Гуманизация антител кролика с использованием универсального каркаса антитела

Гуманизация антител кролика с использованием универсального каркаса антитела

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Связанная информация

По настоящей заявке испрашивается приоритет US 61/075697, поданной 25 июня 2008 года; дополнительно испрашивается приоритет US 61/155041, поданной 24 февраля 2009 года и US61/155105 от 24 февраля 2009 года.

Предпосылки изобретения

Моноклональные антитела, их конъюгаты и производные являются очень важными с коммерческой точки зрения в качестве терапевтических и диагностических средств. Не являющиеся человеческими антитела вызывают сильный иммунный ответ у пациентов, как правило, после однократной инъекции в низкой дозе (Schroff, 1985 Cancer Res. 45:879-85, Shawler. J. Immunol. 1985 135:1530-5; Dillman, Cancer Biother. 1994 9:17-28). Поэтому было разработано несколько способов снижения иммуногенности антител мышей и других грызунов, а также технологии для получения полностью человеческих антител с использованием, например, трансгенных мышей или фагового дисплея. Были сконструированы химерные антитела, в которых скомбинированы вариабельные области грызунов и константные области человека (например, Boulianne Nature 1984 312:643-6), значительно уменьшая проблему иммуногенности (например, LoBuglio, Proc. Natl. Acad. Sci. 1989 86:4220-4; Clark, Immunol. Today 2000 21:397-402). Также сконструированы гуманизированные антитела, в которых собственно последовательность вариабельной области грызуна сконструирована таким образом, чтобы максимально соответствовать последовательности человека, сохраняя по меньшей мере исходные CDR, или где CDR антитела грызуна пересажены в каркас антитела человека (например, Riechmann, Nature 1988 332:323-7; US5693761). Поликлональные антитела кролика широко используют для биологических анализов, таких как ELISA или вестерн-блоттинг. Поликлональные антитела кролика как правило являются предпочтительными среди поликлональных антител грызунов, как правило, из-за их намного более высокой аффинности. Кроме того, у кролика часто можно получить хороший ответ антитела на антигены, которые вызывают слабый иммунный ответ у мышей и/или не являются источником удовлетворительных связывающих молекул при использовании в фаговом дисплее. Вследствие этих хорошо известных преимуществ антитела кролика могут быть идеальными для использования при исследовании и разработки терапевтических антител. Причина, по которой они широко не используются, в основном связана с техническими сложностями при получении моноклональных антител кролика. Так как у кроликов не известны опухоли, подобные миеломам, то для получения моноклональных антител кролика не может использоваться традиционная гибридомная технология. Впервые исследование способа получения клеточной линии-партнера для слияния с экспрессирующими антитела кролика клетки было проведено Knight et al. (Spieker-Polet et al., PNAS 1995, 92:9348-52), а улучшенная клеточная линия-партнер для слияния была описана Pytela et al. in 2005 (см. например патент США № 7429487). Однако эта технология не имеет широкого применения, так как ноу-хау в основном контролируется одной исследовательской группой. Для получения моноклональных антител в литературе описаны альтернативные способы, включающие клонирование антител из выбранных клеток, экспрессирующих антитела, посредством ОТ-ПЦР, но никогда еще не было публикаций об их успешном применении для антител кролика.

Полагают, что антитела кролика, подобно антителам мыши вызывают сильный иммунный ответ при использовании для лечения человека, таким образом, антитела кролика, перед тем, как их можно будет использовать клинически, необходимо гуманизировать. Однако способы, которые используют для получения гуманизированных антител грызунов, нельзя просто экстраполировать для антител кролика вследствие структурных различий между антителами кролика и мыши и, соответственно, между антителами кролика и человека. Например, CDR3 легкой цепи (CDR L3) часто является намного более длинной, чем ранее известные CDR L3 из антител человека или мыши.

На современном этапе развития в данной области было описано несколько подходов для гуманизации антител кролика, которые, однако, не являются классическим подходом для пересадки, в котором CDR не являющийся человеческим донорного антитела пересаживают на акцепторное антитело человека. В WO 04/016740 описан так называемый подход "изменения поверхности". Целью этого подхода "изменения поверхности" является модификация доступных для растворителя остатков не являющегося человеческим каркаса так, чтобы они становились более похожими на остатки человека. В данной области известны способы гуманизации антител кролика, подобные способам, описанным в WO 04/016740. В WO08/144757 и WO05/016950 описаны способы гуманизации моноклонального антитела кролика, включающие сравнение аминокислотных последовательностей исходного антитела кролика с аминокислотными последовательностями подобного антитела человека. Затем аминокислотную последовательность исходного антитела кролика изменяют так, чтобы его каркасные области были более похожи по последовательности с эквивалентными каркасными областями подобного антитела человека. Для получения хороших связывающих способностей для каждой иммуносвязывающей молекулы отдельно необходимо произвести трудоемкие опытно-конструкторские работы.

Возможной проблемой указанных выше подходов является то, что в них используют не каркас человека, а конструируют каркас кролика так, чтобы он выглядел более похожим на каркас человека. У такого подхода существует риск того, что участки аминокислот, находящиеся в сердцевине белка, все еще могут содержать иммуногенные T-клеточные эпитопы.

К настоящему времени заявители не нашли антител кролика, которые были гуманизированы с применением способов пересадки, существующих на современном уровне техники. Это можно объяснить тем, что CDR кролика может полностью отличаться от CDR человека или грызуна. Как известно в данной области, большинство цепей V_H кролика относительно вариантов мыши и человека содержат дополнительные спаренные цистеины. В дополнение к консервативному дисульфидному мостику, формирующемуся между cys22 и cys92, также существует мостик cys21-cys79, а также S-S-мостик между CDR, формирующийся в некоторых цепях кролика между последним остатком CDR H1 и первым остатком CDR H2. Кроме того, пары остатков цистеина часто находят в CDR L3. Кроме того, многие CDR антител кролика не подходят ни одной из ранее известных канонических структур. В частности, CDR L3 часто является намного длиннее, чем CDR L3 вариантов человека или мыши.

Таким образом, пересадка CDR из не являющихся человеческими антител в каркас человека является важной задачей белковой инженерии. Перенос антигенсвязывающих петель из эволюционировавшего в природе каркаса в другой искусственно выбранный каркас человека необходимо проводить так, чтобы природные конформации петель сохранялись для связывания антигена. Часто после пересадки петель аффинность связывания антигена значительно снижается или исчезает. Использование тщательно подобранных каркасов человека при пересадке антигенсвязывающих петель максимально повышает вероятность сохранения аффинности связывания у гуманизированной молекулы (Roguzka et al 1996). Хотя для множества экспериментов по пересадке, доступных в литературе, приведено приблизительное руководство для пересадки CDR, обобщить этот принцип невозможно. Характерные проблемы после пересадки петель CDR связаны с потерей специфичности, стабильности или возможности получения.

Таким образом, существует актуальная необходимость в улучшенных способах надежной и быстрой гуманизации антител кролика для применения в качестве терапевтических и диагностических средств. Кроме того, существует необходимость в акцепторных каркасах человека для надежной гуманизации антител кролика, обеспечивающих функциональные антитела и/или фрагменты антител с биофизическими свойствами, подобными лекарственным средствам.

Сущность изобретения

Неожиданно было обнаружено, что каркас высокорастворимого и стабильного антитела человека, идентифицированного анализом "контроль качества" (QC) (как описано в WO 0148017 и в Auf der Maur et al., (2001), FEBS Lett. 508, p. 407-412) особенно удобен для встраивания CDR из других, не являющихся человеком видов животных, например, CDR кролика. Таким образом, в первом аспекте изобретение относится к вариабельным областям легкой и тяжелой цепей конкретного антитела человека (так называемого, антитела "FW1.4"), которые особенно удобны в качестве универсального акцептора для CDR из ряда антител, в частности, из антител кролика, с различной специфичностью связывания, вне зависимости от присутствия или отсутствия в CDR дисульфидного мостика. Кроме того, настоящее изобретение относится к двум мутантным последовательностям каркаса указанного конкретного антитела человека, а именно rFW1.4 и rFW1.4(V2), которые оба являются каркасами, особенно подходящими в качестве универсальных акцепторных каркасов для пересадки CDR кролика. В другом аспекте изобретение относится к повтору каркасных остатков, который делает каркас человека подходящим для встраивания CDR из других, не являющихся человеком видов животных, в частности, CDR кролика.

Гуманизированные иммуносвязывающие молекулы, полученные пересадкой CDR кролика в эти высокосовместимые каркасы вариабельных областей тяжелой и легкой цепей, постоянно и надежно сохраняют пространственную ориентацию антител кролика, из которых получены донорные CDR. Таким образом, нет никакой необходимости вводить в акцепторный каркас какие-либо структурно значимые позиции донорной иммуносвязывающей молекулы. Вследствие этих преимуществ можно достичь высокопроизводительной гуманизации антител кролика без оптимизации или с незначительной оптимизацией связывающей способности.

Таким образом, в другом аспекте изобретение относится к способам пересадки CDR кролика и других не являющихся человеческими CDR, в каркасные последовательности легкой цепи и/или тяжелой цепи растворимого и стабильного антитела человека, описываемые в настоящем документе, таким образом, получая гуманизированные антитела с превосходными биофизическими свойствами. В частности, иммуносвязывающие молекулы, получаемые способами по изобретению, демонстрируют превосходные функциональные свойства, такие как растворимость и стабильность.

Краткое описание рисунков

На фигуре 1 представлено определение CDR H1, используемой в настоящем документе для пересадки антигенсвязывающих участков из моноклональных антител кролика в каркасы высокорастворимого и стабильного антитела человека.

На фигуре 2 схематически представлена B-клетка 1, меченная флуоресцентным антителом 2, взаимодействующая с экспрессирующей мишень клеткой 3, окрашенной внутриклеточным красителем 4. Выбранная мишень: 5; BCR: 6.

Фигура 3: способ отбора FACS B-клеток кролика, связывающихся с растворимой мишенью ESBA903. Фиг. 3A: лимфоциты отбирают по прямому и боковому рассеянию. Фиг. 3B: Среди них выбирают клетки IgG+ IgM- (вероятно B-клетки памяти) (красное окно). Фиг. 3C: Полагают, что клетки с двойным окрашиванием ESBA903-PE и ESBA903-PerCP (зеленое окно) кодируют высокоаффинное IgG против ESBA903. Клетки, демонстрирующие наибольшую яркость флуоресценции (розовое окно), сортировали в 96-луночные планшеты.

Фигура 4. Гранулы, покрытые антителами против TNF-альфа (мечеными PE), связываются с клетками CHO, трансфицированными TNF-альфа (верхняя панель). Контрольные гранулы, покрытые антителами против CD19 (мечеными APC) не связываются с клетками CHO, трансфицированными TNF-альфа (средняя панель). Гранул, покрытые антителами против TNF-альфа (мечеными PE), не связываются с клетками CHO дикого типа (wt) (нижняя панель). Точечные диаграммы слева демонстрируют прямое и боковое рассеяние, которое указывает, соответственно, на размер и степень детализации событий. Группу единичных гранул (≈3 мкм) отбирают в P2. Клетки CHO окончательно связанные с гранулами (≈30 мкм) отбирают в P1. Точечные диаграммы в середине демонстрируют события P1 (клетки CHO) относительно их окрашивания PE или APC. Таким образом, если клетки взаимодействуют с гранулами с антителами против TNF-альфа, они должны появится в окне P3, а если они взаимодействуют с гранулами с антителами против CD19, они должны появится в окне P4. Справа детализирована статистика для каждого из образцов.

Фигура 5. Гранулы, покрытые антителами против TNF-альфа-PE, и гранулы, покрытые антителами против CD19-APC смешивают вместе с клетками CHO, трансфицированными TNF-альфа. Клетки CHO отбирают (P1) и из них клетки, связывающиеся с гранулами, покрытыми антителами против TNF-альфа-PE, или гранулами, покрытыми антителами против CD19-APC показаны в окнах P3 и P4, соответственно. Несвязанные гранулы видны в окне P2.

Фигура 6. Анализ последовательностей антител кролика, извлеченных из базы данных Kabat, подтверждает, что CDR3 вариабельной области тяжелой цепи, как правило, на три аминокислоты длиннее, чем ее вариант мыши.

Подробное описание изобретения

Определения

Для простоты понимания настоящего изобретения ниже определены некоторые термины. На всем протяжении подробного описания указаны дополнительные определения.

Термин "антитело" относится к полноразмерным антителам и к любому антигенсвязывающему фрагменту. Термин "антигенсвязывающий полипептид" и "иммуносвязывающая молекула" используют в настоящем документе взаимозаменяемо. "Антитело" относится к белку, необязательно гликозилированному, содержащему по меньшей мере две тяжелых (H) цепи и две легких (L) цепи, соединенных между собой дисульфидными связями, или к его антигенсвязывающей части. Каждая тяжелая цепь состоит из вариабельной области тяжелой цепи (сокращаемой в настоящем документе как V_H) и константной области тяжелой цепи. Константная область тяжелой цепи состоит из трех доменов, C_H1, C_H2 и C_H3. Каждая легкая цепь состоит из вариабельной области легкой цепи (сокращаемой в настоящем документе как V_L) и константной области легкой цепи. Константная область легкой цепи состоит из одного домена, C_L. Области V_H и V_L можно дополнительно подразделить на области гипервариабельности, называемые определяющими комплементарность областями (CDR), расположенные между более консервативными областями, называемыми каркасными областями (FR). Каждая V_H и V_L состоит из трех CDR и четырех FR, расположенными от N-конца до C-конца в следующем порядке: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. Вариабельные области тяжелых и легких цепей содержат связывающий домен, который взаимодействует с антигеном. Константные области антител могут опосредовать связывание иммуноглобулина с тканями или факторами хозяина, включая различные клетки иммунной системы (например, эффекторные клетки) и первый компонент (C1q) классической системы комплемента.

Термин "антигенсвязывающая часть" антитела (или просто "часть антитела") относится к одному или нескольким фрагментам антитела, которые сохраняют способность специфически связываться с антигеном (например, TNF). Показано, что антигенсвязывающую функцию антитела могут осуществлять фрагменты полноразмерного антитела. Примеры связывающих фрагментов, охватываемых термином "антигенсвязывающая часть" антитела, включают (i) Fab-фрагмент, моновалентный фрагмент, состоящий из доменов V_L, V_H, C_L и C_H1; (ii) F(ab')₂-фрагмент, бивалентный фрагмент, содержащий два Fab-фрагмента, связанные дисульфидным мостиком в шарнирной области; (iii) Fd-фрагмент, состоящий из доменов V_H и C_H1; (iv) Fv-фрагмент, состоящий из доменов V_L и V_H одного плеча антитела; (v) один домен или фрагмент dAb (Ward et al., (1989) Nature 341:544-546), состоящий из домена V_H; и (vi) выделенная определяющая комплементарность область (CDR) или (vii) сочетание двух или более выделенных CDR, которые необязательно может соединять синтетический линкер. Кроме того, хотя два домена Fv-фрагмента, V_L и V_H, кодируются отдельными генами, их, используя рекомбинантные способы, можно соединять синтетическим линкером, который позволяет получать их в виде одной белковой цепи, в которой области V_L и V_H спарены с формированием моновалентных молекул (известных как одноцепочечные Fv (scFv); см. например, Bird et al., (1988) Science 242:423-426; и Huston et al., (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883). Такие одноцепочечные антитела также следует включать в термин "антигенсвязывающая часть" антитела. Эти фрагменты антител получают общепринятыми способами, известными специалистам в данной области, и фрагменты подвергают скринингу на полезность тем же способом, как и интактные антитела. Антигенсвязывающие части можно получать способами рекомбинантной ДНК, или ферментативным или химическим расщеплением интактных иммуноглобулинов. Антитела могут быть различного изотипа, например, антителом IgG (например, подтипов IgG1, IgG2, IgG3 или IgG4), IgA1, IgA2, IgD, IgE или IgM.

Термин "иммуносвязывающая молекула" относится к молекуле, содержащий весь антигенсвязывающий участок антитела или его часть, например, весь вариабельный домен тяжелой и/или легкой цепи или его часть так, что иммуносвязывающая молекула специфически распознает антиген-мишень. Неограничивающие примеры иммуносвязывающих молекул включают полноразмерные молекулы иммуноглобулинов и scFv, а также фрагменты антител, включая в качестве неограничивающих примеров (i) Fab-фрагмент, моновалентный фрагмент, состоящий из доменов V_L, V_H, C_L и C_H1; (ii) F(ab')₂-фрагмент, бивалентный фрагмент, содержащий два Fab-фрагмента, связанных дисульфидным мостиком в шарнирной области; (iii) фрагмент Fab', который по существу представляет собой Fab с частью шарнирной области (см., Fundamental Immunology (Paul ed., 3.sup.rd ed. 1993); (iv) Fd-фрагмент, состоящий из доменов V_H и C_H1; (v) Fv-фрагмент, состоящий из доменов V_L и V_H одного плеча антитела, (vi) однодоменное антитело, такое как фрагмент dAb (Ward et al., (1989) Nature 341:544-546), состоящий из домена V_H или V_L, антител верблюдовых (см. Hamers-Casterman, et al., Nature 363:446-448 (1993), и Dumoulin, et al., Protein Science 11:500-515 (2002)) или акул (например, нанотела® Ig-NAR акул; и (vii) нанотело, вариабельная область тяжелой цепи, содержащая один вариабельный домен и два константных домена.

Термин "одноцепочечное антитело", "одноцепочечный Fv" или "scFv" относится к молекуле, содержащий вариабельный домен тяжелой цепи антитела (или область; V_H) и вариабельный домен легкой цепи антитела (или область; V_L), соединенные линкером. Такие молекулы scFv могут иметь общую структуру: NH₂-V_L-линкер-V_H-COOH или NH₂-V_H-линкер-V_L-COOH. Подходящие линкеры на существующем уровне техники состоят из повторяющихся аминокислотных последовательностей GGGGS или их вариантов. В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения используют линкер (GGGGS)₄ с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:8, но также возможны варианты из 1-3 повторов (Holliger et al., (1993), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448). Другие линкеры, которые можно использовать по настоящему, изобретению описаны в Alfthan et al., (1995), Protein Eng. 8:725-731, Choi et al., (2001), Eur. J. Immunol. 31:94-106, Hu et al., (1996), Cancer Res. 56:3055-3061, Kipriyanov et al., (1999), J. Mol. Biol. 293:41-56 и Roovers et al., (2001), Cancer Immunol.

Как используется в настоящем документе, термин "функциональное свойство" представляет собой свойство полипептида (например, иммуносвязывающей молекулы), улучшение которого (например, относительно обычного полипептида) является желательным и/или предпочтительным для специалиста в данной области, например, для улучшения технологических свойств или терапевтической эффективности полипептида. В одном из вариантов осуществления функциональное свойство представляет собой стабильность (например, термостабильность). В другом варианте осуществления функциональное свойство представляет собой растворимость (например, в условиях клетки). В еще одном варианте осуществления функциональное свойство представляет собой характер агрегации. В другом варианте осуществления функциональное свойство представляет собой экспрессию белка (например, в прокариотической клетке). В еще одном варианте осуществления функциональное свойство представляет собой характер рефолдинга после растворения телец включения в производственном процессе. В определенных вариантах осуществления функциональное свойство не представляет собой улучшения аффинности связывания антигена. В другом предпочтительном варианте осуществления улучшение одного или нескольких функциональных свойств не оказывает значительного эффекта на аффинность связывания иммуносвязывающей молекулы.

Термин "CDR" относится к одной из шести гипервариабельных областей в вариабельных доменах антитела, которые в основном вносят вклад в связывание антигена. Одно из наиболее общеупотребительных определений для шести CDR предоставлено в Kabat E.A. et al., (1991) Sequences of proteins of immunological interest. NIH Publication 91-3242). Как используется в настоящем документе, определение CDR по Kabat используют только для CDR1, CDR2 и CDR3 вариабельного домена легкой цепи (CDR L1, CDR L2, CDR L3 или LI, L2, L3), а также для CDR2 и CDR3 вариабельного домена тяжелой цепи (CDR H2, CDR H3 или H2, H3). Однако, как используют в настоящем документе, CDR1 вариабельного домена тяжелой цепи (CDR H1 или H1) определяют по положениям остатков (нумерация по Kabat), начиная с положения 26 и заканчивая до положения 36. Это определение по существу представляет собой объединение CDR H1, различно определенного по Kabat и Chotia (также см. фигуру 1 для иллюстрации).

Как используется в настоящем документе термин "каркас антитела" относится к части вариабельного домена, V_L или V_H, которая служит в качестве поддержки для антигенсвязывающих петель (CDR) этого вариабельного домена. По существу он представляет собой вариабельный домен без CDR.

Термин "эпитоп" или "антигенная детерминанта" относится к участку на антигене, с которым специфически связывается иммуноглобулин или антитело (например, специфический участок на молекуле TNF). Как правило, эпитоп включает по меньшей мере 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 или 15 последовательных или не последовательных аминокислот в уникальной пространственной конформации. См., например, Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology, Vol. 66, G. E. Morris, Ed. (1996).

Термины "специфическое связывание", "селективное связывание", "селективно связывается" и "специфически связывается" относятся к связыванию антитела с эпитопом на предопределенном антигене. Как правило, антитело связывается с аффинностью (K_D) приблизительно менее 10^-7 M, такой как приблизительно менее 10^-8 M, 10^-9 M или 10^-10 M или даже менее.

Термин "K_D" или "K_d" относится к равновесной константе диссоциации конкретного взаимодействия антитело-антиген. Как правило, антитела по изобретению связываются с TNF с равновесной константой диссоциации (K_D) менее чем приблизительно 10^-7 M, такой как менее чем приблизительно 10^-8 M, 10^-9 M или 10^-10 M или даже менее, например, как определяют с применением технологии поверхностного плазмонного резонанса (SPR) на устройстве BIACORE.

Как используется в настоящем документе термин "молекула нуклеиновой кислоты", относится к молекулам ДНК и к молекулам РНК. Молекула нуклеиновой кислоты может быть одноцепочечной или двухцепочечной, но, предпочтительно, представляет собой двухцепочечную ДНК. Нуклеиновая кислота является "функционально связанной", если она находится в функциональной связи с другой последовательностью нуклеиновой кислоты. Например, промотор или энхансер функционально связан с кодирующей последовательностью, если он влияет на транскрипцию последовательности.

Термин "вектор" относится к молекуле нуклеиновой кислоты, способной к транспортировке другой нуклеиновой кислоты, с которой он соединен. В одном из вариантов осуществления вектор представляет собой "плазмиду", которая обозначает замкнутую кольцевую двухцепочечную ДНК в которую можно лигировать дополнительные участки ДНК. В другом варианте осуществления вектор представляет собой вирусный вектор, где дополнительные участки ДНК можно лигировать в вирусный геном. Векторы, описываемые в настоящем документе, могут быть способными к автономной репликации в клетке-хозяине, в которую их вводят (например, бактериальные векторы с бактериальным участком начала репликации и эписомные векторы млекопитающих), или могут интегрироваться в геном клетки-хозяина после введения в клетку-хозяина и, таким образом, реплицируются вместе с геномом хозяина (например, неэписомные векторы млекопитающих).

Термин "клетка-хозяин" относится к клетке, в которую вводят вектор экспрессии. Клетки-хозяева включают бактериальные, микробные, растительные или животные клетки, предпочтительно, клетки Escherichia coli, Bacillus subtilis; Saccharomyces cerevisiae, Pichia pastoris, CHO (линии китайского хомяка) или NSO.

Термин "зайцеобразные" относится к представителям таксономического порядка Lagomorpha, включающего семейства Leporidae (например, зайцы и кролики), и Ochotonidae (пищухи). В наиболее предпочтительном варианте осуществления, зайцеобразные представляет собой кролика. Как используется в настоящем документе термин "кролик" относится к животному, принадлежащему к семейству Leporidae.

Как используется в настоящем документе, "идентичность" относится к совпадению последовательностей двух полипептидов, молекул или двух нуклеиновых кислот. Когда положение в двух сравниваемых последовательностях занято одним и тем же основанием или одной и той же аминокислотной мономерной субъединицей (например, если положение в обоих из двух полипептидов занято лизином), тогда соответствующие молекулы являются идентичными по этому положению. "Процент идентичности" двух последовательностей представляет собой функцию количества идентичных положений, выявляемых в последовательностях с учетом количества пропусков и длины каждого пропуска, которые необходимо внести для оптимального выравнивания двух последовательностей. Как правило, сравнение проводят, когда две последовательности выровнены с получением максимума идентичности. Такое выравнивание можно проводить, например, с помощью алгоритма Needleman and Wunsch (J. Mol. Biol. (48):444-453 (1970)), на котором основана программа GAP в программный пакет GCG, с использованием матрицы Blossum 62 или матрицы PAM250, и весом пропуска 16, 14, 12, 10, 8, 6 или 4 и длиной пропуска 1, 2, 3, 4, 5 или 6.

Если не указано иного, все технические и научные термины, используемые в настоящем документе, имеют то же значение, как обычно понимает специалист в области, к которой принадлежит настоящее изобретение. Хотя в практическом осуществлении или тестировании настоящего изобретения можно использовать способы и материалы, сходные или эквивалентные способам и материалам, описываемым в настоящем документе, ниже описаны подходящие способы и материалы. В случае сомнений следует руководствоваться настоящим описанием. Кроме того, материалы, способы и примеры являются только иллюстративными и не предназначены для ограничения.

В приведенных ниже разделах подробнее описаны различные аспекты изобретения. Следует понимать, что различные варианты осуществления, наиболее предпочтительные варианты осуществления и диапазоны можно произвольно комбинировать. Кроме того, в зависимости от конкретного варианта осуществления выбранные определения, варианты осуществления или диапазоны могут не использоваться.

Если не указано иного, положения аминокислот указаны в соответствии со схемой нумерации AHo. Система нумерации AHo дополнительно описана в Honegger, A. and Pluckthun, A. (2001) J. Mol. Biol. 309:657-670). Альтернативно можно использовать нумерацию по системе Kabat, как дополнительно описано в Kabat et al., (Kabat, E. A., et al., (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242). Таблицы преобразования для двух различных систем нумерации, используемых для идентификации положений аминокислотных остатков в вариабельных областях тяжелых и легких цепей антител, предоставлены в A. Honegger, J. Mol. Biol. 309 (2001) 657-670.

В первом аспекте настоящее изобретение относится к универсальному акцепторному каркасу для пересадки CDR других видов животных, например, от кролика. Ранее описано, что антитела или производные антител, содержащие каркасы человека, идентифицированные в так называемом скрининге "контроль качества" (WO0148017), как правило, характеризуются высокой стабильностью и/или растворимостью. Хотя одноцепочечный каркас человека FW1.4 (комбинация SEQ ID NO:1 (называемого в WO03/097697 a43) и SEQ ID NO:2 (называемого в WO03/097697 KI27)) по характерным параметрам однозначно уступает в анализе "контроль качества", неожиданно обнаружено, что он обладает высокой собственной термодинамической стабильностью и хорошо продуцируется, притом в сочетании с рядом различных CDR. Стабильность этой молекулы в основном можно считать свойством ее каркасных областей. Кроме того, показано, что FW1.4 по существу высоко совместим с антигенсвязывающими участками антител кролика. Таким образом, FW1.4, представляет собой подходящую поддерживающую молекулу для конструирования стабильных гуманизированных фрагментов антител scFv, получаемых при пересадке петель кролика. Таким образом, в одном из аспектов изобретение относится к акцепторному каркасу иммуносвязывающей молекулы, содержащему последовательность V_H по меньшей мере на 90% идентичную SEQ ID NO:1, и/или последовательность V_L по меньшей мере на 85% идентичную SEQ ID NO:2, более предпочтительно, содержащему последовательность FW1.4 (SEQ ID NO:3), для пересадки CDR кролика, или последовательность по меньшей мере на 60%, более предпочтительно, по меньшей мере на 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% идентичную SEQ ID NO:3.

Кроме того, выявлено, что FW1.4 можно оптимизировать, замещая несколько остатков в положениях в тяжелой цепи FW1.4 и/или замещая остаток в 1 положении в легкой цепи FW1.4. Таким образом, неожиданно обнаружено, что конформация петель большого множества CDR кролика в V_H может полностью сохраняться, как правило, вне зависимости от последовательности донорного каркаса. Указанные остатки в тяжелой цепи, а также в 1 положении в легкой цепи FW1.4 являются консервативными в антителах кролика. Консенсусный остаток для положений в тяжелой цепи, а также одного положения в легкой цепи устанавливают на основании репертуара кролика и вводят в последовательность акцепторного каркаса человека.

Как результат, модифицированный каркас 1.4 (далее в настоящем документе, обозначаемый как rFW1.4) совместим практически с любой CDR кролика. Кроме того, rFW1.4, содержащая различные CDR кролика, хорошо экспрессируется и хорошо продуцируется в отличие от одиночных цепей кролика дикого типа и при этом почти полностью сохраняет аффинность исходного донорного антитела кролика.

Таким образом, настоящее изобретение относится к каркасу вариабельной области тяжелой цепи SEQ ID NO:1, дополнительно содержащему один или несколько аминокислотных остатков, которые, как правило, поддерживают конформацию CDR, получаемых из иммуносвязывающей молекулы кролика. В частности, указанные остатки находятся в одном или нескольких положениях аминокислот, выбранных из группы, состоящей из 24H, 25H, 56H, 82H, 84H, 89H и 108H (нумерация AHo). Доказано, что эти положения влияют на конформацию CDR и, таким образом, предусмотрены для мутации для встраивания донорных CDR. Предпочтительно, указанные один или несколько остатков выбраны из группы, состоящей из: треонина (T) в положении 24, валина (V) в положении 25, глицина или аланина (G или A) в положении 56, лизина (K) в положении 82, треонина (T) в положении 84, валина (V) в положении 89 и аргинина (R) в положении 108 (нумерация AHo). Предпочтительно, присутствуют по меньшей мере три, более предпочтительно, четыре, пять, шесть, а наиболее предпочтительно, все семь остатков. Неожиданно выявлено, что присутствие указанных остатков повышает стабильность иммуносвязывающей молекулы.

В предпочтительном варианте осуществления изобретение относится к акцепторному каркасу иммуносвязывающей молекулы, содержащему V_H по меньшей мере на 50%, более предпочтительно, по меньшей мере на 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% и даже, более предпочтительно, на 100% идентичную SEQ ID NO:4, при условии, что присутствуют по меньшей мере один, более предпочтительно, по меньшей мере три, более предпочтительно, четыре, пять, шесть, а наиболее предпочтительно, семь остатков из группы, содержащей треонин (T) в положении 24, валин (V) в положении 25, аланин (A) или глицин (G) в положении 56, треонин (T) в положении 84, лизин (K) в положении 82, валин (V) в положении 89 и аргинин (R) в положении 108 (нумерация AHo). В предпочтительном варианте осуществления акцепторный каркас иммуносвязывающей молекулы представляет собой акцепторный каркас иммуносвязывающей молекулы для CDR кролика.

В предпочтительном варианте осуществления указанный каркас вариабельной области тяжелой цепи представляет собой или содержит SEQ ID NO:4 или SEQ ID NO:6. Оба из указанных каркасов вариабельных областей тяжелых цепей можно, например, комбинировать с любым подходящим каркасом легкой цепи.

Таким образом, настоящее изобретение относится к акцепторному каркасу иммуносвязывающей молекулы, содержащему

(i) каркас вариабельной области тяжелой цепи по меньшей мере на 70% идентичный, предпочтительно, по меньшей мере на 75%, 80%, 85%, 90%, более предпочтительно, по меньшей мере на 95% идентичный SEQ ID NO:4; и/или

(ii) каркас вариабельной области легкой цепи по меньшей мере на 70% идентичный, предпочтительно, по меньшей мере на 75%, 80%, 85%, 90%, более предпочтительно, по меньшей мере на 95% идентичный SEQ ID NO:2.

В более предпочтительном варианте осуществления, каркас вариабельной области тяжелой цепи содержит треонин (T) в положении 24, глицин (G) в положении 56, треонин (T) в положении 84, валин (V) в положении 89 и аргинин (R) в положении 108 (нумерация AHo).

В предпочтительном варианте осуществления вариабельная область легкой цепи содержит треонин (T) в положении 87 (нумерация AHo).

В предпочтительном варианте осуществления указанный акцепторный каркас иммуносвязывающей молекулы содержит

(i) каркас вариабельной области тяжелой цепи, выбранный из группы, состоящей из SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:4 и SEQ ID NO:6; и/или

(ii) каркас вариабельной области легкой цепи SEQ ID NO:2 или SEQ ID NO:9.

В предпочтительном варианте осуществления каркас вариабельной области тяжелой цепи соединен с каркасом вариабельной области легкой цепи посредством линкера. Линкер может представлять собой любой подходящий линкер, например линкер, содержащий от 1 до 4 повторов последовательности GGGGS, предпочтительно, пептид (GGGGS)₄ (SEQ ID NO:8), или линкер, как описано в Alfthan et al. (1995) Protein Eng. 8:725-731.

В другом предпочтительном варианте осуществления акцепторный каркас иммуносвязывающей молекулы представляет собой последовательность по меньшей мере на 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, более предпочтительно, по меньшей мере на 95% идентичную SEQ ID NO:5, с тем условием, что последовательность, предпочтительно, не представляет собой SEQ ID NO:3. Более предпочтительно, акцепторный каркас иммуносвязывающей молекулы содержит или представляет собой SEQ ID NO:5.

В другом предпочтительном варианте осуществления акцепторный каркас иммуносвязывающей молекулы представляет собой последовательность по меньшей мере на 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, более предпочтительно, по меньшей мере на 95% идентичную SEQ ID NO:7, с тем условием, что последовательность, предпочтительно, не представляет собой SEQ ID NO:3. Более предпочтительно, акцепторный каркас иммуносвязывающей молекулы содержит или представляет собой SEQ ID NO:7.

Кроме того, неожиданно было обнаружено, что присутствие описанного выше аминокислотного повтора делает каркас, предпочтительно, каркас человека, особенно подходящим для введения CDR других не являющихся человеком видов животных, в частности, CDR кролика. Указанный повтор не оказывает отрицательного влияния на стабильность иммуносвязывающей молекулы. CDR представлены в конформации, сходной с их природной пространственной ориентацией в иммуносвязывающей молекуле кролика; таким образом, необходимости пересадки в акцепторный каркас структурно значимый положений нет. Таким образом, акцепторный каркас иммуносвязывающей молекулы человека или гуманизированный акцепторный каркас иммуносвязывающей молекулы содержит по меньшей мере три аминокислоты, предпочтительно, четыре, пять, шесть, а более предпочтительно, семь аминокислот из группы, состоящей из треонина (T) в положении 24, валина (V) в положении 25, аланина (A) или глицина (G) в положении 56, лизина (K) в положении 82, треонина (T) в положении 84, валина (V) в положении 89 и аргинина (R) в положении 108 (нумерация AHo).

Как описано в настоящем документе, акцепторные каркасы иммуносвязывающих молекул могут содержать повышающую растворимость замену в каркасе тяж