществления антитело имеет вариабельную область легкой цепи с последовательностью SEQ ID NO: 3 или 4 и вариабельную область тяжелой цепи с последовательностью SEQ ID NO: 1 или 2. Конкретные примеры антител по настоящему изобретению включают в себя антитело, имеющее вариабельную область легкой цепи с SEQ ID NO: 3 и вариабельную область тяжелой цепи с SEQ ID NO: 1, и антитело, имеющее вариабельную область легкой цепи с SEQ ID NO: 4 и вариабельную область тяжелой цепи с SEQ ID NO: 2.

Антитела могут быть различных изотипов, например, IgG1, IgG2, IgG2a, IgG или IgG4. Могут быть использованы как моноклональные, так и поликлональные антитела. В некоторых вариантах осуществления это антитела человека, гуманизированные или химерные антитела.

Настоящее изобретение также дополнительно представляет выделенную нуклеиновую кислоту, вектор или векторы, и клетки-хозяева, подходящие для экспрессии антитела по настоящему изобретению.

В настоящее изобретение также дополнительно предлагается фармацевтическая композиция, содержащая антитела по настоящему изобретению и фармацевтически приемлемый наполнитель. В некоторых вариантах фармацевтическая композиция представляет собой диагностическую композицию, например, содержащую меченые антитела. В некоторых вариантах фармацевтическая композиция является терапевтической.

В некоторых вариантах осуществления антитело используется для обнаружения, например, для определения наличия β8 in vivo или т vitro. В таких вариантах осуществления антитело прямо или опосредованно помечено обнаруживаемым фрагментом. Таким образом, в некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение предоставляет способы определения присутствия интегрина β8 в биологическом образце (in vitro или in vivo), включающий в себя контакт биологического образца с мечеными антителами в соответствии с настоящим изобретением и обнаружение присутствия меченого антитела, тем самым определяя присутствие интегрина β8. В некоторых вариантах осуществления, метод используется для диагностики состояния, выбранного из группы, состоящей из артрита, хронической обструктивной болезни легких (ХОБЛ), астмы, фиброзного расстройства, аутоиммунного воспалительного заболевания мозга, рассеянного склероза, демиелинизирующего заболевания (например, поперечного миелита, болезни Девика, синдрома Гийена-Барре), нейровоспаления, заболевания почек, аденокарциномы, плоскоклеточного рака, глиомы, рака молочной железы, и роста рака и метастазов.

Настоящее изобретение также относится к трансгенной мыши, которая экспрессирует человеческий интегрин β8. В некоторых вариантах, трансгенные мыши по изобретению не экспрессируют интегрин мыши β8.

Композиции и способы по настоящему изобретению могут быть использованы для уменьшения активации TGF-β у индивидов, имеющих одно или несколько состояний, выбранных из группы, состоящей из артрита, хронической обструктивной болезни легких (ХОБЛ), астмы, фиброзных расстройств, аутоиммунных заболеваний, воспалительных заболеваний мозга, рассеянного склероза, демиелинизирующих заболеваний (например, поперечного миелита, болезни Девика, синдрома Гийена-Барре), нейровоспалений, заболеваний почек, аденокарциномы, плоскоклеточного рака, глиомы, рака молочной железы, и роста рака и метастазов, и в которых уменьшение содержания TGF-β улучшает состояние больных. В некоторых вариантах осуществления фиброзные расстройства дыхательных путей представляют собой фиброз, идиопатический легочный фиброз, неспецифическую интерстициальную пневмонию, постинфекционный фиброз легких, диффузное альвеолярное повреждение, связанный с фиброзом легких коллагеноз, индуцированный лекарствами фиброз легких, силикоз, связанный с асбестом фиброз легких, дыхательный бронхиолит, дыхательный бронхиолит ассоциированный с интерстициальным заболеванием легких, десквамативный интерстициальный фиброз, криптогенную пневмонию, хроническую аллергическую пневмонию, медикаментозный фиброз легких, фиброз почек или печени.

Подробное описание изобретения

Введение

Настоящее изобретение основано, частично, на открытии того, что определенные анти-ανβ8 антагонисты, анти-ανβ8 антитела или иммуноконъюгаты избирательно нарушают опосредованную ανβ8 активацию TGF-β, но не адгезию ανβ8 - экспрессирующей клетки к иммобилизованному TGF-β.Соответственно, настоящее изобретение предоставляет способы уменьшения активации TGF-β у индивида посредством введения антагониста ανβ8 (например, малых молекул, антител анти-ανβ8 или иммуноконъюгатов) индивиду, который в этом нуждается, тем самым снижая активацию TGF-β в его организме. Настоящее изобретение также предусматривает новые антитела, имеющие вариабельную область тяжелой цепи, содержащую три CDR тяжелой цепи: SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, и вариабельную область легкой цепи, содержащую три CDR легкой цепи: SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10.

Определения

Термин "интегрин β8" используется взаимозаменяемо с itgb8, ITGB8, β8, и им подобными терминами. ITGB8, как правило, используют для обозначения последовательности человека, в то время itgb8 относится к последовательности мыши. Последовательности человеческого белка можно найти в базе Uniprot, код доступа Р26012, а последовательности белков мышей имеются в базе Uniprot под кодом доступа Q0VBD0.

Термин "антагонист", по настоящему изобретению, относится к агенту, который ингибирует экспрессию полипептида или полинуклеотида изобретения или связывается с ним, частично или полностью блокируя стимуляцию, снижая, предотвращая, задерживая активацию, инактивируя, уменьшая чувствительность, или понижая активность полипептида или полинуклеотида по настоящему изобретению. Антагонист может нейтрализовать активность (например, предотвратить связывание и активацию природным лигандом) или принудительно уменьшить активность.

Термины "идентичные" или процент "идентичности" в контексте двух или более нуклеиновых кислот или полипептидных последовательностей, относятся к двум или более последовательностям или подпоследовательностям, которые являются одинаковыми или имеют определенный процент аминокислотных остатков или нуклеотидов, которые являются такими же (т.е. около 60% идентичности, предпочтительно 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или более идентичности в пределах определенного региона, при сравнении и выравнивании для максимального соответствия в окне сравнения или в определенной области), и измеряется с помощью алгоритмов сравнения последовательностей BLAST или BLAST 2.0 с параметрами по умолчанию описанными ниже, или с помощью ручного выравнивания и визуального осмотра (см., например, веб-сайт NCBI http://ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/ или подобный). Такие последовательности, далее называют, "по существу идентичными". Настоящее изобретение предоставляет, например, антитела, имеющие полинуклеотидные или полипептидные последовательности, которые имеют, по меньшей мере, 80% идентичности, предпочтительно 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, или 100% идентичности, по отношению к эталонной последовательности, например, SEQ ID NO:1-10. Данное определение относится, или может быть применено в качестве дополнения к тестовой последовательности. Данное определение также включает в себя последовательности, которые имеют делеции и/или вставки, а также те, которые имеют замены. Как описано ниже, предпочтительные алгоритмы могут учитывать пробелы и т.п. Предпочтительно, идентичность существует в области, которая состоит, по меньшей мере, примерно из 25 аминокислот или нуклеотидов в длину, или более предпочтительно, в области, составляющей 50-100 аминокислот или нуклеотидов в длину.

Для сравнения последовательности, как правило, одна последовательность выступает в качестве эталонной последовательности, с которой сравниваются тестовые последовательности. При использовании алгоритма сравнения исследуемая последовательность и эталонная последовательность вводятся в компьютер, если необходимо назначаются координаты подпоследовательности, и устанавливаются параметры алгоритма программы. Предпочтительно, могут быть использованы параметры по умолчанию, или могут быть установлены альтернативные параметры. Алгоритм сравнения последовательностей затем вычисляет основанный на параметрах программы процент идентичностей последовательности для тестовой последовательности по отношению к эталонной последовательности.

Термин "окно сравнения", как он использован в данном документе, включает в себя ссылку на сегмент, состоящий из некоторого количества смежных позиций, примерно из от 20 до 600, как правило, от около 50 до около 200, более обычно от около 100 до 150, последовательность которых может быть сравнена с эталонной последовательностью того же числа смежных позиций, после того как две последовательности оптимально выровняют. Методы выравнивания последовательностей для сравнения хорошо известны в данной области техники. Оптимальное выравнивание последовательностей для сравнения можно проводить, например, с помощью алгоритма локальной гомологии Smith & Waterman, Adv. Appl. Math. 2:482 (1981), с помощью алгоритма гомологии выравнивания Needleman и Wunsch, J. Mol. Biol. 48:443 (1970), способом поиска сходства Pearson & Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444 (1988), по компьютеризированной реализации этих алгоритмов (GAP, BESTFIT, FASTA, и TFASTA на программном обеспечении Wisconsin Genetics, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI), или ручным выравниванием и визуальной инспекцией (см., например. Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel и др., ред. 1995 года, дополнение)).

Алгоритмы, которые подходят для определения процента идентичности и подобия последовательностей представляют собой алгоритмы BLAST и BLAST 2.0, которые описаны в Altschul и др., Nuc. Acids Res. 25:3389-3402 (1977) и Altschul и др., J. Mol. Biol. 215:403-410 (1990), соответственно. BLAST и BLAST 2.0, используются, с параметрами, описанными здесь, чтобы определить процент идентичности последовательности нуклеиновых кислот и белков по изобретению. Программное обеспечение для проведения анализа BLAST является общедоступным через Национальный центр по биотехнологической информации (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/). Этот алгоритм включает первичную идентификацию пар последовательностей с максимальным сходством (HSP) посредством идентификации коротких слов с длиной W в представляющей интерес последовательности, которые либо совпадают, либо удовлетворяют некоторому оцениваемому положительно порогу значения Т при выравнивании со словом такой же длины в последовательности из базы данных. Т определяется как порог значений для соседних слов (Altschul (1990) выше). Эти изначальные совпадения соседних слов выступают в роли затравок для начала поиска при обнаружении более длинных HSP, содержащих их. Поиск совпадений слов распространяется в обоих направлениях вдоль каждой последовательности до тех пор, пока суммарное значение для выравнивания может повышаться. Суммарные значения вычисляются с использованием для нуклеотидных последовательностей параметров М (значение компенсации за пару совпавших остатков; всегда >0) и N (штрафной балл за несоответствие остатков, всегда <0). Для аминокислотных последовательностей для вычисления суммарного значения используется оценочная матрица. Продолжение поиска совпадений слов в каждом направлении останавливают, если суммарное значение для выравнивания снижается по величине Х ниже максимально достижимого значения; суммарное значение снижается до нуля или ниже при накоплении одного или нескольких выровненных остатков с отрицательным значением или если достигнут конец любой последовательности. Параметры алгоритма BLAST W, Т и Х определяют чувствительность и скорость выравнивания. Программа BLASTN (для нуклеотидных последовательностей) использует в качестве параметров по умолчанию длину слова (W) 11, ожидаемое значение (Е) 10, М=5, N=-4 и сравнение обеих цепей. Для аминокислотных последовательностей программа BLASTP использует в качестве параметров по умолчанию длину слова 3 и ожидаемые значения (Е) 10 и оценочную матрицу BLOSUM62 (см. Henikoff& Henikoff (1989) Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 89:10915), фрагменты для выравнивания (В) 50, ожидаемое значение (Е) 10, М=5, N=-4 и сравнение обеих цепей.

Термин нуклеиновые "кислоты" относится к дезоксирибонуклеотидам или рибонуклеотидам и их полимерам в одно-или двуцепочечной форме, и к их наборам. Этот термин охватывает нуклеиновые кислоты, содержащие известные нуклеотидные аналоги или модифицированные остатки остова или связи, которые являются синтетическими, природными, и не встречающимися в природе, которые имеют аналогичные связывающие свойства, что и эталонная нуклеиновая кислота, и которые метаболизируются способом, сходным с эталонными нуклеотидами. Примеры таких аналогов включают, без ограничения фосфоротиоаты, фосфорамидаты, метилфосфонаты, хиральные-метилфосфонаты, 2-O-метилрибонуклеотиды, пептид-нуклеиновые кислоты (PNA).

Если не указано иное, последовательности нуклеиновых кислот помимо непосредственно приведенной последовательности также включают в себя консервативно модифицированные варианты (например, вырожденные замены кодонов) и комплементарные последовательности. В частности, вырожденные замены кодонов могут быть получены путем создания последовательности, в которых третье положение одного или нескольких (или всех) выбранных кодонов заменяется любым из канонических нуклеотидов или и/или дезоксинозиновыми остатками (Batzer et al. Nucleic Acids Res. 19:5081 (1991); Ohtsuka и др., J. Biol Chem 260:2605-2608 (1985);. Rossolini и др., Moll. Cell. Probes 8:91-98 (1994)). Термин "нуклеиновые кислоты" используется наравне с геном, ДНК РНК, олигонуклеотидом, и полинуклеотидом.

Последовательности нуклеиновых кислот также безусловно включает в себя "сплайс-варианты". Аналогично, белок, кодируемый нуклеиновой кислотой, безусловно, включает в себя любой белок, кодируемый сплайс-вариантом данной нуклеиновой кислоты. "Сплайс-варианты", как следует из названия, являются продуктами альтернативного сплайсинга гена. После транскрипции, исходный транскрипт нуклеиновой кислоты может быть спайсирован так, что различные (альтернативные) нуклеиновые кислоты - продукты сплайсинга будут кодировать различные полипептиды. Механизмы получения сплайс-вариантов различаются, но включают в себя альтернативный сплайсинг экзонов. Альтернативные полипептиды, полученные из одной и той же нуклеиновой кислоты сквозной транскрипцией, также охватываются этим определением. Любые продукты реакции сплайсинга, в том числе рекомбинантные формы продуктов сплайсинга, включены в данное определение. Например, сплайс варианты калиевого канала обсуждаются в Leicher et al., J. Biol. Chem. 273(52):35095-35101 (1998).

Термин "полипептид", "пептид" и "белок" используют в данном документе взаимозаменяемо для обозначения полимера аминокислотных остатков. Данные термины распространяются и на полимеры аминокислот, в которых один или несколько аминокислотных остатков являются искусственным химическим миметиком, соответствующим природным аминокислотам, а также встречающиеся в природе аминокислотные полимеры и не встречающиеся в природе аминокислотные полимеры.

Термин "аминокислота" относится к природным и синтетическим аминокислотам, а также аналогам аминокислот и миметикам аминокислот, которые функционируют способом, сходным с встречающимися в природе аминокислотами. Встречающиеся в природе аминокислоты это аминокислоты кодируемые генетическим кодом, а также аминокислоты, которые впоследствии были модифицированы, например, гидроксипролин, гамма-карбоксиглутамат, и O-фосфосерин. Аналоги аминокислот относится к соединениям, которые имеют ту же основную химическую структуру, что и природная аминокислота, т.е. α-углерод, который связан с водородом, карбоксильные группы, аминогруппы, и R-группу, например, гомосерин, норлейцин, метионинсульфоксид, метионинметилсульфоний. Такие аналоги содержат измененные R группы (например, норлейцин) или модифицированные пептидные остовы, но сохраняют такую же основную химическую структуру, что и природные аминокислоты. Миметики аминокислот относятся к химическим соединениям, которые имеют структуру, отличную от общей химической структуры аминокислот, но функционально похожи на природные аминокислоты.

Аминокислоты могут быть представлены в настоящем документе общеизвестными трехбуквенными или однобуквенными символами рекомендованными Комиссией Биохимической Номенклатуры IUPAC-IUB. Нуклеотиды представлены их общепринятыми однобуквенными обозначениями.

Термин "консервативно модифицированные варианты" относится как аминокислотным, так и к нуклеотидным последовательностям. Что касается конкретных последовательностей нуклеиновых кислот, консервативно модифицированные варианты относятся к тем нуклеиновым кислотам, которые кодируют идентичные или по существу идентичные аминокислотные последовательности, или в случае, когда нуклеиновая кислота не кодирует аминокислотную последовательность, то по существу идентичную последовательность. Из-за вырожденности генетического кода, большое число функционально идентичных нуклеиновых кислот кодируют один белок. Например, все кодоны GCA, GCC, GCG и GCU кодируют аминокислоту аланин. Таким образом, в каждом месте, где аланин задается кодоном, кодон может быть изменен на любой из описанных соответствующих кодонов без изменения кодируемого полипептида. Такие вариации нуклеиновых кислот являются "молчащими вариациями", которые являются одним из видов консервативно модифицированых вариантов. Каждая описанная в настоящем документе последовательность нуклеиновых кислот, которая кодирует полипептид, также включает все возможные "молчащие вариации" нуклеиновых кислот. Специалистам в данной области должны быть понятно, что каждый кодон в нуклеиновой кислоте (за исключением AUG, который обычно является только кодоном метионина, и TGG, который обычно является только кодоном триптофана) может быть модифицирован для получения функционально идентичных молекул. Соответственно, каждая "молчащая вариация" нуклеиновой кислоты, которая кодирует полипептид, включается в каждую описанную последовательность в отношении продукта экспрессии, но не в отношении последовательностей зондов.

Что касается аминокислотных последовательностей, специалистами в данной области должно быть понятно, что отдельные замены, делеции или вставки в нуклеиновую кислоту, пептид, полипептидную или белковую последовательность, которые изменяют, добавляют или удаляют одну аминокислоту или небольшой процент аминокислот в закодированной последовательности являются "консервативно-модифицированными вариантами", если изменение приводит к замене аминокислоты на химически подобную аминокислоту. Таблицы консервативных замен, в которых представлены функционально аналогичные аминокислоты, хорошо известны в данной области. Такие консервативно модифицированные варианты, дополнительно не исключают полиморфных вариантов, межвидовых гомологов, и аллелей по настоящему изобретению.

Каждая из следующих восьми групп содержит аминокислоты, которые являются консервативными заменами друг для друга: 1) аланин (А), глицин (G), 2) аспарагиновая кислоты (D), глутаминовая кислота (Е), 3) аспарагин (N), глютамин (Q), 4) аргинин (R), лизин (K), 5) изолейцин (I), лейцин (L), метионин (М), валин (V); 6) фенилаланин (F), тирозин (Y), триптофан (W); 7) серии (S), треонин (Т) и 8) цистеин (С), метионин (М) (см., например, Creighton, Proteins (1984)).

"Метка" или "обнаруживаемая часть" представляет собой соединение, обнаруживаемое спектроскопическими, фотохимическими, биохимическими, иммунохимическими, химическими или другими физическими средствами. Например, полезные метки включают в себя ³²Р, флуоресцентные красители, электронно-плотные реагенты, ферменты (например, используемые в ELISA), биотин, дигоксигенин, или гаптены и белки, которые могут быть обнаружены, например, путем введения радиоактивной метки в пептид или использоваться для обнаружения антител, специфически связывающихся с пептидом.

Термин "рекомбинантный", при использовании по отношению, например, к клетке, или нуклеиновой кислоте, белку, или вектору, указывает, что клетка, нуклеиновая кислота, белок, или вектор были изменены путем введения гетерологичной нуклеиновой кислоты или белка или путем изменения нативной нуклеиновой кислоты или белка. Также данный термин применим к клетке, которая была получена от модифицированной указанным способом клетки. Так, например, рекомбинантные клетки экспрессируют гены, которых нет в нативных (нерекомбинантных) формах клеток или экспрессируют нативные гены, которые в противном случае экспрессируют аномально, недостаточно или не экспрессируют вообще.

Термин "гетерологичный" при использовании по отношению к участку нуклеиновой кислоты указывает, что нуклеиновая кислота содержит две или более подпоследовательности, которые не встречаются в таком же соотношении друг с другом в природе. Например, такие нуклеиновые кислоты, как правило, получают рекомбинацией и они, как правило, содержат две или более последовательности от неродственных генов соединенные, так, чтобы образовывать новую функциональную нуклеиновую кислоту, например, промотор из одного источника и кодирующую область из другого источника. Также, «гетерологичный белок» указывает на то, что данный белок состоит из двух или более последовательностей, которые не находятся в таком же соотношении друг с другом в природе (например, гибридный белок).

Термин "антитело" относится к полипептиду, который содержит область каркаса, кодируемую генами иммуноглобулинов, или к его фрагменту, который специфически связывает и распознает антиген. Распознанные гены иммуноглобулинов включают гены константной области каппа, лямбда, альфа, гамма, дельта, эпсилон и мю, а также множество генов иммуноглобулинов вариабельной области. Легкие цепи классифицируются как каппа или лямбда. Тяжелые цепи классифицируются как гамма, мю, альфа, дельта, или эпсилон, которые, в свою очередь, определяют класс иммуноглобулина IgG, IgM, IgA, IgD и IgE, соответственно. Как правило, антигенсвязывающий участок антитела, будет наиболее важным для специфичности и аффинности связывания.

Антитело связывается с эпитопом антигена. Эпитоп является сайтом антигена специфическим связывающим антитело, и может включать в себя несколько аминокислот или несколько областей, состоящих из нескольких аминокислот, например, 5 или 6, или более, например, 20 или более аминокислот, или участки этих аминокислот. В некоторых случаях, эпитоп включает в себя небелковые компоненты, например, углеводы, нуклеиновые кислоты или липиды. В некоторых случаях, эпитоп представляет собой трехмерный фрагмент. Так, например, где мишенью является белок, эпитоп может содержать последовательно соединенные аминокислоты, или аминокислоты из разных частей белка, перенесенных в непосредственную близость вследствие фолдинга белка (например, эпитоп прерывистого типа). То же самое верно и для других типов молекул-мишеней, которые образуют трехмерные структуры.

Структурная единица примерного иммуноглобулинов (антитела) включает в себя тетрамер. Каждый тетрамер состоит из двух идентичных пар полипептидных цепей, каждая пара имеет одну "легкую" (около 25 кДа) и одну "тяжелую" цепь (около 50-70 кДа). N-конец каждой цепи определяет вариабельную область примерно из 100-110 или более аминокислот, в первую очередь ответственных за распознавание антигена. Термины вариабельная легкая цепь (V_L) и вариабельная тяжелая цепь (V_H) относятся к данным легким и тяжелым цепям соответственно.

Антитела существуют, например, в виде интактных иммуноглобулинов или в виде ряда широко известных фрагментов, полученных путем гидролиза различными пептидазами. Так, например, пепсин расщепляет антитела ниже дисульфидных связей в шарнирной области для получения F(ab)'₂ - димера Fab, который сам по себе является легкой цепью, соединенной с V_H-C_H1 дисульфидной связью. F(ab)'₂ может быть восстановлен в мягких условиях с разрывом дисульфидных связей в шарнирной области, тем самым димер F(ab)'₂ превращается в мономер Fab'. Мономер Fab' это по существу Fab с частью шарнирной области (см. Fundamental Immunology (Paul изд., 3-е изд., 1993). Хотя различные фрагменты антитела определяют в терминах расщепления интактного антитела, специалистам в данной области должно быть понятно, что такие фрагменты могут быть синтезированы de novo либо химически, либо с помощью методов рекомбинантной ДНК. Таким образом, термин "антитело", как он используется в данном документе, также включает в себя фрагменты антител, полученные либо путем модификации целых антител, или синтезированные de novo с использованием методологии рекомбинантных ДНК (например, единая цепь Fv), или те, которые были получены с использованием библиотек фагового дисплея (см., например, McCafferty и др., Nature 348:552-554 (1990)).

Для приготовления подходящих антител по настоящему изобретению, например, рекомбинантных, моноклональных, или поликлональных антител, и для их применения в соответствии с настоящим изобретением, в данной области может быть использовано много известных способов (см., например, Coler Milstein, Nature 256:495-497 (1975); Kozbor и др., Immunology Today 4: 72 (1983); Cole и др., стр.77 - 96, Monoclonal antibodies in cancer therapy Alan P. Liss, Inc (1985); Coligan, Current Protocols in immunology (1991); Harlow & Lane, (1988), Antibodies, A Laboratory Manual, а также Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice (2d ed. 1986)). Гены, кодирующие тяжелые и легкие цепи представляющего интерес антитела могут быть клонированы из клеток, например, гены, кодирующие моноклональные антитела, могут быть клонированы из гибридомы и используются для производства рекомбинантных моноклональных антител. Генетические библиотеки, кодирующие тяжелые и легкие цепи моноклональных антител, также могут быть получены из гибридомы или из плазматических клеток. Случайное сочетание тяжелой и легкой цепи генных продуктов генерирует большой пул антител с различной антигенной специфичностью (см., например, Kuby, Immunology (3-е изд. 1997)). Способы для производства антител одной цепи или рекомбинантных антител (патент США 4946778, патент США №4816567) могут быть адаптированы для производства антител к полипептидам по настоящему изобретению. Кроме того, трансгенные мыши или другие организмы, такие как прочие млекопитающие, могут быть использованы для экспрессии гуманизированных или человеческих антител (см., например. Патенты США №5545807, 5545806, 5569825, 5625, 126, 5633425, 5661, 016, Marks и др., Bio/Technology 10:779-783 (1992); Lonberg и др., Nature 368:856-859 (1994), Morrison, природа 368:812-13 (1994); Fishwild и др., Nature Biotechnology 14:845-51 (1996); Neuberger, Nature Biotechnology 14:826 (1996) и Lonberg и Huszar, Inter. Rev. Immunol. 13:65-93 (1995)). Кроме того, технология фагового дисплея может быть использована для выявления антител и гетеромерных фрагментов Fab, которые специфически связываются с выбранным антигеном (см., например, McCafferty и др., Nature 348:552-554 (1990); Marks и др., Bio/Technology 10:779-783 (1992)). Антитела также могут быть сделаны биспецифическими, т.е. способными распознавать два различных антигена (см., например, WO 93/08829, Traunecker и др., EMBO J. 10:3655-3659 (1991) и Suresh и др., Methods in Enzimology 121: 210 (1986)). Антитела могут быть также гетероконъюгатами, например, двумя ковалентно связанными антителами или иммунотоксинами (см., например, патент США №4676980, WO 91/00360, WO 92/200373 и ЕР 03089).

Методы гуманизации или приматизации не человеческих антител хорошо известны в данной области. Как правило, гуманизированное антитело имеет один или несколько аминокислотных остатков, введенных в него из источника, который не является человеком. Эти «не являющиеся человеческими» аминокислотные остатки часто упоминаются как импортные остатки, которые обычно берутся из импортированного вариабельного домена. Гуманизация может главным образом выполняться в соответствии со способом Winter and co-workers (см., например, Jones и др., Nature 321:522-525 (1986); Riechmann и др., Nature 332:323-327 (1988); Verhoeyen и др., Science 239: … 1534-1536 (1988) и Presta, Curr Op Struct Biol 2:593-596 (1992)), путем замены CDR грызунов или CDR последовательностей на соответствующие последовательности человеческого антитела. Соответственно, такие гуманизированные антитела представляют собой химерные антитела (патент США №4816567), в