Векторная система на основе aslv

Векторная система на основе aslv

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Настоящее изобретение относится к вирусному самоинактивирующемуся (SIN) вектору на основе вируса саркомы и лейкоза птиц (ASLV), вирусным частицам, содержащим вектор, предлагаемый в изобретении, расщепляющей-пакующей системе, которая содержит или состоит из SIN-вектора, первой хелперной плазмиды, которая служит для экспрессии слитого вирусного белка gag-pol, и второй хелперной плазмиды, которая служит для экспрессии оболочечного белка (env) ретровируса, а также к способу получения вирусной частицы с помощью расщепляющей-пакующей системы, прежде всего путем экспрессии в культивируемых человеческих клетках. Кроме того, изобретение относится к вирусной частице, предназначенной для применения в качестве лекарственного средства, прежде всего для переноса трансгена в клетки, а также к применению вирусной частицы для получения лекарственного средства. Первая и вторая хелперные плазмиды, например, входящие в пакующую клеточную линию или применяемые для ее кратковременной трансфекции, служат для создания нереплицирующихся (RCR-некомпетентных) вирусных частиц, которые содержат РНК, имеющую предлагаемый в изобретении SIN-LTR (длинный концевой повтор) на 3'-конце, где РНК может иметь терапевтически эффективный сегмент, который, например, представляет собой трансген. Для этого SIN 3'-LTR характерно наличие обширной делеции в U3-области, которая в процессе обратной транскрипции копируется в 5' LTR.

Для экспрессии трансгена, который, например, в том случае, когда он предназначен для применения в генной терапии, может представлять собой человеческий или гетерологичный ген, вирусный SIN-вектор предпочтительно содержит кассету экспрессии, расположенную 5'-в направлении относительно 3' SIN LTR.

Кроме того, вектор, предлагаемый в изобретении, находящийся в человеческих пакующих клетках, позволяет получать вирусные частицы с высоким титром и отличается тем, что в процессе трансдукции клеток-мишеней, прежде всего человеческих клеток, путем контакта клеток экстракорпорально, т.е. in vitro, или путем введения частицы, адаптированной для этой цели, в клетки пациента, трансдуцированные in vivo, достигают стабильной и отличающейся небольшим снижением экспрессии трансгена соответственно в течение длительного периода времени, при этом частота трансформации клеток-мишеней в результате онко генной активации является низкой. Кассета экспрессии содержит промотор, расположенный в 5'-направлении относительно нуклеотидной последовательности, кодирующей трансген, и посттранскрипционный регуляторный элемент (PRE), прежде всего WPRE (PRE вируса гепатита сурков (WHV)), предпочтительно расположенный в 3'-направлении относительно последовательности, кодирующей трансген.

Известный уровень техники

Hughes (Folia Biologika 50, 2004, сс.107-119) описал серии вирусных векторов на основе вируса птичьего лейкоза (ALV), которые для повышения производства компетентных в отношении репликации ретровирусов (RCR) несли функциональные LTR (RCAS: Replication-Competent ASLV LTR with a Splice Acceptor; компетентные в отношении репликации LTR ASLV с акцепторным сайтом сплайсинга). В этой системе все компоненты, необходимые для производства вируса, находились в одной плазмиде (подобно тому, как это имеет место в полноразмерном вирусе), а возможный трансген встраивали в 3'-нетранслируемую область (UTR).

Ни с соавторами (Molecular Therapy, 2008, сс.1617-1623) продемонстрировали, что ASLV не имеет тенденцию к предпочтительному встраиванию внутрь проонкогенов или в непосредственной близости к ним и что LTR ALSV не имеют тенденцию к активации примыкающих генов и на этой основе сделали заключение о том, что ALSV может представлять собой приемлемую основу для вирусных векторов. Установлено, что путем усовершенствования полиаденилирования можно получать делеции энхансерной области (энхансер) в LTR или ингибировать процесс транскрипции с помощью сигнала терминации.

Ни с соавторами (Human Gene Therapy, 2007, сс.691-700)) и Mitchell с соавторами (Plos Biology, 2004, e234) продемонстрировали, что ALSV не имеет тенденцию к предпочтительному встраиванию внутрь проонкогенов или в непосредственной близости к ним, прежде всего не обладает выраженным предпочтением к областям, расположенным вблизи промотора. Вследствие этого опасность инсерционнного мутагенеза оценивается как более низкая по сравнению с применяемыми в клинических условиях векторными системами на основе вируса мышиного лейкоза (MLV) и вируса иммунодефицита человека (ВИЧ). Установлено, что делеция энхансерной области (энхансер) в LTR или предупреждение процесса транскрипции с помощью сигнала терминации могут рассматриваться как желательные. Из-за архитектуры вектора (1 плазмида, реплицирующаяся) эта система, как правило, является не пригодной для клинических применений.

Ни с соавторами продемонстрировали, что вирусные векторы, полученные из ASLV, которые имеют интактные LTR, не реплицируются в клетках млекопитающих. Точная причина этого явления не установлена.

Благодаря характерной для ретровирусов архитектуре 2 LTR ретровирусов имеют присущие им слабые полиА-сигналы. Для лентивирусных векторов установлено, что процесс транскрибирования с 3'-конца встроенного вирусного вектора может приводить к нежелательной активации гена, что описано, например, у Zaiss с соавторами (Journal of Virology, 2002, сс.7209-7219) и Schambach Baum соавторами (Molecular Therapy, 15(6), 2007, сс.1167-1173). Важным является также то, что U3-область помимо промоторных элементов и энхансерных элементов содержит также энхансеры полиаденилирования, и поэтому для каждого семейства вирусов должны быть вновь валидированы любые делеции с учетом остаточной энхансерной активности и эффективности полиаденилирования.

Для векторов на основе гамма-ретровирусов Kraunus с соавторами (Gene Therapy, 2004, сс.568-1578) предложили удалять целиком область энхансерного элемента и промотора 3" U3-области и оставлять только первые 22 пары оснований (п.о.), расположенных против хода транскрипции относительно энхансера, и последние 14 п.о., расположенных по ходу транскрипции. У ASLV и вируса саркомы Рауса (RSV) LTR-область усложнена наличием очень короткой R-области (короткая повторяющаяся последовательно в каждом конце генома), в результате чего полиА-сигнал (ААТААА) находится в U3-области. Это является очень необычным для ретровирусов (обычно он локализован в R-области) и делает конструирование SIN-вектора очень сложным.

Aubert с соавторами (The J. of Cell Biology, 113, 1991, сс.497-506) и Flamant с соавторами (Journal of General Virology, 74, 1993, сс.39-46) описали делеции в U3-области ALV, затрагивающие положения от -149 до -15 относительно R-области, и от -149 до -15, и от -98 до -59 соответственно, и в этом случае также относительно R-области. Во все эти U3-области все еще входили сохранившиеся энхансерные элементы (Cullen и др., МСВ, 1985, сс.438-447), что создавало проблемы для возможных клинических применений. Это связано с тем, что эти энхансерные элементы могли нарушать регуляцию примыкающих генов (например, онкогенов) путем инсерционного мутагенеза.

Задача изобретения

Таким образом, в основу изобретения была положена задача разработать пригодную для применения в клинических условиях расщепляющую-пакующую систему, включающую вирусный вектор и хелперные плазмиды, которая предназначена для производства в клетках млекопитающих (например, человеческих клетках, например, линии НЕК293Т), с помощью которой вирусный вектор можно получать в виде упакованной вирусной частицы, что минимизирует риск рекомбинации с компетентными в отношении репликации ретровирусами (RCR), а также минимизирует риск того, что инсерция вирусного вектора приведет к активации примыкающих генов в клетке-мишени (инсерционный мутагенез). Предпочтительно вирусный вектор и система, содержащая хелперные плазмиды, соответственно должны позволять также создавать вирусные частицы, имеющие высокие титры, при этом вирусный вектор должен содержать кассету экспрессии, из которой трансген и регуляторные последовательности гена (например, shPHK (короткие (или малые) образующие шпильку РНК), miPHK (микроРНК) и др.) эффективно транскрибируются и/или транслируются. Предпочтительно эти векторы псевдотипированы с приемлемыми для применения в клинических условиях оболочечными белками (например, RD114/TR, env амфотропного MLV, гликопротеин вируса везикулярного стоматита (VSVg)). Все эти критерии следует рассматривать в комбинации, так как они имеют решающее значение для возможных клинических применений.

Подробное описание изобретения

Задача, положенная в основу изобретения, решается с помощью отличительных признаков, которые представлены в формуле изобретения, и прежде всего с помощью вектора, обладающего требуемыми свойствами. Вирусную ДНК можно транскрибировать из плазмиды, которая согласно формуле изобретения представляет собой вирусный вектор на основе ASLV, 3э U3 которого продуцирует или соответственно представляет собой самоинактивирующийся 3э LTR (SIN-LTR), а также вирусную частицу, которая содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую вирусный вектор, прежде всего РНК. Кроме того, изобретение относится к системе, содержащей первую хелперную плазмиду, которая кодирует в кассете экспрессии кодирующую последовательность слитого белка gag-pro-pol ASLV, и вторую хелперную плазмиду, которая кодирует в кассете экспрессии оболочечный белок (env), например, ASLV, RD114/TR, амфотропного MLV, VSVg или экотропного MLV.

Когда первая и вторая хелперная плазмиды присутствуют в эукариотической клетке, обозначенной далее как пакующая клетка, то продуцируются вирусные частицы с высоким титром, вирусная РНК которых сама является самоинактивирующейся (SIN) из-за делеций в 5' U3-области, возникающей в клетке-мишени из 3э U3-области в процессе обратной транскрипции в вирусную ДНК, но которые обеспечивают высокий уровень транскрипции и эффективную трансляцию трансгена, который находится в кассете экспрессии, расположенной в 5э-направлении перед 3э SIN-LTR. В такой конфигурации активация примыкающих геномных последовательностей при встраивании вирусного вектора существенно снижается. Снижение активации примыкающих последовательностей продемонстрировано для γ-ретровирусных векторов Zychlinski с соавторами (Mol. Ther., 16, 2008, сс.718-725).

Мутации, известные для вирусных SIN-векторов на основе других ретровирусов, например лентивирусов, которые объединяют свойства высокого титра в пакующих клетках, с одной стороны, отсутствие промоторной активности у LTR, а также эффективную транскрипцию трансгена из кассеты экспрессии с находящимся внутри вектором без процесса транскрипции в геномные последовательности в сайте инсерции, нельзя применять при конструировании SIN-LTR-векторов на основе ASLV. Это связано с устройством функциональных элементов в индивидуальных вирусах и их взаимодействием с клеточными факторами хозяина, которые не являются идентичными друг другу, и не позволяет предсказывать воздействие изменения последовательностей на титр, на предупреждение активации примыкающих геномных последовательностей в сайте инсерции и на транскрипцию трансгена из внутренней кассеты экспрессии.

Вирусный вектор, предлагаемый в изобретении, содержит вместо LTR дикого типа 3'-LTR, в U3-области которого путем делеции удален большой сегмент, в результате чего транскрипциональная активность промоторной и энхансерных областей U3 в значительной степени, предпочтительно полностью, уменьшена или элиминирована соответственно. Элиминацию промоторной и энхансерных областей U3-области, например, в результате делеции или замены нуклеотидов этой области, определяют с помощью оценки активности, когда промоторная активность подвергнутой делеции или замененной U3-области обладающего функциональной активностью расположенного в 3'-направлении репортерного гена находится на уровне фоновой активности лишенного промотора репортерного гена, как, например, в случае полностью удаленной U3-области. В частности, согласно изобретению U3-область ASLV имеет только нуклеотиды 1-27 и нуклеотиды 187-229, предпочтительно только нуклеотиды 1-27 и 207-229 из состоящей из 229 нуклеотидов U3-области дикого типа (SEQ ID NO: 1). Указанная измененная 3'-U3-область вирусного вектора, предлагаемого в изобретении, в которой удалены в результате делеции из U3-области дикого типа нуклеотиды 28-186 и предпочтительно удалены в результате делеции также нуклеотиды 187-202, после обратной транскрипции и интеграции в геном киетки-мишени практически не обладает промоторной активностью и/или энхансерной активностью. Вирусная РНК, которую можно упаковывать, находится под контролем сильного промотора, расположенного 5'-направлении, который утрачивается в процессе обратной транскрипии и не входит в вирусную РНК, образовавшуюся в результате транскрипции соответственно. Это позволяет создавать транскрипт, который в сочетании с первой и второй хелперной плазмидой, можно применять для получения имеющих высокий титр вирусных частиц, которые содержат вирусную РНК.

Удаленные в результате делеции промоторные области и энхансерные области необязательно можно заменять встроенной нуклеотидной последовательностью, которая не обладает ни промоторной активностью, ни энхансерной активностью.

3'-SIN-LTR вектор, предлагаемый в изобретении, может состоять из вышеуказанных сегментов имеющей делецию U3-области дикого типа, R-области дикого типа и U5-области дикого типа. U3-область с делениями, предлагаемыми в изобретении, необязательно может содержать дополнительные нуклеотидные последовательности, которые не обладают промоторной активностью, расположенные между сохранившимися сегментами U3-области дикого типа, которые выбирают, например, из группы, включающей miPHK, shPHK, энхансеры полиаденилирования (USE), распознаваемые рекомбиназами последовательности (например, LoxP, Rox, FRT) и изолирующие элементы (например, cHS4).

Для инсерции нуклеотидных последовательностей, не обладающих промоторной активностью, в предлагаемую в изобретении U3-область эта область предпочтительно должна иметь уникальный сайт рестрикции, распознаваемый рестриктазой, прежде всего, предпочтительно, чтобы нуклеотиды 187-190 согласно нумерации U3-области дикого типа в результате мутации были заменены на последовательность оснований CGTA, что приводит к созданию второго сайта рестрикции SnaBI, который имеет распознаваемую последовательность TACGTA.

В качестве альтернативы делеции нуклеотидов 187-202 можно также изменять путем мутации нуклеотиды 200-206 (ТАТТТАА), например, с получением последовательности TGTCTAA. Вероятно, нуклеотиды 200-206 формируют ТАТА-бокс в U3-области дикого типа, поэтому мутация, которая изменяет этот ТАТА-бокс, снижает или элиминирует часть промоторной активности U3-области, обусловленную этим сегментам.

Имеющая делеции U3-область, предлагаемая в изобретении, содержит также сайт присоединения интегразы (присоединение интегразы), прежде всего на нуклеотидах 1-25, а также полиА-сигнал, например, на нуклеотидах 223-228, в каждом случае нумерация нуклеотидов соответствует нумерации в U3-области дикого типа. Вероятно, сохранение сайта присоединения интегразы и полиА-сигнала является важным для заражения вирусом. При создании изобретения неожиданно было установлено, что вектор, предлагаемый в изобретении, с одной стороны, обеспечивает получение вирусных частиц, имеющих высокий титр в пакующей клетке или линии пакующих клеток, а, с другой стороны, обеспечивает эффективную транскрипцию трансгена из кассеты экспрессии под контролем сильного внутреннего промотора после обратной транскрипции и интеграции в геном клетки-мишени, без транскрипци 3'-SIN-LTR в областях, примыкающих к сайту интеграции, или активации примыкающих геномных последовательностей.

Без осуществления процесса концентрирования титр вирусных частиц, полученных в пакующих клетках, которые содержат вирусную РНК, содержащую 3' SIN-LTR, предлагаемый в изобретении, или 3' U3-область, предлагаемую в изобретении, составляет примерно 1х10 инфекционных частиц/мл. При этом на титр влияет ген, кодирующий слитый белок gag-pro-pol и оболочечный белок соответственно, первой и второй хелперной плазмиды соответственно, и не существенно влияет природа или протяженность делеции U3-области.

При создании изобретения неожиданного было установлено, что экспрессия трансгена из кассеты экспрессии в вирусных векторах, предлагаемых в изобретении, которые имеют SIN-делецию, примерно в 3 раза превышала экспрессию в применяемом для сравнения векторе, в котором 3' LTR включал U3-область, имеющую последовательность дикого типа. Согласно изобретению предпочтительным является также, чтобы кодирующие последовательности первой и/или второй хелперных плазмид включали оптимизированные кодоны, т.е. вирусные кодоны были заменены на кодоны клетки-мишени, прежде всего, заменены на человеческие кодоны, например, с использованием способов получения вирусных частиц и вирусных векторов, предлагаемых в изобретении, которые, например, находят применение в качестве лекарственного средства или для производства фармацевтических композиций. Предпочтительная хелперная плазмида, предлагаемая в изобретении, содержит последовательность, которая кодирует слитый белок gag-pro-pol, в которой вирусные кодоны адаптированы к человеческим наиболее часто встречающимся кодонам.

Для применения в качестве лекарственного средства вирусную частицу, содержащую вирусный вектор, можно приготавливать таким образом, чтобы ее можно было вводить пациенту/человеку или животному кроме человека. В альтернативном варианте вирусная частица и вирусный вектор соответственно можно приводить в контакт с клетками, полученными из организма пациента, т.е. для трансдукции клеток in vitro, которые затем, необязательно после стадии культивирования и/или селекции, приготавливают и применяют соответственно в качестве трансдуцированных клеток, предназначенных для введения пациенту, при этом предпочтительно пациент представляет собой того же пациента, из организма которого получены клетки.

Согласно изобретению в имеющей оптимизированные кодоны кодирующей последовательности слитого белка gag-pro-pol поддерживался начальный сдвиг рамки считывания на -1 (нуклеотид) и транзиция pro в роl относительно ASLV дикого типа.

Установлено, что адаптация наиболее часто встречающихся кодонов ASLV к наиболее часто встречающимся кодонам клетки-мишени, прежде всего к человеческим наиболее часто встречающимся кодонам, в кодирующих областях хелперных плазмид приводит к существенному повышению титра вирусных частиц, так, например, только адаптация наиболее часто встречающихся кодонов слитого белка gag-pro-pol к человеческим наиболее часто встречающимся кодонам сама по себе приводит к повышению примерно в 50 раз титра вирусных частиц в человеческих пакующих клетках.

Для адаптации наиболее часто встречающихся кодонов к человеческим наиболее часто встречающимся кодонам предпочтительно применяют оптимальные (но, не ограничиваясь только ими) пулы тРНК из Homo sapiens; например, кодон глицина GGT с целью адаптации предпочтительно заменяют на GGC. Кроме того, удаляли негативные вызывающие нестабильность РНК мотивы, а также криптические сайты полиаденилирования, а также вторичную структуру РНК, с получением более стабильной мРНК, которая обладала более высокой способностью к трансляции в человеческих клетках. Кроме того, деактивировали в кодирующей последовательности встречающийся в естественных условиях донорный сайт сплайсинга, акцепторный сайт сплайсинга и дополнительные криптические сигналы сплайсинга. Таким образом, предпочтительная хелперная плазмида несет неактивный донорный сайт сплайсинга в гене gag-pol, например, соответствующий нуклеотидам 1501-1502 в SEQ ID NO: 14. Предпочтительно gag кодируется нуклеотидами 1475-3436 SEQ ID NO: 14, a pol кодируется нуклеотидами 3738-6291 SEQ ID NO: 14, поскольку в этих сегментах практически удалены криптические вызывающие нестабильность мотивы РНК и сайты полиаденилирования, а также вторичная структура РНК, то в результате можно получать вирусные частиц, обладающие высокой эффективностью трансдукции, с высоким титром.

И, наконец, согласно изобретению предпочтительно, чтобы вирусный вектор, предпочтительно помимо первой хелперной плазмиды, а также предпочтительно помимо второй хелперной плазмиды, не имел никаких последовательностей, гомологичных последовательностям клетки-мишени, а также предпочтительно также, в частности, не имел перекрывающихся последовательностей, например, не имел сегментов последовательностей, в которых более 5 нуклеотидов были гомологичны друг другу, предпочтительно не имел сегментов последовательностей, в которых более 10-20 нуклеотидов были гомологичны друг другу. Тем самым минимизируется вероятность рекомбинации в пакующей клетке и/или клетке-мишени и минимизируется также вероятность создания RCR.

Таким образом, изобретение относится к вирусной РНК, которая в направлении от 5'- к 3'-концу содержит или состоит из 5' R-области и 5' U5-области, сайта связывания праймера (PBS), сигнала упаковки (40, который в отличие от известных из существующего уровня техники гамма-ретровирусных или лентивирусных векторов действует без ретровирусного донорного сайта сплайсинга, кассеты экспрессии для трансгена или содержащей трансген соответственно и укороченной 3' U3-области (обозначена как Д или d), предлагаемой в изобретении, 3' R-области и выступающего полиА-сегмента (полиА-хвост), а также к вектору, предназначенному для транскрипции вирусной РНК, который в дополнение к нуклеотидной последовательности, кодирующей вирусную РНК, имеет расположенный в 5'-направлении относительно ее 5' R-области, эукариотический или вирусный промотор соответственно, и при этом в векторе нуклеиновая последовательность, кодирующая вирусную РНК, присутствует в форме ДНК, в которой 3' SIN-LTR имеет полиА-сегмент.

Кроме того, изобретение относится к применению вирусной РНК и вирусной частицы, которая содержит вирусную РНК, в качестве лекарственного средства и для приготовления фармацевтической композиции, предназначенной для трансдукции клеток-мишеней, например, человеческих соматических клеток, а также к фармацевтическим композициям, которые содержат вирусную РНК или вирусные частицы, содержащие вирусную РНК, и к применению указанных фармацевтических композиций в качестве лекарственного средства для переноса трансгена в клетку, прежде всего при осуществлении генной терапии.

Кроме того, изобретение относится к клеткам, которые включают интегрированную или неинтегрированную нуклеотидную последовательность, которые получают путем контакта с вирусными частицами, предлагаемыми в изобретении, и которые содержат U3-область, предлагаемую в изобретении, например, ДНК-сегмент, полученный в результате обратной транскрипции из вирусной РНК, предлагаемой в изобретении. Указанные клетки могут представлять собой экстракорпоральные клетки животных или интракорпоральные клетки животных за исключением человеческих гамет.

Кассета экспрессии содержит промотор и по меньшей мере одну транскрибируемую и/или транслируемую последовательность трансгена, которая может представлять собой ген, гомологичный или гетерологичный клетке-мишени, и предпочтительно расположенный против хода транскрипции относительно транскрибируемой последовательности трансгена PRE или других пост-транскрипциональных регуляторных сегментов нуклеиновых кислот или модулей нуклеиновых кислот. Транскрибируемая последовательность может содержать также внутренние сайты связывания рибосом (IRES) в сочетании с кодирующими белок последовательностями, расположенным по ходу транскрипции относительно них, а также другие функциональные сегменты нуклеиновых кислот или кодирующие ферменты сегменты нуклеиновых кислот (например, двунаправленные промоторы, кодирующие последовательности сайтов, расщепляемых 2А-протеазой, или гены 2А-протеазы). Кроме того, необязательно изолирующая последовательность может быть встроена в имеющую делеции 3' U3-область, например, в сайт рестрикции, находящейся в ней, которая ослабляет взаимодействие трансгена с примыкающими геномными последовательностями, или может быть встроена распознаваемая рекомбиназой последовательность, например, распознаваемая последовательность, выбранная из группы, включающей rox, loxP, FRT. После обратной транскрипции и копирования в 5' LTR распознаваемую рекомбиназой последовательность можно активировать путем добавления и экспрессии соответственно рекомбиназы в клетках-мишенях, и, например, сегменты нуклеиновой кислоты в интегрированной ДНК (например, часть кассеты экспрессии), расположенные между распознаваемыми рекомбиназой последовательностями, можно переворачивать или удалять. Другие последовательности, которые можно встраивать в 3' U3-область, содержат, например, последовательности-мишени мякроРНК, короткие (или малые) образующие шпильку РНК или сегменты последовательности, которые облегчают выявление вставки в помощью ПЦР.

Имеющая делеции U3-область в 3' SIN-LTR, предлагаемая в изобретения, в результате делеции энхансерных и промоторных элементов из U3-области дикого типа позволяет создавать вирусные частицы, титры которых превышают титры векторов в пакующих клетках, которые имеют LTR дикого типа, поскольку часто наблюдается резкое снижение вирусных титров, когда не осуществляют делеции в U3-области.

Транскрипция трансгенов, входящих в кассету экспрессии, контролируется промотором кассеты экспрессии, который обозначают также как внутренний промотор. При создании настоящего изобретения высказано предположение о том, что имеющие делеции U3-области, предлагаемые в изобретении, имеют полиА-сигнал, который устраняет процесс транскрипции позади векторной последовательности и обеспечивает правильный полиА-сигнал. Это предположение подтверждается наличием улучшенной в 3 раза экспрессии трансгена, входящего в кассету экспрессии вектора, предлагаемого в изобретении, по сравнению с экспрессией трансгена из вектора, который содержит 3' LTR дикого типа.

Наиболее предпочтительно из нуклеотидной последовательности вирусного вектора, предлагаемого в изобретении, полностью удалены в результате делеции последовательности, кодирующие структурные белки вируса, включая донорный сайт сплайсинга (SD), например, имеет место полная деления последовательностей gag, env, pol и src. Установлено, что в векторах на основе ASLV, у которых удалены в результате делеции последовательности, которые кодируют структурные белки вируса, также отсутствует донорный сайт сплайсинга. При создании изобретения неожиданно было установлено, что указанный вектор на основе ASLV позволяет осуществлять упаковку вирусной РНК в пакующих клетках с помощью расщепляющей-пакующей системы. Это является неожиданным, поскольку, как известно, в ретровирусных векторах области кодирующих вирусных последовательностей требуются для упаковки, поскольку в область этих последовательностей, кодирующих структурные белки вируса, входят сигналы, требующиеся для экспорта РНК, для взаимодействия с нуклеокапсидом вируса и для обратной транскрипции, например, как в случае ВНЧ. Таким образом, вектор, предлагаемый в изобретении, может содержать сигнал упаковки! (У), который входит в SEQ ID NO: 5 (нуклеотиды 1042-1292) без сегментов последовательностей, которые кодируют структурные белки вируса.

Нуклеотидная последовательность вирусного вектора, в которой отсутствует донорный сайт сплайсинга, являющаяся предпочтительным вариантом осуществления изобретения, представляет собой важное отличие от известных лентивирусных или γ-ретровирусных векторов, которые несут встречающийся в естественных условиях вирусный донорный сайт сплайсинга, расположенный против хода транскрипции относительно сайта связывания праймера. В этих известных векторах донорный сайт сплайсинга требуется для получения высоких титров вирусных частиц. При создании изобретения неожиданно было установлено, что вектор, предлагаемый в изобретении, позволяет получать высокие тиры в пакующих клетках даже без его встречающегося в естественных условиях или другого донорного сайта сплайсинга. Поскольку встречающийся в естественных условиях донорный сайт сплайсинга ASLV локализован в гене gag, его полная делеция приводит в результате к удалению донорного сайта сплайсинга. Согласно другому предпочтительному варианту осуществления изобретения в вектор не входит также вирусный акцепторный сайт сплайсинга. Акцепторный сайт сплайсинга ASLV локализован в гене ро1, поэтому его полная делеция приводит в результате также к удалению акцепторного сайта сплайсинга.

Удаление путем делеции донорного сайта сплайсинга и акцепторного сайта сплайсинга в векторе, предлагаемом в изобретении, приводит к оптимизации получения вирусных частиц в пакующих клетках и, кроме того, повышает биологическую безопасность вектора, поскольку рекомбинация с компетентными в отношении репликации ретровирусами становится более трудной. Возможное взаимодействие с клеточными сигналами сплайсинга также является менее вероятным в интрагенных вставках вектора.

Наиболее предпочтительно вектор в 5'-области содержит R-область, U5-область и сигнал упаковки в нуклеотидной последовательности, которая не кодирует структурные белки вируса, и к которой в 3'-направлении присоединена кассета экспрессии трансгена, например, непосредственно, прежде всего после лидерной области. Установлено, что вирусный вектор на своем 5'-конце может содержать R-область, U5-область и сигнал упаковки, который содержит или состоит из нуклеотидов 1042-1292 SEQ ID NO: 5, причем предпочтительно в 3'-направлении к этой последовательности примыкает кассета экспрессии, содержащая трансген.

Для целей изобретения порядок расположения генетических элементов представлен в направлении от 5'- к 3'-концу, если специально не указано иное;

нуклеотидные последовательности представлены в направлении от 5'- к 3'-концу.

Подробное описание изобретения

Ниже изобретение описано более подробно с помощью примеров со ссылкой на чертежи, на которых показано:

на фиг.1 - схематическая структура ASLV дикого типа;

на фиг.2 - схематическая структура SIN-вектора, предлагаемого в изобретении, и плазмиды, содержащей вектор;

на фиг.3 - схематическая структура первой хелперной плазмиды;

на фиг.4 - схематическая структура второй хелперной плазмиды;

на фиг.5 - сравнение U3-области (U3) дикого типа с имеющей делеции U3-областью (dU3), предлагаемой в изобретении, с имеющей делеции U3-областью, предлагаемой в изобретении, без ТАТА-бокса (dU3 поТАТА) и с имеющей делеции U3-областью, предлагаемой в изобретении, которая содержит мутантный ТАТА-бокс (dU3 TATAmut);

на фиг.6 - плазмидная карта вектора, предлагаемого в изобретении, в котором кассета экспрессии кодирует EGFP (усиленный зеленый флуоресцентный белок) в качестве примера трансгена;

на фиг.7 - карта плазмиды, содержащей вектор, предлагаемый в изобретении, в котором ТАТА-бокс U3-области является мутантным;

на фиг.8 - карта плазмиды, содержащей вектор, предлагаемый в изобретении, в котором из U3-области дополнительно удален ТАТА-бокс;

на фиг.9 - плазмидная карта первой хелперной плазмиды, предназначенной для трансляции слитого белка gag-pol;

на фиг.10 - плазмидная карта первой хелперной плазмиды, в которой в последовательность, кодирующая слитый белок gag-pol, представляет собой последовательность с кодонами, оптимизированными для человеческой пакующей клетки и/или клетки-мишени;

на фиг.11 - график, демонстрирующий уровень экспрессии трансгена (EGFP) из вектора, предлагаемого в изобретении, в сравнении с экспрессией из вирусного вектора, который содержит 3' LTR дикого типа;

на фиг.12 - график, демонстрирующий уровень экспрессии трансгена (EGFP) из SIN-векторов, предлагаемых в изобретении;

на фиг. 13 - изображение общей структуры вектора, предлагаемого в изобретении, в сравнении со структурой лентивирусного и γ-ретровирусного SIN-вектора соответственно;

на фиг. 14 сверху - схематическое изображение конструкций нуклеиновых кислот (ДНК-конструкций), предназначенных для транскрипции вирусной РНК, которые содержат кассеты экспрессии, включающий нуклеотидную последовательность, подлежащую тестированию в отношении промоторной активности и энхансерной активности, функционально встроенную в 5′-направлении относительно репортерного гена, и

на фиг. 15 - уровень экспрессии репортерного гена в клетках, трансфектированных вирусной РНК, представленной на фиг. 14, и данные об отсутствии промоторной активности/энхансерной активности.

В описании SIN-U3, предлагаемой в изобретении, нумерацию нуклеотидов осуществляли со ссылкой на нуклеотидную последовательность U3 дикого типа ASLV и соответственно делеции и сегменты SIN-U3-области соответственно обозначены согласно нумерации нуклеотидов U3 дикого типа.

На фиг. 1 представлена схематическая структура ASLV дикого типа, в которой LTR содержат U3-область, R-область и U5-область, которые примыкают друг к другу. LTR всегда являются идентичными, поскольку при репликации вируса и U3-область 3′ LTR копируется в 5′-конец и области R и U5 5′ LTR копируются в 3′ LTR. Сайт инициации транскрипции в положении +1 соответствует 5′-концу 5′ R-области.

На фиг. 2 представлен вектор, предлагаемый в изобретении, в виде плазмиды, на 5′-конце которой промотор расположен перед R-областью, что позволяет начинать транскрипцию с 5′ R-области. Указанный 5′ промотор 5′ LTR вследствие того, что сайт инициации транскрипции находится в положении +1, которое соответствует первому нуклеотиду 5′ R-области, не входит в вирусную РНК; полученная вирусная РНК состоит из областей, расположенных между нуклеотидом в положении +1 5′ R-области и 3′-концом 3′ R-области плюс полиА-хвост. Соответственно вирусные частицы содержат вирусную РНК, созданную из того сегмента вектора, который содержит 5′ R-область (которая включает нуклеотид +1), простирающуюся вплоть до 3′-конца 3′ R-области с выступающим полиА-хвостом. Промотор вирусного вектора, расположенный против хода транскрипции относительно 5' R-области, показанный на фиг.2, который предпочтительно состоит из энхансера SV40 и из U3-области дикого типа RSV (вирус саркомы Рауса), не становится компонентом вирусной РНК, но контролирует эффективность транскрипции ДНК-последовательности вирусной РНК, представленной на фиг.2. В этом случае вектор представлен на уровне плазмиды в виде ДНК-последовательности, кодирующей вирусную РНК, которая может представлять собой компонент плазмиды, из которой транскрибируется вирусная РНК.

Как показано на фиг.2, вирусный вектор между LTR и соответственно после лидерной области содержит кассету экспрессии, которая содержит по меньшей мере один внутренний промотор, например промотор SFFV (вирус некроза селезенки) и EFS (фактор элонгации, 1α), имеет нуклеотидную последовательность, которая кодирует трансген (ген), предпочтительно имеет PRE, расположенный на 3'-конце.

PRE, предпочтительно представляет собой WPRE кассеты экспрессии, предпочтительно отличается наличием делеции X-ORF и/или мутациями ATG.

Вектор, предлагаемый в изобретении, и вирусная РНК, предлагаемая в изобретении, по меньшей мере в 3' LTR содержат U3-область, которая имеет делеции, инактивирующие любую промоторную активность LTR. В направлении от 5' к 3' SIN LTR и/или внутри 3' U3-области вирусный вектор, предлагаемый в изобретении, может содержать гомологичные и/или гетерологичные генетические элементы, например, последовательности, которые содержат miPHK, shPHK, энхансеры полиаденилирования, распознающие рекомбиназу последовательности, USE и/или изолирующие последовательности.

Между элементами 5' LTR и 3' LTR, предпочтительно между областями 5' LTR и кассетой экспрессии вектор, предлагаемый в изобретении, предпочтительно несет сайт связывания праймера и сигнал упаковки ср).

В отличие от компетентных в отношении репликации ретровирусов вирусный вектор, предлагаемый в изобретении, не имеет последовательностей, которые кодируют gag-pol и/или оболочечные белки.

Вирусные белки, которые необходимы для создания вирусной частицы, содержащей вирусную РНК, кодируются отдельными хелперными плазмидами, предпочтительно первой хелперной плазмидой, которая несет кодирующую последовательность слитого белка gag-pro-pol в кассете экспрессии между промотором и последовательностью полиаденилирования, что показано на фиг.3, второй хелперной плазмидой, которая содержит последовательность, кодирующую