Постоянные линии клеток человека для получения вирусов гриппа

Постоянные линии клеток человека для получения вирусов гриппа

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Заявленное изобретение относится к способу получения вакцины на основе вируса гриппа с использованием постоянных клеток-амниоцитов человека, а также к применению постоянной клетки-амниоцита человека для получения вакцины на основе вируса гриппа.

Вакцинация в здравоохранении является самой важной мерой предотвращения заболевания, вызываемого ежегодной эпидемией гриппа. Успешное применение вакцин зависит от быстрейшего производства достаточно больших объемов вакцин, например, инактивированных вирусов, из стабильных и простых в применении исходных материалов. Ускоренная разработка вакцин и их адекватная доступность крайне важны в эффективной борьбе со многими болезными человека и животных. Как результат задержек в производстве вакцин и количественных потерь, могут возникать проблемы с контролем над вспышками заболеваний. Данное обстоятельство послужило в последнее время причиной целенаправленности исследований на культивирование вирусов в клеточных культурах для использования в качестве вакцин.

В настоящее время, доступные вакцины против гриппа производят из эмбрионов куриных яиц. Данные куриные яйца должны пройти контроль на отсутствие определенных вирусных и бактериальных загрязнений. Эти так называемые «свободные от специфической патогенной флоры» (SPF) куриные яйца доступны в коммерческих объемах. Даже несмотря на то, что куриные яйца весьма успешно применяют для размножения вирусов животных и человека, они обладают рядом недостатков в производстве вакцин. Например, в случае пандемии, резко увеличивается спрос на куриные яйца производстве вакцин, учитывая то, что для получения одной дозы обычной вакцины требуется одно яйцо. Исходя из того, что объем куриных яиц ограничен, требуется примерно год для накопления необходимого количества куриных яиц. Помимо этого, существуют подтипы гриппа, крайне патогенные для куриц, которые могут послужить причиной недостатка куриных яиц в случае пандемии. Дополнительно, сам процесс производства высоко затратный и долговременный. Еще одним недостатком производства вакцин в куриных яйцах является невозможность полного исключения куриного белка из вакцин, и, соответственно, проявления аллергической реакции у некоторых пациентов. И, наконец, возможная селекция субпопуляции, отличающейся от встречающегося в природе вируса, требует применения систем альтернативных клеток-хозяев.

В отличие от куриных яиц, клетки для производства вакцин против гриппа на основе клеточных культур всегда доступны. Они хранятся в глубокой заморозке и могут быть быстро разморожены и репродуцированы в требуемых объемах в любой момент времени при необходимости. Таким образом, производство вакцин можно запустить в любой требуемый момент времени. В случае резко возросшего спроса, или более частой циркуляции новых непрогнозируемых штаммов вирусов, необходимую вакцину могут изготовить в кратчайшее время.

Процесс производства с использованием клеточной культуры позволяет осуществлять получение вирусов в форме вакцин в закрытой, стандартизированной системе при определенных, контролируемых параметрах. Благодаря контролируемости процесса производства, окончательная вакцина против гриппа не требует добавления антибиотиков. Поскольку получение вакцин против гриппа на основе клеточных культур полностью независимо от наличия куриных яиц, вакцина не содержит яичного белка и, таким образом, не вызывает аллергических реакций у пациентов с непереносимостью белка куриных яиц.

В настоящее время, для производства вакцин против гриппа используют преимущественно три линии клеток, а именно, клетки PER.C6 человека, клетки почек собак производства Madin Darby Canine Kidney (MDCK), и клетки почек мартышек (Vero). Дополнительно, в настоящее время в разработке находятся линии клеток сетчатки уток (AGE1.CR) и линии птичьих эмбриональных стволовых клеток. Производство вакцин в клетках млекопитающих является альтернативой производству вакцин на основе куриных яиц, однако данные клетки требуют наличия сыворотки и/или прикрепления для надежной поддержки их роста. Данное обстоятельство затрудняет и повышает стоимость производства вакцин в данных клетках, поскольку, из соображений мер предосторожности, сыворотку необходимо полностью отделить, а рост на твердых прикреплениях ограничен, что приводит к более низкой производительности.

Преимуществом производства вакцин в клетках млекопитающих является тот факт, что изоляцию и репликацию вируса в клеточной культуре не генерируют какой-либо пассажир-зависимой селекции фенотипа, отличающегося от клинического дикого типа. Таким образом, вирусный гликопротеин гемагглютинин, посредством которого осуществляют инфицирование прикрепления к клетке и интеграцию вируса в клетку, экспрессируют аналогично природной форме, и он обладает улучшенной специфичностью и авидностью, соответственно, способствует появлению клеточно-опосредованного иммунитета у людей.

Таким образом, целью заявленного изобретения является предоставление постоянных линий клеток человека с улучшенными характеристиками для производства вакцин на основе вирусов гриппа.

Цель достигается практическим воплощением сути заявленного изобретения, определенной в формуле изобретения.

Фиг. иллюстрируют заявленное изобретение.

Фиг.1А-Ж схематически представляют динамику изменения различных параметров во время культивирования постоянной линии клеток-амниоцитов CAP 1D5 в 293SFMII среде (●), постоянной линии клеток-амниоцитов CAP 1D5 в PEM среде (▲) и постоянной линии клеток почек собак MDCK.SUS2 (Madin Darby Canine Kidney) в SMIF8 среде (♦) во встряхиваемых колбах емкостью 100 мл. Фиг.1А графически представляет динамику изменения концентрации жизнеспособных клеток трех линий клеток, в сравнении; фиг.1Б представляет динамику изменения концентрации мертвых клеток линий клеток; а фиг.1В представляет динамику колебания уровня выживаемости линий клеток. Фиг.1Г-Ж схематически представляют динамику изменения значения pH (Г), концентрации (Д) глюкозы (светлые значки) и лактозы (темные значки), темные значки (Е) глутамина (Gln) (светлые значки) и аммония (темные значки), и концентрации (Ж) глутаминовой кислоты (Glu) (светлые значки) и пирувата (темные значки).

Фиг.2 представляет гистограмму, изображающую замеры титров вирусов как значение TCID₅₀ в 4 проходах штаммов гриппа A/PR78/34 (H1N1) и A/Uruguay/716/2007 (H3N2) в CAP-1D5 клетках 293SFMII и PEM среды. Сокращения: A/PR 293: штамм гриппа A/PR/8/34 (H1N1) в CAP-1D5 клетках в 293SFMII среде, A/PR PEM: штамм гриппа A/PR/8/34 (H1N1) в CAP-1D5 клетках в PEM среде; A/Urug 293: A/Uruguay/716/2007 штамм гриппа (H3N2) в CAP-1D5 клетках в 293SFMII среде; A/Urug PEM: штамм гриппа A/Uruguay/716/2007 (H3N2) в CAP-1D5 клетках в PEM среде; значение TCID₅₀ - вирусный титр в числе вирусов/мл, которое требуется для инфицирования 50% клеток-хозяев.

Фиг.3А-Е схематически представляют динамику изменения количества вирусных частиц, обозначенных как log HA (гемагглютинин) единицы/100 мкл и концентрации жизнеспособных клеток в культуре постоянных клеток-амниоцитов CAP-1D5 в 293SFMII-(A, Б) и в PEM среде (В, Г), постоянных клеток почек собак MDCK.SUS2 в SMIF8 среде (Д, Е) после инфицирования клеток штаммом вируса гриппа A/PR/8/34 при использовании различных объемов вируса, обозначенных как величины MOI (множественность заражения): MOI: 0.0025 (Δ) MOI: 0.025 (□), MOI: 0.25 (○). MOI (множественность заражения) представляет соотношение числа инфицированных частиц к клеткам-мишеням.

Фиг.4А-Г схематически представляют динамику изменения различных параметров культивирования постоянной линии клеток-амниоцитов CAP-1D5 в PEM среде в биореакторе объемом 1 л, в котором инфекция происходит после 114 ч с различным объемом вируса, обозначенным как MOI от 0,025 с вирусом гриппа A/PR/8/34 (адаптированный). Фиг.4А схематически представляет динамику изменения концентрации жизнеспособных клеток (▲), концентрации мертвых клеток (Δ) и уровня выживаемости клеток (). Фиг.4Б схематически представляют количество вирусных частиц, обозначенное как log HA (гемагглютинин) единиц/100 мкл (▲), концентрации глутамата (Δ) и пирувата () в среде. Фиг.4 В схематически представляет динамику изменения значения pH (Δ), а фиг.4Г представляет динамику изменения инфекционности (в TCID₅₀/мл). Значение TCID₅₀ показывает титр вируса как число вирусов/мл повторно, которое требуется для инфицирования 50% клеток-хозяев.

Фиг.5А и Б показывают гистограммы, представляющие титры вирусов, измеренные как log HA единиц/100 мкл (А) или значение TCID₅₀ (Б) вдоль 4 проходов штаммов гриппа A/Brisbane/59/2007, B/Florida/4/2006, свиного гриппа (A/Swine (H1N2) Bakum/1832/00) и лошадиного гриппа (A/Equine, A/Newmarket/1/93 (H3N8)) на клетках CAP-1D5 в 293SFMII и PEM среде. Сокращения: A/Bris 293: штамм гриппа A/Brisbane/59/2007 на CAP-1D5 клетках в 293SFMII среде; A/Bris PEM: штамм гриппа A/Brisbane/59/2007 на CAP-1D5 клетках в PEM среде; B/Flor 293: штамм гриппа B/Florida/4/2006 на CAP-1D5 клетках в 293SFMII среде; B/Flor PEM: штамм гриппа B/Florida/4/2006 на CAP-1D5 клетках в PEM среде; Schw 293: штамм гриппа A/Swine (H1N2) Bakum/1832/00 на CAP-1D5 клетках в 293SFMII среде; Schw PEM: штамм гриппа A/Swine (H1N2) Bakum/1832 00 на CAP-1D5 клетках в PEM среде; horse 293: штамм гриппа A/Equine, A/Newmarket/1/93 (H3N8) на CAP-1D5 клетках в 293SFMII среде; horse PEM: штамм гриппа A/Equine, A/Newmarket/1/93 (H3N8) на CAP-1D5 клетках в PEM среде; значение TCID₅₀ показывает титр вируса как число вирусов/мл, которое требуется для инфицирования 50% клеток-хозяев.

Фиг.6А и Б схематически представляют динамику изменения концентрации жизнеспособных клеток и значения pH в культивировании постоянной линий клеток-амниоцитов CAP-1D5 в 100 мл PEM среды во встряхиваемых колбах, причем первоначальная концентрация клеток составляет 5×10⁵ клеток/мл, а среда дополнительно содержит 4 мМ пирувата (♦), или первоначальная концентрация клеток составляет 8×10⁵ клеток/мл, а среда дополнительно содержит 4 мМ пирувата (▲), или первоначальная концентрация клеток составляет 8×10⁵ клеток/мл, а среда дополнительно содержит 10 мМ пирувата плюс дополнительные аминокислоты (●).

Фиг 7А-В схематически представляют динамику изменения титров вирусов, измеренных в log HA единиц/100 мкл культуры, причем CAP-1D5 клетки инфицировали адаптированным штаммом гриппа A/PR/8/34. До инфицирования, не проводили никакой смены среды (А), либо осуществили разбавление 1:2 с PEM средой (Б), либо полную смену среды. Фиг.7А схематически представляет динамику изменения титра вируса CAP-1D5 клеточных культур без смены среды, причем для инфицирования использовали различные концентрации трипсина 1×10^-4 Е/клетку (♦), 3×10^-5 E/клетку (▲) и 5×10^-5 E/клетку (■). Фиг.7Б схематически представляет динамику изменения титра вируса CAP-1D5 клеточных культур с разбавлением 1:2 с PEM средой, причем для инфицирования использовали различные концентрации трипсина 1×10^-4 Е/клетку (♦), 3×10^-5 E/клетку (▲), и 5×10^-5 E/клетку (■). Фиг.7 В схематически представляет динамику изменения титра вируса CAP-1D5 клеточных культур с полной сменой среды, причем для инфицирования не использовали трипсин () или использовали различные концентрации трипсина 1×10^-4 Е/клетку (▲), 1×10^-5 Е/клетку (♦), 5×10^-5 Е/клетку (■) и 1×10^-6 E/клетку (x).

Фиг.8A-E схематически представляют динамику изменения титра вирусов в CAP-1D5 клеточных культурах, которые инфицировали вирусами гриппа A/PR/8/34, A/Brisbane/59/2007 or B/Florida/4/200, причем до инфицирования либо осуществили смену среды (А-В), либо не проводили смену среды (Г-Е). Инфицирование вирусом гриппа A/PR/8/34 и B/Florida/4/2006 осуществили соответственно с объемами вируса, обозначенными как MOI 0.25, 0.025 и 0.0025. Инфицирование вирусом гриппа A/Brisbane/59/2007 происходило при значениях MOI 0.1, 0.025 и 0.0025. MOI (множественность заражения) представляет соотношение числа инфицированных частиц к клеткам-мишеням.

Фиг.9А и Б схематически представляют динамику изменения концентрации жизнеспособных клеток и титра вируса CAP-1D5 клеточных культур (B16, B26, и Wave) и почек собак-MDCK. SUS2 культура (MDCK), которую инфицировали с адаптированным A/PR/8/34 вирусом гриппа и культивировали в объеме 1 л в STR (Sartorius) (В16, В26, и MDCK) или Wave Bioreactors (Wave Biotech AG) (Wave). До инфицирования осуществили смену среды, в случае использования В26 культур и Wave.

Фиг.10А-В схематически представляют динамику изменения титра вируса, измеренного в log HA единиц/100 мкл, концентрации жизнеспособных клеток и значения pH CAP-1D5 клеточных культур, которые были инфицированы адаптированным вирусом гриппа A/PR/8/34 и культивированы в PEM 100 мл среды во встряхиваемых колбах. До инфицирования, осуществили либо 1:1 смену среды (светлые значки) со 293SFMII средой (□) или PEM средой (◊), либо полную смену среды (темные значки) со 293SFMII средой (■) или PEM средой (♦).

Термин «вирус гриппа», в том значении, в котором его используют в описании заявленного изобретения, относится к членам ортомиксовирусов, которые могут инфицировать человека и животных. Их классифицируют на вирус гриппа типов A, B и C. Вирусы гриппа A и B объединены в род (таксон). Вирусы гриппа C различают благодаря их семи геномным сегментам. Вирусы гриппа A и B имеют восемь геномных сегментов. Дополнительно, вирусы гриппа A и B каждый кодирует гемагглютинин (HA) и нейроминидазу (NA); в отличие от них, вирус гриппа С кодирует поверхностный белок, который сочетает два свойства гемагглютинин-эстераза-слитый белок (HEF). Вирусы гриппа A дополнительно делят на подтипы, на основе последовательности молекул гемагглютинина (H1-H15) и нейраминидазы (N1-N9).

Термин «белок вируса гриппа», в том значении, в котором его используют в описании заявленного изобретения, относится к белкам или производным вируса гриппа. Производное вируса гриппа обычно представляет собой белок или его часть вируса гриппа, который могут использовать в целях иммунизации. Белки вируса гриппа или их производные образуют белки вирусной оболочки или ее частей. В частности, белки вируса гриппа образуют белки гриппа A, белки гриппа В или белки гриппа C, например, гемагглютинин (HA), нейраминидазу (NA), нуклеопротеин (NP), матричные белки (M1) и (M2), белки полимеразы (PB1), (PB2) и (PA) и неструктурные белки (NS1) и (NS2) и их части. Части (фрагменты) белков вирусов гриппа содержат один или более эпитопов белков гриппа A, белков гриппа B или белков гриппа C. Эпитопы могут являться CD4+T-клеточными эпитопами, которые представляют пептиды, содержащие связывающий мотив класса ГКГ класса II и репрезентированы на поверхности антигенпрезентирующих клеток, при помощи молекул ГКГ класса II, или CD8+T-клеточными эпитопами, которые представляют пептиды, содержащие связывающий мотив класса ГКГ класса I и репрезентированы на поверхности антигенпрезентирующих клеток, при помощи молекул ГКГ класса I. Например, алгоритмическая модель, анализы связывания ГКГ, методы идентификации антигена in silico, и методы рентгенографической кристаллографии позволяют осуществлять идентификацию антигенов, способных связывать различные молекулы ГКГ.

Термин «вакцина», в том значении, в котором его используют в описании заявленного изобретения, относится к биологически или генетически модифицированному (инжинирингованному) антигену, содержащему белки, белковые субъединицы, пептиды, углеводороды, липиды, нуклеиновые кислоты, убитые или аттенуированные вирусы, причем оные могут быть целыми вирусными частицами или частями вирусных частиц, или их комбинацией. Антиген может являться как минимум эпитопом, например, T-клеточным и/или B-клеточным эпитопом. Упомянутый антиген детектируется иммунологическими рецепторами, например, T-клеточным рецептором или B-клеточным рецептором. Вакцину используют после применения в специфической активации иммунной системы в отношении конкретного вируса. Таким образом, реакцию иммунной системы используют как инициации иммунного ответа в присутствии вирусов и их специфических антигенов, соответственно. Это приводит к образованию антител и специфических T-хелперных клеток, способных предоставлять долговременную защиту от конкретного заболевания, которое, в зависимости от вируса, длится от нескольких лет до всей продолжительности жизни. Вакцины содержат живые или инактивированные вакцины. Живая вакцина, например, содержит аттенуированные вирусы, сохраняющие способность к репродуцированию вирусов, которые не могут вызвать заболевание. В случае использования инактивированной вакцины, данные вирусы убивают или содержат только фрагменты вируса (антигены). Инактивирование (убийство) вируса происходит, например, путем воздействия химических веществ, таких, как формальдегид, бета-пропиолактон и псоралин. Вирусная оболочка остается неизменной. Существуют также токсоидные вакцины, содержащие только биологически инактивированную часть (токсоид) токсина вируса (например, столбнячный токсин), которые также включают в убитые вакцины. В частности, инактивированная вакцина может представлять собой расщепленную вакцину, содержащую фрагменты белков вирусной оболочки. Разрушение или расщепление вирусной оболочки может иметь место, например, при использовании детергентов или сильных органических растворителей. Вирусы могут инактивировать и убивать добавлением химических агентов, соответственно. Помимо этого, субъединичные вакцины также являются частью убитых вакцин; они содержат специфические компоненты вируса, например, белки гемагглютинина и нейраминидазы.

Термин «вакцина на основе вируса гриппа», в том значении, в котором его используют в описании заявленного изобретения, относится ко всем белкам, пептидам или их частям, а также нуклеиновым кислотам, кодирующим данные белки, пептиды или части вируса гриппа, а также сами частицы вируса гриппа, рекомбинантные белки вируса гриппа, включая белки оболочки вируса гриппа, субвирусные частицы, вирусоподобные частицы (VLP), комплексы с вирусоподобными частицами и/или их части, которые могут использовать для иммунизации против гриппа.

Термин «адъювант», в том значении, в котором его используют в описании заявленного изобретения, относится к веществам, способным модулировать иммуногенность антигена. Адъювантами являются, например, минеральные соли, скваленовые смеси, мурамилпептиды, производные сапонина, препараты клеточной стенки микобактерий, определенные эмульсии, монофосфорил липид A, производные миколевой кислоты, сурфактанты неионных блок-полимеров, Quil A, B-субъединица холерного токсина, полифасфазены и их производные, иммуностимулирующие комплексы, цитокиновые адъюванты, MF59 адъювант, липидные адъюванты, мукозные адъюванты, определенные бактериальные экзотоксины, специфические олигонуклеотиды и PLG.

Термин «амниоциты», в том значении, в котором его используют в описании заявленного изобретения, относится ко всем клеткам, которые присутствуют в амниотической жидкости, и могут быть изъяты путем амниоцентеза. Эти клетки происходят либо из амниона, либо тканей плода, соприкасающихся с амниотической жидкостью. По морфологическому признаку, амниоциты подразделяют на три основных класса: фибробластоподобные клетки (Ф-клетки), эпителиоидные клетки (Э-клетки) и клетки амниотической жидкости (АЖ-клетки) (Hohn et al., Pediat. Res. 8:746-754, 1974). АЖ-клетки являются доминирующим классом.

Термин «постоянные линии клеток», в том значении, в котором его используют в описании заявленного изобретения, относится к клеткам, подвергнутым генетической модификации таким образом, что они могут продолжать расти перманентно в клеточной культуре при стабильных условиях культуры. Такие клетки также получили название «иммортализованных».

Термин «первичные клетки» в том значении, в котором его используют в описании заявленного изобретения, относится к клеткам, которые были получены путем прямого изъятия из организма или ткани, и помещены в культуру. Первичные клетки имеют очень ограниченную продолжительность жизни.

Термин «трансфекция», в том значении, в котором его используют в описании заявленного изобретения, относится к любому способу, подходящему для введения упомянутой нуклеиновой кислоты (кислот) в клетки. В качестве примеров (в т.ч., в сочетании) можно привести способ кальциево-фосфатный, электропорацию, липосомальные системы различных типов.

Термин «метилированный кэп» («CAP»), в том значении, в котором его используют в описании заявленного изобретения, относится к постоянной линии амниоцитов человека, полученной путем иммортализации первичных амниоцитов человека с генными факторами аденовируса E1A и E1B.

Термин «метилированный кэп-Т» («CAP-Т»), в том значении, в котором его используют в описании заявленного изобретения, относится к CAP-клеткам, которые в дополнение были подвергнуты стабильной трансфекции с молекулой нуклеиновой кислоты, содержащей последовательность большого SV40 Т-антигена.

Объект заявленного изобретения относится к способу получения вакцины на основе вируса гриппа, включающему следующие этапы:

(i) контакт вируса гриппа с постоянной клеткой человека,

(ii) культивирование постоянной клетки человека,

(iii) обеспечение экспрессии вируса гриппа, и

(iv) изолирование вируса гриппа из среды.

Согласно заявленному способу, постоянные клетки человека культивируют при параметрах (например, температура, среда, pH), которые благоприятны для роста клеток. Условия касательно температуры, среды, значения pH и прочие параметры роста, известны специалистам в данной области техники, или могут быть определены обычными методами. Как только культура достигла требуемой плотности роста, для инфицирования клеток добавляют вирусы гриппа. Для размножения вируса внутри клеток может потребоваться несколько дней. Во время этого процесса размножения, большая часть клеток погибает, а вирусы высвобождаются в среду. Содержащий вирус раствор отделяют от клеточных остатков, например, путем центрифугирования. Вирус затем могут отделить от раствора среды при помощи, например, хроматографической колонки, а объем могут уменьшить. Затем, вирусы могут инактивировать, например, химическим процессом, с последующим расщеплением вируса, при необходимости. После дополнительной очистки и концентрирования, получают концентрат антигена штамма вируса.

В предпочтительном варианте практического воплощения заявленного изобретения, штаммы вирусов гриппа A/PR/8/34, A/Uruguay/716/2007, A/Brisbane/59/2007, B/Florida/4/2006, свиного гриппа (A/Swine (H1N2) Bakum/1832/00) или лошадиного гриппа (A/Equine, A/Newmarket/1/93 (H3N8)) используют для инфицирования постоянных клеток человека.

В еще одном предпочтительном варианте практического воплощения заявленного изобретения, вирусы гриппа, используемые для инфицирования постоянных линий клеток человека, предварительно адаптируют к клеткам; предпочтительно, они представляют собой вышеперечисленные вирусы гриппа. Предпочтительно, данная адаптация проходит в 4 прохода. Предпочтительно, адаптацию вирусов гриппа осуществляют в 293SFMII среде или PEM среде.

Дополнительно, объект заявленного изобретения относится к способу получения вакцины на основе вируса гриппа, включающему следующие этапы:

(i) контакт молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей белок вируса гриппа, с постоянной клеткой человека,

(ii) культивирование постоянной клетки человека,

(iii) обеспечение репликации молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей белок вируса гриппа и/или экспрессии белка гриппа, и

(iv) изолирование молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей белок гриппа и/или белок вируса гриппа из среды.

В предпочтительном варианте практического воплощения заявленного изобретения, постоянные клетки человека, применяемые в способе согласно заявленному изобретению, представляют собой постоянные клетки-амниоциты человека.

В предпочтительном варианте практического воплощения заявленного изобретения, постоянные клетки человека культивируют во встряхиваемых колбах или биореакторах, предпочтительно STR или Wave Bioreactors. Постоянные клетки человека могут культивировать в различных средах, но предпочтительно в 293SFMII или PEM среде. Дополнительно, к среде могут добавить пируват, глутамин, глюкозу и другие аминокислоты. Предпочтительно, среда содержит 4 мМ или 10 мМ пирувата или других аминокислот.

В еще одном предпочтительном варианте практического воплощения заявленного изобретения, первоначальная концентрация постоянных клеток человека при культивировании во встряхиваемых колбах составляет 5×10⁵ клеток/мл, более предпочтительно 8×10⁵ клеток/мл.

В еще одном предпочтительном варианте практического воплощения заявленного изобретения, значение pH клеточной культуры находится в пределах от 7.1 до 7.8, более предпочтительно в пределах от 7.3 до 7.5, наиболее предпочтительно в пределах от 7.3 до 7.5.

В еще одном предпочтительном варианте практического воплощения заявленного изобретения, осуществляют полную смену среды или 1:2 разбавление со средой до инфицирования постоянных клеток человека вирусом гриппа.

В предпочтительном варианте практического воплощения заявленного изобретения, используют трипсин в концентрации 1×10^-4 Е/клетку, 1×10^-5 Е/клетку, 3×10^-5 Е/клетку, 5×10^-5 Е/клетку или 1×10^-6 Е/клетку для инфицирования постоянных клеток человека вирусом гриппа. При отсутствии смены среды до инфицирования постоянных клеток человека, предпочтительно используют трипсин в концентрации 1×10^-4 Е/клетку для инфицирования упомянутых клеток вирусом гриппа. При 1:2 разбавлении со средой до инфицирования постоянных клеток человека, предпочтительно используют трипсин в концентрации 5×10^-5 E/клетку для инфицирования упомянутых клеток вирусом гриппа. При полной смене среды до инфицирования постоянных клеток человека, предпочтительно используют трипсин в концентрации 5×10^-6 E/клетку для инфицирования упомянутых клеток вирусом гриппа.

В предпочтительном варианте практического воплощения заявленного изобретения, объем вируса, определенный как значение MOI (множественность заражения) в пределах от 0.001 до 0.3 используют для инфицирования постоянных клеток человека. В предпочтительном варианте практического воплощения заявленного изобретения, объем вируса, определенный как значение MOI в пределах от 0.25, 0.1, 0.06, 0.025 или 0.0025 используют для инфицирования постоянных клеток человека. Предпочтительно, когда постоянные клетки человека инфицируют вирусом гриппа A/PR/8/34 без смены среды до инфицирования, объем вируса, определенный как значение MOI 0.25 используют для инфицирования постоянных клеток человека вирусом гриппа; когда постоянные клетки человека инфицируют вирусом гриппа A/Brisbane/59/2007 без смены среды до инфицирования, объем вируса, определенный как значение MOI 0.1 используют для инфицирования постоянных клеток человека вирусом гриппа. Предпочтительно, когда постоянные клетки человека инфицируют вирусом гриппа A/PR/8/34 со сменой среды до инфицирования, объем вируса, определенный как значение MOI 0.1 или 0.25 используют для инфицирования постоянных клеток человека вирусом гриппа; когда постоянные клетки человека инфицируют вирусом гриппа A/Brisbane/59/2007 со сменой среды до инфицирования, объем вируса, определенный как значение MOI 0.06 или 0.25 используют для инфицирования постоянных клеток человека вирусом гриппа; и когда постоянные клетки человека инфицируют вирусом гриппа B/Florida/4/2006 со сменой среды до инфицирования, объем вируса, определенный как значение MOI 0.01, 0.025 или 0.0025 используют для инфицирования постоянных клеток человека вирусом гриппа.

В предпочтительном варианте практического воплощения заявленного изобретения, концентрация клеток в момент инфицирования, в случае культивирования во встряхиваемых колбах, находится в пределах от 1×10⁶ до 6×10⁶ клеток/мл. Предпочтительно, концентрация клеток в момент инфицирования составляет 2.3×10⁶ клеток/мл, 4.5×10⁶ клеток/мл или 5×10⁶ клеток/мл. В предпочтительном варианте практического воплощения заявленного изобретения, концентрация клеток в момент инфицирования составляет 4.5×10⁶ клеток/мл, в случае отсутствия смены среды до инфицирования. В еще одном предпочтительном варианте практического воплощения заявленного изобретения, концентрация клеток в момент инфицирования составляет 2.3×10⁶ клеток/мл, и до инфицирования проводят 1:2 разбавление со свежей PEM средой. В еще одном предпочтительном варианте практического воплощения заявленного изобретения, концентрация клеток в момент инфицирования составляет 5×10⁶ клеток/мл, и до инфицирования проводят полную смену среды.

В особенно предпочтительном варианте практического воплощения заявленного изобретения, постоянные клетки человека культивируют в биореакторе STR (Sartorius) емкостью 1 литр в PEM среде с 4 мМ глутамина и 4 мМ пирувата, первоначальная концентрация клеток составляет 5×10⁵ клеток/мл, причем, при концентрации клеток 2.1×10⁶ клеток/мл с вирусом гриппа в объеме, определенном как значение MOI 0.025, проводят инфицирование без предварительной смены среды. Предпочтительно, инфицирование осуществляют в присутствие трипсина в финальной концентрации 3×10^-5 Е/мл.

В особенно предпочтительном варианте практического воплощения заявленного изобретения, постоянные клетки человека культивируют в биореакторе STR (Sartorius) емкостью 1 литр в PEM среде, при этом первоначальная концентрация клеток составляет 8×10⁵ клеток/мл, и при этом инфицирование проводят с вирусом гриппа, используя объем вируса, определенный как значение MOI 0.025, со сменой среды до инфицирования. Предпочтительно, инфицирование проводят в присутствие трипсина в финальной концентрации 3×10^-5 Е/мл.

В особенно предпочтительном варианте практического воплощения заявленного изобретения, постоянные клетки человека культивируют в биореакторе Wave (Wave Biotech AG) емкостью 1 литр в PEM среде с 4 мМ глутамина, 4 мМ пирувата и 20 мМ глюкозы в PEM среде, первоначальная концентрация клеток составляет 5×10⁵ клеток/мл, а концентрация клеток до инфицирования составляет 2.1×10⁶ клеток/мл, при этом инфицирование проводят с объемом вируса, определенным как значение MOI 0.025, без смены среды до инфицирования. Предпочтительно, инфицирование проводят в присутствие трипсина в финальной концентрации 3×10^-5 Е/мл.

В предпочтительном варианте практического воплощения заявленного изобретения, постоянные клетки человека культивируют в PEM среде с 4 мМ глутамина и 4 мМ пирувата во встряхиваемых колбах, причем проводят смену среды до инфицирования клеток вирусом гриппа, с объемом вируса, определенным как значение MOI 0.025, в присутствие концентрации трипсина 1×10^-6 E/клетку.

В предпочтительном варианте практического воплощения заявленного изобретения, постоянные клетки человека культивируют в PEM среде с 4 мМ глутамина и 4 мМ пирувата во встряхиваемых колбах, причем проводят 1:1 смену среды до инфицирования клеток вирусом гриппа, с объемом вируса, определенным как значение MOI 0.025, в присутствие концентрации трипсина 1×10^-5 Е/клетку.

В производстве белков гриппа и молекул нуклеиновых кислот, кодирующих белок гриппа, культивированные клетки человека с молекулами нуклеиновых кислот, кодирующими белок гриппа, трансфектируют, и затем белок вируса гриппа или молекулы нуклеиновых кислот, кодирующие белок гриппа, изолируют и очищают, используя известные способы.

В еще одном предпочтительном варианте практического воплощения заявленного изобретения, клетки человека находятся в или между средне-экспоненциальной фазой роста и стационарной фазой роста, согласно заявленному способу, в момент инфицирования вирусной частицей, или в момент трансфекции с молекулой нуклеиновой кислоты, кодирующей белок вируса гриппа или его часть. Типичная кривая роста, в которой изображена зависимость концентрации клеток от времени, представляет собой сигмоидную кривую. Она начинается с так называемой лаг-фазы, с последующими лог-фазой или экспоненциальной фазой роста и стационарной фазой роста. Средняя экспоненциальная фаза роста в данном случае соответствует первой точке перегиба типичной кривой роста, причем точка перегиба является точкой на кривой роста в том месте, где форма кривой меняется от вогнутой к выпуклой, или наоборот. Стационарная фаза начинается, когда кривая роста достигает плоской части, т.е. число клеток остается постоянным.

Нуклеиновые кислоты, получаемые с применением способа согласно заявленному изобретению, кодирующие белок гриппа, предоставляемый изобретательским способом, могут быть использованы для иммунизации нуклеиновыми кислотами, или так называемых ДНК вакцин. При иммунизации нуклеиновыми кислотами, иммуногенные антигены, т.е. антигены, запускающие иммунный ответ у человека, инокулируются. Такие иммуногенные антигены кодируются ДНК или РНК, присутствуют как кассеты экспрессии или векторы, или интегрированы в вирусные векторы с целью индукции иммунного ответа на генный продукт. ДНК вакцины могут предоставлять в различных системах доставки, например, как ДНК или РНК, в форме линеаризованных или кольцевых плазмид или кассет экспрессии, причем они снабжены необходимыми элементами для экспрессии, как, например, промотором, сайтами полиаденилирования, репликатором (точкой начала репликации) и т.п. В случае введения ДНК, аналогичный комплект присутствует в буфере с или без адъюванта, или связанными с наночастицами, или в адъювант-содержащем компаунде, или интегрированными в вирусный или бактериальный вектор. DNA вакцины запускают как гуморальный, так и клеточный иммунный ответ. Преимуществом использования ДНК вакцин является то, что антиген эксперссируют в его нативной форме, что приводит к улучшенной иммунизации. Другим преимуществом использования ДНК вакцин является то, что, в отличие от ослабленных живых вакцин, они неинфекционные и не могут быть снова вирулентными.

Введение ДНК вакцин в форме ДНК или РНК, плазмидных или линейных фрагментов ДНК, которые связаны с частицами, могут осуществлять путем инъекций или генетической пушки. Например, ДНК вакцины для инъекций могут присутствовать в физиологическом или забуференном растворах.

Нуклеиновые кислоты, получаемые с применением способа согласно заявленному изобретению, кодирующие белок гриппа, белок гриппа и вирус гриппа, могут использовать в качестве вакцины против вируса гриппа типов A и/или B и/или C.

Вакцина на основе вируса гриппа, полученная с применением способа в соответствии с заявленным изобретением, содержит все белки, пептиды или их части, а также нуклеиновые кислоты, кодирующие данные белки, пептиды или их части, -- вируса гриппа, а также сами частицы вируса гриппа, рекомбинантные белки вирусов гриппа, включая белки оболочки вируса гриппа, субвирусные частицы, вирусоподобные частицы (VLP), комплексы с вирусоподобными частицами и/или их части, которые могут использовать для иммунизации против гриппа.

Предпочтительно, белки гриппа, полученные с применением способа в соответствии с заявленным изобретением, представляют собой белки или производные вируса гриппа, предпочтительно штаммов вирусов гриппа A/PR/8/34, A/Uruguay/716/2007, A/Brisbane/59/2007, B/Florida/4/2006, вируса свиного гриппа (A/Swine (H1N2) Bakum/1832/00) или вируса лошадиного гриппа (A/Equine, A/Newmarket/1/93 (H3N8)).

Изолирование и очистку нуклеиновых кислот, кодирующих белок вируса гриппа или его части, полученных с применением способа в соответствии с заявленным изобретением, осуществляют с применением традиционных методов, известных специалистам в данной области техники.

Изолирование и очистку белков вирусов гриппа, полученных с применением способа в соответствии с заявленным изобретением, осуществляют с применением традиционных методов, известных специалистам в данной области техники. Очистка белков первоначально зависит от их происхождения. Различие делают между внутри- и внеклеточными белками. Если белки расположены внутри клеток, вначале необходимо разрушить клеточные стенки, например, используя силу трения или осмолизис. После этого, осуществляют сепарирование нерастворимого материала, например, клеточных мембран и клеточных стенок, к примеру, путем центрифугирования (способ, применяемый по умолчанию для сепарирования клеток, клеточных органелл (органоидов) и белков). Более эффективным способом, с точки зрения емкости сепарирования, является импульсный электрофорез. Дополнительно, после сепарирования прочих клеточных компонентов, все еще присутствует необходимость сепарировать белки разных размеров, пептиды и аминокислоты. Сепарирование белков могут проводить одно- или двумерным гель-электрофорезом или капиллярным электр