Применение ингибиторов nkg2d для лечения сердечно-сосудистых и метаболических заболеваний, таких как диабет 2 типа

Применение ингибиторов nkg2d для лечения сердечно-сосудистых и метаболических заболеваний, таких как диабет 2 типа

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Исследования, финансируемые из федерального бюджета

Данное изобретение было осуществлено при государственной поддержке по гранту № PEN04143, присужденному Департаментом сельского хозяйства Соединенных Штатов, и гранту № CA093678, присужденному Национальным институтом здоровья (NIH). Правительство обладает определенными правами на данное изобретение.

Ссылки на родственные заявки

По данной заявке испрашивается приоритет по 35 U. S. C. § 119(e) в отношении предварительной патентной заявки США с регистрационным № 61/234425, поданной 17 августа 2009 г., и предварительной патентной заявки США с регистрационным № 61/304113, поданной 12 февраля 2010 г., полное содержание которых включено в данный документ посредством ссылок.

Область техники изобретения

Настоящее изобретение относится к способам лечения диабета 2 типа и/или патологических состояний, которые можно регулировать или приводить в норму посредством ингибирования NKG2D, например, сердечно-сосудистых заболеваний.

Уровень техники изобретения

Большое и все возрастающее число людей страдает от сахарного диабета. Сахарный диабет, также известный как диабет, представляет собой нарушение метаболизма, приводящее к повышению уровня глюкозы в крови вследствие относительной или абсолютной недостаточности гормона поджелудочной железы инсулина. Инсулин секретируется из поджелудочной железы в кровь, в зависимости от уровня глюкозы в крови и его основной функцией является направление находящейся в крови глюкозы в резервную систему организма, при этом уровень глюкозы остается под контролем.

Известно, что диабет существует в форме диабета 1 типа и 2 типа. Диабет 1 типа характеризуется прогрессирующей потерей бета-клеток поджелудочной железы вследствие неблагоприятного баланса между разрушительными аутоиммунными процессами, направленными на бета-клетки, с одной стороны и регенеративной способностью этих клеток с другой стороны. Этот дисбаланс в конечном итоге приводит к полной потере бета-клеток и эндогенной секреции инсулина. Диабет 1 типа составляет 5-10% от всех случаев диабета. Диабет 2 типа характеризуется резистентностью к инсулину и нарушением функции бета-клеток, что включает нарушение первой фазы высвобождения инсулина, уменьшение импульсного выброса бета-клетками и недостаток инсулина. Диабет 2 типа является наиболее распространенной формой заболевания, составляющей 90-95% всех случаев диабета.

Люди с диабетом в два-четыре раза более склонны к развитию сердечно-сосудистых заболеваний, чем люди без диабета. Сердечно-сосудистые заболевания являются основным осложнением и основной причиной смерти у людей с диабетом 2 типа, несмотря на значительные улучшения в методах лечения на протяжении последних десятилетий. Повышенный риск сердечных приступов, инсульт и ампутация нижних конечностей являются основными причинами преждевременной смерти у людей с диабетом. Более высокая распространенность факторов риска сердечно-сосудистых заболеваний, включая ожирение, гипертонию, дислипидемию и отсутствие физической активности, как правило, сопутствует диабету 2 типа.

Сердечно-сосудистые заболевания являются наиболее серьезной проблемой здравоохранения и основной причиной смертности в Соединенных Штатах Америки (США). По данным Американской кардиологической ассоциации, стоимость профилактики и терапии сердечно-сосудистых заболеваний составила поразительную сумму в 448,5 миллиардов долларов США в 2008 г. только в США, что является огромным финансовым бременем для общества. Атеросклероз является формой сердечно-сосудистого заболевания, при которой бляшки, состоящие из жировых веществ и клеточных компонентов, накапливаются на внутренней выстилке артериальных сосудов. Заболевание начинается с отложения аномальных метаболитов в восприимчивых участках артерий пациентов при дисфункциональных метаболических состояниях, таких как диабет, и прогрессирует с вовлечением множества факторов, включая иммунную активацию и воспаление.

Аномальные метаболические состояния, такие как диабет, являются причиной различных клеточных ответов на стресс, которые вызывают воспаление тканей и активацию иммунных клеток, что, в свою очередь, усиливает метаболические нарушения, создавая порочный круг, который поддерживает последующие события, лежащие в основе таких нарушений, как прогрессирование сердечно-сосудистых заболеваний. Однако молекулярные события, связывающие эти процессы, не до конца понятны, что создает помеху попыткам модулировать иммунную систему для лечения метаболической дисфункции и осложнений сердечно-сосудистых заболеваний.

Соответственно, существует потребность в эффективных методах прогнозирования, профилактики и лечения заболеваний, связанных с метаболической дисфункцией, таких как диабет, а также сердечно-сосудистые заболевания и расстройства.

Сущность изобретения

Настоящее изобретение относится к открытию семейства иммуностимулирующих молекул, которые характеризуются повышенной регуляцией у пациентов и животных с диабетом 2 типа и/или метаболическими дисфункциями и могут играть важную роль в активации иммунных клеток для воспаления сосудов и печени, метаболической дисфункции и развития сердечно-сосудистого заболевания. В частности, повышенные уровни стимуляторных лигандов для NKG2D, эффективного иммуноактивирующего рецептора, были обнаружены у пациентов с диабетом 2 типа, а также в животных моделях дисфункционального липидного метаболизма и атеросклероза.

Соответственно, настоящее изобретение относится к новым способам, композициям и наборам для лечения диабета 2 типа и патологических состояний, которые можно регулировать или приводить в норму посредством ингибирования NKG2D, например, сердечно-сосудистых заболеваний. Настоящее изобретение также относится к новым способам выявления и диагностики предрасположенности к диабету 2 типа или сердечно-сосудистому заболеванию, либо наличия диабета 2 типа или сердечно-сосудистого заболевания.

В одном варианте осуществления настоящее изобретение относится к способу лечения диабета 2 типа, включающему введение субъекту, нуждающемуся в этом, терапевтически эффективного количества средства, ингибирующего активацию или сигнализацию NKG2D. В другом варианте осуществления настоящее изобретение относится к способу лечения диабета 2 типа, включающему введение субъекту, нуждающемуся в этом, терапевтически эффективного количества средства, блокирующего взаимодействие связывания лиганда NKG2D. В другом варианте осуществления настоящее изобретение относится к способу лечения патологического состояния, которое можно регулировать или приводить в норму посредством ингибирования NKG2D, включающему введение субъекту, нуждающемуся в этом, терапевтически эффективного количества средства, ингибирующего активацию или сигнализацию NKG2D, при этом патологическое состояние выбирают из группы, состоящей из диабета 2 типа, сердечно-сосудистого заболевания, воспалительного заболевания и заболевания, связанного с метаболической дисфункцией. В другом варианте осуществления настоящее изобретение относится к способу лечения патологического состояния, которое можно регулировать или приводить в норму посредством ингибирования NKG2D, включающему введение субъекту, нуждающемуся в этом, терапевтически эффективного количества средства, блокирующего взаимодействие связывания лиганда NKG2D, при этом патологическое состояние выбирают из группы, состоящей из диабета 2 типа, сердечно-сосудистого заболевания, воспалительного заболевания и заболевания, связанного с метаболической дисфункцией.

В другом варианте осуществления настоящее изобретение относится к применению терапевтически эффективного количества средства, ингибирующего активацию или сигнализацию NKG2D, у субъекта для лечения диабета 2 типа. В другом варианте осуществления настоящее изобретение относится к применению терапевтически эффективного количества средства, блокирующего взаимодействие связывания лиганда NKG2D, у субъекта для лечения диабета 2 типа. В другом варианте осуществления настоящее изобретение относится к применению терапевтически эффективного количества средства, ингибирующего активацию или сигнализацию NKG2D, у субъекта для лечения патологического состояния, которое можно регулировать или приводить в норму посредством ингибирования NKG2D, при этом патологическое состояние выбирают из группы, состоящей из диабета 2 типа, сердечно-сосудистого заболевания, воспалительного заболевания и заболеваний, связанных с метаболической дисфункцией. В другом варианте осуществления настоящее изобретение относится к применению терапевтически эффективного количества средства, блокирующего взаимодействие связывания лиганда NKG2D, у субъекта для лечения патологического состояния, которое можно регулировать или приводить в норму посредством ингибирования NKG2D, при этом патологическое состояние выбирают из группы, состоящей из диабета 2 типа, сердечно-сосудистого заболевания, воспалительного заболевания и заболевания, связанного с метаболической дисфункцией.

В некоторых вариантах осуществления патологическое состояние, которое можно регулировать или приводить в норму посредством ингибирования NKG2D, представляет собой диабет 2 типа. В некоторых вариантах осуществления патологическое состояние представляет собой сердечно-сосудистое заболевание.

В некоторых вариантах осуществления субъект является человеком.

В некоторых вариантах осуществления средство выбирают из группы, состоящей из растворимого NKG2D, антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, специфически связывающего NKG2D, лиганда NKG2D и ингибитора активности или экспрессии лиганда NKG2D. В некоторых вариантах осуществления средство представляет собой антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, специфически связывающий NKG2D. В некоторых вариантах осуществления антитело или его антигенсвязывающий фрагмент является человеческим или гуманизированным. В некоторых вариантах осуществления антитело или его антигенсвязывающий фрагмент связывает NKG2D человека (hNKG2D). В некоторых вариантах осуществления антитело или его антигенсвязывающий фрагмент снижает опосредованную NKG2D активацию или сигнализацию экспрессирующей NKG2D клетки. В некоторых вариантах осуществления антитело или его антигенсвязывающий фрагмент конкурирует с по меньшей мере одним лигандом NKG2D за связывание с NKG2D. В некоторых вариантах осуществления лиганд NKG2D представляет собой MICA/B.

В некоторых вариантах осуществления введение средства приводит к по меньшей мере одному из перечисленных далее событий у субъекта: снижению уровней глюкозы в крови, улучшению толерантности к глюкозе, снижению резистентности к инсулину, уменьшению массы тела, снижению артериального давления, уменьшению воспаления или снижению метаболических дисфункций.

В некоторых вариантах осуществления средство вводят внутривенно, внутрибрюшинно или подкожно.

В некоторых вариантах осуществления способы по настоящему изобретению дополнительно включают по меньшей мере одно дополнительное средство, выбранное из группы, состоящей из противодиабетических средств, средств против ожирения, средств, регулирующих аппетит, антигипертензивных средств, средств для лечения и/или профилактики осложнений, вызванных или связанных с диабетом, а также средств для лечения и/или профилактики осложнений и нарушений, вызванных или связанных с ожирением. В некоторых вариантах осуществления дополнительное средство выбирают из группы, состоящей из (a) средства для снижения уровня глюкозы в крови, выбранного из группы, состоящей из GLP-1 и производных и аналогов GLP-1, эксендина-4 и производных и аналогов эксендина-4, амилина и производных и аналогов амилина, сульфонилмочевин, бигуанидов, меглитинидов (таких как натеглинид и репаглинид), ингибиторов глюкозидазы, ингибиторов DPP-IV (дипептидилпептидазы-IV), ингибиторов SGLT2, ингибиторов или агонистов SGLT1, гастрина и аналогов и производных гастрина, FGF-21 (фактора роста фибробластов 21) и производных и аналогов FGF-21, ингибиторов протонного насоса, таких как лансопразол, омепразол, декслансопразол, эзомепразол, пантопразол и рабепразол, агонистов RXR, холестирамина, колестипола, пробукола, декстротироксина, агонистов PPAR, а также адипонектина и производных и аналогов адипонектина; (b) средства для снижения уровня липидов в крови или изменения метаболизма липидов, выбранного из группы, состоящей из антигиперлипидемических средств, ингибиторов HMG CoA (статинов), таких как ловастатин, правастатин и симвастатин, и фибратов, таких как гемфиброзил и клофибрат; (c) средства для снижения потребления пищи или увеличения расхода энергии, выбранного из группы, состоящей из антагонистов NPY (нейропептида Y), агонистов PYY (полипептида YY), агонистов PP (панкреатического полипептида), агонистов рецептора Y2, агонистов рецептора Y4, агонистов смешанного рецептора Y2/Y4, агонистов MC4 (меланокортина 4), антагонистов орексина, глюкагона и производных и аналогов глюкагона, агонистов CRF (кортикотропин рилизинг-фактора), антагонистов CRF BP (белка, связывающего кортикотропин рилизинг-фактор), агонистов урокортина, агонистов β3, агонистов MSH (меланоцитстимулирующего гормона), антагонистов MCH (меланоцитконцентрирующего гормона), агонистов CCK (холецистокинина), ингибиторов обратного захвата серотонина, ингибиторов обратного захвата серотонина и норадреналина, смешанных серотониновых и норадренергических соединений, агонистов 5HT (серотонина), агонистов бомбезина, антагонистов галанина, гормона роста, соединений, высвобождающих гормон роста, агонистов TRH (тиреотропин рилизинг-гормона), модуляторов UCP 2 или 3 (разобщающего белка 2 или 3), агонистов лептина, агонистов DA (бромокриптина, допрексина), ингибиторов липазы/амилазы, модуляторов RXR (ретиноидного X-рецептора), антагонистов гистамина H3 и агонистов CART (транскрипта, регулируемого кокаином и амфетамином); и (d) средства для снижения артериального давления, выбранного из группы, состоящей из β-блокаторов, таких как альпренолол, атенолол, тимолол, пиндолол, пропранолол и метопролол, ингибиторов ACE (ангиотензинпревращающего фермента), таких как беназеприл, каптоприл, эналаприл, фозиноприл, лизиноприл, алатриоприл, квинаприл и рамиприл, блокаторов кальциевых каналов, таких как нифедипин, фелодипин, никардипин, исрадипин, нимодипин, дилтиазем и верапамил, а также α-блокаторов, таких как доксазозин, урапидил, празозин и теразозин.

В одном варианте осуществления настоящее изобретение относится к композиции, содержащей терапевтически эффективное количество средства, ингибирующего активацию и сигнализацию NKG2D, и фармацевтически приемлемый носитель. В другом варианте осуществления настоящее изобретение относится к композиции, содержащей терапевтически эффективное количество средства, блокирующего взаимодействие связывания лиганда NKG2D, и фармацевтически приемлемый носитель.

В некоторых вариантах осуществления средство полезно для лечения диабета 2 типа. В некоторых вариантах осуществления средство полезно для лечения патологического состояния, которое можно регулировать или приводить в норму посредством ингибирования NKG2D.

В некоторых вариантах осуществления патологическое состояние выбирают из группы, состоящей из диабета 2 типа, сердечно-сосудистого заболевания, воспалительного заболевания и заболевания, связанного с метаболической дисфункцией. В некоторых вариантах осуществления патологическое состояние представляет собой диабет 2 типа. В некоторых вариантах осуществления патологическое состояние представляет собой сердечно-сосудистое заболевание.

В некоторых вариантах осуществления средство выбирают из группы, состоящей из растворимого NKG2D, антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, специфически связывающего NKG2D, лиганда NKG2D и ингибитора активности или экспрессии лиганда NKG2D. В некоторых вариантах осуществления средство представляет собой антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, специфически связывающий NKG2D. В некоторых вариантах осуществления антитело или его антигенсвязывающий фрагмент является человеческим или гуманизированным. В некоторых вариантах осуществления антитело или его антигенсвязывающий фрагмент связывает NKG2D человека (hNKG2D).

В некоторых вариантах осуществления средство представляет собой ингибитор активности или экспрессии лиганда NKG2D. В некоторых вариантах осуществления ингибитор активности или экспрессии лиганда NKG2D представляет собой ингибитор MICA/B. В некоторых вариантах осуществления ингибитор MICA/B представляет собой специфичную для MICA/B киРНК.

В некоторых вариантах осуществления композиции по настоящему изобретению дополнительно содержат по меньшей мере одно дополнительное средство, выбранное из группы, состоящей из противодиабетических средств, средств против ожирения, средств, регулирующих аппетит, антигипертензивных средств, средств для лечения и/или профилактики осложнений, вызванных или связанных с диабетом, а также средств для лечения и/или профилактики осложнений и нарушений, вызванных или связанных с ожирением. В некоторых вариантах осуществления дополнительное средство выбирают из группы, состоящей из (a) средства для снижения уровня глюкозы в крови, выбранного из группы, состоящей из GLP-1 и производных и аналогов GLP-1, эксендина-4 и производных и аналогов эксендина-4, амилина и производных и аналогов амилина, сульфонилмочевин, бигуанидов, меглитинидов (таких как натеглинид и репаглинид), ингибиторов глюкозидазы, ингибиторов DPP-IV (дипептидилпептидазы-IV), ингибиторов SGLT2, ингибиторов или агонистов SGLT1, гастрина и аналогов и производных гастрина, FGF-21 (фактора роста фибробластов 21) и производных и аналогов FGF-21, ингибиторов протонного насоса, таких как лансопразол, омепразол, декслансопразол, эзомепразол, пантопразол и рабепразол, агонистов RXR, холестирамина, колестипола, пробукола, декстротироксина, агонистов PPAR, а также адипонектина и производных и аналогов адипонектина; (b) средства для снижения уровня липидов в крови или изменения метаболизма липидов, выбранного из группы, состоящей из антигиперлипидемических средств, ингибиторов HMG CoA (статинов), таких как ловастатин, правастатин и симвастатин, и фибратов, таких как гемфиброзил и клофибрат; (c) средства для снижения потребления пищи или увеличения расхода энергии, выбранного из группы, состоящей из антагонистов NPY (нейропептида Y), агонистов PYY (полипептида YY), агонистов PP (панкреатического полипептида), агонистов рецептора Y2, агонистов рецептора Y4, агонистов смешанного рецептора Y2/Y4, агонистов MC4 (меланокортина 4), антагонистов орексина, глюкагона и производных и аналогов глюкагона, агонистов CRF (кортикотропин рилизинг-фактора), антагонистов CRF BP (белка, связывающего кортикотропин рилизинг-фактор), агонистов урокортина, агонистов β3, агонистов MSH (меланоцитстимулирующего гормона), антагонистов MCH (меланоцитконцентрирующего гормона), агонистов CCK (холецистокинина), ингибиторов обратного захвата серотонина, ингибиторов обратного захвата серотонина и норадреналина, смешанных серотониновых и норадренергических соединений, агонистов 5HT (серотонина), агонистов бомбезина, антагонистов галанина, гормона роста, соединений, высвобождающих гормон роста, агонистов TRH (тиреотропин рилизинг-гормона), модуляторов UCP 2 или 3 (разобщающего белка 2 или 3), агонистов лептина, агонистов DA (бромокриптина, допрексина), ингибиторов липазы/амилазы, модуляторов RXR (ретиноидного X-рецептора), антагонистов гистамина H3 и агонистов CART (транскрипта, регулируемого кокаином и амфетамином); и (d) средства для снижения артериального давления, выбранного из группы, состоящей из β-блокаторов, таких как альпренолол, атенолол, тимолол, пиндолол, пропранолол и метопролол, ингибиторов ACE (ангиотензинпревращающего фермента), таких как беназеприл, каптоприл, эналаприл, фозиноприл, лизиноприл, алатриоприл, квинаприл и рамиприл, блокаторов кальциевых каналов, таких как нифедипин, фелодипин, никардипин, исрадипин, нимодипин, дилтиазем и верапамил, а также α-блокаторов, таких как доксазозин, урапидил, празозин и теразозин.

В одном варианте осуществления настоящее изобретение относится к набору, включающему: (a) терапевтически эффективное количество средства, ингибирующего активацию или сигнализацию NKG2D, в сочетании с фармацевтически приемлемым носителем; и (b) инструкции по применению. В другом варианте осуществления настоящее изобретение относится к набору, включающему: (a) терапевтически эффективное количество средства, блокирующего взаимодействие связывания лиганда NKG2D, в сочетании с фармацевтически приемлемым носителем; и (b) инструкции по применению.

В некоторых вариантах осуществления средство полезно для лечения диабета 2 типа.

В некоторых вариантах осуществления средство полезно для лечения патологического состояния, которое можно регулировать или приводить в норму посредством ингибирования NKG2D.

В некоторых вариантах осуществления патологическое состояние выбирают из группы, состоящей из диабета 2 типа, сердечно-сосудистого заболевания, воспалительного заболевания и заболевания, связанного с метаболической дисфункцией. В некоторых вариантах осуществления патологическое состояние представляет собой диабет 2 типа. В некоторых вариантах осуществления патологическое состояние представляет собой сердечно-сосудистое заболевание.

В некоторых вариантах осуществления средство выбирают из группы, состоящей из растворимого NKG2D, антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, специфически связывающего NKG2D, лиганда NKG2D и ингибитора активности или экспрессии лиганда NKG2D. В некоторых вариантах осуществления средство представляет собой антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, специфически связывающий NKG2D. В некоторых вариантах осуществления антитело или его антигенсвязывающий фрагмент является человеческим или гуманизированным. В некоторых вариантах осуществления антитело или его антигенсвязывающий фрагмент связывает NKG2D человека (hNKG2D).

В некоторых вариантах осуществления наборы по настоящему изобретению дополнительно включают по меньшей мере одно дополнительное средство, выбранное из группы, состоящей из противодиабетических средств, средств против ожирения, средств, регулирующих аппетит, антигипертензивных средств, средств для лечения и/или профилактики осложнений, вызванных или связанных с диабетом, а также средств для лечения и/или профилактики осложнений и нарушений, вызванных или связанных с ожирением. В некоторых вариантах осуществления дополнительное средство выбирают из группы, состоящей из (a) средства для снижения уровня глюкозы в крови, выбранного из группы, состоящей из GLP-1 и производных и аналогов GLP-1, эксендина-4 и производных и аналогов эксендина-4, амилина и производных и аналогов амилина, сульфонилмочевин, бигуанидов, меглитинидов (таких как натеглинид и репаглинид), ингибиторов глюкозидазы, ингибиторов DPP-IV (дипептидилпептидазы-IV), ингибиторов SGLT2, ингибиторов или агонистов SGLT1, гастрина и аналогов и производных гастрина, FGF-21 (фактора роста фибробластов 21) и производных и аналогов FGF-21, ингибиторов протонного насоса, таких как лансопразол, омепразол, декслансопразол, эзомепразол, пантопразол и рабепразол, агонистов RXR, холестирамина, колестипола, пробукола, декстротироксина, агонистов PPAR, а также адипонектина и производных и аналогов адипонектина; (b) средства для снижения уровня липидов в крови или изменения метаболизма липидов, выбранного из группы, состоящей из антигиперлипидемических средств, ингибиторов HMG CoA (статинов), таких как ловастатин, правастатин и симвастатин, и фибратов, таких как гемфиброзил и клофибрат; (c) средства для снижения потребления пищи или увеличения расхода энергии, выбранного из группы, состоящей из антагонистов NPY (нейропептида Y), агонистов PYY (полипептида YY), агонистов PP (панкреатического полипептида), агонистов рецептора Y2, агонистов рецептора Y4, агонистов смешанного рецептора Y2/Y4, агонистов MC4 (меланокортина 4), антагонистов орексина, глюкагона и производных и аналогов глюкагона, агонистов CRF (кортикотропин рилизинг-фактора), антагонистов CRF BP (белка, связывающего кортикотропин рилизинг-фактор), агонистов урокортина, агонистов β3, агонистов MSH (меланоцитстимулирующего гормона), антагонистов MCH (меланоцитконцентрирующего гормона), агонистов CCK (холецистокинина), ингибиторов обратного захвата серотонина, ингибиторов обратного захвата серотонина и норадреналина, смешанных серотониновых и норадренергических соединений, агонистов 5HT (серотонина), агонистов бомбезина, антагонистов галанина, гормона роста, соединений, высвобождающих гормон роста, агонистов TRH (тиреотропин рилизинг-гормона), модуляторов UCP 2 или 3 (разобщающего белка 2 или 3), агонистов лептина, агонистов DA (бромокриптина, допрексина), ингибиторов липазы/амилазы, модуляторов RXR (ретиноидного X-рецептора), антагонистов гистамина H3 и агонистов CART (транскрипта, регулируемого кокаином и амфетамином); и (d) средства для снижения артериального давления, выбранного из группы, состоящей из β-блокаторов, таких как альпренолол, атенолол, тимолол, пиндолол, пропранолол и метопролол, ингибиторов ACE (ангиотензинпревращающего фермента), таких как беназеприл, каптоприл, эналаприл, фозиноприл, лизиноприл, алатриоприл, квинаприл и рамиприл, блокаторов кальциевых каналов, таких как нифедипин, фелодипин, никардипин, исрадипин, нимодипин, дилтиазем и верапамил, а также α-блокаторов, таких как доксазозин, урапидил, празозин и теразозин.

В одном варианте осуществления настоящее изобретение относится к способу выявления предрасположенности к развитию диабета 2 типа или наличия диабета 2 типа у субъекта, включающему: (a) получение образца от субъекта; (b) создание контакта образца с по меньшей мере одним реагентом, который выявляет наличие экспрессии MICA/B; (c) измерение уровня экспрессии MICA/B в образце; и (d) установление корреляции между избыточной экспрессией MICA/B и предрасположенностью к развитию диабета 2 типа или наличием диабета 2 типа у субъекта. В другом варианте осуществления настоящее изобретение относится к способу выявления предрасположенности к развитию сердечно-сосудистого заболевания или наличия сердечно-сосудистого заболевания у субъекта, включающему: (a) получение образца от субъекта; (b) создание контакта образца с по меньшей мере одним реагентом, который выявляет наличие экспрессии MICA/B; (c) измерение уровня экспрессии MICA/B в образце; и (d) установление корреляции между избыточной экспрессией MICA/B и предрасположенностью к развитию сердечно-сосудистого заболевания или наличием сердечно-сосудистого заболевания у субъекта.

В некоторых вариантах осуществления реагент представляет собой антитело к MICA/B.

В некоторых вариантах осуществления образец представляет собой сыворотку.

В некоторых вариантах осуществления субъект является человеком.

В некоторых вариантах осуществления способы по настоящему изобретению дополнительно включают измерение уровня экспрессии маркера сердечно-сосудистого заболевания, не являющегося MICA/B, в образце и установление корреляции между избыточной экспрессией или недостаточной экспрессией маркера сердечно-сосудистого заболевания и предрасположенностью к развитию сердечно-сосудистого заболевания или наличием сердечно-сосудистого заболевания у субъекта.

Краткое описание чертежей

На фиг.1 представлена серия графиков, демонстрирующих обнаружение растворимых белков MICA в сыворотках пациентов с диабетом 2 типа и их связь с экспрессией других провоспалительных цитокинов. (A) Обнаружение растворимого MICA в крови пациентов с диабетом 2 типа. Сыворотки пациентов с диабетом анализировали на белки MICA при помощи набора для ELISA (R&D Systems, Minneapolis, MN). Рекомбинантные белки MICA использовали в качестве стандартов, исходя из которых, рассчитывали уровни MICA в сыворотках. На оси абсцисс каждый номер обозначает пациента. (B и C) Уровни IL-6 и TNF-α в сыворотках тех же пациентов, проанализированные с помощью 4-компонентной панели провоспалительных цитокинов человека (IL-6, TNF-α, IL-1β и IFN-γ) (Meso Scale Discovery, Gaithersburg, MD). (D) Сывороточные уровни С-реактивного белка (CRP) в сыворотках пациентов с диабетом 2 типа, проанализированные с использованием набора ELISA для CRP (Calbiotech Inc. Spring Valley, CA). (E) Пациенты с диабетом в среднем имеют более высокие уровни MICA в сыворотках, чем протестированные пятьдесят пациентов с раком. Данные для пациентов с диабетом 2 типа сгруппированы, и сопоставлены с данными пятидесяти пациентов с раком.

На фиг.2 представлена серия микрофотографий замороженных срезов, демонстрирующих обнаружение MICA/B при иммуногистохимическом окрашивании в аортальных бляшках человека. Замороженные срезы бляшек окрашивали антителами против MICA/B (A, C, E, G). Соседние срезы окрашивали антителами против Mac-3 или CD31 для выявления макрофагов или эндотелиальных клеток (B, D, F, H). Срез нормальной аорты использовали в качестве контроля для окрашивания на MICA (I).

На фиг.3 представлена серия фотографий электрофоретических гелей и серия фотографий иммуногистохимически окрашенных замороженных срезов, демонстрирующие повышенную регуляцию лигандов NKG2D в атеросклеротических бляшках ApoE-/- мыши. (A) Полуколичественный ОТ-ПЦР анализ транскриптов для лигандов NKG2D Rae-1δ, Rae-1ε и H60b в РНК аортальных бляшек. (B) Анализ методом ОТ-ПЦР в реальном времени транскриптов Rae-1δ, Rae-1ε и H60b в образцах РНК, выделенных из областей дуги аорты у ApoE-/- мышей, получавших в качестве корма «западную диету» (WD), и подобранных по возрасту мышей дикого типа, получавших в качестве корма «западную диету» и обычный корм. Эксперимент проводили дважды. (C) Иммуногистохимическое окрашивание замороженных срезов бляшек от ApoE-/- мышей, у которых бляшки развивались естественно (справа) или ускоренным образом в результате индуцированного STZ диабета (слева). Срезы одновременно окрашивали антителом против Rae-1 или H60 (коричневый цвет) и антителом против CD68 (синий цвет). (D) Иммуногистохимическое окрашивание атеросклеротических аорт ApoE-/- мышей, получавших в качестве корма «западную диету», на лиганды NKG2D Rae-1 и H60. Замороженные срезы областей дуги атеросклеротических аорт (верх и центр) и «свободных от бляшек» грудных областей (низ) тех же самых ApoE-/- мышей, получавших «западную диету», окрашивали поликлональными антителами козы против антител мыши к Rae-1 (R&D Systems) или антител к H60 (Santa Cruz Biotechnology). Фотографии в центре представляют собой большее увеличение (400×) зон, заключенных в рамки из верхних панелей (100×). (E) Анализ методом проточной цитометрии экспрессии Rae-1 на клеточной поверхности макрофагов и эндотелиальных клеток, выделенных из атеросклеротических аорт ApoE1^-/- мышей или нормальных аорт мышей дикого типа. Селекцию макрофагов проводили на популяцию CD45⁺CD11b⁺CD16/32⁺, а селекцию эндотелиальных клеток проводили на популяцию CD45^-CD31⁺. Серые зоны соответствуют окрашиванию подобранным по изотипу контрольным антителом. (F) Вестерн-блот анализ на суммарные белки Rae-1 в обработанных in vitro макрофагах дикого типа. (G) Полуколичественный ОТ-ПЦР анализ повышенной регуляции различных лигандов NKG2D в макрофагах дикого типа, культивированных в одной только среде и в присутствии дополнительных oxLDL, природного LDL (nLDL) и LPS (в качестве контроля). (H) Анализ методом проточной цитометрии экспрессии Rae-1 на макрофагах дикого типа, культивированных in vitro в присутствии окисленного LDL (oxLDL) или конечных продуктов усиленного гликозилирования (AGE). Макрофаги выделяли из брюшной полости и культивировали in vitro в течение двух дней в среде, содержащей 5 мкг/мл oxLDL или 200 мкг/мл AGE до проведения анализа методом проточной цитометрии так же, как на панели E, за исключением того, что пунктирные линии соответствовали окраске в присутствии 10-кратного избытка немеченых антител против всех форм Rae-1.

На фиг.4 представлена серия фотографий аорты от ApoE-null мышей, которые демонстрируют подавление образования бляшек анти-NKG2D антителом у ApoE-null мышей с диабетом. (A) Образование бляшек в аорте у репрезентативных ApoE-null мышей с диабетом, получавших анти-NKG2D или контрольное антитело. Проводили перфузию аорты PBS, и изучали под препаровальной лупой на наличие явных непрозрачных бляшек. Обратите внимание на резко уменьшенные размеры бляшек у мышей, получавших анти-NKG2D антитело (области, обведенные кружком). (B) Окрашивание анфас красителем Oil red O аорты на отложение липидного содержимого у ApoE-/- мышей, получавших анти-NKG2D (MI-6) и контрольное антитело (контроль) из одного репрезентативного эксперимента. Аорты открывали, фиксировали в 10%-ном формалине и окрашивали красителем Oil red O. Липидное содержимое окрашивалось в темно-красный цвет. Обратите внимание на меньшее окрашивание Oil red O в областях дуги аорты у мышей, получавших анти-NKG2D антитело.

На фиг.5 представлена серия графиков, демонстрирующих, что воздействие на взаимодействие NKG2D/лиганд предотвращает атеросклероз в различных моделях на мышах. (A) Эффект блокады с помощью анти-NKG2D антитела на развитие атеросклероза у ApoE-/-мышей с индуцированным стрептозотоцином диабетом. Размеры бляшек на аорте у контрольных и получавших анти-NKG2D антитело ApoE-/- мышей с диабетом рассчитывали на основании отношения положительных по окрашиванию Oil red O областей ко всей области дуги. (B и C) Эффект нокаута NKG2D на развитие атеросклероза у KLRK1-/-ApoE-/- мышей с индуцированным стрептозотоцином диабетом (B) или получавших «западную диету» (C) (ген KLRK1 кодирует белок NKG2D). Размеры бляшек рассчитывали так же, как и на панели A. ApoE-/- мышей использовали в качестве контроля.

На фиг.6 представлена серия графиков, демонстрирующих пониженное содержание провоспалительных цитокинов в сыворотках ApoE-null мышей с диабетом, получавших анти-NKG2D антитело. Сыворотки четырех, получавших анти-NKG2D антитело (Ат MI-6), и трех, получавших контрольное антитело (Ат Con), ApoE-null мышей с диабетом, наряду с сыворотками двух, каждый раз подобранных по возрасту, мышей дикого типа B6 (дикий тип), ApoE-/- мышей в возрасте одного месяца (молодые ApoE) или восьми месяцев (старые ApoE) анализировали напрямую с использованием 7-компонентного набора мышиных провоспалительных цитокинов (IL-6, TNF-α, IFN-γ, IL-12p70, IL-10, IL-1β и KC/CXCL1) (Meso Scale Discovery, Gaithersburg, MD). Звездочкой * отмечены статистически значимые различия между величинами, установленными для получавших анти-NKG2D антитело и контрольное антитело ApoE-/- мышей с диабетом.

На фиг.7 представлена серия графиков, демонстрирующих пониженное содержание провоспалительных цитокинов в сыворотках KLRK1-/-ApoE-/- мышей (имеющих дефектный ген NKG2D). Сыворотки получавших «западную диету» (12 мышей/группу) (панель A) или с индуцированным STZ диабетом (4 мыши/группу) (панель B) KLRK1-/-ApoE-/- и ApoE-/- мышей анализировали напрямую с использованием 7-компонентного набора мышиных провоспалительных цитокинов (IL-6, TNF-α, IFN-γ, IL-12p70, IL-10, IL-1β и KC/CXCL1) (Meso Scale Discovery, Gaithersburg, MD), как на фиг.6. Звездочками отмечены статистически значимые различия между величинами, установленными для получавших анти-NKG2D антитело и контрольное антитело ApoE-/- мышей с диабетом (***p<0,01; *p<0,05).

На фиг.8 представлена пара фотографий сывороток и пара графиков, демонстрирующих облегченное метаболическое патологическое состояние у KLRK1-/-ApoE-/- мышей. (A) Более прозрачный внешний вид сывороток у получавших «западную диету» KLRK1-/-ApoE-/- мышей, чем у питающихся аналогично ApoE-/- мышей. (B) Пониженные уровни холестерина и триглицеридов в крови у KLRK1-/-ApoE-/- мышей. Сыворотки на панели A анализировали на содержание общего холестерина и триглицеридов. Звездочками ** отмечены статистически значимые различия между величинами, установленными для KLRK1/ApoE двойных нокаутных и ApoE-нокаутных мышей (**p<0,05). В каждой группе использовали по меньшей мере 5 мышей.

На фиг.9 представлен график, демонстрирующий пониженные активности сывороточной аланинаминотрансферазы (ALT) у нокаутных по NKG2D KLRK1-/-ApoE-/- мышей по сравнению с ApoE-/- мышами. В каждой группе использовали по меньшей мере 5 мышей.

На фиг.10 представлена пара графиков, демонстрирующих, что предотвращение взаимодействия NKG2D/лиганд уменьшает воспаление в печени у получавших «западную диету» ApoE-/- мышей. (A) Сниженная продукция IL-6 в культивируемых ex vivo эксплантатах печени KLRK1-/-ApoE-/- мышей с нокаутом NKG2D.