Новая протеаза грибов и ее применение

Новая протеаза грибов и ее применение

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Область изобретения

Данное изобретение относится к ферменту сериновой протеазе грибов, применяемому в различных ситуациях, в частности, в стиральных и посудомоечных средствах. Изобретение относится к нуклеиновокислотной молекуле, кодирующей указанный фермент, рекомбинантному вектору, клетке-хозяину для продукции указанного фермента, композиции, содержащей указанный фермент, а также к способу изготовления такой композиции. Это изобретение также относится к различным применениям указанного фермента или композиций, содержащих указанный фермент.

Уровень техники

Микробные протеазы являются одними из наиболее важных гидролитических ферментов и находят применение в различных промышленных областях, таких как моющие средства, продукты питания, кожа, фармацевтические средства, диагностические средства, управление отходами и восстановление серебра. Микробные внеклеточные протеазы составляют основную часть, более одной трети, общего объема продаж промышленных ферментов по всему миру (Cherry and Fidantsef, 2003). Приблизительно 90% коммерческих протеаз являются ферментами моющих средств (Gupta et al., 2002). Большинство коммерческих протеаз, в основном нейтральные и щелочные, производятся организмами, принадлежащими роду Bacillus.

Сериновые протеазы семейства субтилизинов, или субтилизины, продуцируемые видами Bacillus, образуют крупнейшую подгруппу промышленных протеаз. Эти ферменты являются коммерчески важными в качестве компонента, разрушающего белки, или добавки моющих средств. Коммерческие моющие препараты, используемые в настоящее время, содержат природные щелочные сериновые протеазы, полученные из видов Bacillus, или являются рекомбинантными протеазными препаратами (Maurer, 2004). Варианты природных ферментов с улучшенной каталитической эффективностью и/или лучшей устойчивостью к температуре, окислителям и изменениям условий мытья были разработаны путем сайт-направленного и/или случайного мутагенеза. Примерами коммерческих протеаз являются такие, как субтилизин Carlsberg (Alcalase®, Novozymes, Дания), субтилизин 309 (Savinase®, Novozymes, Дания), субтилизин 147 (Esperase®, Novozymes, Дания), Kannase® (Novozymes, Дания), Purafect® (Genencor Inc., США), Purafect® Ox, Properase® (Genencor Inc., США) и BLAP серий S и X (Henkel, Германия).

Несколько щелочных сериновых протеаз (ЕС 3.4.21) и генов, кодирующих эти ферменты, также были выделены из эукариотических организмов, в том числе дрожжей и мицелиальных грибов. Патенты US №3652399 и ЕР 519229 (Takeda Chemical Industries, Ltd, JP) раскрывают щелочную протеазу из рода Fusarium (бесполое состояние, телеоморфа) или Gibberella (половое состояние, анаморфа), в частности из Fusarium sp.S-19-5 (ATCC 20192, IFO 8884), F. oxysporum f. sp.lini (IFO 5880) или G. saubinetti (ATCC 20193, IF06608), используемую для составления моющих средств и других очищающих композиций. WO 88/03946 и WO 89/04361 (Novo Industri A/S, Дания) раскрывают ферментативную моющую добавку и моющую композицию, включающую протеазу и липазу, где протеаза грибов получена из Fusarium, в частности, F. oxysporum или F. so/an/. Моющая добавка, включающая протеазу со специфичностью к пептидным связям, граничащим только с одной или двумя конкретными аминокислотами, раскрыта в WO 89/06270. WO 1994025583 (NovoNordisk A/S, Дания) раскрывает активный трипсиноподобный протеазный фермент, получаемый из видов Fusarium, в частности из штамма F. oxysporum (DSM 2672), а также последовательность ДНК, кодирующую его. Аминокислотная последовательность новой протеазы, получаемой из Fusarium sp.BLB (FERM ВР-10493), раскрыта в WO 2006101140 (SODX Co. Ltd, Накамура). Кроме того, сообщалось о щелочных протеазах из видов грибов, таких как Tritirachium и Conidiobolus (см. обзор Anwar and Saleemuddin, 1998).

Применение сериновых протеаз грибов в различных случаях также известно из нескольких патентных заявок. Например, комбинация целлюлазы и протеазы, в частности трипсиноподобной протеазы из Fusarium sp. DSM 2672, в качестве моющей добавки или композиции раскрыта в WO 1992018599 (NovoNordisk A/S). Такие моющие композиции также могут содержать обратимые ингибиторы протеаз для стабилизации фермента(ов), как описано в WO 1992003529 и WO 1992005239 (NovoNordisk A/S). Процесс удаления или отбеливания загрязнения и пятен с целлюлозных тканей с помощью ферментного гибрида, включающего каталитически активную аминокислотную последовательность такой протеазы, связанную с аминокислотной последовательностью, содержащей целлюлозо-связывающий домен, раскрыт в WO 1997028243 (NovoNordisk A/S). WO 1997002753 (NovoNordisk A/S) раскрывает способ мягкой очистки загрязненного технологического оборудования с помощью липазы и протеазы, которая предпочтительно является сериновой протеазой, получаемой из Fusarium. Применение F. equiseti и других грибов в восстановлении органических веществ в сточных водах раскрыто в патентной заявке ЕР 1464626 (Biovitis S.A., Франция).

Социально-экономические задачи и правительственные постановления вынуждают индустрию моющих средств принимать во внимание многие экологические аспекты, включая не только применение более мягких химических веществ, которые могут быть использованы в небольших количествах и, следовательно, оставляют меньше следов, загрязняющих окружающую среду, но также необходимость энергосбережения. Ферменты моющих средств, в частности протеазы, являются важным компонентом в композициях моющих средств. Необходимость экономии энергии за счет уменьшения температур стирки и более широкое применение синтетических волокон, которые не переносят высокие температуры и современный образ жизни, изменили привычки клиентов в сторону низких температур стирки и создали спрос на новые ферменты, которые эффективны при низких температурах.

Несмотря на то, что были опубликованы многочисленные патентные публикации, обзоры и статьи, например ЕР 0290567 и ЕР 0290569 (Novo Nordisk A/S, Дания), в которых раскрыты сериновые протеазы из различных микроорганизмов, например низкотемпературные щелочные протеазы из актиномицетов (Nocardiopsis dassonvillei) и грибов (Paecilomyces marquandii), до сих пор существует большая потребность в альтернативных сериновых протеазах, которые являются подходящими и эффективными в изменении, разрушении и удалении белковых материалов, в частности в диапазоне низких или умеренных температур, и которые стабильны в присутствии моющих средств с сильно изменяющимися свойствами.

Промышленность моющих средств делает большие успехи в адаптации своих новых продуктов к привычкам и потребностям клиентов, свойствам новых текстильных изделий и новых стиральных машин. Очевидно, что при разработке новых моющих средств, в частности композиций для стирки и мытья посуды, должен быть удовлетворен широкий спектр различных и быстро меняющихся потребностей. Для того чтобы выполнить все изменяющиеся требования промышленности моющих средств и правительственные постановления, новые ингредиенты сериновые протеазы для моющих композиций не только должны быть способны выполнять свои задачи в широких диапазонах рН и температур и оставаться стабильными в различных условиях, в том числе при механическом и химическом вмешательствах в сочетании с различными моющими средствами, но также желательно, чтобы сериновая протеаза могла быть получена в больших количествах, которые затем могут быть доходно обработаны путем простого отделения от ферментативного бульона и мицелия.

Сущность изобретения

Целью данного изобретения является создание сериновой протеазы грибного происхождения, которая демонстрирует широкую субстратную специфичность, является активной в широком диапазоне рН и имеет широкий температурный оптимум, т.е. функционирует как при низких, так и при умеренных температурах. Сериновые протеазы для стиральных и посудомоечных средств должны быть стабильны также в присутствии моющих средств или должны быть совместимыми с моющими средствами. В частности, объектом изобретения является создание сериновой протеазы, которая способна удалять белковый материал, в том числе загрязнители, при стирке белья и мытье посуды при более низких температурах, чем имеющиеся в настоящее время коммерческие ферментные препараты, тем самым экономя энергию. Сериновая протеаза грибов может быть произведена в грибах-хозяевах с высокой продуктивностью, и затем легко может быть выполнена последующая обработка, например путем отделения ферментативного бульона и мицелия.

Данное изобретение относится к ферменту сериновой протеазе грибов, который обладает активностью сериновой протеазы и включает аминокислотную последовательность зрелого фермента Fe_RF6318, определенного в SEQ ID №15, или аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 86% идентичность с аминокислотной последовательностью зрелого фермента Fe_RF6318, определенного в SEQ ID №15.

Фермент изобретения можно получить из Fusarium equiseti, более предпочтительно из сданного на хранение штамма CBS 119568.

Фермент имеет молекулярную массу от 25 до 35 кДа. Фермент имеет оптимальную температуру в диапазоне от 30°С до 70°С при рН 9. Указанный фермент имеет оптимум рН в диапазоне рН от 6 до 11 при 50°С. Оптимумы температуры и рН определяли в 15-минутной реакции с помощью казеина в качестве субстрата. Сериновая протеаза изобретения способна разрушать или удалять белковые загрязнители в присутствии моющего средства в пределах от 10 до 60°C.

Фермент сериновая протеаза грибов изобретения кодируется выделенной полинуклеотидной последовательностью, которая гибридизуется в жестких условиях с полинуклеотидной последовательностью, включенной в плазмиду pALK2521, содержащую нуклеотидную последовательность SEQ ID №9, сохраненную в E. coli RF7664 под регистрационным номером DSM 22171.

Указанный фермент кодируется выделенной полинуклеотидной последовательностью, которая кодирует полипептид, включающий аминокислотную последовательность зрелого фермента Fe_RF6318, определенную в SEQ ID №15, или аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 86% идентичную аминокислотной последовательности зрелого Fe_RF6318, определенной в SEQ ID №15. Предпочтительно указанный фермент кодируется выделенной нуклеиновокислотной молекулой, содержащей нуклеотидную последовательность SEQ ID №14.

Фермент сериновая протеаза грибов изобретения полной длины кодируется полинуклеотидной последовательностью, включенной в pALK2529, сохраненный в E. coli RF7800 под регистрационным номером DSM 22172.

Фермент сериновая протеаза грибов производится из рекомбинантного экспрессионного вектора, содержащего нуклеиновокислотную молекулу, кодирующую сериновую протеазу грибов изобретения, функционально связанную с регуляторными последовательностями, способными направлять экспрессию гена, кодирующего сериновую протеазу, в подходящем хозяине. Подходящие хозяева включают гетерологичных хозяев, предпочтительно микробных хозяев рода Trichoderma, Aspergillus, Fusarium, Humicola, Chrysosporium, Neurospora, Rhizopus, Penicillium и Mortiriella.

Предпочтительно указанный фермент вырабатывается в Trichoderma или Aspergillus, наиболее предпочтительно в Т. reesei.

Данное изобретение также относится к выделенной нуклеиновокислотной молекуле, кодирующей фермент сериновую протеазу грибов, выбранной из группы, включающей:

(а) нуклеиновокислотную молекулу, кодирующую полипептид, имеющий активность сериновой протеазы и включающий аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID №15;

(б) нуклеиновокислотную молекулу, кодирующую полипептид, имеющий активность сериновой протеазы и по меньшей мере на 86% идентичный аминокислотной последовательности SEQ ID №15;

(в) нуклеиновокислотную молекулу, содержащую кодирующую последовательность нуклеотидной последовательности, показанной в SEQ ID №10;

(г) нуклеиновокислотную молекулу, содержащую кодирующую последовательность полинуклеотидной последовательности, содержащейся в DSM 22171 или DSM 22172;

(д) нуклеиновокислотную молекулу, кодирующая последовательность которой отличается от кодирующей последовательности нуклеиновокислотной молекулы любого из пп. от (в) до (г) из-за вырожденности генетического кода; а также

(е) нуклеиновокислотную молекулу, гибридизующуюся в жестких условиях с нуклеиновокислотной молекулой, содержащейся в DSM 22171, и кодирующую полипептид, имеющий активность сериновой протеазы и аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 86% идентичную аминокислотной последовательности, показанной в SEQ ID №15.

Изобретение также относится к рекомбинантному экспрессионному вектору, включающему нуклеотидную последовательность изобретения, функционально связанную с регуляторными последовательностями, способными направлять экспрессию указанного гена, кодирующего сериновую протеазу, в подходящем хозяине. Подходящие хозяева включают гетерологичных хозяев, предпочтительно микробных хозяев рода Trichoderma, Aspergillus, Fusarium, Humicola, Chrysosporium, Neurospora, Rhizopus, Penicillium и Mortiriella. Предпочтительно указанный фермент вырабатывается в Trichoderma или Aspergillus, наиболее предпочтительно в Т. reesei.

Изобретение также относится к клетке-хозяину, содержащей рекомбинантный экспрессионный вектор, описанный выше. Предпочтительно клеткой-хозяином является микробный хозяин, такой как нитчатый гриб. Предпочтительные хозяева относятся к роду Trichoderma, Aspergillus, Fusarium, Humicola, Chrysosporium, Neurospora, Rhizopus, Penicillium и Mortiriella. Более предпочтительно хозяином является Trichoderma или Aspergillus, наиболее предпочтительно нитчатый гриб Т. reesei.

Данное изобретение относится к способу получения полипептида, имеющего активность сериновой протеазы, при этом указанный способ включает этап культивирования клетки-хозяина изобретения и этап восстановления полипептида. Также в рамки изобретения включен полипептид, имеющий активность сериновой протеазы, кодируемый нуклеиновой кислотой изобретения и получаемый способом, описанным выше.

Изобретение относится к способу получения ферментного препарата, включающему этапы культивирования клетки-хозяина изобретения и либо восстановления полипептида из клетки, либо выделения клеток из культуральной среды и получения супернатанта. В рамки изобретения также включен ферментный препарат, получаемый способом, описанным выше.

Изобретение относится к ферментному препарату, в состав которого входит фермент сериновая протеаза изобретения.

Ферментный препарат изобретения также может содержать другие ферменты, выбранные из группы протеазы, амилазы, целлюлазы, липазы, ксиланазы, маннаназы, кутиназы, пектиназы или оксидазы с посредником или без него, а также подходящие добавки, выбранные из группы стабилизаторов, буферов, поверхностно-активных веществ, отбеливающих агентов, посредников, антикоррозионных агентов, структурообразователей, средств, препятствующих распространению грязи по ткани после стирки, оптических отбеливателей, красителей, пигментов, каустика, абразивов, консервантов и др.

Использованная культуральная среда от продуцирующего хозяина может быть использована как таковая, либо клетки-хозяева могут быть удалены и/или она может быть сконцентрирована, профильтрована или фракционирована. Она может также быть высушена. Ферментный препарат изобретения может быть в виде жидкости, порошка или гранул.

Также в рамки изобретения входит применение фермента сериновой протеазы или ферментного препарата изобретения для моющих средств, для обработки волокон, для обработки шерсти, для обработки волос, для обработки кожи, для обработки пищи или корма или для любых применений, включающих модификацию, разрушение или удаление белкового материала. В частности, фермент или ферментный препарат используется в качестве моющей добавки в производстве жидких моющих средств и стиральных порошков.

Краткое описание графических материалов

На фиг.1 показана нуклеотидная последовательность гена Fe prtS8A от Fusarium equiseti RF6318 и выведенная аминокислотная последовательность. Предполагаемый сигнальный пептид, проанализированный с помощью программы SignalP V3.0, отмечен строчными буквами и подчеркнут. Пропоследовательность и выведенные аминокислоты пропоследовательности отмечены строчными буквами. Зрелая нуклеотидная и пептидная последовательности отмечены заглавными буквами (N-концевая последовательность, определенная из очищенного белка Fe_RF6318 дикого типа). Расположение предполагаемой последовательности интрона отмечено нижним регистром, курсивом и пунктирной линией под нуклеотидной последовательностью. Стоп-кодон показан звездочкой под последовательностью. N-концевая последовательность и пептидные последовательности, полученные из белка Fe_RF6318 дикого типа, выделены серым фоном.

На фиг.1А показана нуклеотидная последовательность гена Fe prt8A от старт-кодона ATG до кодона ССТ (нуклеотиды с 898 по 900), область последовательности, кодирующая аминокислотную последовательность с Met1 по Val278 белка Fe_RF6318.

На фиг.1В показана нуклеотидная последовательность гена Fe prt8A от кодона СТС (нуклеотиды с 901 по 903) до стоп-кодона ТАА, область последовательности, кодирующая аминокислотную последовательность от Leu279 до А1а412 белка Fe_RF6318.

На фиг.2 схематически показана кассета, используемая для экспрессии гена Fe prtSSA в Trichoderma reesei.

На фиг.3 показан частично очищенный рекомбинантный белок Fe_RF6318, проанализированный в 12% геле SDS PAGE. Линия 1. Образец частично очищенного Fe_RF6318, Линия 2. Маркер молекулярного веса (Bench Mark Protein Ladder, Invitrogen).

На фиг.4А описана температурная характеристика рекомбинантного белка Fe_RF6318, анализированного при рН 9 в 15-минутной реакции с помощью казеина в качестве субстрата. Данные точки являются средними значениями трех отдельных измерений.

На фиг.4В описано влияние рН на активность рекомбинантного белка Fe_RF6318. Используемым буфером был 40 мМ буфер Бриттон-Робинсона, казеин был использован в качестве субстрата, время реакции составляло 15 минут, а температура реакции составляла 50°С. Данные точки являются средними значениями трех отдельных измерений.

На фиг.5 описана эффективность рекомбинантного белка Fe_RF6318 на загрязнителе кровь/молоко/чернила (арт.116, ЕМРА) при 30°С, рН 9, 60 мин. Для сравнения использовали коммерческие препараты Savinase Ultra® 16L (Novozymes A/S, Дания) и Purafect® 4000L (Genencor Inc., США). ΔL* (дельта L*)=насыщенность белого L* обработанной ферментом ткани - насыщенность белого L* ткани, обработанной только буфером (ферментный контроль).

На фиг.6 описана эффективность рекомбинантного белка Fe_RF6318 на загрязнителе кровь/молоко/чернила (арт.116, ЕМРА) при 50°С, рН 9, 60 мин. Для сравнения использовали коммерческие препараты Savinase Ultra® 16L и Purafect® 4000L. ΔL* (дельта L*)=насыщенность белого L* обработанной ферментом ткани - насыщенность белого L* ткани, обработанной только буфером (ферментный контроль).

На фиг.7А описана эффективность рекомбинантного белка Fe_RF6318 на загрязнителе кровь/молоко/чернила (арт.117, ЕМРА) при 40°С, рН примерно 10, 60 мин, в присутствии стирального порошка (арт.601, ЕМРА). Для сравнения использовали коммерческий препарат Purafect® 4000L. ΔL* (дельта L*)=насыщенность белого L* обработанной ферментом ткани - насыщенность белого L* ткани, обработанной только буфером (ферментный контроль).

На фиг.7В описана эффективность рекомбинантного белка Fe_RF6318 на загрязнителе кровь/молоко/чернила (арт.117, ЕМРА) при 40°С, рН примерно 10, 60 мин, в присутствии стирального порошка и отбеливающих агентов (арт.604 и 606, ЕМРА). Для сравнения использовали коммерческий препарат Purafect® 4000L. ΔL* (дельта L*) = насыщенность белого L* обработанной ферментом ткани - насыщенность белого L* ткани, обработанной только буфером (ферментный контроль).

На фиг.8А описана эффективность рекомбинантного белка Fe_RF6318 на загрязнителе кровь/молоко/чернила (арт.117, ЕМРА) при 50°С, рН примерно 10, 60 мин, в присутствии стирального порошка (арт.601, ЕМРА). Для сравнения использовали коммерческий препарат Purafect® 4000L. ΔL* (дельта L*) = насыщенность белого L* обработанной ферментом ткани - насыщенность белого L* ткани, обработанной только буфером (ферментный контроль).

На фиг.8 В описана эффективность рекомбинантного белка Fe_RF6318 на загрязнителе кровь/молоко/чернила (арт.117, ЕМРА) при 50°С, рН примерно 10, 60 мин, в присутствии стирального порошка и отбеливающих агентов (арт.604 и 606, ЕМРА). Для сравнения использовали коммерческий препарат Purafect® 4000L. ΔL* (ltkmnf L*)=насыщенность белого L* обработанной ферментом ткани -насыщенность белого L* ткани, обработанной только буфером (ферментный контроль).

На фиг.9 показана эффективность рекомбинантного белка Fe_RF6318 на загрязнителе кровь/молоко/чернила (арт.117, ЕМРА) и жидкого моющего средства Ariel Sensitive при 40°С, рН примерно рН 7,9, 60 мин. Для сравнения использовали коммерческие препараты Savinase® Ultra 16L и Purafect® 4000L. На оси абсцисс показана дозировка фермента (единицы активности/мл), на оси ординат ΔL* (дельта L*)=насыщенность белого L* обработанной ферментом ткани - насыщенность белого L* ткани, обработанной только буфером (ферментный контроль).

На фиг.10 показана эффективность рекомбинантного белка Fe_RF6318 на загрязнителе кровь/молоко/чернила (арт.117, ЕМРА) с различными концентрациями жидкого моющего средства для цветных тканей при 30°С. Для сравнения использовали коммерческие препараты Purafect® 4000L и Savinase® Ultra 16L. ΔL* (дельта L*) = насыщенность белого L* обработанной ферментом ткани - насыщенность белого L* ткани, обработанной только буфером (ферментный контроль).

На фиг.10А показана эффективность с концентрацией моющего средства 5 г/л и рН 7,5.

На фиг.10 В показана эффективность с концентрацией моющего средства 5 г/л (доза фермента рассчитывается как для белка).

На фиг.10С показана эффективность с концентрацией моющего средства 3,3 г/л и рН 7,4.

На фиг.10D показана эффективность с концентрацией моющего средства 1 г/л и рН 7,3.

На фиг.11 показана эффективность рекомбинантного белка Fe_RF6318 на загрязнителе кровь/молоко/чернила (арт.117, ЕМРА) с различными концентрациями Ariel Sensitive (ферментный контроль) на тканях при 30°С. Для сравнения использовали коммерческие препараты Purafect® 4000L и Savinase® Ultra 16L. ΔL* (дельта L*) = насыщенность белого L* обработанной ферментом ткани - насыщенность белого L* ткани, обработанной только буфером (ферментный контроль).

На фиг.11А показана эффективность с концентрацией моющего средства 5 г/л и рН 8.

На фиг.11В показана эффективность с концентрацией моющего средства 5 г/л (доза фермента рассчитывается как для белка).

На фиг.11С показана эффективность с концентрацией моющего средства 3,3 г/л и рН 7,9.

На фиг.11D показана эффективность с концентрацией моющего средства 1 г/л и рН 7,6.

На фиг.12 показана эффективность рекомбинантного белка Fe_RF6318 на различных загрязнителях в анализах Launder Ometer с жидким моющим средством Ariel Sensitive (без ферментов) при 30°С. Для сравнения использовали коммерческий препарат Savinase® Ultra 16L. ΔL* (дельта L*) = насыщенность белого L* обработанной ферментом ткани - насыщенность белого L* ткани, обработанной только буфером (ферментный контроль).

На фиг.12А показана эффективность на крови/молоке/чернилах/ПЭ-хлопке (арт.117, ЕМРА).

На фиг.12В показана эффективность на крови/молоке/чернилах/хлопке (арт.116, ЕМРА).

На фиг.12С показана эффективность на траве (арт.164, ЕМРА).

На фиг.13 показана эффективность рекомбинантного белка Fe_RF6318 на различных загрязнителях в анализах Launder Ometer с жидким моющим средством для цветных тканей при 30°С. Для сравнения использовали коммерческие препараты Savinase® Ultra 16L и Purafect® 4000L. ΔL* (дельта L*) = насыщенность белого L* обработанной ферментом ткани - насыщенность белого L* ткани, обработанной только буфером (ферментный контроль).

На фиг.13А показана эффективность на крови/молоке/чернилах/ПЭ-хлопке (арт.117, ЕМРА).

На фиг.13В показана эффективность на крови/молоке/чернилах/хлопке (арт.116, ЕМРА).

На фиг.13С показана эффективность на траве (арт.164, ЕМРА).

На фиг.13D показана эффективность на какао (арт.112, ЕМРА).

На фиг.14 описана общая эффективность по удалению загрязнителя (дельта % SR) ферментного препарата Fe_RF6318 на восьми различных чувствительных к протеазам загрязнителях (таб.5) в полномасштабных испытаниях моющих средств. Для сравнения использовали коммерческие препараты Savinase® Ultra 16L и Purafect® 4000L.

На фиг.14А описана общая эффективность по удалению загрязнителя с дозировкой протеазных препаратов в зависимости от активности.

На фиг.14В описана общая эффективность по удалению загрязнителя с дозировкой протеазных препаратов в зависимости от количества белка.

На фиг.15 описан эффект удаления загрязнителя жидким моющим средством для цветных тканей в полномасштабном испытании при 30°С.

На фиг.15А описано удаление загрязнителя кровь/молоко/чернила/хлопок (C-05-014/CFT).

На фиг.15В описано удаление загрязнителя кровь/молоко/чернила/ПЭ-хлопок (C-05-014/CFT).

На фиг.15С описано удаление загрязнителя шоколадное молоко/краска/хлопок (C-03-030/CFT).

На фиг.15D описано удаление загрязнителя арахисовое масло/молоко/хлопок (С-05-014/CFT).

На фиг.15Е описано удаление загрязнителя яичный желток/краска/хлопок (CS-38-010/CFT).

На фиг.16 описана эффективность рекомбинантного белка Fe_RF6318 на загрязнителе кровь/молоко/чернила (арт.117, ЕМРА) при температурах от 10°С до 60°С, рН 9, 60 мин. Для сравнения использовали коммерческие препараты Savinase Ultra® 16L (Novozymes A/S, Дания), Purafect® 4000L (Genencor Inc., США) и Properase® 4000E (Genencor, США). ΔL* (дельта L*) = насыщенность белого L* обработанной ферментом ткани - насыщенность белого L* ткани, обработанной только буфером (ферментный контроль).

На фиг.16А показана эффективность рекомбинантного белка Fe_RF6318 и коммерческих протеазных препаратов при 10°С.

На фиг.16В показана эффективность рекомбинантного белка Fe_RF6318 и коммерческих протеазных препаратов при 20°С.

На фиг.16С показана эффективность рекомбинантного белка Fe_RF6318 и коммерческих протеазных препаратов при 30°С.

На фиг.16D показана эффективность рекомбинантного белка Fe_RF6318 и коммерческих протеазных препаратов при 40°С.

На фиг.16Е показана эффективность рекомбинантного белка Fe_RF6318 и коммерческих протеазных препаратов при 50°С.

На фиг.16F показана эффективность рекомбинантного белка Fe_RF6318 и коммерческих протеазных препаратов при 60°С.

На фиг.17 показана эффективность рекомбинантного белка Fe_RF6318 на загрязнителе кровь/молоко/чернила (арт.117, ЕМРА) и с жидким моющим средством в концентрации 3,3 г/л при 10°С и 20°С. Для сравнения использовали коммерческие препараты Savinase® Ultra 16L, Purafect® 4000L и Properase® 4000 E. ΔL* (дельта L*) = насыщенность белого L* обработанной ферментом ткани - насыщенность белого L* ткани, обработанной только буфером (ферментный контроль).

На фиг.17А показана эффективность при 10°С.

На фиг.17В показана эффективность при 20°С.

СПИСОК ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

SEQ ID №1 Последовательность амино-концевого пептида №3792 из протеазы RF6318 Fusarium equiseti.

SEQ ID №2 Последовательность триптического пептида 1246.673 из протеазы RF6318 Fusarium equiseti.

SEQ ID №3 Последовательность триптического пептида 3341.633 из протеазы RF6318 Fusarium equiseti.

SEQ ID №4 Последовательность триптического пептида 1503.799 из протеазы RF6318 Fusarium equiseti.

SEQ ID №5 Последовательность олигонуклеотидного праймера PR087, полученного из амино-концевого пептида SEQ ID №1.

SEQ ID №6 Последовательность олигонуклеотидного праймера PR088, полученного из амино-концевого пептида SEQ ID №1.

SEQ ID №7 Последовательность олигонуклеотидного праймера PR089, полученного из пептида SEQ ID №4.

SEQ ID №8 Последовательность олигонуклеотидного праймера PR090, полученного из пептида SEQ ID №4.

SEQ ID №9 Последовательность ПЦР-фрагмента, полученного с помощью праймеров PR088 (SEQ ID №6) и PR089 (SEQ ID №7) и геномной ДНК RF6318 Fusarium equiseti в качестве субстрата.

SEQ ID №10 Нуклеотидная последовательность гена протеазы RF6318 Fusarium equiseti (Fe prtS8A).

SEQ ID №11 Выведенная аминокислотная последовательность протеазы RF6318 Fusarium equiseti (Fe_RF6318) полной длины, включающая аминокислоты с Met1 до Ala412.

SEQ ID №12 Нуклеотидная последовательность, кодирующая аминокислотную последовательность проферментной формы протеазы RF6318 Fusarium equiseti.

SEQ ID №13 Аминокислотная последовательность проферментной формы протеазы RF6318 Fusarium equiseti, включающая аминокислоты сА1а21 до Ala412 протеазы полной длины.

SEQ ID №14 Нуклеотидная последовательность, кодирующая аминокислотную последовательность зрелой формы протеазы RF6318 Fusarium equiseti.

SEQ ID №15 Аминокислотная последовательность зрелой формы протеазы RF6318 Fusarium equiseti, включающая аминокислоты сА1а124 до Ala412 фермента полной длины.

ДЕПОЗИТЫ

Fusarium equiseti RF6318 сдали на хранение в Centraalbureau Voor Schimmelcultures на Uppsalalaan 8, 3508 AD, Утрехт, Нидерланды, 7 апреля 2006 года и присвоили регистрационный номер CBS 119568.

Штамм E. coli RF7664, содержащий плазмиду pALK2521, сдали на хранение в Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zeilkulturen GmbH (DSMZ), Inhoffenstrasse 7b, D-38124 Брауншвейг, Германия, 14 января 2009 года и присвоили регистрационный номер DSM 22171.

Штамм Е. coli RF7800, содержащий плазмиду pALK2529, сдали на хранение в Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zeilkulturen GmbH (DSMZ), Inhoffenstrasse 7b, D-38124 Брауншвейг, Германия, 14 января 2009 года и присвоили регистрационный номер DSM 22172.

Подробное описание изобретения

Данное изобретение предлагает сериновую протеазу грибного происхождения, которая демонстрирует широкую субстратную специфичность, стабильность при широких диапазонах рН и имеет широкий температурный оптимум, т.е. хорошую эффективность как при низких, так и при умеренных температурах. Фермент идеально подходит для применения в моющих средствах, выдерживая окисление и хелатообразование и будучи эффективным при низких уровнях фермента в моющих растворах. В частности, сериновая протеаза активна при температурах до 10°С, предпочтительный диапазон составляет от 10°С до 60°С. Таким образом, данное изобретение предлагает альтернативную сериновую протеазу для применения в производстве моющих средств и в других применениях. Сериновая протеаза грибов может быть получена в высокопродуктивных грибах-хозяевах, и последующая обработка, например, путем отделения ферментативного бульона и мицелия, может быть легко выполнена.

Под «сериновой протеазой» или «сериновой эндопептидазой» или «сериновой эндопротеиназой» в связи с этим изобретением понимается фермент, классифицируемый как ЕС 3.4.21 по Номенклатуре Международного союза биохимии и молекулярной биологии. Сериновые протеазы имеются как в одноклеточных, так и в сложных организмах. На основании их структурного сходства сериновые протеазы были сгруппированы по меньшей мере в шесть родов (SA, SB, SC, SE, SF и SG; S обозначает сериновую протеазу), которые затем были подразделены на семейства с аналогичными аминокислотными последовательностями и трехмерными структурами (см., например, Интернет-страницу сериновых протеаз http://www.biochem.wustl.edu/~protease/, Отделение биохимии и молекулярной биофизики Вашингтонского Университета Медицины в Сент-Луисе, штат Миссури, США). Эти ферменты, гидролизующие или разрушающие белки, характеризуются наличием нуклеофильной сериновой группы в активном центре, а протеазы рода SA и рода SB также отличаются наличием важных остатков аспартата и гистидина, которые наряду с серином формируют каталитическую триаду.

Основные рода включают «химотрипсин-подобные» сериновые протеазы, в том числе химотрипсин, трипсин и эластазу (род SA), и «субтилизин-подобные» сериновые протеазы (род SB). Ферменты нацелены на различные области полипептидной цепи на основании боковых цепей аминокислотных остатков, примыкающих к участку расщепления. Сериновая протеаза данного изобретения относится к роду SB.

Охарактеризованные «субтилизин-подобные сериновые протеазы», или «субтилазы», как правило, имеют бактериальную природу. Этот класс протеаз, представленный различными Bacillus, такими как В. amyloliquifaciens, В. licheniformis и Б. subtilis (Rao et al., 1998), является специфическим для ароматических или гидрофобных остатков, таких как тирозин, фенилаланин и лейцин.

Термин «сериновая протеазная активность», используемый в изобретении, предназначен для обозначения гидролитической активности по отношению к белок-содержащим субстратам, например, казеину, гемоглобину, кератину и БСА. Способы анализа протеолитической активности хорошо известны в литературе и приведены, например, в Gupta et al. (2002).

Протеазы можно классифицировать с помощью группоспецифических ингибиторов. Разнородная группа «ингибиторов сериновых протеаз» включает синтетические химические ингибиторы и природные белковые ингибиторы. Одна группа природных ингибиторов представляет собой серпины (сокращенно от ингибиторов сериновых протеаз), такие как антитромбин и альфа-1-антитрипсин. Искусственные синтетические ингибиторы включают 3,4-дихлороизокумарин (3,4-DCI), диизопропилфторфосфат (DFP), фенилметилсульфонилфторид (PMSF) и тозил-L-лизин-хлорметилкетон (TLCK). Некоторые из сериновых протеаз ингибируются тиоловыми реагентами, такими как п-хлормеркурибензоат (РСМВ), из-за присутствия цистеинового остатка вблизи активного центра. Таким образом, активность сериновой протеазы может быть определена в анализе, основанном на расщеплении специфического субстрата, или в анализе с использованием какого-либо белок-содержащего субстрата с или без специфического ингибитора сериновых протеаз в соответствующих условиях.

Сериновые протеазы, как правило, активны в нейтральной или щелочной рН с оптимумом рН между 7 и 11 и имеют широкую субстратную специфичность. Под «щелочными сериновыми протеазами» понимаются ферменты, активные и стабильные при рН от 9 до 11 или даже при рН от 10 до 12,5 (Shimogaki et al., 1991) и с изоэлектрической точкой примерно рН 9. Они представляют наибольшую подгруппу коммерческих сериновых протеаз. Молекулярные массы щелочных сериновых протеаз находятся в диапазоне между 15 и 35 кДа. Температурные оптимумы природных сериновых протеаз составляют примерно 60°С (Rao et al., 1998).

Штаммы микроорганизмов, способные проявлять протеазную активность, могут быть проверены, и активность может быть определена на различных субстратах. Выбранные штаммы можно культивировать на подходящей среде. После того, как было получено достаточное количество интересующей сериновой протеазы, фермент может быть выделен или очищен, и его свойства могут быть более тщательно охарактеризованы. Альтернативно, гены, кодирующие сериновые протеазы в различных организмах, могут быть выделены, и аминокислотную последовательность, кодируемую генами, можно сравнить с аминокислотными последовательностями выделенной сериновой протеазы и охарактеризовать в Примерах данного документа.

Полученные протеазные ферменты, в частности, сериновые протеазы, могут быть очищены с помощью традиционных способов химии ферментов, таких как приготовление солей, ультрафильтрация, ионообменная хроматография, аффинная хроматография, гель-фильтрация и хроматография гидрофобных взаимодействий. Очистку можно контролировать с помощью определения белка, анализов активности ферментов и электрофореза в SDS-полиакриламидном геле. Может быть определена ферментативная активность и стабильность очищенного фермента при различных значениях температуры и рН, а также молекулярная масса и изоэлектрическая точка.

Очистка предпочтительной сериновой протеазы данного изобретения была продемонстрирована в примере 16. Профильтрованный культуральный супернатант проводили через колонку Q Sepharose FF. Фракцию, прошедшую через колонку, проводили через фенильную колонку Sepharose HP, и белки элюировали с линейным уменьшением градиента соли. Фракции, демонстрирующие протеазную активность, объединяли, концентрировали и проводили через колонку Superdex 75 10/300 GL. После анализа активности проводили очистку на казеине, меченном резоруфином, как описано в примере 16. Естественно, можно выделить фермент данного изобретения с помощью других известных способов очистки вместо или в дополнение к способам, описанным в данном документе. Рекомбинантную сериновую протеазу очищали, как описано в примере 5, и использовали для характеризации рН и температурного профилей.

Молекулярную массу очищенной сериновой протеазы можно определить с помощью масс-спектрометрии или SDS-PAGE в соответствии с Laemmli (1970). Молекулярную массу также можно предсказать по аминокислотной последовательности фермента. Зрелая сериновая протеаза или зрелый фермент сериновая протеаза, как правило, имеет молекулярную массу от 20 до 35 кДа, как правило, примерно от 25 до 30 кДа (Rao et al., 1998).

Сериновые протеазы синтезируются в виде неактивных «зимогенных предшественников», или «зимогенов», в форме препроферментов, которые активируются путем удаления сигнальной последовательности (секреторного сигнального пептида, или препептида) и пропоследовательности (пропептида) для получения активной зрелой формы фермента (Chen и Inouye, 2008). Этот процесс активации включает действие протеаз и может возникнуть в результате ограниченного саморасщепления или аутокаталитического процессинга сериновой протеазы. Проп