Способ получения иммуноферментной тест-системы для определения эпитопов оболочечного белка вируса пуумала протективной направленности в вакцинных препаратах против геморрагической лихорадки с почечным синдромом

Способ получения иммуноферментной тест-системы для определения эпитопов оболочечного белка вируса пуумала протективной направленности в вакцинных препаратах против геморрагической лихорадки с почечным синдромом

Реферат

Изобретение относится к области биотехнологии, в частности к получению вакцины для профилактики геморрагической лихорадки с почечным синдромом (ГЛПС), а именно, к способу получения тест-систем, предназначенных для контроля содержания в вакцинном препарате специфических вирусных белков - индукторов иммунного ответа против хантавирусов - возбудителей ГЛПС.

Геморрагическая лихорадка с почечным синдромом - острое, вирусное заболевание зоонозной природы, характеризующееся системным поражением мелких кровеносных сосудов, геморрагическим диатезом и своеобразным поражением почек, высоким уровнем заболеваемости, тяжёлым течением (нередко с летальным исходом) и стойкой потерей трудоспособности. Отсутствие специфических средств лечения и профилактики обусловливают высокую социальную и медицинскую значимость ГЛПС как в России, так и во многих странах мира. Случаи заболевания ГЛПС выявлены в 57 административных регионах Российской Федерации и составляют ежегодно 8-10 тысяч больных, при этом 98% заболеваемости регистрируется в Европейской части России, из которых 98% случаев ассоциированы с вирусом Пуумала.

Наиболее эффективным методом борьбы с ГЛПС является вакцинопрофилактика, что было продемонстрировано в Китае и Южной Корее. В настоящее время коммерческие вакцины против ГЛПС производятся только в Китае, однако ни одна из этих вакцин не может применяться в европейских регионах России, так как не обеспечивает защиты от вируса Пуумала - возбудителя ГЛПС в этих регионах.

Для изготовления и контроля вакцины против вируса Пуумала необходимо решить проблему разработки эффективных методов контроля содержания специфических антигенов - индукторов иммунного ответа в вакцинных препаратах, в том числе на технологических этапах их производства. Одним из способов иммунохимического определения вирусных белков - антигенов является метод иммуноферментного анализа.

В настоящее время ФГУП ПИПВЭ им. М.П.Чумакова выпускает иммуноферментную тест-систему "Хантагност", с помощью которой можно выявлять антитела к различным эпитопам нуклеокапсидного белка. Однако наибольшую значимость при конструировании вакцинного препарата имеют протективные белки, в данном случае поверхностный белок G_N:G_C, определенные эпитопы которого индуцируют выработку вирус-нейтрализующих антител.

Целью предлагаемого изобретения является конструирование иммуноферментной тест-системы для определения оболочечного белка вируса Пуумала, являющихся индуктором гуморального иммунного ответа, ассоциированного с вирус-нейтрализующими свойствами антител.

В качестве основы такого метода были приготовлены мышиные моноклональные антитела, обладающие нейтрализующей активностью против вируса Пуумала.

Принцип действия предлагаемого изобретения основан на специфическом иммунохимическом взаимодействии моноклональных антител, обладающих нейтрализующей активностью, с соответствующими эпитопами оболочечного белка вируса Пуумала, полипротеина G_N:G_C. Визуализация антигена, связавшегося с моноклональными антителами, осуществляется с помощью меченных пероксидазой хрена высоко авидных IgG к вирусу Пуумала, выделенных из сыворотки крови реконвалесцента ГЛПС.

Коротко, процесс конструирования иммуноферментной тест-системы «ХАНТА-ПУУ» включает: получение очищенных моноклональных антител (мАТ) к хантавирусу Пуумала, отбор клонов антител, обладающих вирус-нейтрализующей активностью, наработка и очистка нейтрализующих мАТ, выделение IgG из сыворотки крови реконвалесцентов ГЛПС с высокими титрами специфических антител к вирусу ПУУ и приготовление конъюгата, с пероксидазой хрена (далее пероксидазный конъюгат); комплектация набора тест-системы.

Более подробно получение тест-системы осуществляют следующим образом.

I. Получение моноклональных антител. Мышей линии BALB/c иммунизируют очищенным препаратом инактивированного вируса Пуумала (штамм К-27/Уфа-85) в дозе 100 мкг/мышь, иммунизацию проводят в подушечки задних лап дважды с двухнедельным интервалом. Клетки подколенных лимфоузлов иммунных мышей гибридизуют с клетками мышиной миеломы линии SP2/0 по стандартной методике, используя полиэтиленгликоль 4000. Гибридомные клетки, продуцирующие специфические антитела, подвергают 2-4-кратному клонированию методом предельных разведений. Клоны гибридомы с устойчивой продукцией антител нарабатывают в культуре в среде DMEM (HyClone) с добавлением 5% фетальной телячьей сыворотки. Для наработки антител гибридомные клетки вводят в перитонеальную полость мышей, через 7-14 дней регистрируют развитие асцитных опухолей.

Асцитные жидкости проверяют на содержание специфических антител методом иммуноферментного анализа. Для этого образцы, содержащие очищенные антигены хантавирусов в концентрации 100 нг/мл в фосфатносолевом буфере (ФСБ), вносят в лунки иммунопанели (Costar, 3018), с последующей инкубацией при 6±2°C - 18 часов. Далее в лунки вносят 3% бычий сывороточный альбумин (БСА) (Sigma, 8159) и панели оставляют в течение 1 ч при комнатной температуре (22±3°C). После отмывания панели (здесь и далее: 5 раз по 5 мин раствором 0,01 М ФСБ + 0,05% Tween-20) в лунки вносят культуральную жидкость гибридомы. После 1 ч контакта при 37°C лунки отмывают и вносят меченные пероксидазой хрена IgG против иммуноглобулинов мыши (Sigma, A4416). В качестве индикаторной системы используют субстрат-индикаторную смесь (ТМБ, Sigma, Т8665). Антитела (IgG) выделяют из асцитных жидкостей аффинной хроматографией на колонке с HiTeap ProteinG (GE Healthcare, 17-0405-03). Очищенные моноклональные антитела стандартизуют по белку (до 1 мг/мл) и далее определяют их специфическую активность методом нейтрализации.

II. Отбор клонов, вырабатывающих нейтрализующие вирус антитела, проводят методом реакции нейтрализации (РН). Образцы моноклональных антител, а также контрольных сывороток в 2-кратных разведениях смешивают в равных объемах с культуральной жидкостью, содержащей 50-100 ФОЕ вирусов Пуумала, Добрава, Хантаан и Сеул. После инкубирования при 6±2°C в течение 18-20 часов вирус-сывороточные смеси по 0,2 мл вносят на монослой клеток VERO-E6, выращенных в 24 луночных панелях (Costar, 3524), и оставляют на контакт при 37°С в течение 1 часа, после чего инокулят удаляют и вносят метилцеллюлозное покрытие. Выживший вирус определяют по методу индикации ФОЕ. Титр вирус-нейтрализующих антител в образце определяют как величину, обратную его разведению, подавляющему 80% ФОЕ. В результате проведенных исследований отобран клон ПУУ/G10, который характеризуется способностью нейтрализовать 50-80 ФОЕ вируса Пуумала в концентрации ≥1 мкг/мл при отсутствии нейтрализующей активности по отношению к другим хантавирусам в концентрации 1000 мкг/мл.

Таблица 1
Нейтрализующая активность мАТ, полученных к вирусу Пуумала
мАТ	Субизо-тип	МФА с антигенами	РН
ПУУ	ХАН	СЕУЛ	ДОБ	Vero-E6	ПУУ	ХАН	СЕУЛ	ДОБ
PUU/G10	IgG2a	2048*	<64	<64	<64	<64	1280	<20	<20	<20
PUU/D21	IgG1	4096	1024	4096	4096	<64	<20	<20	<20	<20
PUU/H6	IgG1	4096	4096	4096	4096	<64	<20	<20	<20	<20
Контрольные поликлональные сыворотки
ПУУ №421	8192	256	512	512	<64	2560	<20	<20	<20
ХТН №6851	512	4096	2048	4096	<64	<20	1280	40	<20
СЕУЛ №11	256	512	1024	512	<64	<20	40	640	<20
ДОБ №68	256	2048	1024	4096	<64	<20	80	40	2560
Примечание: * - титры антител, выраженные в величинах, обратных разведению образца

III. Конъюгирование иммуноглобулинов из сыворотки крови реконвалесцента ГЛПС-ПУУ с пероксидазой хрена.

Растворяют 5 мг пероксидазы хрена с RZ 3,0 в 1 мл 0,3М бикарбонатного раствора и после полного растворения пероксидазы добавляют 0,025 мл 0,32% раствора формальдегида (1:100). Осторожно перемешивают на магнитной мешалке в течение 30 минут при температуре от 15 до 25°C, затем к смеси добавляют 1 мл 0,04 М раствора периодата натрия. По истечении 30 минут перемешивания цвет смеси (коричневый) приобретает зеленоватый оттенок. Добавляют 1 мл 0,16 М раствора этиленгликоля, перемешивают в течение 1 часа. Смесь диализуют против 1 л 0,01 М карбонатно-бикарбонатного буферного раствора (КББ) в течение 16-20 час при температуре (6±2)°C. Параллельно проводят диализ 1,5 мл IgG ПУУ в концентрации 10 мг/мл в тех же условиях. После диализа активированную пероксидазу переносят во флакон, добавляют 1 мл IgG ПУУ, диализованных против КББ, смесь осторожно перемешивают при температуре 18-25°C в течение 2 час. Добавляют 5 мг NaBH4 и оставляют на 2 часа при температуре (6±2)°C. Полученный конъюгат диализуют против 1 л 0,01М ФСБ в течение 16-20 час при температуре 18-25 °С. После диализа конъюгат извлекают из мешка и наносят на колонку (1,6×90 см) с сефадексом G-100, уравновешенную 1М ФСБ. Элюируют тем же буфером (скорость элюции свободная) при температуре (6±2)°C, собирая фракции по 3 мл. Окрашенные фракции фотометрируют при 280 нм и 403 нм. Определяют отношение оптической плотности (ОП) каждой фракции при 403 нм к 280 нм (показатель RZ - ОП 403/ОП280) и отбирают 1-2 пиковые фракции с RZ 0,45-0,6 (оптимум - 0,5). Конъюгат разводят 1:10 в 1%-ном растворе бычьего сывороточного альбумина на 0,1 М ФСБ. Для хранения в жидком виде разводят 1:2 в глицерине и разливают в инсулиновые флаконы.

Иммуноферментная тест-система «ХАНТА-ПУУ», сконструированная по предлагаемому способу, обладает следующими достоинствами:

1) видовой специфичностью, проявляющейся в том, что тест-система «ХАНТА-ПУУ» выявляет исключительно вирус Пуумала;

2) антигенной специфичностью, проявляющейся в том, что тест-система «ХАНТА-ПУУ» выявляет исключительно эпитопы белка, обладающего протективной активностью, в частности, способностью активизировать гуморальное звено иммунитета, индуцируя выработку нейтрализующих антител;

3) с одинаковой чувствительностью выявляются антигены как живого, так и инактивированного формалином вируса.

Принципиальное отличие предлагаемой тест-системы «ХАНТА-ПУУ» от иммуноферментной тест-системы "Хантагност", выпускаемой ФГУП ПИПВЭ им. М.П.Чумакова согласно ТУ 9388-016-01895045-2010, является способность выявлять исключительно эпитопы поверхностного белка вируса Пуумала, являющиеся индуктором нейтрализующих антител. Определяющим технологическим решением поставленной задачи является получение специфических вирус-нейтрализующих мАТ. Дополнительным контролем специфичности выявления антигенов вируса Пуумала, является использование в качестве вторичных (выявляющих) антител к этому вирусу иммуноглобулинов из сывороток крови реконвалесцентов ГЛПС-ПУУ. Тест-система «ХАНТА-ПУУ» позволяет с одинаковой чувствительностью выявлять антигены как живого, так и инактивированного формалином вируса, что важно с точки зрения оценки специфической активности инактивированных вакцинных препаратов на технологических этапах их производства.

Пример 1.

Для определения протективного белка вируса Пуумала в образцах вакцинного полуфабриката (концентрат вируссодержащей культуральной жидкости, очищенный концентрат, инактивированный формалином концентрат) применяют тест-систему «ХАНТА-ПУУ». В лунки иммунопанели вносят мАТ ПУУ/G10 в концентрации 1 мкг/мл в КББ. После контакта в течение 12-18 часов при температуре (6±2)°C в лунки вносят 3% БСА и панели оставляют в течение 1 ч при комнатной температуре. Во вспомогательной панели готовят двукратные разведения исследуемых образцов на ФСБ. После отмывания панели (как описано выше) в лунки вносят исследуемые образцы. После 2-х часового контакта при 37°C лунки отмывают, вносят пероксидазный конъюгат и инкубируют панели 1 ч при 37°C. После отмывки в лунки панели вносится ТМБ (Sigma, T8665) и через 20 мин проводят учет опыта, определяя оптическую плотность в лунках панели с помощью спектрофотометра при длине волны 450. За титр антигена принимают конечное разведение образца, для которого отношение оптической плотности в лунке со специфическим иммуноглобулином превышает показатель оптической плотности с нормальным иммуноглобулином в 2,1.

Таблица 2
Определение поверхностного (GN:GC) антигена вируса Пуумала с помощью иммуноферментной тест-системы ХАНТА-ПУУ
Вирус	Общий белок по Лоури в мкг/мл	Титр вируса в lg ФОЕ/мл	Титр антигена
до добавления формалина	инактивированный формалином
ПУУ-К*	10800	7,2	8192	8192
ПУУ F-1**	45	5,6	1024	1024
ПУУ F-2	63	6,2	4096	4096
ПУУ F-3	94	5,4	1024	1024
ПУУ F-4	111	3,8	128	128
ДОБ F-2	89	6,8	<64	<64
XTH F-2	92	7,2	<64	<64
СЕУЛ F-2	69	6,1	<64	<64
Vero F-2	120	0	<64	<64
Примечание. * - неочищенный концентрат вируссодержащей культуральной жидкости;
** - очищенные гельфильтрацией фракции концентратов культуральной жидкости

С целью определения чувствительности метода приводятся данные по содержанию живого вируса в образцах. Для контроля специфичности тест-системы «ХАНТА-ПУУ» использован концентрат культуральной жидкости клеток VeroE6, являющихся субстратом для размножения вируса, а также пиковые по целевому белку фракции очищенных концентратов вирусов ДОБ, СЕУ, ХТН. Результаты, приведенные в таблице 1, свидетельствуют:

1) иммуноферментная тест-система «ХАНТА-ПУУ» выявляет исключительно антигены вируса Пуумала в титрах, пропорциональных титру вируса, и не выявляет антигены вирусов Добрава, Хантаан и Сеул;

2) инактивирование вируса формалином (0,25%) не влияет на чувствительность и специфичность определения антигенов оболочечного белка G_N:G_C вируса Пуумала.

Ближайший аналог

Антигены хантавирусов	RU 200010888 5 МПК G01N 33/53 1, A61K 39/12	Научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии СО РАМН, авторы Кушнарева Т.В., Слонова Р.А., Компанец Г.Г., Заявка: 2000108885/13, 10.04.2000,дата публикации: 27.01.2002	СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ДИАГНОСТИКУ МА ХАНТАВИРУСОВ
Антигены хантавирусов	RU 2180754, МПК G01N 33/53 1, A61K 39/12	Заявитель Научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии СО РАМН, авторы: Кушнарева Т.В., Слонова Р.А., Компанец Г.Г., Заявка: Патентообладатель: Научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии СО РАМН, заявка: 2000108885/13, 10.04.2000, Опубликовано: 20.03.2002	СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ДИАГНОСТИКУ МА ХАНТАВИРУСОВ	Дата начала отсчетасрока действия патента: 10.04.2000
Антигены хантавирусов	RU 99103436, МПК G01N 33/56 9	Заявитель Башкирский государственный медицинский университет, НПО "Башбиомед", авторы: Батыршин Р.А., Плечев В.В., Тимербулатов В.М. заявка: 99103436/14, 01.03.1999, дата публикации заявки: 20.02.2001	СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ ГЕМОРРАГИЧЕСКОЙ ЛИХОРАДКИ С ПОЧЕЧНЫМ СИНДРОМОМ
Антигены хантавирусов	RU 2159439, МПК G01N 33/569	Заявитель Башкирский государственный медицинский университет, НПО "Башбиомед", авторы: Батыршин Р.А., Плечев В.В., Тимербулатов В.М. заявка:99103436/14, 01.03.1999 Опубликовано: 20.11.2000	СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ ГЕМОРРАГИЧЕСКОЙ ЛИХОРАДКИ С ПОЧЕЧНЫМ СИНДРОМОМ	Дата начала отсчета срока действия патента: 01.03.1999
Предмет поиска	Наименование источника информации	Автор, фирма (держатель) технической документации	Год, место и орган издания (утверждения, депонирования источника)
1	2	3	4
Антигены хантавирусов	ГПФ	Научно-исследовательский институт эпидемиологии	Дата публикации: 27.01.2002

		и микробиологии СО РАМН, авторы Кушнарева Т.В., Слонова Р.А., Компанец Г.Г.
Антигены хантавирусов	ГПФ	Научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии СО РАМН, авторы Кушнарева Т.В., Слонова Р.А., Компанец Г.Г.	Дата начала отсчета срока действия патента: 10.04.2000
Антигены хантавирусов	ГПФ	Башкирский государственный медицинский университет, НПО "Башбиомед", авторы: Батыршин Р.А., Плечев В.В., Тимербулатов В.М.	Дата публикации заявки: 20.02.2001
Антигены хантавирусов	ГПФ	Башкирский государственный медицинский университет, НПО "Башбиомед", авторы: Батыршин Р.А., Плечев В.В., Тимербулатов В.М.	Дата начала отсчета срока действия патента: 01.03.1999
Антигены хантавирусов	ГПФ	University of Connecticut Health Center, Srivastava P.K.	Дата начала отсчета срока действия патента: 01.03.1999

Способ получения иммуноферментной тест-системы для определения эпитопов оболочечного белка вируса Пуумала протективной направленности в вакцинных препаратах против геморрагической лихорадки с почечным синдромом (ГЛПС), включающий получение мышиных моноклональных антител, обладающих нейтрализующей активностью по отношению к вирусу Пуумала, сорбцию их на поверхность иммунопанели, выделение IgG из сывороток крови реконвалесцентов ГЛПС с высокими титрами специфических антител к вирусу Пуумала и приготовление конъюгата специфических IgG с пероксидазой хрена.