Новый опухолевый биомаркер

Новый опухолевый биомаркер

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Область изобретения

Настоящее изобретение связано с диагностикой и лечением опухолей, в частности, с новым опухолевым биомаркером, а также со способами и наборами для детектирования возникновения злокачественной опухоли и матастазов. Настоящее изобретение связано также со способами и лекарственными средствами для лечения злокачественной опухоли и/или ее матастазов.

Предшествующий уровень техники

В настоящее время ежегодно во всем мире приблизительно у 11 миллионов людей диагностируют опухоли, и предполагается, что к 2020 году это количество возрастет более чем до 16 миллионов. В 2005 году из 58 миллионов смертей 7,6 миллионов было вызвано злокачественной опухолью (что составляет приблизительно 13%). Это количество возрастет, и предполагается, что к 2015 и 2030 годам от злокачественных опухолей погибнет, соответственно, 9 и 11,4 миллиона человек. (Всемирная Организация Здравоохранения, 2006).

Опухолевые маркеры являются веществами, количество которых уменьшается или увеличивается при генных мутациях или в результате вариации экспрессии генов в процессе клеточного канцерогенеза. Обычно опухолевые маркеры включают в себя антигены и другие биологически активные вещества, которые могут быть использованы для раннего детектирования злокачественных опухолей, а также для мониторинга прогрессии заболевания и реакции на лечение (ASCO, 1996). Это создает огромные преимущества для клинического лечения злокачественных опухолей, в особенности когда злокачественную опухоль удается обнаружить еще до появления какого-либо заметного клинического признака, или когда опухолевые маркеры могут быть использованы для мониторинга реакции пациентов на конкретный вид лечения. В настоящее время на развитие опухолевых маркеров затрачиваются бульшие усилия, с тем, чтобы полнее удовлетворить клинические потребности.

Применимость большей части опухолевых биомаркеров, используемых в настоящее время в клинике, более или менее ограничена в силу недостаточной чувствительности и специфичности. Например, уровень AFP [альфа-фетопротеин] и ультразвуковые исследования широко используются для детектирования рака печени. Хотя их чувствительность и не очень высока, они действительно продлевают срок выживаемости пациентов при диагностировании у людей наличия высокой степени риска. Опухолевый антиген CA-125 имеет повышенную чувствительность, но лишен специфичности. Сходным образом, опухолевый биомаркер CA15-3 в крови, показатель злокачественной опухоли молочной железы, трудно использовать для ранней диагностики ввиду его низкой чувствительности. Следовательно, в настоящее время способы раннего детектирования рака и определение злокачественности опухоли в клинике недоступны. Необходимо развитие новых технологий, а также новых способов.

Развитие опухолевой протеомики дает основание надеяться на возможность идентификации новых опухолевых биомаркеров и скрининга, ранней диагностики и прогнозирования опухолей. Злокачественная трансформация опухолей всегда приводит к изменению экспрессии белков, которая может быть идентифицирована и количественно оценена на белковом уровне. Таким образом, можно получить большое количество информации и данных, посредством которых можно будет открывать потенциальные биомаркеры и оценивать их в плане дальнейшего развития и клинических применений.

Hsp90α (белок теплового шока 90α, Hsp90α) является молекулярным шапероном, функционирование которого связано со стабилизацией зависимых от него белков в их активных состояниях. Hsp90α является одним из наиболее изобилующих белков в эукариотических клетках и составляет примерно 1-2% от общего количества клеточных белков. Внутриклеточный Hsp90α главным образом функционирует, стабилизируя связанные с ним белки (то есть рецептор эстрогена), и способствует их созреванию (то есть некоторые киназы и сигнальные белки). Кроме того, Hsp90α участвует также и в других физиологических явлениях, таких как эволюция мутировавших белков, реорганизация цитоскелета, транслокация ядерных белков, клеточная пролиферация и апоптоз, деградация белков, процессинг антигенов и распознавание ЛПС и т.д. Hsp90α связан также со многими заболеваниями, такими как злокачественные опухоли, аутоиммунные заболевания и сердечнососудистые заболевания. Например, моноклональное антитело против антигена последовательности LKVIRK, полученной из Hsp90α, может быть использовано для лечения инфекции, сопутствующей грибковой, и такое клиническое испытание проводится в настоящее время компанией Neutec (под коммерческим названием: Mycogrip).

Сообщалось также, что Hsp90α может быть секретирован под действием некоторых стимулов (Liao et al. (2000) J. Biol. Chem. 275, 189-96). Поскольку Hsp90α является классическим внутриклеточным белком, мало сообщений относительно функции внеклеточного Hsp90α. В известных ранее литературных источниках Hsp90α был идентифицирован как белок, облегчающий процессинг антигенов в клетках, в которых антиген подвергается процессингу (АПС, антиген-представляющие клетки), и было обнаружено, что он является одним из четырех белков в липополисахарид (ЛПС)-активирующихся кластерах, которые могут взаимодействовать с ЛПС таким образом, чтобы происходил запуск ответа внутриклеточных белков (Triantafilou et al. (2002) Trends in Immunology 23, 301-4).

Было обнаружено также, что Hsp90α в большом количестве экспрессируется на поверхности некоторых опухолевых клеток, включая клетки немелкоклеточного рака легкого, клетки меланомы и клетки рака печени (Ferrarini et al. (1992) Int. J. Cancer 51, 613-19). Предполагалось, что высокий уровень экспрессии Hsp90α на клеточной поверхности указанных клеток связан с процессингом антигена, тогда как прямых доказательств этого представлено не было.

Сообщалось также, что Hsp90α может способствовать транслокации трансмембранных белков (Schlatter et al. (2002) Biochem. J. 362, 675-84), а также то, что он связан с выходом из клеток некоторых лекарственных средств против лейкемии, рака легкого и рака шейки матки (Rappa et al. (2002) Oncol. Res. 12, 113-9 и Rappa et al. (2000) Anticancer Drug Des 15,127-34).

Внутриклеточный Hsp90α является важной мишенью для разработки противораковых лекарственных средств, поскольку он участвует в регуляции многих путей передачи сигналов, которые являются критичными в клеточном канцерогенезе. Ингибирование внутриклеточного Hsp90α может приводить к селективной деградации белков, связанных с клеточной пролиферацией, с контролем клеточного цикла, а также с апоптозом. В настоящее время считается, что некоторые известные антибиотики, такие как гелданамицин, радицикол и кумермицин A1 являются природными ингибиторами Hsp90α. В патенте WO 00/53169 описывается указанный механизм и высказывается предположение, что предотвращение взаимодействия между шаперонами и связанными с ними белками является способом ингибирования активности шаперонов. Считается, что в ряду указанных антибиотиков указанной активностью обладает кумарин и его производные. Однако ингибиторы, описанные в патенте WO 00/53169, в основном нацелены на внутриклеточный Hsp90α.

Аналог гелданамицина 17-AAG также является ингибитором Hsp90α, и в настоящее время он проходит проверку в клинических испытаниях. Однако в некоторых сообщениях показано, что 17-AAG может вызывать неспецифические ингибирующие эффекты и клеточную токсичность в результате взаимодействия со многими другими клеточными компонентами. Кроме того, в силу ограниченности познаний в отношении многообразия процессов передачи клеточных сигналов с участием Hsp90α и связанных с ним белков, непосредственное ингибирование внутриклеточного Hsp90α является рискованным.

В другом патенте (EP1457499A1) описана функция внеклеточного Hsp90α по облегчению инвазии опухолевой клетки путем содействия секреции или активации MMP-2. На основе указанных механизмов в данном патенте предполагается, что ингибирование внеклеточного Hsp90α может препятствовать опухолевой инвазии и метастазированию, и что путем детектирования ответа опухолевых клеток на лечение под действием ингибитора Hsp90α можно сделать заключение об инвазивной способности клеток и их связи с Hsp90α.

Авторы изобретения по заявке на патент WO/2008/070472 предлагают осуществлять мониторинг противоопухолевой эффективности терапии, нацеленной на Hsp90α, путем детектирования в плазме Hsp90α и других связанных с ним факторов. В указанной заявке ими на мышиных моделях определена взаимосвязь между уровнем Hsp90α в плазме и эффективностью нацеленной на Hsp90α терапии с помощью ингибиторов этого белка, включая 17-AAG и 17-DMAG, а также взаимосвязь между уровнем Hsp90α в плазме и объемом опухоли. Однако ими не было представлено никакого доказательства относительно точной формы плазматического Hsp90α и не было приведено соотношения между уровнем Hsp90α в плазме и злокачественностью опухоли, в частности, опухолевыми метастазами. Ими не было предложено также и применение плазматического Hsp90α в качестве независимого опухолевого биомаркера в диагностике и прогнозировании опухолей.

Одна из групп исследователей сообщала, что сывороточный уровень Hsp90α связан со стадиями немелкоклеточного рака легких (Xu et al. (2007) J. Cancer Mol. 3, 107-112). Сывороточный уровень Hsp90α у этих пациентов с раком легких был значительно выше, чем у нормальных людей или у пациентов с доброкачественной опухолью. Однако в указанной публикации опять же не была идентифицирована ни точная форма сывороточного Hsp90α, ни его взаимосвязь с опухолевыми метастазами. Кроме того, в ней исследовался только немелкоклеточный рак легкого, тогда как взаимосвязь и специфичность сывороточного уровня Hsp90α в отношении рака молочной железы, рака печени и рака поджелудочной железы оставались неизвестными. Кроме того, в указанной публикации описано только количественное изменение сывороточного Hsp90α у опухолевых пациентов, там не представлено никакой информации относительно точного содержания Hsp90α в сыворотке, а также относительно порогового значения нормального или аномального уровня, что является необходимым для диагностики и прогнозирования опухолей.

Краткое содержание изобретения

Настоящее изобретение основано на обнаружении того, что уровень Hsp90α в крови коррелирует с развитием, злокачественностью и метастазированием многих типов злокачественных опухолей. Соответственно, Hsp90α в крови может быть использован в качестве нового опухолевого биомаркера. Авторы изобретения обнаружили, что Hsp90α в крови отличается от внутриклеточного Hsp90α тем, что он лишен четырех аминокислотных остатков на своем C-конце, по сравнению с внутриклеточным Hsp90α.

Следовательно, в одном из аспектов настоящее изобретение связано с изолированным полипептидом, содержащим аминокислотную последовательность SEQ ID NO:1 или состоящим из нее.

Полипептид согласно изобретению может быть фосфорилирован. В частности, в полипептиде согласно настоящему изобретению один или более аминокислотных остатков в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:1 в положениях, выбранных из группы, состоящей из Thr90, Ser231, Ser263, Tyr309 и их сочетания, фосфорилированы. Предпочтительно, чтобы в полипептиде согласно настоящему изобретению был фосфорилирован Thr90.

Полипептид согласно настоящему изобретению может служить в качестве опухолевого биомаркера. С помощью агента, специфически связывающегося с полипептидом согласно настоящему изобретению, можно осуществить детектирование уровня указанного полипептида в крови и, следовательно, определить наличие, степень злокачественности, а также метастазирование злокачественных опухолей.

Соответственно, в другом аспекте настоящее изобретение связано с применением агента, способного специфически связываться с полипептидом согласно настоящему изобретению, при изготовлении набора для определения наличия, стадии и/или метастазирования злокачественной опухоли у субъекта путем определения уровня полипептида согласно изобретению в плазме, для скрининга наличия злокачественной опухоли среди популяции высокого риска путем детектирования уровня полипептида согласно изобретению в плазме, для определения прогноза в отношении пациента, имеющего злокачественную опухоль, путем детектирования уровня полипептида согласно изобретению в плазме, для определения эффективности хирургического вмешательства, радиационной терапии или химиотерапии в отношении пациента, имеющего опухоль, путем детектирования уровня полипептида согласно настоящему изобретению в плазме.

Предпочтительно, чтобы указанный агент, способный к специфическому связыванию с полипептидом согласно изобретению, являлся антителом, специфичным в отношении данного полипептида. Предпочтительно, чтобы указанное антитело было моноклональным антителом или его антиген-связывающим фрагментом, таким как scFv, Fab, Fab' и F(ab')2. В одном из специфических воплощений указанное антитело является MAb E9 или D10, которое продуцируется клеточными линиями, депонированными, соответственно, под регистрационными номерами CGMCC No. 2903 или 2904.

Согласно настоящему изобретению, указанное антитело специфически связывается с полипептидом согласно изобретению и, предпочтительно, специфически связывается с полипептидом согласно изобретению, присутствующим в плазме. Предпочтительно, чтобы указанное антитело специфически связывалось с фосфорилированной формой полипептида согласно изобретению, где указанная фосфорилированная форма полипептида содержит один или более фосфорилированных аминокислотных остатков в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:1 в положениях, выбранных из группы, состоящей из Thr90, Ser231, Ser263, Tyr309 и их сочетания. Предпочтительно, чтобы Thr90 в полипептиде согласно настоящему изобретению был фосфорилирован.

В другом аспекте настоящее изобретение связано с применением ингибитора полипептида согласно изобретению при получении лекарственного средства для предотвращения или лечения метастазов злокачественной опухоли у субъекта. В одном из воплощений данного аспекта указанный ингибитор представляет собой антитело, специфичное в отношении полипептида согласно изобретению. Предпочтительно, чтобы указанное антитело было гуманизированным антителом или его антиген-связывающим фрагментом. В одном из воплощений указанное антитело специфически связывается с фосфорилированной формой полипептида согласно изобретению, где указанная фосфорилированная форма полипептида содержит один или более фосфорилированных аминокислотных остатков в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:1 в положениях, выбранных из группы, состоящей из Thr90, Ser231, Ser263, Tyr309 и их сочетания. В предпочтительном воплощении указанное антитело специфически связывается с полипептидом, который фосфорилирован в положении Thr90. В одном из специфических воплощений указанное антитело представляет собой MAb E9 или D10, продуцируемые клеточными линиями, депонированными, соответственно, под регистрационными номерами CGMCC No. 2903 или 2904.

В указанных выше аспектах настоящего изобретения указанной злокачественной опухолью может быть, например, рак легкого, рак печени, рак желудка, рак желудочно-кишечного тракта, рак пищевода, остеосаркома, рак поджелудочной железы, лимфома, рак толстой и прямой кишок, рак молочной железы, рак предстательной железы, рак ротовой полости, рак носоглотки, рак шейки матки, рак яичника, лейкемия, злокачественная меланома, саркома, почечноклеточный рак и холангиокарцинома.

Настоящее изобретение включает в себя также антитела, которые могут специфически связываться с полипептидом согласно настоящему изобретению в плазме. В одном из специфических аспектов указанное антитело представляет собой MAb E9 или D10, продуцируемые клеточными линиями, депонированными, соответственно, под регистрационными номерами CGMCC No. 2903 или 2904. Предпочтительно, чтобы указанное антитело было гуманизированным антителом или его антиген-связывающим фрагментом. В одном из воплощений указанное антитело специфически связывается с фосфорилированной формой указанного полипептида, где указанная фосфорилированная форма полипептида содержит один или более фосфорилированных аминокислотных остатков в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:1 в положениях, выбранных из группы, состоящей из Thr90, Ser231, Ser263, Tyr309 и их сочетания. В предпочтительном воплощении указанное антитело специфически связывается с полипептидом, который фосфорилирован в положении Thr90.

В другом аспекте настоящее изобретение связано со способом ингибирования инвазии и метастазирования злокачественной опухоли, включающим в себя стадию ингибирования фосфорилирования внутриклеточного Hsp90α в злокачественных клетках. В одном из воплощений настоящее изобретение связано со способом ингибирования инвазии и метастазирования злокачественной опухоли, включающим в себя стадию ингибирования фосфорилирования Hsp90α по Thr90 в злокачественных клетках. В одном из специфических воплощений данного аспекта указанный способ включает в себя стадию повышения экспрессии молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей протеинфосфатазу 5 (PP5) в злокачественных клетках, например, путем внедрения гена.

Краткое описание графического материала

Фиг.1: Уровень Hsp90α в плазме мышей-опухоленосителей значительно выше, чем таковой у нормальных мышей.

Фиг.2: Уровень Hsp90α в плазме пациентов значительно выше, чем таковой у нормальных людей.

Фиг.3: Исследование титра мышиных моноклональных антител E9 и D10.

Фиг.4: Стандартная кривая плазматического Hsp90α, полученная с помощью мышиного моноклонального антитела E9 и кроличьего поликлонального антитела S2 (сэндвич-ELISA).

Фиг.5: Количественное определение уровня Hsp90α в плазме у пациентов с раком легкого, печени, поджелудочной железы, а также у пациентов с доброкачественной ретенционной кистой молочной железы и миомой матки, полученное с помощью сэндвич-ELISA:

A: Уровень Hsp90α в плазме у пациентов с раком печени, измеряемый методом сэндвич-ELISA. Уровень Hsp90α в плазме у пациентов с доброкачественной опухолью печени варьирует от 2 до 10 нг/мл, преимущественно от 2 до 5 нг/мл, тогда как уровень Hsp90α в плазме у 69% (20/29) пациентов с раком печени составляет выше 50 нг/мл, что в среднем более чем в 10 раз выше, чем у пациентов с доброкачественной опухолью, и это согласуется с результатами вестерн-блоттинга. Это свидетельствует о том, что уровень Hsp90α в плазме положительно коррелирует со злокачественностью опухоли.

B: Уровень Hsp90α в плазме у пациентов с раком легкого, измеряемый методом сэндвич-ELISA. Уровень Hsp90α в плазме у 64% (9/14) пациентов с раком легкого составляет выше 50 нг/мл, что в среднем более чем в 10 раз выше, чем у пациентов с доброкачественной опухолью. Это свидетельствует о том, что уровень Hsp90α в плазме положительно коррелирует со злокачественностью опухоли.

C: Уровень Hsp90α в плазме у пациентов со злокачественной опухолью молочной железы, измеряемый методом сэндвич-ELISA. По сравнению с пациентами с доброкачественной опухолью, наиболее высокий уровень Hsp90α в плазме составляет более чем 5-кратное повышение. В целом повышение среднего уровня Hsp90α в плазме пациентов со злокачественной опухолью молочной железы является статистически значимым по сравнению с таковым у пациентов с доброкачественной опухолью.

D: Уровень Hsp90α в плазме у пациентов со злокачественной опухолью поджелудочной железы, измеряемый методом сэндвич-ELISA. Уровень Hsp90α в плазме у 100% (10/10) пациентов со злокачественной опухолью поджелудочной железы составляет более 50 нг/мл, что в среднем более чем в 10 раз выше, чем у пациентов с доброкачественной опухолью. Это свидетельствует о том, что уровень Hsp90α в плазме положительно коррелирует со злокачественностью опухоли.

Фиг.6: Количественное определение уровня Hsp90α в плазме пациентов со злокачественной опухолью при наличии или отсутствии у них метастазов, предпринятое с помощью метода сэндвич-ELISA:

A: Пациентов со злокачественной опухолью печени делили на две группы, в одной из которых пациенты имели метастазы, а в другой не имели метастазов, и затем в указанных двух группах сравнивали уровни Hsp90α. Уровни Hsp90α в плазме пациентов со злокачественной опухолью и метастазами всегда были выше 200 нг/мл, тогда как у пациентов без метастазов они колебались от 50 до 200 нг/мл.

B: Пациентов со злокачественной опухолью легкого делили на две группы, в одной из которых пациенты имели метастазы, а в другой не имели метастазов, и затем в указанных двух группах сравнивали уровни Hsp90α. Уровни Hsp90α в плазме пациентов со злокачественной опухолью и метастазами всегда были выше 200 нг/мл, тогда как у пациентов без метастазов они колебались от 50 до 200 нг/мл.

C: Пациентов со злокачественной опухолью молочной железы делили на две группы, в одной из которых пациенты имели метастазы, а в другой не имели метастазов, а затем в указанных двух группах сравнивали уровни Hsp90α. Уровни Hsp90α в плазме пациентов со злокачественной опухолью и метастазами всегда были статистически значимо выше таковых у пациентов без метастазов.

Фиг.7: Количественное определение уровня Hsp90α в плазме пациентов с воспалением (пневмония и гепатит), здоровых людей и опухолевых пациентов, предпринятое с помощью метода сэндвич-ELISA:

A: Для того, чтобы убедиться, что повышенный уровень Hsp90α в плазме пациентов со злокачественной опухолью является опухолеспецифическим, авторы изобретения сравнивали уровень Hsp90α в плазме пациентов с пневмонией, в плазме здоровых людей и опухолевых пациентов, и обнаружили, что уровень Hsp90α в плазме пациентов с пневмонией изменяется в интервале от 2 до 10 нг/мл, что указывает на статистически незначимые изменения по сравнению с таковыми у нормальных людей.

B: Уровень Hsp90α в плазме пациентов с гепатитом (гепатит A и B) колеблется от 2 до 10 нг/мл, что указывает на отсутствие статистически значимых изменений по сравнению с таковыми у нормальных людей.

Фиг.8: Hsp90α в плазме, секретируется опухолевыми клетками.

Фиг.9: Hsp90α, секретируемый опухолевыми клетками, представляет собой форму, укороченную на C-конце.

Фиг.10: Плазматический Hsp90α лишен четырех C-концевых аминокислотных остатков.

Фиг.11: Плазматический Hsp90α является фосфорилированным.

Фиг.12: Уровень Hsp90α, фосфорилированного по остатку Thr90, в плазме пациентов-опухоленосителей повышен.

Фиг.13: В плазме пациентов-опухоленосителей повышение уровня Hsp90α, фосфорилированного по остатку Thr90, сопоставимо с уровнем Hsp90α.

Фиг.14: Фосфорилирование Hsp90α по остатку Thr90 является необходимым условием, предшествующим секреции Hsp90α.

Фиг.15: Протеинфосфатаза 5 (PP5) осуществляет дефосфорилирование Hsp90α, фосфорилированного по остатку Thr90.

A: Очищенную PP5 инкубировали совместно с Hsp90α, фосфорилированным по остатку Thr90 (pT90-Hsp90α), и количественно оценивали выделяющуюся фосфатную группу. Пептид является положительным контролем. В результате было показано, что PP5 может напрямую осуществлять дефосфорилирование Hsp90α, фосфорилированного по остатку Thr90.

B: В клетках линии MCF-7 злокачественной опухоли молочной железы человека повышенная экспрессия человеческой PP5 приводит к ингибированию Thr90-фосфорилирования Hsp90α (составляя 0,55 такового в контрольной группе), а РНК-интерференция эндогенной человеческой PP5 приводит к повышению Thr90-фосфорилирования Hsp90α (составляя 1,58 такового в контрольной группе).

Фиг.16: PP5 регулирует секрецию Hsp90α.

A: В линии клеток MCF-7 злокачественной опухоли молочной железы человека повышенная экспрессия человеческой PP5 приводит к ингибированию секреции Hsp90α.

B: В линии клеток MCF-7 злокачественной опухоли молочной железы человека РНК-интерференция эндогенной человеческой PP5 приводит к повышению секреции Hsp90α.

Фиг.17: Взаимозависимость уровня экспрессии PP5 и уровня секреции Hsp90α.

Фиг.18: Взаимозависимость уровня экспрессии PP5 и инвазивной способности опухолевых клеток.

Фиг.19: Специфическое антитело против Hsp90α может ингибировать миграцию опухолевых клеток.

Фиг.20: Специфическое антитело против Hsp90α может ингибировать метастазирование опухоли.

Информация, связанная с депонированием биологических материалов

Линию клеток мышиной гибридомы SP2/0-Agl4, которая продуцирует моноклональное антитело E9, депонировали в Китайском Центре Коллекционирования Общих Микробиологических Культур (CGMCC, Chinese Academy of Sciences Institute of Microbiology, Datun Road, Chaoyang District, Beijing) 24 февраля 2009 года под регистрационным номером No. CGMCC No.2903.

Линию клеток мышиной гибридомы SP2/0-Agl4, которая продуцирует моноклональное антитело E9, депонировали в Китайском Центре Коллекционирования Общих Микробиологических Культур (CGMCC, Chinese Academy of Sciences Institute of Microbiology, Datun Road, Chaoyang District, Beijing) 24 февраля 2009 года под регистрационным номером No. CGMCC No.2904.

Подробное описание изобретения

Канцерогенез вызывает изменения определенных путей передачи внутриклеточных сигналов, сопровождаемые изменениями экспрессии, модификации и распределения белков. Указанные изменения могут быть использованы для мониторинга развития и прогрессии опухоли, а указанные белки называются опухолевыми маркерами. С развитием технологий протеомики становится возможным осуществление мониторинга изменений опухолевого протеома качественно или количественно. Обнаружено много новых опухолевых маркеров, обеспечивающих более точные и достоверные данные для реализации клинической диагностики и прогноза опухолей.

Настоящее изобретение основано на открытии нового опухолевого маркера в плазме, то есть плазматического Hsp90α. По сравнению с внутриклеточным Hsp90α (аминокислотной последовательностью которого является последовательность SEQ ID NO:3, а кодирующей его последовательностью нуклеиновой кислоты является последовательность SEQ ID NO:4), плазматический Hsp90α имеет делецию 4 аминокислот на С-конце.

Соответственно, в одном из аспектов настоящее изобретение относится к изолированному полипептиду, Hsp90α, обнаруживаемому в плазме или в сыворотке, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:1 или состоит из нее. Используемый здесь термин "полипептид согласно изобретению" относится к Hsp90α, присутствующему в плазме или в сыворотке, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:1 или состоит из нее. Предпочтительно, чтобы используемый здесь термин "полипептид согласно изобретению" относился к полипептиду, состоящему из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:1. В настоящей заявке термин "Hsp90α в плазме" или "Hsp90α в сыворотке" может быть использован взаимозаменяемым образом, указывая на свободную форму белка Hsp90α, присутствующего в крови, в отличие от внутриклеточного или связанного с клеточной поверхностью белка Hsp90α. В таком применении термин "полипептид" и "белок" может быть использован взаимозаменяемым образом.

Настоящее изобретение относится также к полинуклеотиду, кодирующему полипептид, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:1 или состоящий из нее. В специфическом воплощении указанный полинуклеотид содержит или состоит из нуклеиновокислотной последовательности SEQ ID NO:2.

Авторы изобретения обнаружили также, что в плазме полипептид согласно изобретению представлен в фосфорилированной форме, в которой один или более аминокислотных остатков в аминокислотной последовательности, соответствующей SEQ ID NO:1, выбранных из группы, состоящей из Thr90, Ser231, Ser263, Tyr309 и их сочетаний, являются фосфорилированными. Предпочтительно, чтобы в полипептиде согласно настоящему изобретению фосфорилированным был остаток Thr90.

Такая специальная форма присутствующего в плазме Hsp90α (фосфорилированная и усеченная на C-конце) еще не описана. При этом никогда еще не было описано также и то, что плазматический белок Hsp90α связан с развитием и прогрессией опухоли. В документе EP1457499A1 описана внеклеточная форма Hsp90α, а также высказано предположение, что ингибиторы Hsp90α могут быть использованы для лечения опухолевых метастазов, для детекции инвазии опухоли и для определения зависимости инвазивности опухоли от Hsp90α. Однако способ, описанный в EP1457499A1, используется для детекции Hsp90α клеточной поверхности, и он не годится для определения Hsp90α в плазме. В патенте EP1457499A1 не содержится ни описание, ни предположение о том, что плазматический Hsp90α может быть использован для определения степени и стадии злокачественности или для мониторинга терапевтического ответа и прогнозирования злокачественной опухоли путем измерения уровня Hsp90α. В документе W0/2008/070472 сообщается о том, что эффекты противораковой терапии, нацеленной на Hsp90α, могут быть определены путем детектирования Hsp90α и связанных с ним факторов в плазме, но там нет указания на то, что Hsp90α является независимым опухолевым маркером в диагностике и прогнозировании злокачественной опухоли.

Авторы настоящего изобретения изучали образцы крови приблизительно одной сотни пациентов (с раком молочной железы, раком печени, раком поджелудочной железы, раком легкого и т.д.) и обнаружили, что уровень Hsp90α в плазме коррелирует со злокачественностью опухоли, а в особенности с метастазированием опухоли; в то же время воспалительный ответ не влияет на уровень Hsp90α в плазме. Следовательно, плазматический Hsp90α может служить в качестве опухолевого маркера, который может быть использован при диагностике и прогнозировании опухолей и метастазов.

Соответственно, в другом аспекте настоящее изобретение связано с набором для определения плазматических уровней полипептида согласно изобретению. Набор согласно изобретению содержит средство, способное специфически связываться с полипептидом согласно изобретению. Набор согласно изобретению может быть использован для детектирования уровня Hsp90α в плазме.

Настоящее изобретение связано также с применением средства, способного специфически связываться с полипептидом согласно изобретению, для изготовления набора для детектирования уровня Hsp90α в образце плазмы субъекта. Набор согласно изобретению может быть использован для определения наличия, злокачественности и метастазирования опухоли; для скрининга злокачественной опухоли в популяции высокого риска; для определения прогноза у пациентов со злокачественной опухолью; а также для определения эффективности лечения путем хирургического вмешательства, радиационной терапии или химиотерапии и/или для определения того, надо ли - или когда именно надо - прекращать указанное терапевтическое воздействие.

Используемый здесь термин "средство, способное специфически связываться с полипептидом согласно изобретению" относится к молекулам, которые могут с высокой степенью аффинности связываться с полипептидом согласно изобретению. Указанные средства включают в себя также молекулы, которые могут связываться с внутриклеточным Hsp90α и с Hsp90α клеточной поверхности. Средство, способное специфически связываться с полипептидом согласно изобретению, может быть представлено белками, в частности, антителами, специфичными в отношении Hsp90α. В предпочтительных примерах указанное выше антитело является моноклональным антителом или его антиген-связывающим фрагментом, таким как scFv, Fab, Fab' и F(ab')2. В специфическом воплощении указанные антитела являются моноклональным антителом E9 или D10, которые продуцируются клеточной линией с регистрационным номером депозита CGMCC No. 2903 или 2904, соответственно.

Моноклональные антитела получают путем скрининга клеток, которые могут секретировать указанные антитела, а затем путем культивирования таких клеток in vitro. Указанный способ хорошо известен специалистам в данной области (Kohler G & Milstein C. (1975) Nature. 256, 495-7). Способ получения Hsp90α-специфического моноклонального антитела является следующим: в качестве первой иммунизации, рекомбинантный человеческий Hsp90α (rhHsp90α, 100 мкг) с полным адъювантом Фрейнда подкожно инъецируют мышам BALB/c в несколько участков на бедре; через 3 недели такую же дозу rhHsp90α инъецируют внутрибрюшинно (в/б) с неполным адъювантом Фрейнда; третью иммунизацию производят через 3 недели путем в/б инъекции той же самой дозы (через 5 - 7 дней проверяют титр антител в крови); еще через 3 недели производят бустер-иммунизацию путем в/б введения 200 мкг rhHsp90α. Через 3 дня клетки селезенки сливают с гибридомой SP2/0-Ag14 (SP2/0) (источник: ATCC CRL-1581), используя HAT для скрининга. Затем осуществляют предельное разведение клеток гибридомы. Для идентификации и, в конечном счете, для селекции клеточных линий, которые могут секретировать специфичные в отношении Hsp90α антитела, были использованы методы иммуноблоттинга и ELISA.

Согласно настоящему изобретению, антитела, используемые для изготовления набора, могут специфически связываться с Hsp90α, и предпочтительно, с Hsp90α плазмы крови. В одном из воплощений указанные антитела специфически связываются с Hsp90α, в котором один или более из следующих аминокислотных остатков: Thr90, Ser231, Ser263, Tyr309 и их сочетание - являются фосфорилированными. В предпочтительном воплощении описанные здесь антитела могут специфически связываться с Hsp90α, содержащим фосфорилированный Thr90.

Настоящее изобретение связано также со способом детектирования уровня полипептида согласно изобретению в плазме. Уровень Hsp90α в плазме может быть детектирован любым из подходящих способов. Описанные здесь способы включают в себя прямой и непрямой способы детектирования полипептида согласно изобретению, который может быть использован для диагностики развития, злокачественности и метастазирования опухоли.

Прямые измерения включают в себя способы детектирования описанного полипептида согласно изобретению с помощью средства, способного специфически связываться с указанным полипептидом, например, с помощью антител, специфичных в отношении указанных полипептидов, методом вестерн-блоттинга или ELISA.

Концентрация Hsp90α может быть определена также и непрямым способом путем детектирования активности Hsp90α. Примером является анализ тепловой денатурации люциферазы, который может быть использован для детектирования активности шаперона Hsp90α (Johnson et al. (2000) J. Biol. Chem., 275, 32499-32507).

Предпочтительно, чтобы уровень Hsp90α в плазме можно было детектировать путем ELISA или вестерн-блоттинга, включающих в себя следующие стадии:

а) сбор цельной крови субъекта, например, пациента со злокачественной опухолью, и получение из нее плазмы или сыворотки путем центрифугирования;

b) детектирование с помощью методов ELISA или вестерн-блоттинга уровня Hsp90α в плазме или сыворотке, полученных на стадии (a), при этом образец плазмы здорового человека используется в качестве отрицательного контроля, а образец плазмы пациентов со злокачественными опухолями используется в качестве положительного контроля, и, необязательно, получение стандартной кривой концентрации Hsp90α; и

c) определение злокачественности и стадии опухоли в соответствии с уровнем Hsp90α в плазме, и, следовательно, определение диагноза, прогноза или эффективности лечения для данного субъекта.

На стадии (b) могут быть использованы также и другие методы, например, другие способы на основе реакций антиген-антитело, а также способы, основанные на других принципах прямого или непрямого отражения концентраций Hsp90α, например, способы определения концентрации Hsp90α путем детектирования активности Hsp90α.

Стандартный образец Hsp90α, используемый для получения стандартной кривой ELISA, может быть очищен из плазмы пациентов со злокачественной опухолью и может быть получен также с помощью рекомбинантных технологий. Стандартный образец Hsp90α может быть полноразмерным Hsp90α, его фрагментами, а также другими рекомбинантными белками или конъюгатами, содержащими последовательность Hsp90α. "Стандартная кривая концентрации Hsp90α" относится к корреляционной кривой между концентрацией Hsp90α и значениями поглощения, определяемыми при ELISA с использованием стандартных образцов Hsp90α. "Стандартный образец Hsp90α" относится к плазматическому белку Hsp90α, рекомбинантному белку Hsp90α, его фрагментам или производным со степенью чистоты выше 95%.

"Определение злокачественности опухоли" относится к вынесению заключения относительно злокачественности опухоли в результате изучения концентрации Hsp90α в образцах плазмы пациентов и сравнения полученной величины с отрицательным и положительным контролями.

Для определения уровня Hsp90α в плазме могут быть использованы как метод сэндвич-ELISA, так и конкурентный метод ELISA. Конкурентный метод ELISA с более высокой чувствительностью является предпочтительным.

Обычно метод сэндвич-ELISA включает в себя следующие стади