Композиция, содержащая экстракт травяной комбинации, для предотвращения или лечения диабетической периферической нейропатии

Композиция, содержащая экстракт травяной комбинации, для предотвращения или лечения диабетической периферической нейропатии

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Область техники, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение относится к композиции для профилактики и терапии диабетической периферической нейропатии, содержащей травяной экстракт смеси Dioscorea Rhizoma:Dioscorea nipponica 3,5:1 (мас./мас.).

Благодарности

Эта работа получила поддержку в рамках программы Global Leading Technology департамента стратегических исследований и планирования развития (OSP), финансируемой Министерством инновационной экономики, республики Корея. (№ 10039303).

Предшествующий уровень техники

Частота возникновения сахарного диабета быстро увеличивается во всем мире. По оценкам всемирной организации здравоохранения приблизительно 180 миллионов человек страдают сахарным диабетом по данным на 2008 год, с перспективой удвоения числа больных диабетом к 2030 году. Таким образом, финансовые и общественные затраты, ассоциированные с диабетом, повысились, и наблюдается увеличение смертности от осложнений диабета. Однако начало или прогрессирование диабета можно замедлять, точно регулируя уровень сахара в крови, таким образом, важно поддерживать эугликемию наряду с изменением образа жизни и адекватным лечением.

Сахарный диабет является основной известной причиной нейропатии в развитых странах. Диабетическая периферическая нейропатия представляет собой термин, используемый для описания симптомов, соответствующих вызываемому диабетом нарушению периферийной нервной системы. Она представляет собой наиболее распространенное осложнение, с которым сталкиваются больные диабетом.

Диабетическая периферическая нейропатия ухудшает качество жизни пациентов с диабетом и представляет собой основную причину смертности пациентов. Распространенность диабетической периферической нейропатии у пациентов с диабетом увеличивается с возрастом пациента и продолжительностью диабета. Диабетическая периферическая нейропатия возникает у пациентов с диабетом 1 типа и 2 типа с более высокой распространенностью у пациентов с диабетом 2 типа (32,1%), чем у пациентов с диабетом 1 типа (22,7%) (Primary Care Diabetes, Volume 1, Issue 3, September 2007, Pages 129-134, Diagnosis of diabetic peripheral neuropathy among patients with type 1 and type 2 diabetes in France, Italy, Spain, and the United Kingdom).

Приблизительно 10% пациентов с диабетом жалуются на постоянную боль, которая может быть спонтанной или может возникать под воздействием стимулов. Боль может усугубляться или становиться некурабельной. Диабетическая периферическая нейропатическая боль является более тяжелой, как правило, ночью, и ее описывают преимущественно как дискомфорт с чувством жжения, колющая боль, язвы, чувство напряжения и т.п. Кроме того, диабетическую периферическую нейропатическую боль чаще чувствуют в ногах, чем в руках. Часто сильная боль может приводить к потере массы или депрессии (Pain Medicine, Volume 8, Number S2 2007, Diabetic Peripheral Neuropathic Pain: Recognition and Management).

Диабетическую периферическую нейропатию диагностируют тестом на мышечную силу и измерением тактильной чувствительности, температурной чувствительности, вибрационной чувствительности, скорости кровотока кожи периферических отделов и нервной проводимости. Диабетическую периферическую нейропатию в настоящее время лечат, контролируя уровень сахара в крови, этиологическим лечением и симптоматическим лечением. Вследствие того, что корреляция гипергликемии и прогрессирования нейропатии является хорошо установленной и выявленной во многих исследованиях, в которых описывают высокий коэффициент распространенности диабетической периферической нейропатии у пациентов с диабетом, которые не контролируют свой сахар в крови, где контролирование сахара в крови признают как первичный способ предотвращения/лечения диабетической периферической нейропатии (N. Engl. J. Med. 1993, 329:977-86, The effect of intensive treatment of diabetes on the development and progression of long-term complications in insulin-dependent diabetes mellitus).

Характерными среди этиологических терапевтических средств для диабетической нейропатии являются альфа-липоевая кислота, ингибиторы альдозоредуктазы и гамма-линолевая кислота. α-липоевая кислота (тиоктовая кислота), антиоксидант, уменьшает индуцируемый гипергликемией окислительный стресс, который приводит к гибели нервных клеток, таким образом, блокируя этиологические факторы диабетической нейропатии. Предотвращая прохождение глюкозы по полиоловому пути в нервных клетках, ингибиторы альдозоредуктазы могут подавлять аккумуляцию сорбита, который приводит к повреждению нервной клетки, блокировать прогрессирование диабетической нейропатии. Однако разработка большинства из них была прекращена на полпути вследствие побочных эффектов и недостаточного финансирования. В настоящее время используют только эпалрестат в Японии. Выявлено, что γ-линоленовая кислота, которая является компонентом фосфолипидов мембраны нервной клетки и компонентом простагландина E, который играет важную роль в гомеостазе кровотока в нервных клетках, уменьшает некоторые симптомы диабетической нейропатии (BMJ, 2007, Jul 14, 335(7610):87. Epub. 2007 Jun 11, Review. Effects of treatments for symptoms of painful diabetic neuropathy: systematic review).

Симптоматические терапевтические средства для облегчения боли диабетической нейропатии включают трициклические антидепрессанты, противосудорожные средства, избирательные ингибиторы обратного захвата серотонина и капсаицин для местного применения. Трициклические антидепрессанты (TCA) действуют, ингибируя обратный захват серотонина и норадреналина в центральной нервной системе, блокируя проведение боли, а также повышая уровень эндогенного эндорфина, облегчая боль. Противосудорожные средства и избирательные ингибиторы обратного захвата серотонина используют в качестве альтернативных вариантов для пациентов с непереносимостью TCA. Капсаицин для местного применения, известный как пригодный для болевой дизестезии, инициирует высвобождение нейропептида, субстанции P из ноцицептивных волокон типа C и подавляет накопление субстанции P, препятствуя проведению и распространению периферических болевых сигналов, что приводит к уменьшению боли.

Однако затруднительно найти терапии, которыми адекватно лечат пациентов с диабетической периферической нейропатией, вследствие того, что существует большое многообразие этиологических факторов и симптомов. На практике для облегчения боли и подавления прогрессирования диабетической периферической нейропатии предпочтение отдают симптоматическому лечению перед этиологическим лечением. Таким образом, существует возрастающая потребность в терапии, которая может устранять диабетическую периферическую нейропатию, восстанавливая разрушенные при диабете нервы. Фактор роста нервов, функционирующий, облегчая восстановление нейронов, выступает как эффективный кандидат для лечения диабетической периферической нейропатии.

Многие проведенные исследования свидетельствуют о том, что биосинтез фактора роста нервов (NGF) и ретроградный транспорт в нейронах у индивидуумов с диабетом являются повышенными, и таким образом, их рассматривают как один из этологических факторов диабетической периферической нейропатии. У здоровых индивидуумов NGF продуцируется в кератиноцитах кожи и взаимодействует с рецептором trkA. С другой стороны, низкий уровень NGF наблюдают в кератиноцитах кожи пациентов с диабетом, для которого известно, что он ассоциирован с декомпенсацией чувствительных нервных волокон (Diabetes Obes Metab., 2008 Feb, 10(2):99-108. Epub 2007 Jun 26, Review. Diabetic neuropathy: new strategies for treatment).

Проведенные исследования демонстрируют, что введение NGF приводит к уменьшению боли и симптомов у животных с индуцированной диабетической периферической нейропатией. На основании этих результатов также проводили клинические испытания на пациентах с диабетической нейропатией. В рандомизированном плацебо-контролируемом клиническом испытании 2 фазы, симптомы и боль у пациентов с диабетической периферической нейропатией уменьшались после введения рекомбинантного NGF человека три раза/неделю в течение 6 месяцев. Однако рандомизированное плацебо-контролируемое клиническое испытание 3 фазы проводили в течение 48 недель, тем не менее не являлось в значительной степени эффективным вследствие боли на участке инъекции и незначительных фармацевтических эффектов. Таким образом, последующие исследования были направлены на индуцирование биосинтеза эндогенного NGF, а не на пополнение внешнего NGF (Am. J. Med., 1999 Aug 30, 107(2B):34S-42S, Review. Neurotrophic factors in the therapy of diabetic neuropathy).

Dioscorea Rhizoma, растение, принадлежащее к Dioscoreaceae, представляет собой термин для свежего корневища Dioscorea batatas Decaisne или Dioscorea japonica Thunberg, лишенного перидермы, или для корневища, получаемого после того, как свежее корневище пропарили и высушили в лекарственное средство из растительного сырья. Растение содержит диосцин, сапонин стероидного типа, и аллантоин.

Dioscorea nipponica, корневище вьющегося многолетнего растения Dioscorea nipponica Makino, содержит различные сапонины стероидного типа, включая диосцин, просапоген A и просапоген C.

В лекарственном средстве из растительного сырья эти травы используют отдельно или в комбинации с другими травами. В опубликованных ранее документах не описана медицинская эффективность экстракта из комбинации этих двух трав в отношении диабетической периферической нейропатии.

Патент Кореи № 854621 относится к композиции для предотвращения и лечения периферической нейропатии, содержащей экстракт из растения, выбранного из числа Dioscorea nipponica, Dioscorea quinqueoloba, Dioscorea batatas, Dioscorea japonica и Dioscorea tokora, в котором описано, что композиция индуцирует рост невритов и увеличивает секрецию эндогенного фактора роста нервов, таким образом, является эффективной для предотвращения и лечения периферической нейропатии.

Авторы настоящего изобретения подтверждают, что действием экстракта из растения, выбранного из числа Dioscorea nipponica, Dioscorea quinqueoloba, Dioscorea batatas, Dioscorea japonica и Dioscorea tokora, являлась индукция значительного роста невритов и увеличение секреции эндогенного NGF, как описано в патенте Кореи № 854621. Неожиданно, авторы настоящего изобретения выявили посредством экспериментов на моделях на животных, что экстракт из смеси Dioscorea Rhizoma и Dioscorea nipponica в конкретном отношении обеспечивает терапевтически синергическое действие в отношении диабетической периферической нейропатии, повышая уровень NGF in vivo, например, в плазме и в слюнной железе, в очень значительной степени и облегчая вызываемую диабетической нейропатией боль, высокочувствительную к термическим и механическим стимулам, тогда как экстракты из каждой или из комбинации этих трав обладают одинаковым действием в отношении роста невритов и секреции эндогенного фактора роста нервов, что привело к настоящему изобретению.

Описание изобретения

Техническая проблема

Целью настоящего изобретения является предоставление растительной композиции, получаемой из трав, раскрытых в патенте Кореи № 854621, обладающей действием в отношении значительного увеличения in vivo уровня фактора роста нервов (NGF), терапевтически эффективной в отношении диабетической периферической нейропатии.

Другой целью настоящего изобретения является предоставление фармацевтической композиции и функционального оздоровительного пищевого продукта для профилактики и терапии диабетической периферической нейропатии, содержащих растительную композицию.

Решение проблемы

Целей настоящего изобретению можно достигать предоставлением фармацевтической композиции и функционального оздоровительного пищевого продукта, содержащих травяной экстракт, получаемый из смеси 3,5:1 (мас./мас.) Dioscorea Rhizoma:Dioscorea nipponica, пригодный для предотвращения и лечения диабетической периферической нейропатии.

По одному из аспектов настоящее изобретение относится к травяному экстракту из смеси Dioscorea Rhizoma и Dioscorea nipponica. Более конкретно травяной экстракт, к которому относится настоящее изобретение, получают из смеси, содержащей Dioscorea Rhizoma и Dioscorea nipponica в массовом отношении 3,5:1 (мас./мас.).

Травяной экстракт по настоящему изобретению можно получать из смеси высушенных Dioscorea Rhizoma и Dioscorea nipponica холодным осаждением в 50% этаноле при комнатной температуре в течение 48 часов с последующей концентрацией в вакууме. Более подробно, Dioscorea Rhizoma и Dioscorea nipponica промывают, сушат, режут и смешивают в массовом отношении Dioscorea Rhizoma:Dioscorea nipponica 3,5:1 и подвергают смесь однократному холодному осаждению в 5 массовых частях 50% этанола при комнатной температуре в течение 48 часов с последующим концентрированием экстракта при сниженном давлении.

Согласно другому аспекту настоящее изобретение относится к композиции для профилактики и терапии диабетической периферической нейропатии, содержащей в качестве активного ингредиента травяной экстракт из смеси Dioscorea Rhizoma:Dioscorea nipponica 3,5:1 (мас./мас.) в комбинации с фармацевтически приемлемым носителем, разбавителями или эксципиентом.

Композиция по настоящему изобретению содержит травяной экстракт из смеси Dioscorea Rhizoma:Dioscorea nipponica 3,5:1 (мас./мас.) в количестве от 0,01 до 80 мас.% от общей массы композиции и предпочтительно в количестве от 1 до 50 мас.%

Специалистам в данной области следует понимать, что симптомы диабетической нейропатии включают потерю чувствительности, такую как тактильная чувствительность, вибрационная чувствительность, температурная чувствительность и т.д., и боль, такую как дискомфорт с чувством жжения, колющие боли, болезненное ощущение, чувство напряжения и т.п.

Композиция на основе травяного экстракта из смеси Dioscorea Rhizoma:Dioscorea nipponica 3,5:1 (мас./мас.) в соответствии с настоящим изобретением может дополнительно содержать подходящий носитель, эксципиент или разбавитель.

Примеры носителя, эксципиента или разбавителей, пригодных в композиции по настоящему изобретению, включают лактозу, декстрозу, сахарозу, сорбит, маннит, ксилит, эритритол, мальтит, крахмал, гуммиарабик, альгинат, желатин, фосфат кальция, силикат кальция, целлюлозу, метилцеллюлозу, микрокристаллическую целлюлозу, поливинилпирролидон, воду, метилгидроксибензоат, пропилгидроксибензоат, тальк, стеарат магния и минеральное масло.

Композицию по настоящему изобретению можно формулировать в пероральных лекарственных формах, таких как порошки, гранулы, таблетки, капсулы, суспензии, эмульсии, сиропы, аэрозоль и т.д., местных средств, суппозиториев или стерильных инъекционных растворов. Фармацевтическую композицию по настоящему изобретению можно формулировать в комбинации с разбавителем или эксципиентом, таким как наполнитель, сгущающее средство, связывающее средство, средство для смачивания, дезинтегрант, поверхностно-активное вещество и т.д. Твердые препараты, предназначенные для перорального введения, могут находиться в форме таблеток, пилюль, порошков, гранул, капсул и т.п. В отношении таких твердых средств объединенный травяной экстракт по настоящему изобретению формулируют в комбинации по меньшей мере с одним эксципиентом, таким как крахмал, карбонат кальция, сахароза, лактоза или желатин. В дополнение к таким простым эксципиентам, можно использовать смазочные средства, такие как стеарат магния и тальк. Жидкие препараты, предназначенные для перорального введения, включают суспензии, растворы для внутреннего применения, эмульсию, сиропы и т.п. В дополнение к простому разбавителю, такому как вода или парафиновое масло, в жидких препаратах могут содержаться различные эксципиенты, такие как средства для смачивания, подсластители, ароматизаторы, консерванты и т.п. Также фармацевтическую композицию по настоящему изобретению можно вводить непероральным путем. Для этого можно использовать стерильные водные растворы, неводные растворители, суспензии, эмульсии, лиофилизаты, суппозитории и т.п. Для неводных растворителей и суспензий подходящими могут являться инъецируемый пропиленгликоль, полиэтиленгликоль, растительные масла, такие как оливковое масло, и сложные эфиры, такие как этилолеат. Основные минеральные вещества суппозиториев включают витепсол, макрогол, Tween 61, масло какао, лауриновое масло и глицерожелатин.

В соответствии с дополнительным аспектом настоящее изобретение относится к использованию травяного экстракта из смеси Dioscorea Rhizoma:Dioscorea nipponica 3,5:1 (мас./мас.) при получении терапевтического средства для диабетической периферической нейропатии.

В соответствии с еще одним дополнительным аспектом настоящее изобретение относится к способу лечения диабетической нейропатии, включающему введение фармацевтической композиции в терапевтически эффективном количестве нуждающемуся в этом млекопитающему, где указанная фармацевтическая композиция содержит травяной экстракт из смеси Dioscorea Rhizoma:Dioscorea nipponica 3,5:1 (мас./мас.).

Дозирование фармацевтической композиции, содержащей травяной экстракт смеси Dioscorea Rhizoma:Dioscorea nipponica 3,5:1 (мас./мас.), может изменяться в зависимости от различных факторов, включая возраст, пол, массу и состояние здоровья пациентов, рацион питания, время введения, путь введения, скорость экскреции и т.п. Как правило, фармацевтическую композицию по настоящему изобретению можно вводить в виде однократной дозы или в виде многократных доз один раз в сутки при суточном дозировании в диапазоне от 0,01 до 10 г/кг и предпочтительно от 1 до 5 г/кг. Однако специалистам в данной области следует понимать, что дозирование не ограничивает каким-либо образом настоящее изобретение.

Фармацевтическую композицию, содержащую травяной экстракт из смеси Dioscorea Rhizoma:Dioscorea nipponica 3,5:1 (мас./мас.) в соответствии с настоящим изобретением, можно вводить различными путями млекопитающим, таким как крысы, мыши, домашний скот, люди и т.д. Можно рассматривать все пути введения, например, фармацевтическую композицию можно вводить перорально, интраректально, внутривенно, внутримышечно, подкожно, внутриматочно, интрадурально или интрацереброваскулярно.

Практически не обладающий токсичностью и побочными эффектами, травяной экстракт из смеси Dioscorea Rhizoma:Dioscorea nipponica 3,5:1 (мас./мас.) можно безопасно принимать внутрь в течение длительного периода времени с целью предотвращения диабетической нейропатии.

В настоящем изобретении проводили тесты in vivo для определения способности травяного экстракта из смеси Dioscorea Rhizoma:Dioscorea nipponica 3,5:1 (мас./мас.) повышать уровень фактора роста нервов in vivo и уменьшать симптомы диабетической периферической нейропатии. Данные от моделей на животных, которые соответственно являлись здоровыми и страдающими диабетической нейропатией, демонстрировали, что экстракт из смеси трав конкретного отношения в соответствии с настоящим изобретением обладал терапевтически синергическим действием по сравнению с экстрактами из отдельных трав или смеси трав других массовых отношений.

В соответствии с еще одним аспектом предусматривают, что настоящее изобретение представляет собой функциональные оздоровительные пищевые продукты для предотвращения и улучшения состояния диабетической нейропатии, содержащие травяной экстракт из смеси Dioscorea Rhizoma:Dioscorea nipponica 3,5:1 (мас./мас.) и ситологически приемлемую пищевую добавку.

В рамках изобретения предполагают, что термин "функциональные оздоровительные пищевые продукты" включает такие продукты, которые определены в "2002 Law for health functional foods", такие как диетические пищевые продукты, встречающиеся в списке установленных веществ или ингредиентов для функциональных оздоровительных пищевых продуктов, верифицированных в отношении функциональности и безопасности для людей, в соответствии со статьей KFDA № 2004-12 Управления по контролю качества продуктов и лекарств Кореи.

Более конкретно, настоящее изобретение относится к функциональным оздоровительным пищевым продуктам для предотвращения и улучшения состояния диабетической нейропатии, содержащим экстракт трав из смеси Dioscorea Rhizoma:Dioscorea nipponica 3,5:1 и ситологически приемлемую пищевую добавку.

Композицию, содержащую экстракт трав из смеси Dioscorea Rhizoma:Dioscorea nipponica 3,5:1 в соответствии с настоящим изобретением, можно применять для лекарственного средства, пищевого продукта и напитка для уменьшения симптомов диабетической нейропатии. Например, пищевые продукты, к которым можно добавлять экстракт трав по настоящему изобретению, включают напитки, жевательную резинку, чаи, витаминные комплексы и пищевые добавки. Для применения в лекарственных средствах экстракт трав может находиться в форме пилюль, порошков, гранул, таблеток, капсул или жидкостей.

Когда применяют для твердых пищевых продуктов, экстракт трав по настоящему изобретению можно использовать в количестве от 0,1 до 15 мас.% от общей массы пищевого продукта и предпочтительно в количестве от 0,2 до 10 мас.%. В жидкой форме диетического пищевого продукта экстракт трав по настоящему изобретению может содержаться в количестве в диапазоне от 0,1 до 30 г на 100 мл жидкости и предпочтительно от 0,2 до 5 г.

За исключением конкретного отношения, указанного для нежелательных ингредиентов трав, не предусматривают конкретных ограничений для жидкой композиции диетического пищевого продукта. Как характерные напитки, жидкая композиция диетического пищевого продукта может дополнительно содержать различные ароматизаторы, природные углеводы или другие добавки.

Предпочтительные примеры природных углеводов включают моносахариды, такие как глюкоза, фруктоза и т.д., дисахариды, такие как мальтоза, сахароза и т.д., полисахариды, такие как декстрин, циклодекстрин и т.д., и сахарные спирты, такие как ксилит, сорбит, эритритол и т.д. Пригодные в настоящем изобретении ароматизаторы могут быть природными (тауматин, экстракт стевии, например, ребаудиозид A, глициризин) или синтетическими (сахарин, аспартам). Природные углеводы можно использовать в количестве приблизительно от 1 до 20 г на 100 мл жидкой композиции диетического пищевого продукта и предпочтительно в количестве приблизительно от 5 до 12 г.

Кроме того, композиция по настоящему изобретению может содержать различные питательные вещества, витамины, минералы (электролиты), синтетические и/или природные ароматизаторы, красители, наполнители (сыр, шоколад и т.д.), пектиновую кислоту и ее соли, альгиновую кислоту и ее соли, органические кислоты, защитные коллоидные загустители, регуляторы pH, стабилизаторы, консерванты, глицерин, спирты и карбонизирующие средства для карбонатных напитков. Для применения в натуральном фруктовом соке, напитках на основе натуральных фруктовых соков или овощных напитках композиция по настоящему изобретению может дополнительно содержать мякоть фруктов. Эти добавки можно использовать отдельно или в сочетании. Как правило, но необязательно, количества добавок находятся в порядке от 0 до 20 массовых частей на 100 массовых частей композиции.

Полезные эффекты изобретения

Как описано ранее, экстракт трав из смеси Dioscorea Rhizoma:Dioscorea nipponica 3,5:1 (мас./мас.) в соответствии с настоящим изобретением обладает значительно более высоким синергическим действием в отношении увеличения уровня фактора роста нервов (NGF) in vivo, роста невритов и когнитивной способности по сравнению с аналогичными показателями для экстрактов только из Dioscorea Rhizoma или Dioscorea nipponica или смеси Dioscorea Rhizoma и Dioscorea nipponica в других массовых отношениях, и таким образом можно использовать в фармацевтических композициях и функциональных оздоровительных пищевых продуктах для предотвращения и лечения диабетической периферической нейропатии.

Краткое описание чертежей

Фиг. 1 представляет собой электронные фотоснимки, демонстрирующие эффект экстракта примера 1 на седалищный нерв мышей с диабетом 1 типа.

Фиг. 2 представляет собой электронные фотоснимки, демонстрирующие эффект экстракта примера 1 на седалищный нерв крыс с диабетом 1 типа.

Способ осуществления изобретения

Лучшее понимание настоящего изобретения можно получать посредством следующих ниже примеров, которые приведены для иллюстрации, и не следует их интерпретировать как ограничивающие настоящее изобретение.

Пример 1: Получение экстракта смеси Dioscorea Rhizoma и Dioscorea nipponica

Dioscorea Rhizoma и Dioscorea nipponica, обе в сухом состоянии, приобретали в магазине лекарственных трав на рынке Kyoungdong, Корея. Затем из них удаляли примеси, травы измельчали с использованием устройства для нарезания и смешивали в массовом отношении Dioscorea Rhizoma:Dioscorea nipponica 3,5:1. К 2 кг смеси добавляли 10 л 50% раствора этанола с последующей инкубацией при комнатной температуре в течение 48 часов при перемешивании. Смесь трав удаляли фильтрованием и концентрировали фильтрат в вакууме и сушили сублимацией с получением смешанного экстракта трав (неочищенного экстракта) (см. таблицу 1)

Таблица 1Выход продукта объединенного травяного экстракта по изобретению
Пример	Количество вещества	Растворитель	Количество растворителя	Промывание	Температура экстракции	Время экстракции	Неочищенный экстракт (г)	Выход продукта (%)
D. Rhizoma	D. nipponica
Пример 1	1,55 кг	0,45 кг	50% EtOH	10 л	1 л	Комнатная температура	2 суток	212,85	10,64

Сравнительный пример 1: Получение экстракта Dioscorea Rhizoma

Экстракт Dioscorea Rhizoma (неочищенный экстракт) получали таким же образом, как в примере 1, за исключением того, что использовали 2 кг Dioscorea Rhizoma вместо 2 кг смеси (см. таблицу 2).

Сравнительный пример 2: Получение экстракта Dioscorea nipponica

Экстракт Dioscorea nipponica (неочищенный экстракт) получали таким же образом, как в примере 1, за исключением того, что использовали 2 кг Dioscorea nipponica вместо 2 кг смеси (см. таблицу 2).

Таблица 2Выход продукта соответствующих экстрактов из D. Rhizoma и D. Nipponica
№ сравнит. примера	Количество вещества	Растворитель	Количество растворителя	Промывание	Температура экстракции	Время экстракции	Неочищенный экстракт (г)	Выход продукта (%)
D. Rhizoma	D. nipponica
1	2 кг	-	50% EtOH	10 л	1 л	Комнатная температура	2 суток	253,8	12,69
2	-	2 кг	50% EtOH	10 л	1 л	Комнатная температура	2 суток	160,0	8,00

Сравнительный пример 3-10: Получение экстрактов из смеси Dioscorea Rhizoma и Dioscorea nipponica

Использовали аналогичные травы Dioscorea Rhizoma и Dioscorea nipponica, как использовали в примере 1. Dioscorea Rhizoma и Dioscorea nipponica измельчали с использованием устройства для нарезания и смешивали в массовых отношениях, указанных в таблице 3. К 2 кг каждой смеси добавляли 10 л 50% раствора этанола с последующей инкубацией при комнатной температуре в течение 48 часов при перемешивании. Смеси трав удаляли фильтрованием и концентрировали фильтрат в вакууме и сушили сублимацией с получением смешанных экстрактов трав (неочищенные экстракты).

Таблица 3Выход продукта объединенного экстракта смеси D. Rhizoma и D. Nipponica
№ сравнит. примера	Количество вещества	Растворитель	Промывание	Температура экстракции	Время экстракции	Неочищенный экстракт (г)	Выход продукта (%)
D. Rhizoma	D. nipponica	Вид	Количество
3	1	1	50% EtOH	10 л	1 л	Комнатная температура	2 суток	179,05	8,95
4	1,33	0,67	50% EtOH	10 л	1 л	Комнатная температура	2 суток	135,96	6,80
5	1,67	0,33	50% EtOH	10 л	1 л	Комнатная температура	2 суток	160,07	8,00
6	1,82	0,18	50% EtOH	10 л	1 л	Комнатная температура	2 суток	138,75	6,93
7	0,67	1,33	50% EtOH	10 л	1 л	Комнатная температура	2 суток	153,56	7,68
8	0,45	1,55	50% EtOH	10 л	1 л	Комнатная температура	2 суток	139,15	6,96
9	0,33	1,67	50% EtOH	10 л	1 л	Комнатная температура	2 суток	181,06	9,05
10	0,18	1,82	50% EtOH	10 л	1 л	Комнатная температура	2 суток	146,43	7,32

Тестовый пример 1: Тестирование уровня in vivo фактора роста нервов на модели на здоровых мышах

Оценивали способность неочищенного экстракта с 50% этанолом в примере 1 индуцировать секрецию фактора роста нервов in vivo (O. Arrieta and J. Sotelo et al., Retinoic acid increases tissue and plasma contents of nerve growth factor and prevents neuropathy in diabetic mice. European Journal of Clinical Investigation (2005) 35).

Самцов мышей ICR каждый массой 25~30 г акклиматизировали в течение 1 недели при 22-24ºC при относительной влажности 60-80% при содержании на воде и стандартном корме. Их разделяли на группы в зависимости от массы. Получаемые в обоих примерах экстракты перорально вводили в предопределенных количествах мышам с использованием габапентина в качестве положительного контроля при дозе 100 мг/кг, через 16 часов у мышей отбирали образцы крови. Затем их умерщвляли для выделения седалищного нерва и слюнных желез.

Затем образцы крови центрифугировали при 10000 об./мин. в течение 10 минут, уровни фактора роста нервов в таким образом выделенной плазме измеряли ELISA (ABS 450 нм). Седалищный нерв и слюнные железы взвешивали и добавляли раствор, содержащий 100 мМ Tris-HCl, 1M NaCl, 2% BSA, 4 мМ ЭДТА, 2,0% Trtion®X-100, 0,02% азида натрия, 0,1 мг/мл пепстатина А, 5 мг/мл апротонина, 0,5 мг/мл противоболевого средства, 167 мг/мл бензамидина и 5,2 мг/мл PMSF, в пропорциональных массам количествах с последующей гомогенизацией. Гомогенаты инкубировали в течение 15 минут с 1н. HCl в количестве 1 мкл/50 мкл для окисления и нейтрализовали 1н. NaOH в количестве 1 мкл/50 мкл. Для получения супернатантов проводили центрифугирование при 10000 об./мин. в течение 10 минут. Как и в плазме, в седалищном нерве и слюнных железах количественно анализировали уровни фактора роста нервов.

Данные приведены в таблице 4 для уровней NGF в плазме, в таблице 5 для уровней NGF в седалищном нерве и в таблице 6 для уровней NGF в слюнной железе.

Таблица 4Уровень NGF в плазме
Группа	Количество вещества (кг)	Массовое отношение D. Rhizoma:D. nipponica	Доза (мг/кг)	Уровень NGF в плазме (пг/мл)
D. Rhizoma	D. nipponica
Контроль					601,5
Пример 1	1,55	0,45	3,5:1	100	1106,9
Сравнит. пример 1	2	-	-	100	606,2
Сравнит. пример 2	-	2	-	100	602,1
Сравнит. пример 3	1	1	1:1	100	663,6
Сравнит. пример 4	1,33	0,67	1:2	100	689,9
Сравнит. пример 5	1,67	0,33	5:1	100	725,6
Сравнит. пример 6	1,82	0,18	10:1	100	696,8
Сравнит. пример 7	0,67	1,33	1:2	100	607,0
Сравнит. пример 8	0,45	1,55	1:3,5	100	656,0
Сравнит. пример 9	0,33	1,67	1:5	100	642,6
Сравнит. пример 10	0,18	1,82	1:10	100	640,7
Габапентин				100	610,4

При введении в аналогичной дозе, как можно видеть в таблице 4, наблюдали, что экстракт Dioscorea Rhizoma сравнительного примера 1, экстракт Dioscorea nipponica сравнительного примера 2 и экстракты из смеси Dioscorea Rhizoma и Dioscorea nipponica сравнительных примеров 3-10 индуцировали секрецию фактора роста нервов в плазме в той же степени, что и контроль. В противоположность этому, экстракт примера 1 увеличивал уровень NGF в плазме в большей степени по сравнению с уровнем, получаемым при введении экстракта Dioscorea Rhizoma, экстракта Dioscorea nipponica или экстрактов из смеси Dioscorea Rhizoma и Dioscorea nipponica в других массовых отношениях.

Увеличение уровня фактора роста нервов в плазме, путь по которому фактор роста нервов двигается к мишеням, свидетельствует об индукции секреции фактора роста нервов. Таким образом, экстракт из смеси Dioscorea Rhizoma:Dioscorea nipponica 3,5:1 (мас./мас.) в соответствии с настоящим изобретением дополнительно индуцирует секрецию фактора роста нервов, значительно повышая уровень NGF in vivo по сравнению с экстрактами из одной Dioscorea Rhizoma, одной Dioscorea nipponica или из смеси Dioscorea Rhizoma и Dioscorea nipponica в других массовых отношениях.

Таблица 5Уровень NGF в седалищном нерве
Группа	Количество вещества (кг)	Массовое отношение D. Rhizoma:D. nipponica	Доза (мг/кг)	Уровень NGF в седалищном нерве (пг/мг)
D. Rhizoma	D. nipponica
Контроль					3,3
Пример 1	1,55	0,45	3,5:1	100	7,5
Сравнит. пример 1	2	-	-	100	3,8
Сравнит. пример 2	-	2	-	100	3,6
Сравнит. пример 3	1	1	1:1	100	4,6
Сравнит. пример 4	1,33	0,67	1:2	100	4,1
Сравнит. пример 5	1,67	0,33	5:1	100	4,0
Сравнит. пример 6	1,82	0,18	10:1	100	3,2
Сравнит. пример 7	0,67	1,33	1:2	100	5,1
Сравнит. пример 8	0,45	1,55	1:3,5	100	4,6
Сравнит. пример 9	0,33	1,67	1:5	100	4,0
Сравнит. пример 10	0,18	1,82	1:10	100	4,9
α-липоевая кислота				50	5,0
Габапентин				100	4,2

Наблюдения показали, что при введении в аналогичной дозе, как можно видеть в таблице 5, экстракт Dioscorea Rhizoma сравнительного примера 1, экстракт Dioscorea nipponica сравнительного примера 2 и экстракты из смеси Dioscorea Rhizoma и Dioscorea nipponica сравнительных примеров 3-10 вызывали секрецию фактора роста нервов в седалищном нерве в той же степени, что и контроль. В противоположность этому, экстракт примера 1 увеличивал уровень NGF в седалищном нерве в большей степени по сравнению с уровнем, получаемым при введении экстракта Dioscorea Rhizoma, экстракта Dioscorea nipponica или экстрактов из смеси Dioscorea Rhizoma и Dioscorea nipponica в других массовых отношениях.

Таким образом, экстракт из смеси Dioscorea Rhizoma:Dioscorea nipponica 3,5:1 в соответствии с настоящим изобретением может индуцировать секрецию NGF в кровь, что приводит к значительному увеличению уровня NGF в седалищном нерве, ткани-мишени.

Таблица 6Уровень NGF в слюнной железе
Группа	Количество вещества (кг)	Массовое отношение D. Rhizoma:D. nipponica	Доза (мг/кг)	Уровень NGF в слюнной железе (нг/мг)
D. Rhizoma	D. nipponica
Контроль					166,1
Пример 1	1,55	0,45	3,5:1	100	221,7
Сравнит. пример 1	2	-	-	100	171,6
Сравнит. пример 2	-	2	-	100	170,1
Сравнит. пример 3	1	1	1:1	100	206,2
Сравнит. пример 4	1,33	0,67	2:1	100	193,3
Сравнит. пример 5	1,67	0,33	5:1	100	177,4
Сравнит. пример 6	1,82	0,18	10:1	100	202,5
Сравнит. пример 7	0,67	1,33	1:2	100	173,4
Сравнит. пример 8	0,45	1,55	1:3,5	100	200,2
Сравнит. пример 9	0,33	1,67	1:5	100	181,2
Сравнит. пример 10	0,18	1,82	1:10	100	188,1
α-липоевая кислота				50	164,4
Габапентин				100	193,1

Как видно из данных таблицы 6, при введении в аналогичной дозе экстракт Dioscorea Rhizoma сравнительного примера 1 и экстракт Dioscorea nipponica сравнительного примера 2 увеличивали уровень NGF в слюнных железах только на 2-3% по сравнению с контролем, тогда как экстракты из смеси Dioscorea Rhizoma и Dioscorea nipponica сравнительных примеров 3-10 индуцировали секрецию NGF в слюнных железах в той же степени или менее по сравнению с секрецией, получаемой при положительном контроле габапентином. В противоположность этому, экстракт примера 1 повышал уровень NGF в слюнных железах на 33,5%. Таким образом, экстракт по настоящему изобретению обеспечивал значительное увеличение уровня NGF в слюнной железе по сравнению с экстрактами из одной Dioscorea Rhizoma, одной Dioscorea nipponica или смеси Dioscorea Rhizoma и Dioscorea nipponica в других массовых отношениях. Увеличение уровня NGF в слюнной железе, которая функционирует как источник NGF, означает индукцию синтеза NGF.

Таким образом, экстракт трав смеси Dioscorea Rhizoma:Dioscorea nipponica 3,5:1 (мас./мас.) может значительно повышать уровень NGF in vivo.

Таким образом, вследствие своей способности значительно повышать уровень NGF in vivo экстракт трав смеси Dioscorea Rhizoma:Diosc